HROMATOGRAFIJA U ANALIZI I KONTROLI LEKOVA

Mira L. Zeevi

mzecevic@pharmacy.bg.ac.yu

Separacione metode analize

ta je hromatografija?
Hromatografija je fiziko-hemijska metoda separaciona pre svega, a slii u ....
Analitika

Razdvajanje

cilj

Identifikacija Odreivanje
Preparativna

Smea

Komponente

Koncentrisanje Preiavanje

 razdvajanje komponenata se postie procesom stalne raspodele

m o l e k u l a i l i j o n a i z m e u p o k r e t n e

Podela hromatografskih metoda

prema fizikoj prirodi mobilne i stacionarne faze, prema obliku stacionarne faze, prema mehanizmu razdvajanja i prema tehnici rada

Prema fizikoj prirodi mobilne i stacionarne faze stacionarna faza mobilna faza vrsta tena vrsta gas tena tena tena gas

Prema obliku stacionarne faze

nezavisno od agregatnog stanja pojedinih faza ili prirode sila koje prouzrokuju razdvajanje a) kolonska hr. (gasna, tena i hromatografija sa
j o n s k i m i z m e n j i v a i m a )

b) planarna hr. (papirna, tankoslojna i elektroforeza)

Prema mehanizmima razdvajanja:

Hromatografija se zasniva na razliitim ravnotenim procesima (mehanizmima): adsorpciji (adsorpciona hr.) razliitoj rastvorljivosti
( p a r t i c i o n a i l i p o d e o n a h r . )

jonskoj izmeni (jonoizmenjivaka hr.) i penetraciji kroz pore razl. vel. (gel ekskluziona hr.)

Adsorpcija - interakcija ili vezivanje komponenti uzorka na vrstoj povrini (na aktivnim mestima). adsorpcija desorpcija raspodela (razdvajanje)

Apsorpcija-Particija-(raspodela)-proces raspodeljivanja, pri emu komp

h o m o g e n e r a s t v o r e u s v a k o j o d . u z o r k a g r a d e

Jonska izmena - ravnotena reakcija

s t e h i o m e t r i j s k e i z m e n e j o n a i z m e u j o n a

Penetracija kroz pore - ekskluzija stac. faza je vrsta porozna supstanca, najee gel solvatisani molekuli veeg promera od pora ne
p e n e t r i r a j u k r o z g e l , a m a n j i p e n e t r i r a j u

10

Prema tehnici rada

hromatografija eluiranjem
Eluacija proces u kome mobilna faza ispira sastojke sa stacionarne faze. Eluens rastvara (ili smea) koji nosi komponente
s m e e k r o z s t a c i o n a r n u f a z u .

Eluat rastvor koji izlazi iz kolone.

11

 hromatografija istiskivanjem
na stacionarnu fazu se nanosi rastvor uzorka, a zatim dodaje rastvor pogodne supstance koja istiskuje komponente uzorka i tako ubrzava njihovo kretanje.

frontalna analiza
na stacionarnu fazu se stalno dodaje rastvor uzorka tako da se samo komponenta koja se najbre
k r e e d o b i j a u i s t o m s t a n j u .

12

Adsorpciona hromatografija
Teno-vrsta (hrom. na koloni i TLC) Gasno-vrsta (GC) Jonoizmenjivaka Gel filtracija HPLC
13

Adsorbciona hromatografija- Koeficijent raspodele

Koeficijent raspodele

cs K cm
cs koliina adsorbovane supst. po 1g stacionarne faze cm koncentracija supstance u mobilnoj fazi
Linearna adsorpcina izoterma I dinamika ravnotea
14

 u idealnom sluaju K je const. u irokom opsegu koncentracija linearna hr. - Slika 1 (b) simetrian pik

u praksi linearnost postoji samo sa niim koncentracijama supst. Nelinearnost K - Slika 1 (a) i (c)

(a)
k-nije konstantan: CmCs, asimet.pik

(b)
k- konstantan Cm=Cs

(c)
k-nije konstantan CsCm, asimet.pik
15

Kolonska hromatografija
tena hromatografija
stac. f. smetena u cevi (koloni),

primenjena tehnika eluiranje

kretanje mobilne faze: pod uticajem zemljine tee

i l i p o d p

preparativna i analitika - kolone

16

Slika 2 - (a) Razdvajanje smee sastojaka A i B eluacionom hrom. na koloni (b) Izlazni zapis odgovora detektora na razliitim stupnjevima eluacije

brzina kretanja komponenti = f(koeficijenti raspodele)

17

osnovi

hromatografskog

razdvajanja

je

razlika u osobinama komponenti smee to uslovljava kretanje razliitim brzinama i

razliitu raspodelu u stacionarnoj i mobilnoj

fazi.

... po kinetikoj teoriji!

18

 K = 1, (50% supst. U mf i 50% supst. U sf. K =9, 90% supst. U sf. A 10% u mf. Supstanca sa veim K se zadrava due u koloni

19

Da bi se supst. uspeno razdvajale neophodna je dovoljna razlika u K dve supstance koji pokazuje afinitet supstanci prema stacionarnoj fazi!
stepen adsorpcije zavisi od gustine i jaine aktivnih
m e s t a n a p o v r i n i a d s o r b e n s a k a o i o d v e l i i n e

adsorpcija desorpcija dinamika ravnotea

r a s p o d e l a i z

20

esto se sve supstance ne mogu eluirati jednim rastvaraem; drugi rastvara ili smee poveavaju snagu eluacije!

razdvajanje (zone ili trake)..analiza - detekcija vizuelno, IR, VIS, UV spektrofotometrija, MS, NMR
intenzitet signala = f(koncentracija komponente)

poveanje preenog puta bolje razdvajanje poveanje preenog puta irenje traka (ne moe se izbei!)
21

Protok m.f. pospeuje razdvajanje traka i ono je bre od njihovog irenja. Komponente se uspeno razdvajaju, pod uslovom da je kolona dovoljno duga, tj. da ima dovoljan broj teorijskih platoa. Sposobnost kolone da daje uske i otre pikova

efikasnost kolone

broja teorijskih platoa (N) visina ekvivalentna teorijskom platou (HEPT) ili (H) redukovana visina h asimetrija pika (As) 22

poloaj pika detekcija -identifikacija

a povrina pika kvantifikacija

kalibraciona kriva za svaku komponentu

sastav standarda priblian sastavu uzorka
kontrolisani eksperimentalni uslovi

sertifikovani standardni materijali

metoda unutranjeg standarda

23

Podeona hromatografija
Teno-tena (hrom. na papiru,TLC) HPLC (na koloni) GC

24

Podeona hromatografija koeficijent raspodele

Razdvajanje na osnovu razliite rastvorljivosti komponenata smee u dve tene faze koje se ne meaju definisano podeonim koeficijentom Efikasnost i brzina razdvajanja zavisi od broja teorijskih platoa sf.

25

 Mehanizam interakcije izmeu sf i komponente nije sasvim definisan. Mogue su sve meumolekulske sile: Van Der Waalsove, dipol-dipol, jon-jon, jondipol, H-veza, to znai da je osim razliite rastvorljivosti prisutan i proces adsorpcije.

26