Pembahasan Pemetaan DNA Plasmid Pada praktikum kali ini dilakukan pemetaan DNA plasmid, yang bertujuan untuk

memahami pemetaan DNA plasmid dengan pemotongan atau menggunakan enzim restriksi. Enzim restriksi merupakan suatu enzim yang digunakan untuk memotong DNA pada situs yang spesifik, disebut restriction sites. Enzim restriksi ini mengenali urutan nukleotida spesifik dan memotong DNA pada posisi diantara atau diluar sekuen yang dikenalinya tersebut. Biasanya pemotongan DNA terjadi apabila terdapat sekuen yang disebut palindrom. Sekuen ini memiliki urutan basa yang sama pada kedua utas DNA ketika dibaca pada arah 5 3. Sebelum DNA dapat dimanipulasi dan dilakukan rekombinasi, peta DNA restriksi perlu diketahui terlebih dahulu. Peta restriksi suatu DNA merupakan tempat pemotongan enzim restriksi pada DNA tersebut. Kemudian, beberapa syarat suatu plasmid dapat digunakan sebagai vector cloning adalah mempunyai sekurang-kurangnya dua gen marker yang dapat menandai masuk atau tidaknya plasmid ke dalam sel inang dan mempunyai tempat pengenalan restriksi sekurangkurangnya di dalam salah satu marker yang dapat digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen DNA. Pemilihan enzim restriksi untuk pemotongan fragmen DNA didasarkan pada: ukuran fragmen, bluntended atau sticky-ended fragment, sensitivitas terhadap metilasi dan kompatibel terhadap kondisi reaksi. Enzim restriksi yang akan digunakan pada praktikum kali ini adalah EcoRI dan HindIII, dimana EcoRI didapatkan dari bakteri Escherichia coli dan HindIII didapatkan dari Haemophilus influenza. Gambar dibawah ini menunjukkan enzim EcoRI yang mampu mengenali enam urutan nukleotida spesifik yang kemudian dipotong menjadi 2 bagian

Gambar : Suatu double strand dari DNA yang dipotong oleh enzim restriksi EcoRI (Lodge et al., 2007) sedangkan untuk enzim restriksi HindIII akan memotong pada daerah spesifik

5'...AA G C T T...3' 3'...T T C G AA...5

(Lodge et al., 2007).

Prosedur pertama ialah penyiapan sampel suspensi DNA berupa plasmid hasil isolasi pada praktikum sebelumnya. Plasmid yang akan dipotong menjadi fragmen-fragmen digunakan sebanyak 8 L. Selain itu disiapkan pula aquabidest sebanyak 6 L, buffer tango 2 L, dan enzim restriksi yaitu EcoRI sebanyak 2 L dan HindIII 2 L (dengan urutan: . Gue lupa urutannya apa yg dimasukin duluan, yg dipapan tulis). Buffer tango yang digunakan berisi 33 mM Tris-acetate (pH 7.9 at 37C),10 mM magnesium acetate, 66 mM potassium acetate, 0.1 mg/ml BSA. Penggunaan BSA (Buvine Serum Albumine) dalam campuran reaksi bertujuan agar digesti DNA berhasil. Adanya BSA memberikan pemutusan sempurna dan reprodusibel untuk berbagai substrat DNA. BSA menstabilkan enzim ketika proses digesti berlangsung lebih dari satu jam pada suhu 37 C, karena sebagian besar enzim restriksi endonuklease dalam reaksi buffer tanpa BSA bisa bertahan pada suhu ini hanya selama 10 - 20 menit saja atau bahkan kurang dari 20 menit. Selaijn itu, BSA mengikat ion logam dan bahan kimia lainnya yang mungkin terdapat dalam buffer atau penyiapan DNA yang bisa menonaktifkan endonuklease restriksi. Penambahan buffer diberikan sebelum pemberian enzim restriksi, hal ini dilakukan karena larutan DNA harus disesuaikan agar memberikan kondisi yang tepat untuk aktivitas enzim yang optimal. Enzim restriksi merupakan enzim yang tidak stabil. Oleh karena itu, sebaiknya disimpan pada suhu -20C untuk sebagian besar enzim. Beberapa enzim perlu disimpan pada -70C. Enzim ini harus tetap disimpan di dalam es ketika dikeluarkan dari freezer dan harus selalu menjadi komponen yang ditambahkan terakhir pada campuran reaksi. Enzim harus tetap disimpan dalam keadaan dingin (dalam es) dan harus selalu menjadi komponen yang ditambahkan terakhir dalam campuran reaksi. Aquabidest, buffer tango, dan plasmid dimasukkan ke dalam tabung eppendorf sesuai dengan jumlah yang dibutuhkan, lalu divortex. Kemudian dimasukkan EcoRI sebanyak 2 L kedalam tabung eppendorf dan yang terakhir dimasukkan HindIII 2 L. Campur reaksi dengan baik dengan cara pemipetan atau menggoyangkan tabung eppendorf. Setelah itu, diinkubasikan selama (ini lupa berapa jamnya, mungkin 1 jam) pada suhu 37oC. Dilakukan inkubasi karena . Dilakukan inkubasi pada suhu 37oC karena suhu tersebut merupakan suhu yang optimal untuk aktivitas enzim restriksi tersebut. Namun, terdapat beberapa enzim restriksi yang suhu optimalnya berbeda, sebagai contoh TaqI harus diinkubasi pada suhu 65oC untuk memperoleh aktivitas enzim yang optimum. (kalo mau tambahin atau benerin silahkan) Selesai diinkubasi, seharusnya dilakukan elektroforesis untuk mengecek apakah enzim telah memotong DNA. Bila DNA belum terpotong sempurna, waktu inkubasi dan atau enzim restriksi ditambahkan lagi. Bila telah terpotong sempurna, aktivitas enzim dihentikan dengan memanaskan

larutan DNA pada suhu 65-70oC. Ketika telah diketahui terpotong secara sempurna, dilakukan elektroforesis kembali untuk menentukan ukuran plasmid dan fragmen-fragmennya.