FERMENTAIA DE REGIM

Fermentaia, ca etap a unui proces tehnologic, se definete ca fiind procesul de cretere a microorganismelor pe medii de cultur cu scopul obinerii unor produse de biosintez, denumii metabolii. Creterea microorganismelor este rezultatul interaciunii dintre celula individual i mediul de cultur. Att creterea

microorganismului, ct i producerea de metabolii este determinat de compoziia mediului de cultur, temperatur, pH i gradul de aerare, n cazul proceselor aerobe. Fermentaiile pot fi realizate n regim discontinuu (batch) sau continuu. Fermentaiile discontinue sunt un exemplu de culturi n sisteme nchise, care conin o cantitate limitat de nutrieni (substrat). Dup inoculare, cultura va trece printr-un numr de faze de cretere celular. Creterea microorganismelor este urmrit prin determinarea masei celulare (densitate celular) i a numrului de microorganisme (concentraie celular) fiind realizat turbidimetric sau cu analizoare n IR. Reprezentarea grafic a variaiei numrului de celule pe parcursul unei fermentaii permite vizualizarea curbei de cretere, care cuprinde mai multe faze, corespunztoare diferitelor viteze de cretere, aa cum reiese din figura de mai jos:

ln (conc.biomas) I II III IV

timp 1

Primul domeniu al curbei de cretere poart denumirea de faz de lag, sau faz de cretere staionar, considerat ca faz de acomodare a microorgnismelor la condiiile din fermentator. n procesele industriale durata fazei de lag poate fi redus prin utilizarea unui inocul adaptat anterior substratului industrial. Cel de-al doilea domeniu corespunde fazei de cretere logaritmic (exponenial), care poate fi descris de ecuaia:
dx = x d

(1)

unde x reprezint concentraia de biomas, fiind timpul, h, iar este viteza specific de cretere, h-1. Prin integrarea ecuaiei (1) pentru condiiile iniiale = 0 x = x0 se obine:

ln

x = sau ln x = ln x0 + sau x = x 0 e x0

(2)

Panta segmentului de cretere exponenial reprezint viteza maxim de cretere pentru condiiile date. Valoare vitezei maxime de cretere depinde de natura microorgnismului; cteva exemple sunt date n tabelul de mai jos: Microorganismul max, h-1

Methylomonas methanolytica 0.53 Aspergillus nidulans Penicillium crysogenum

0.36 0.12

Scderea concentraiei de nutrieni din mediu va determina scderea vitezei de cretere. Scderea vitezei de cretere se poate, ns, datora i acumulrii unor substane cu aciune inhibatoare. Cea de-a treia faz este faza de descretere (retardare) datorat consumrii substratului i poate fi descris printr-o relaie dintre i substana limitativ de cretere rezidual:

max c S
K S + cS

(3)

cS fiind concentraia rezidual a substratului limitativ, iar KS constanta de utilizare a

substratului. KS numeric este egal cu valoarea concentraiei substratului pentru care = max i reprezint o msur a afinitii microorganismului pentru substrat.. Dac microorganismul are o afinitate foarte mare pentru substratul limitativ (KS are valoare

mic) viteza de cretere nu va fi afectat pn cnd concentraia substratului nu va scdea la valori foarte mici; acest lucru determin o durat mic pentru faza de retardare. Dac ns microorganismul are o afinitate mic pentru substrat (KS are valoare mare) viteza de cretere va fi afectat chiar i la valori relativ ridicate ale concentraiei substratului limitativ, iar perioada de descretere (retardare) a vitezei va fi lung. Cteva exemple ale valorii KS sunt date n continuare: Microorganism Escherichia coli Substrat limitativ KS, mg/l glucoz 6.810-2 25.0 0.7

Saccharomyces cerevisiae glucoz Pseudomonas sp. metanol

Ultima faz este faza staionar, care n culturile discontinue corespunde punctului n care viteza de cretere devine nul. n aceast etap, din punct de vedere fiziologic, microorganismele au nc metabolismul activ; aceast faz este cea n care se produc metaboliii secundari. Obinerea metaboliilor primari, care se realizeaz n faza de cretere exponenial, poate fi descris de relaia: dc p d = qp x (4)

cp fiind concentraia de produs (metabolit primar), iar qp viteza specific de formare a produsului. Formarea de metabolit se poate lega de producia de biomas prin relaia: dc p dx = Yp / x (5)

unde Yp/x reprezint randamentul de produs raportat la substratul consumat. Prin multiplicarea ecuaiei (5) cu dx/d se obine: dc p dx dc p dc p dx dx = Yp / x = Yp / x = Yp / x x = q p x q p = Yp / x dx d d d d d (6)

relaie care exprim faptul c atunci cnd formarea produsului are loc n perioada de cretere (obinerea unui metabolit primar), viteza specific de obinere a acestuia crete cu viteza specific de cretere.

Dac formarea de produs nu este asociat cu creterea, viteza specific de formare de produs poate fi constant pe un interval larg al vitezei de cretere, sau poate varia ntr-o manier complex. Culturile discintinue se folosesc pentru obinerea de: biomas, caz n care condiiile de cultur trebuie astfel alese nct s asigure o concentraie celular maxim. (ex. obinerea drojdiei de panificaie, a drojdiei de bere, a biomaselor proteice); metabolii primari pentru care etapa de cretere exponenial trebuie extins (ex. obinerea de acizi organici citric, lactic, de aminoacizi); metabolii secundari n acest caz condiiile de cultur trebuie s conduc la o etap scurt de cretere exponenial i o perioad staionar lung. Fermentaii continue n culturile discontinue, creterea exponenial poate fi prelungit prin adugarea n fermentator de mediu de cultur proaspt. Dac mediul de cultur este astfel alctuit nct s fie limitativ de substrat i nu de toxine, creterea exponenial se va prelungi pn cnd substratul adugat se epuizeaz. Suplimentarea de substrat se poate face doar n limita volumului util al fermentatorului. Dac, ns, concomitent cu adugarea de substrat se ndeprteaz mediu din fermentator, se obine o cultur continu. Dac debitele de evacuare, respectiv de alimentare sunt reglate, se ajunge la o producie constant de celule (se atinge starea staionar), adic formarea de biomas nou compenseaz celulele evacuate din reactor. Se definete noiunea de vitez de diluie:
D= F V

(7)

care reprezint raportul dintre debitul de curgere n i din fermentator i volumul acestuia. Modificarea net a concentraiei de celule n timp (acumularea) poate fi scris ca:
dx = crestere evacuare = x D x = x( D ) d

(8)

n condiii staionare, concentraia de celule este constant, adic dx/d = 0 i deci x = Dx adic =D, ceea ce indic faptul c, n condiii staionare, viteza specific de cretere este controlat de viteza de diluie. Prin nlocuirea lui funcie de substratul limitativ, se obine ecuaia:

 max c S dx = x D d K S + cS
cunoscut ca ecuaia lui Monod.

(9)

Modificarea net a concentraiei substratului limitativ (acumularea) poate fi descris de relaia:

dc S = cantit. int rata cantit . iesita cantit. cons. de celule adic d

dc S x cS = D c S 0 D c S max d Yx / s K S + cS

(10)

relaie, care n condiii staionare, cnd dcx/d = 0 i dcS/d = 0 poate fi egalat cu acumularea de celule:

max c S x cS x K + c D = D c S 0 D c S max Y S x / s K S + cS S
i conduce la:

=0

(11)

x = Yx / S c S 0 c S
cS = KS D max D

(12) (13)

pentru D max = Dcrit. Relaia (13) exprim mecanismul prin care viteza de diluie, D, controleaz viteza de cretere, . Creterea celular determin o scdere a substratului limitativ pn la o valoare la care concentraia substratului va favoriza o vitez de cretere egal cu cea de diluie(=D). Dac concentraia substratului scade sub aceast valoare, celulele vor fi evacuate cu o vitez mai mare dect sunt produse (D > ), determinnd o scdere a concentraiei celulare; ca urmare concentraia de substrat limitativ va crete (neavnd cine s-l consume), determinnd o cretere a vitezei de generare de celule i bilanul (echilibrul) se va restabili. Acest tip de sistem continuu se definete ca un sistem chemostat, deoarece viteza de cretere este controlat de mediul chimic, adic de concentraia substratului limitativ. Un alt tip de fermentaie continu este cel turbidostat, n care concentraia celular se menine constant (este controlat) prin reglarea debitelor, meninnd turbiditatea

mediului ntre anumite limite (strnse). Acest lucru se poate realiza printr-un control al mediului cu o fotocelul care transmite semnal la pompa de alimentare cu mediu de cultur. n alte cazuri, monitorizarea concentraiei de biomas se poate realiza prin controlul concentraiei de dioxid de carbon, sistem denumit biostat. Caracteristicile cinetice ale unui microorganism sunt descrise de valorile numerice ale constantelor Y, max i KS. Valoarea lui Y determin concentraia staionar de biomas, max care este egal cu Dcrit definete viteza maxim de diluie care poate fi utilizat n condiii staionare, iar KS determin concentraia rezidual a substratului (indirect concentraia de biomas) i viteza maxim de diluie ce poate fi aplicat. Comportarea unei bacterii cu afinitate mare fa de substrat (valoare mic KS) ntr-o cultur continu este redat n figura urmtoare.

Creterea vitezei de diluie are ca efect o cretere foarte lent a concentraiei reziduale de substrat limitativ pn cnd atinge valoare D = max = Dcrit, dup care creterea devine semnificativ.

Viteza de diluie la care x devine nul (celulele au fost evacuate n totalitate) poart denumirea de vitez critic de diluie, Dcrit i poate fi descrisde ecuaia:

Dcrit =

max c S 0
K S + cS 0

(14)

Valoarea vitezei critice de diluie, Dcrit este determinat de valoarea vitezei maxime de cretere, max , a valorii KS i a variabilei cS0 , cu ct aceasta are o valoare mai mare Dcrit se apropie de max. ntr-o cultur chemostat simpl, max nu se atinge, deoarece ntotdeauna predomin condiiile de substrat limitativ. n cazul unei bacterii cu afinitate mic pentru substrat(valoare mare KS), creterea diluiei conduce la o cretere semnificativ a concetraie substratului limitativ. Se remarc existena unei creteri treptate, lente a concentraiei de de substrat limitativ, respectiv o descretere de celule, x, pe msur ce viteza de diluie se apropie de valoarea critic. x

Dcri

Sistemele reale au abateri semnificative de la idealitate, datorate mai multor factori, cum ar fi: amestecare imperfect; aderarea microorganismelor la pereii fermentatorului; diferite aspecte fiziologice ale culturii (consum de substrat pentru reacii de ntreinere, toxicitatea substratului la viteze mari de diluie). 7

Productivitatea culturilor poate fi exprimat ca raport dintre cantitatea de biomas la timpul de fermentaie. Productivitatea unei culturi discontinue se poate scrie ca fiind:

Pdisc =
unde

x max x 0 1 + 2

Pdisc = D x

(15)

P reprezint productivitatea, adic concentraia celular/h, xmax - concentraia celular maxim atins n stare staionar, x0 - concentraia celular iniial, 1 timpul n care are loc creterea cu vitez maxim, 2 timpul de cretere cu o vitez diferit de cea maxim, care include faza de

lag, faza de retardare, respectiv fazele de amestecare, sterilizare, golire. Pentru o cultur continu productivitatea se exprim cu relaia: Pcont = D x1 3 T unde (16)

3 timpul necesar atingerii strii staionare i include pregtirea fermentatorului,

sterilizarea i fazele discontinue care preced operarea continu, iar T reprezint timpul de meninere a strii staionare. Productivitatea maxim de biomas se obine pentru o diluie care conduce la o valoare maxim a produsului Dx. Avantajele fermentaiilor continue sunt: reducerea timpilor mori necesari pentru curire, umplere, golire, sterilizare, rcire; reducerea volumului fermentatoarelor posibilitatea automatizrii utilizarea mai eficient a substratului i obinerea unor randamente mai mari de produs. Fermentaiile continue se pot realiza n sisteme omogene, cnd masa din interiorul fermentatorului are o compoziie uniform (amestecare perfect), sau siteme eterogene cnd compoziia mediului variaz n lungimea fermentatorului (cazul bioreactoarelor tubulare, considerate cu deplasare total). De asemenea, fermentaiile continue se pot realiza n sisteme deschise cnd microorganismele prsesc zona de fermentaie n mod continuu, o dat cu efluentul i n

sisteme nchise, cnd masa celular este reinut n zona de fermentaie, efluentul fiind lipsit de biomas. Procesele continue de fermentaie sunt recomandate la viteze mari de cretere a microorganismelor. Cteva exemple de produse care se obin prin fermentaii continue: acid acetic, acid lactic, alcolo etilic, 2,3 butandiol, butanol aceton, antibiotice (peniciline, streptomicin, cloramfenicol), vitamina B12. O comparaie ntre

productivitatea realizat pentru procesele continue i cele discontinue este redat n tabelul urmtor: max pentru Pdisc, h-1 Pcont/Pdisc 0.05 0.1 0.2 0.4 0.8 1.0 1.2 0.09 0.21 0.53 1.5 4.6 6.8 9.5

Alegerea regimului tehnologic de funcionare a instalaiei de fermentaie se face funcie de max, care este o caracteristic pentru fiecare tip de microorganism, cultivat pe un anumit substrat limitativ.