BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Dalam teknik biakan murni tidak saja diperlukan bagaimana memperoleh suatu
biakan yang murni, tetapi juga bagaimana memelihara serta mencegah pencemaran dari
luar. Media untuk membiakkan bakteri haruslah steril sebelum digunakan. Pencemaran
terutama berasal dari udara yang mengandung banyak mikroorganisme. Pemindahan
biakan mikroba yang dibiakkan harus sangat hati-hati dan mematuhi prosedur laboratorium
agar tidak terjadi kontaminasi. Oleh karena itu, diperlukan teknik-teknik dalam pembiakan
mikroorganisme yang disebut dengan teknik inokulasi biakan (Dwijoseputro, 1998).
Teknik inokulasi merupakan suatu pekerjaan memindahkan bakteri dari medium
yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Dengan
demikian akan diperoleh biakan mikroorganisme yang dapat digunakan untuk
pembelajaran mikrobiologi. Pada praktikum ini akan dilakukan teknik inokulasi biakan
mikroorganisme pada medium steril untuk mempelajari mikrobiologi dengan satu kultur
murni saja.

1.2 Permasalahan
Permasalahan yang akan dibahas dalamp raktikum ini adalah bagaimana
mempelajari teknik inokulasi biakan mikroorganisme pada medium steril.

1.3 Tujuan
Praktikum ini bertujuan untuk mempelajari teknik inokulasi biakan
mikroorganisme pada medium steril
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pemindahan biakan

Identifikasi biakan mikroorganisme seringkali memerlukan pemindahan ke biakan
segar tanpa terjadi pencemaran. Pemindahan mikroorganisme ini dilakukan dengan teknik
aseptik untuk mempertahankan kemurnian biakan selama pemindahan berulangkali.
Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dalam biakan cair atau padat. Kekeruhan dalam kaldu
menunjukkan terjadinya pertumbuhan mikroorganisme. Bila mikroorganisme menumpuk
pada dasar tabung maka akan membentuk sedimen, sedangkan pada permukaan kaldu
pertumbuhannya terlihat sebagai pelikel (Lay, 1998).
Pertumbuhan mikroorganisme dalam kaldu seringkali menggambarkan aktivitas
metabolismenya. Mikroba aerob obligat berkembang biak pada lapisan permukaan karena
pada bagian ini kandungan oksigen tinggi. Selain dalam media cair, mikroorganisme juga
memperlihatkan pertumbuhan dengan ciri tertentu dalam biakan padat seperti agar miring
atau lempengan agar. Agar miring lazimnya digunakan untuk menyimpan biakan murni
sedangkan agar lempengan lazimnya digunakan untuk memurnikan mikroorganisme (Lay,
1998).

2.2 Inokulasi

Penanaman bakteri atau biasa disebut juga inokulasi adalah pekerjaan memindahkan
bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat
tinggi. Untuk melakukan penanaman bakteri (inokulasi) terlebih dahulu diusakan agar
semua alat yang ada dalam hubungannya dengan medium agar tetap steril, hal ini agar
menghindari terjadinya kontaminasi (Dwijoseputro, 1998).

Ada beberapa tahap yang harus dilakukan sebelum melakukan teknik penanaman
bakteri (inokulasi) yaitu :

1. Menyiapkan ruangan
Ruang tempat penanaman bakteri harus bersih dan keadannya harus steril agar tidak
terjadi kesalahan dalam pengamatan atau percobaaan .dalam labotarium pembuataan
serum vaksin dan sebagainya. Inokulasi dapat dilakukan dalam sebuah kotak kaca
 (encast) udara yang lewat dalam kotak tersebut dilewatkan saringan melalui suatu jalan
agar tekena sinar ultraviolet (Pelczar, 1986).

2. Pemindahan dengan dengan pipet

Cara ini dilakukan dalam penyelidikan air minum atau pada penyelidikan untuk diambil
1 ml contoh yang akan diencerkan oleh air sebanyak 99 ml murni (Pelczar, 1986).

3. Pemindahan dengan kawat inokulasi

Ujung kawat inokulasi sebaliknya dari platina atau nikel .ujungnya boleh lurus juga
boleh berupa kolongan yang diametrnya 1-3mm. Dalam melakukuan penanaman bakteri
kawat ini terlebih dahulu dipijarkan sedangkan sisanya tungkai cukup dilewatkan nyala
api saja setelah dingin kembali kawat itu disentuhkan lagi dalam nyala (Pelczar, 1986).

2.3 Teknik Inokulasi

Ada beberapa metode yang digunakan untuk mengisolasi biakan murni

mikroorganisme yaitu :

2.3.1 Metode gores

Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi
memerlukan ketrampilan-ketrampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang
sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum digoreskan di permukaan
media agar nutrien dalam cawaan petri dengan jarum pindah (lup inokulasi). Di antara
garis-garis goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuh
menjadi koloni (Winarni, 1997).

Cara penggarisan dilakukan pada medium pembiakan padat bentuk lempeng. Bila
dilakukan dengan baik teknik inilah yang paling praktis. Dalam pengerjaannya terkadang
berbeda pada masing-masing laboratorium tapi tujuannya sama yaiitu untuk membuat
goresan sebanyak mungkin pada lempeng medium pembiakan (Kus Irianto, 2006)

Ada beberapa teknik dalam metode goresan, yakni :

a. Goresan T
 b. Goresan kuadran

c. Goresan Radian

d. Goresan Sinambung

2.3.2 Metode tebar

Setetes inokolum diletakan dalam sebuah medium agar nutrien dalam cawan
petridish dan dengan menggunakan batang kaca yang bengkok dan steril. Inokulasi itu
disebarkan dalam medium batang yang sama dapat digunakan dapat menginokulasikan
pinggan kedua untuk dapat menjamin penyebaran bakteri yang merata dengan baik. Pada
beberapa pinggan akan muncul koloni koloni yang terpisah-pisah (Winarni, 1997).

…………
…
…………
…………
…………
2.3.3 Metode tuang

Isolasi menggunakan media cair dengan cara pengenceran. Dasar melakukan

pengenceran adalah penurunan jumlah mikroorganisme sehingga pada suatu saat hanya
ditemukan satu sel di dalam tabung (Winarni, 1997).

2.3.4 Metode tusuk

Metode tusuk yaitu dengan dengan cara meneteskan atau menusukan ujung jarum
ose yang didalamnya terdapat inokolum, kemudian dimasukkan ke dalam media (Winarni,
1997).

2.4 Perbedaan Inokulasi Jamur dan Bakteri

Perbedaan Inokulasi Jamur dan Bakteri adalah :

1. Inokulasi jamur menggunakan jarum ose bentuk batang. Hifa yang berbentuk seperti
benang mudah diambil dengan jarum ose batang dan mudah sekali tumbuh di dalam
suatu media.
2. Inokulasi bakteri menggunakan jarum ose bentuk bulat. Pada ujung jarum ose yang
berbentuk bulat, bakteri akan dapat terambil dalam jumlah yang relatif banyak
(Rohimat, 2002).

2.5 Macam-Macam Media

Ada beberapa macam media yang digunakan untuk inokulasi yaitu :

1.Mixed culture: berisi dua atau lebih spesies mikroorganisme

2. Plate culture: media padat dalam petridish

3. Slant culture : media padat dalam tabung reaksi

4. Stap culture : media padat dalam tabung reaksi, tetapi penanamannya dengan cara
penusukan.

5. Liquid culture : media cair dalam tabung reaksi.

6. Shake culture: media cair dalam tabung reaksi yang penanamannya dikocok.
(Dwijoseputro, 1998).

2.6 Cara menyelidiki Piaraan Murni

Dalam keadaan sebenarnya ( di alam bebas ) boleh dikatakan tidak ada bakteri yang
hidup tersendiri terlepas dari spesies lainnya. Kerapkali bakteri patogen kedapatan
bersama-sama bakteri saproba. Untuk menyendirikan suatu spesies ada dikenal beberapa
cara, yaitu :
1. Dengan pengenceran
Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam-macam spesies
diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Dari enceran inii kemudian diambil sampel 1 ml
untuk diencerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1 ml untuk
disebarkan pada suatu koloni tumbuh dalam medium tersebut, tetapi mungkin juga kita
hanya memperoleh satu koloni saja. Dalam hal yang demikian ini kita memperoleh satu
koloni saja. Dalam hal yang demikian ini kita memperoleh satu koloni murni. Kalau kita
belum yakin, bahwa koloni tunggal yang kita peroleh itu murni, kita dapat mengulang
pengenceran dengan menggunakan koloni ini sebagai sampel (Waluyo, 2005).

Gambar 1. Teknik Pengenceran

2. Dengan Penuangan
Robert koch ( 1943-905 ) mempunyai metode yang lain, yaitu dengan mengambil
sedikit sampel campuran bakteri yang sudah diencerkan, dan sampel ini kemudian
disebarluaskan di dalam suatu medium dari kaldu dan gelatin encer. Dengan demikian
diperoleh hanyalah suatu piaraan adukan. Setelah medium itu mengental, maka selang
beberapa jam kemudian nampaklah koloni – koloni yang masing – masing dapat dianggap
murni. Denagn mengulang pekerjaan seperti di atas, maka akhirnya akan diperoleh piaraan
murni yang lebih terjamin (Waluyo, 2005).

3. Dengan Penggesekan
Metode ini sekarang banyak digunakan, karena tidak begitu memakan waktu, hanya
sayang, dengan cara ini maka bakteri anaerob tidak dapat rumbuh. Jika ujung kawat
inokulasi dibengkokan, kemudian ujung kawat inokulasi itu setelah disentuhkan suatu
koloni lalu digesekkan pada permukaan medium padat, maka beberapa waktu kemudian
(kurang lebih 12 jam) akan nampaklah koloni-koloni yang letaknya tersebar di permukaan
medium. Jika diadakan pemindahan sampel dari suatu koloni yang letaknya terpencil,
maka akan diperoleh suatu piaraan murni (Waluyo, 2005).

4. Dengan Mengucilkan Satu Sel ( Single Cell Isolation )

Mikropipet adalah alat yang dapat memungut satu bakteri dari sekian banyak,
dengan tiada ikut sertanya bakteri lain. Mikropipet ditempatkan pada tangan – tangan suatu
mikromanipulator. Dengan mikropipet dibuat beberapa tetesan bergantung pada suatu kaca
penutup. Pekerjaan ini dilakuan di bawah obyektif mikroskop. Jika tampak suatu tetesan
hanya mengandung satu bakteri, maka dengan lain mikropipet, tetesan tersebut
dipindahkan ke medium encer dengan maksud supaya bakteri tersebut berkembang biak
dulu. Kemudian dari sini dapat diperoleh piaraan murni. Meode ini sangat memerlukan
kesabaran, lagipula mikromanipulator sangat mahal (Waluyo, 2005).

5. Dengan Inokulasi Hewan

Metode ini didasarkan atas suatu kenyataan, bahwa tidak semua bakteri dapat
tumbuh di dalam tubuh seekor hewan. Misal kita ambil dahak dari seseorang yang
disangka menderita tbc. Jika dahak ini disuntikkan ke dalam tubuh tikus putih, maka
bakteri – bakteri aprobe yang ikut serta itu tidak akan bertahan, sehingga kemudian kita
peroleh semata – mata hasil tbc saja. Piaraan pneumococcus murni dapat diperoleh dengan
jalan demikian juga. Bakteri yang ketinggalan dalam tubuh tikus yang sakit atau mati
akhirnya dapat dipindahkan ke dalam medium yang sesuai.
Inokulasi dapat dilakukan di dalam kulit ( intracutaneous ), dapat di bawah kulit
( subcutaneous), dapat di dalam otot ( intramuscular), dapat di rongga tubuh atau lain-lain
tempat lagi (Waluyo, 2005).

2.7 Teknik Aseptik

Sebelum benar-benar dilakukan proses kultur mikroorganisme, pertama kali kita
harus mempertimbangkan bagaimana agar tidak terjadi kontaminasi. Mikroorganisme ada
dimana-mana. Karena ukurannya yang sangat kecil, mereka mudah lepas dalam udara dan
permukaan. Maka dari itu, kita harus mensterilisasikan medium kultur secepatnya setelah
preparasi untuk pemindahan mikroorganisme siap dikontaminasikan, ini biasanya terbunuh.
Bagaimanapun, itu sama pentingnya untuk tindakan pencegahan sampai penanganan
berikutnya mediun kultur harus tetap steril. Demikian materi yang lain yang akan kontak
juga harus tetap terjaga kesterilannya (Cappuccino, 1983).
Teknik yang digunakan dalam pencegahan kontaminasi hingga kultur manipulasi
dan media kultur steril disebut teknik aseptik. Keunggulan itu dibutuhkan keberhasilan
dalam laboratorium mikrobiologi, dan salah satu cara belajar dengan pendamping
mikrobilogi. Kontaminasi udara paling sering menjadi masalah karena udara selalu kontak
dengan partikel debu dan umumnya banyak komunitas mikroorganisme didalamnya.
Ketika wadah dibuka maka segera ditangani agar tidak terkontaminasi dengan udara sekitar.
Transfer aseptik pada kultur dari salah satu medium ke medium yang lain harus lihai
dengan loop inokulasi atau jarum harus disterilkan oleh pembakaran pada nyala api. Dalam
pertumbuhan kultur dibutuhkan tempat yang mudah dipindahkan ke permukaan agar datar,
dimana pertumbuhan suatu koloni berasal dari pertumbuhan dan pembelahan sel tunggal
(Cappuccino, 1983).
 Gambar 2. Teknik Aseptik

2.8 Escherichia coli

Menurut Kenneath tahun (2008), Escherichia coli termasuk dalam famili
Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E.
coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan
manusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E.coli
merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare
lanjutan serta hemolitik uremic (hus). Peranan yang mengguntungkan adalah dapat
dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada level pencemaran air serta mendeteksi
patogen pada feses manusia yang disebabkan oleh Salmonella typhi. (Mikrolibrary, 2008).
Klasifikasi
Kingdom : Bakteria
Filum : Proteobacteria
Kelas : Gamma Proteobacteria
Order : Enterobacteriales
Famili : Enterobacteriaceae
Genus : Escheriachia
Spesies : E. coli
Escherichia coli biasanya hidup di dalam intestinum pada manusia ataupun hewan,
memiliki gram negative, dan fakultatif anaerob. Merupakan makhluk prokariot. Pada
kondisi tertentu bisa menjadi pathogen atau dapat menyebabkan penyakit. Dan bakteri ini
juga dapat menyebabkan keracunan makanan, dan yang paling sering adalah dapat
menyebabkan diare serta beberapa penyakit yang sejenis (Anonim, 2008).
Escherichia coli memproduksi racun yang berbahaya di lapisan intestinum. Bila
terjadi desakan pada intestinum maka akan menghasilkan racun tersebut untuk
menkontaminasi daging dan susu. Escherichia coli merupakan mikroorganisme normal
yang berasal dari kotoran hewan atau manusia baik dalam kondisi sehat maupun sakit.
Oleh karena itu, dikenal juga dengan istilah koli tinja. Morfologi sel bakteri Escherechia
coli berupa batang pendek (0,5-1,0 X 1,0-3,0 µm), serta motil (sel-selnya peritrikus, yaitu
flagela secara merata tersebar diseluruh permukaan sel) dan ada juga yang non motil. Ciri-
ciri biokimiawinya adalah banyak sekali terjadi perubahan pada substrat. Keterangan ini
memberikan cara-cara dasar untuk membedakannya dengan yang lain. Habitatnya pada
lingkungan aquatik, tanah, makanan, air seni dan tinja (Pelczar, 1986).
 BAB III
METODOLOGI

3.1 Alat dan Bahan

3.1.1 Alat
Alat yang dipergukan dalam percobaan ini adalah jarum ose, tabung reaksi, lampu
spiritus, penangas air, cawan Petri, dan inkubator.

3.1.2 Bahan
Bahan yang dipergunakan daalm praktikum ini yaitu kapas lemak dan media agar
yanng telah disterilkan.

3.2 Cara kerja

3.2.1 Metode Gores (Streak Plate Method) pada Media Agar Miring
Tabung Reaksi

- Ditulis nama spesies mikroorganisme, tanggal serta nama praktikan ditulis

pada tabung reaksi.
- Biakan induk dalam tabung reaksi dan media agar miring yang telah
disterilkan diletakkan pada telapak tangan kiri.
- Dipanaskan jarum ose pada nyala api lampu spiritus hingga membara.
- Dibuka sumbat kapas pada biakan induk dengan jari manis dan kelingking.
- Disumbat kapas pada biakan induk ditutup.
- Disumbat kapas media agar miring yang akan diinokulasi mikroorganisme
dibuka dengan cara yang sama dengan langkah 4. Kemudian ujung jarum
ose yang sudah mengandung mikroorganisme digeserkan dengan hati-hati
di atas permukaan agar, dimulai dari dasar tabung secara zig-zag menuju
ke bagian atas tabung.
- Disumbat kapas ditutup secepatnya pada media yang telah diinokulasi.
dipanaskan ujung jarum ose kembali sampai membara untuk
memusnahkan mikroorganisme yang masih menempel.
- Disimpan biakan yang baru diinokulasi dalam inkubator. Diamati,
digambar dan diberi keterangan pertumbuhan koloni bakteri.

Hasil
3.2.2 Metode Gores (Streak Plate Method) pada Media Agar Datar
Tabung Reaksi

- Ditulis nama spesies mikroorganisme, tanggal serta nama praktikan pada

cawan petri.
- Biakan induk dalam tabung reaksi diletakkan pada telapak tangan kiri.
- Dipanaskan jarum ose pada nyala api lampu spiritus hingga membara.
- Dibuka sumbat kapas pada biakan induk dengan jari manis dan kelingking.
- Disumbat kapas pada biakan induk ditutup.
- Dipanaskan pinggiran cawan petri untuk proses sterilisasi cawan petri
- Dibuka sedikit tutup cawan petri dengan tetap melakukannya di dekat api
bunsen.
- Digeserkan ujung jarum ose yang sudah mengandung mikroorganisme
dengan hati-hati di atas permukaan agar, dimulai dari atas permukaan
secara zig-zag menuju ke bagian bawah (goresan T dan kuadran).
- Ditutup secepatnya pada media cawan petri yang telah diinokulasi.
dipanaskan ujung jarum ose kembali sampai membara untuk
memusnahkan mikroorganisme yang masih menempel.
- Disimpan biakan yang baru diinokulasi dalam inkubator. Diamati,
digambar dan diberi keterangan pertumbuhan koloni bakteri.

Hasil
3.2.3 Metode taburan (Pour Plate Method)

Medium Biakan

- Dicairkan medium bakteri di atas penagas air dan didinginkan sampai

suhu 50°C.
- Dituangkan ke dalam cawan petri secara aseptic dan dibiarkan sampai
padat.
- Diencerkan susupensi bahan yang mengandung mikroorganisme seencer
mungkin dan diteteskan secara aseptic.
- Diratakan dengan digoyang seperti angka delapan.
- Ditutup cawan petri dan diberi label, kemudian diinkubasi dalam keadaan
terbalik dalam incubator selama 24-48 jam masa inkubasi

Hasil
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Pengamatan

4.1.1. Inokulasi dengan Metode Gores (Medium Agar Datar)
No. Perlakuan Pengamatan
1. Disiapkan media biakan induk dari - Diberikan pada 2 sampel medium,
jenis mikroorganisme : menggunakan goresan kuadran dan
Bakteri : Escherichia coli goresan T
- Pada medium biakan induk, koloni
bakteri tampak berwarna putih

2. Medium NA pada tabung reaksi yang - Medium berwarna bening

telah disterilkan, dipanaskan di atas kekuningan
kompor listrik selama 10-15 menit - Pemanasan bertujuan untuk
mencairkan media sehingga dapat
dituangkan untuk media agar datar
pada cawan petri

3. Disediakan dua buah cawan petri dan - berfungsi untuk mensterilisasi cawan
sekeliling pinggirnya dipanaskan dekat petri dari kontaminan
api bunsen mikroorganisme yang lain
4. Dituangkan Medium NA panas ke - berfungsi sebagai tempat
dalam cawan petri steril menggoreskan bakteri dan tempat
pertumbuhan koloni bakteri

5. Didiamkan selama beberapa menit - berfungsi agar medium NA menjadi

cawan petri yang telah diberi medium padat seperti agar
NA panas

6. Di panaskan jarum ose hingga - berfungsi untuk mensterilisasi jarum

membara sehingga tidak ada mikroorganisme
lain yang menempel disana.

7. Dibuka sumbat kapas tabung reaksi - berfungsi untuk mensterilisasi tabung

yang berisi isolat biakan induk, dan biakan dari mikroorganisme lain
kemudian dipanaskan bibir tabung
8. Dimasukkan jarum ose bulat pada pengambilan inokulum dengan
medium biakan induk jarum ose untuk menggoreskan ujung bulat pada jarum ke
inokulasi bakteri media biakan induk, memungkinkan
bakteri dapat terambil banyak

9. Dipanaskan mulut tabung reaksi yang - berfungsi untuk mensterilisasi tabung

berisi isolat biakan induk, kemudian dan biakan dari mikroorganisme lain
segera ditutup dengan sumbat kapas

10. Setiap perlakuan di usahakan dilakukan - berfungsi agar saat inokulasi, bahan
secara aseptis (di dekat api bunsen) serta alat gelas yang digunakan tetap
steril
11. Digoreskan inokulum di permukaan - Media agar untuk bakteri digunakan
media agar di dalam cawan petri yang media NA (Nutrien Agar), fungsi
telah disediakan menggunakan metode penggunaan medium NA karena
gores mulai dari sisi samping secara komposisinya yang terdiri dari
merata. Metode gores yang dipakai ekstrak daging sapi didalamnya yang
meode T dan kuadran mengandung protein, karbohidrat,
vitamin, dan sedikit lemak, juga
terdapat adanya faktor pertumbuhan
yang tidak mampu disintesis
mikroorganisme
- Agar koloni yang terbentuk tersebar
merata, tampak jelas dan tidak
bertumpukan
12. Ditutup cawan petri dan dipanaskan - berfungsi untuk mensterilisasi cawan
kembali sekeliling cawan petri dan petri dan biakan dari
diisolasi dengan selotip bening mikroorganisme lain
13. Inokulum cawan petri diinkubasi di - sebagai tempat penyimpanan steril
inkubator pada suhu 370C cawan petri dengan menyeting suhu
optimum bakteri untuk tumbuh
14. Disimpan inokulum ke dalam inkubator Posisi cawan petri terbalik untuk
dengan posisi terbalik, diamati dan menghindari uap air hasil metabolisme
difoto bentuk koloni yang terbentuk bakteri akan menetes dari tutup cawan
setelah diinkubasi selama 2 x 24 jam ke permukaan media. Hal ini akan
dan 4 x 24 jam menghasilkan suatu masa pertumbuhan
yang menganak sungai dan
menghancurkan pembentukan koloni
secara individu. Sehingga untuk
menghindari hal ini, maka ketika
diinkubasi, bagian bawah cawan petri
diletakkan di atas atau terbalik

15. Setelah diinkubasi selama 2x 24 jam

a. Sampel 1: - tidak terbentuk koloni bakteri karena
tidak nampak goresan putih menyebar

b. Sample 2:
- tidak terbentuk koloni bakteri karena
tidak nampak goresan putih menyebar
16. Setelah diinkubasi selama 4x 24 jam
a. Sampel 1: - belum terbentuk koloni bakteri
dengan jumlah lebih banyak karena
belum terdapat goresan yang
nampak jelas

b. Sampel 2:
- belum terbentuk koloni bakteri
dengan jumlah lebih banyak karena
belum terdapat goresan yang
nampak jelas

4.1.2 Inokulasi dengan Metode Gores (Medium Agar Miring)

No. Perlakuan
1. Disiapkan media biakan induk dari
jenis mikroorganisme :
Bakteri : Escherichia coli
Pengamatan
- Masing-masing biakan induk berada di
tabung reaksi yang berisi media agar
miring yang berwarna kuning
- Pada medium biakan induk koloni
bakteri tampak berwarna putih
- Diberikan pada 3 sampel media
2. Disediakan tiga buah tabung reaksi - Medium agar miring berwarna
steril berisi medium agar padat kekuningan
- berfungsi sebagai tempat
menggoreskan bakteri maupun jamur
dan tempat pertumbuhan koloni
bakteri maupun jamur

3. Di panaskan jarum ose hingga - berfungsi untuk mensterilisasi jarum

membara sebelum digunakan dari
mikroorganisme lain

4. Dibuka sumbat kapas tabung reaksi - berfungsi untuk mensterilisasi tabung

yang berisi isolat biakan induk, dan biakan dari mikroorganisme lain
kemudian dipanaskan bibir tabung

5. Dimasukkan jarum ose bulat pada

medium biakan induk untuk inokulasi - pengambilan inokulum dengan
bakteri menggoreskan ujung bulat pada jarum
ke media biakan induk,
memungkinkan bakteri dapat terambil
banyak
6. Dipanaskan mulut tabung reaksi yang - berfungsi untuk mensterilisasi tabung
berisi isolat biakan induk, kemudian dan biakan dari mikroorganisme lain
segera ditutup dengan sumbat kapas

7. Setiap perlakuan di usahakan dilakuan - berfungsi agar saat inokulasi, bahan

secara aseptis (di dekat api bunsen) serta alat gelas yang digunakan tetap
steril

5. Digoreskan inokulum di permukaan - Media agar untuk bakteri digunakan

media agar di dalam tabung reksi yang media NA (Nutrien Agar), fungsi
telah disediakan menggunakan metode penggunaan medium NA karena
gores mulai dari sisi samping arah zig komposisinya yang terdiri dari ekstrak
– zag secara merata daging sapi di dalamnya yang
mengandung protein, karbohidrat,
vitamin, dan sedikit lemak, juga
terdapat adanya faktor pertumbuhan
yang tidak mampu disintesis
mikroorganisme
- Digunakan arah zig – zag agar
memungkinkan koloni yang terbentuk
tersebar merata, tampak jelas dan tidak
bertumpukan
6. Dipanas di sekeliling mulut tabung - berfungsi untuk mensterilisasi tabung
dan segera ditutup dengan sumbat reaksi dan biakan dari mikroorganisme
kapas lain

7. Disimpan inokulum ke dalam - sebagai tempat penyimpanan steril

inkubator pada suhu 370C , diamati cawan petri dengan menyeting suhu
dan difoto bentuk koloni yang optimun bakteri untuk tumbuh
terbentuk setelah diinkubasi selama 2x
24 jam dan 4 x 24 jam
8. Setelah diinkubasi selama 1x 24 jam
a. Sampel 1: - Terbentuk koloni bakteri dengan
jumlah yang tidak dapat dihitung,
terdapat goresan putih menyebar yang
nampak jelas.

b. Sampel 2:

- Koloni terbentuk dengan goresan putih

zig-zag agak menyebar

c. Sampel 3:

- Koloni terbentuk dengan goresan putih

zig-zag agak menyebar

9. Setelah diinkubasi selama 4x 24 jam

a. Sampel 1: - Terbentuk koloni bakteri dengan jumlah
lebih banyak dan sebagian dapat
dihitung, terdapat goresan putih
menyebar yang nampak jelas

b. Sampel 2:

- Koloni terbentuk dengan goresan putih

zig-zag agak menyebar
 c. Sampel 3:
- Koloni terbentuk dengan goresan putih
zig-zag agak menyebar

4.2. Pembahasan
Pada percobaan ini dilakukan inokulasi bakteri Escherichia coli pada medium agar
datar dan medium agar miring.

4.2.1. Inokulasi dengan Metode Gores (Medium Agar Datar)

Pada penggunaan metode gores dengan medium agar datar, mula –mula disiapkan
media biakan induk dari jenis mikroorganisme bakteri Escherichia coli.
Escherichia coli, atau biasa disingkat E. coli, adalah salah satu jenis spesies utama
bakteri gram negatif. E. coli banyak digunakan dalam teknologi rekayasa genetika. Biasa
digunakan sebagai vektor untuk menyisipkan gen-gen tertentu yang diinginkan untuk
dikembangkan. E. coli dipilih karena pertumbuhannya sangat cepat dan mudah dalam
penanganannya.
Biakan induk berada di tabung reaksi yang berisi media agar miring berwarna
kuning. Pada medium biakan induk, koloni bakteri tampak berwarna putih. Disediakan
sebuah cawan petri steril berisi medium agar padat (medium agar yang sebelumnya telah
dipanaskan, dituagkan pada cawan petri steril, kemudian didiamkan untuk proes
pendingina). Medium agar datar ini berwarna kekuningan, berfungsi sebagai tempat
menggoreskan bakteri dan tempat pertumbuhan koloni bakteri. Selanjutnya dipanaskan
jarum ose hingga membara, berfungsi untuk mensterilisasi jarum sebelum digunakan dari
mikroorganisme lain. Sumbat kapas tabung reaksi yang berisi isolat biakan induk dibuka,
kemudian dipanaskan bibir tabung, berfungsi untuk mensterilisasi tabung dan biakan dari
mikroorganisme lain. Kemudian dimasukkan jarum ose pada medium biakan induk dimana
yang digunakan adalah jarum ose bentuk bulat, pengambilan inokulum dengan
menggoreskan ujung bulat pada jarum ke media biakan induk, memungkinkan bakteri
dapat terambil banyak. Dipanaskan mulut tabung reaksi yang berisi isolat biakan induk,
berfungsi untuk mensterilisasi tabung dan biakan dari mikroorganisme udara lain. Setelah
itu tabung reaksi segera ditutup dengan sumbat kapas. Digunakan sumbat kapas disini
karena sifatnya yang dapat menyerap uap air, yang terjadi ketika masa inkubasi. Setiap
perlakuan diusahakan dilakukan secara aseptis (di dekat api bunsen) berfungsi agar saat
inokulasi, tidak ada mikroorganisme kontam. Sebelum inokulasi juga terlebih dahulu harus
diusahakan agar semua alat-alat yang digunakan dan medium benar-benar steril. Hal ini
untuk menghindari kontaminasi yaitu masuknya mikroorganisme yang tidak diinginkan.

Gambar 3. Metode Inokulasi pada Cawan Petri

Selanjutnya digoreskan inokulum di permukaan media agar di dalam cawan petri
yang telah disediakan dengan menggunakan metode gores mulai dari sisi samping secara
merata.
Media agar untuk bakteri digunakan media NA (Nutrien Agar), fungsi penggunaan
medium NA karena komposisinya yang terdiri dari ekstrak daging sapi didalamnya yang
mengandung protein, karbohidrat, vitamin, dan sedikit lemak, juga terdapat adanya faktor
pertumbuhan yang tidak mampu disintesis mikroorganisme. Ditutup cawan petri, dipanas
di sekeliling cawan petri dan diisolasi dengan selotip bening. Perlakuan ini berfungsi
untuk mensterilisasi cawan petri dari mikroorganisme lain. Disimpan inokulum ke dalam
inkubator dengan posisi terbalik, diamati dan difoto bentuk koloni yang terbentuk setelah
diinkubasi selama 2x 24 jam dan 4 x 24 jam. Posisi cawan petri diletakkan terbalik karena
selama inkubasi terbentuk air yang mengembun di dalam cawan petri. Air akan menetes
dari tutup cawan ke permukaan. Hal ini akan menghasilkan suatu masa pertumbuhan yang
menganak sungai dan menghancurkan pembentukan koloni secara individu. Untuk
menghindari hal ini, maka ketika diinkubasi, bagian bawah cawan petri diletakkan di atas
atau terbalik .
 Penggoresan inokulum pada media agar dilakukan untuk dua sampel. Sampel
pertama menggunakan goresan kuadran dan sampel ke 2 goresan T.

Goresan Kuadran Goresan T

Gambar 4. Metode Gores pada Cawan Petri

Dari hasil pengamatan 2 x 24 jam dapat dilihat tidak terbentuknya koloni bakteri
dengan tidak adanya goresan putih meyebar zig-zag pada permukaan medium NA, dengan
kata lain bakteri belum tumbuh pada jangka waktu ini.
Setelah diinkubasi selama 4x 24 jam koloni Escherichia coli masih juga belum
terbentuk, belum terlihat adanya streak putih zig-zag menyebar.
Berikut gambar perbandingan antara koloni bakteri Escherichia coli yang terbentuk
dari sumber referensi dibandingkan dengan hasil pengamatan :

-Terbentuk koloni (Anonim, 2008) -Hasil pengamatan 96 jam (tidak terbentuk koloni)
 Dari hasil pengamatan, pada kedua perlakuan dengan waktu yang berbeda, tidak
ditemukan koloni yang terbentuk. Tidak terbentuk koloni bakteri bisa disebabkan adanya
bahan kontaminan yang masuk saat inokulasi, penggunaan jarum ose belum benar – benar
steril / belum tersterilisasi secara keseluruhan.
Metode gores yang dilakukan pada percobaan ini dengan menggunakan cawan petri.
Cawan petri ini berfungsi berfungsi sebagai tempat madium agar datar untuk penanaman
mikroorganisme dan tempat isolasi. Keuntungan penggunaan cawan petri adalah untuk
memperoleh biakan dengan jumlah yang banyak dan lebih mudah untuk melihat morfologi
biakan.
Medium yang digunakan adalah Nutrient Agar yang sebelumnya dipanaskan agar
bisa membentuk medium. Agar lalu didinginkan dalam tabung reaksi hingga memadat dan
berwarna kuning muda sehinnga membentuk agar tegak. Medium agar tegak adalah
medium yang dibuat dalam tabung reaksi yang diletakkan tegak pada waktu pendinginan.
Keuntungan dari media agar tegak ini adalah luas permukaan besar sehingga memudahkan
untuk identifikasi sedangkan kerugiannya adalah peluang kontaminasi yang besar karena
luas permukaan yang lebar.

4.2.2. Inokulasi dengan Metode Gores (Medium Agar Miring)

Untuk penggunaan metode gores dengan medium agar miring, mula-mula disiapkan
media biakan induk dari jenis mikroorganisme bakteri Escherichia coli. Biakan induk
berada di tabung reaksi yang berisi media agar miring yang berwarna kuning. Pada
medium biakan induk, koloni tampak berupa sebaran/suspensi putih pada permukaan atas
media. Disediakan tiga buah tabung reaksi steril berisi medium agar padat. Medium agar
miring berwarna kekuningan berfungsi sebagai tempat menggoreskan jamur dan tempat
pertumbuhan koloni jamur. Jarum ose dipanaskan hingga membara berfungsi untuk
mensterilisasi jarum sebelum digunakan dari mikroorganisme lain. Sumbat kapas tabung
reaksi yang berisi isolat biakan induk dibuka, kemudian bibir tabung dipanaskan berfungsi
untuk mensterilisasi tabung dan biakan dari mikroorganisme lain.
Setelah itu, jarum ose dimasukkan pada medium biakan induk. Jarum ose bentuk
bulat untuk inokulasi bakteri. Pengambilan inokulum dengan menggoreskan ujung bulat
jarum ke media biakan induk, memungkinkan bakteri dapat terambil banyak. Mulut
tabung reaksi yang berisi isolat biakan induk dipanaskan kembali, berfungsi untuk
mensterilisasi tabung dan biakan dari mikroorganisme lain. Kemudian segera ditutup
dengan sumbat kapas Sumbat kapas lemak bertujuan agar keadaan mikroorganisme di
dalam tabung reaksi tetap steril, apabila ada kontaminan yang akan masuk, maka dapat
terserap dengan sumbat kapas tanpa dapat mempengaruhi mikroorganisme yang akan
dibiakkan.

Gambar 5. Teknik Inokulasi pada Media Miring

Setiap perlakuan diusahakan dilakukan secara aseptis (di dekat api bunsen)
berfungsi agar saat inokulasi, bahan serta alat gelas yang digunakan tetap steril. Inokulum
digoreskan di permukaan media agar miring di dalam tabung reksi yang telah disediakan
menggunakan metode gores mulai dari sisi samping arah zig-zag. Arah zig-zag digunakan
supaya memungkinkan koloni yang terbentuk tersebar merata dan tampak jelas serta tidak
bertumpuk dari koloni yang akan terbentuk. Dipanas di sekeliling mulut tabung dan
segera ditutup dengan sumbat kapas berfungsi untuk mensterilisasi tabung reaksi dan
biakan dari mikroorganisme lain. Inokulum disimpan ke dalam inkubator agar medium
dapat tumbuh pada wadah yang steril dengan menyeting suhu 370C sebagai suhu optimun
bakteri untuk tumbuh, kemudian diamati dan difoto bentuk koloni yang terbentuk setelah
diinkubasi selama 2x 24 jam dan 4 x 24 jam. Berikut gambar perbandingan antara koloni
bakteri Escherichia coli yang terbentuk dari sumber lain dengan hasil pengamatan

-Terbentuk koloni (Anonim, 2008) -Hasil pengamatan 96 jam (terbentuk koloni)

 Dari hasil pengamatan dapat dilihat mulai terbentuknya satu koloni bakteri dan
terdapat goresan yang nampak samar. Pada suatu percobaan pada umumnya bentuk koloni
yang terbentuk di medium agar miring adalah berwarna putih (dilihat dari tiga sampel yang
diamati).
Medium yang digunakan adalah larutan Nutrient Agar yang sebelumnya
dipanaskan agar bisa membentuk medium miring yang didinginkan hingga memadat
dengan memiringkan tabung reaksi sehinnga membentuk agar miring dan berwarna kuning
muda. Medium agar miring adalah medium yang dibuat dalam tabung reaksi yang
diletakkan miring pada waktu pendinginan.
Keuntungan media agar miring ini yaitu luas permukaan yang kecil sehingga
peluang kontaminasi rendah dan dapat memperluas bidang untuk digunakan strain murni
(indukan murni). Sedangkan kerugiannya hanya memuat sedikit mikroorganisme.
Media agar untuk bakteri digunakan media NA (Nutrien Agar) karena
komposisinya yang terdiri dari ekstrak daging sapi di dalamnya yang mengandung protein,
karbohidrat, vitamin, dan sedikit lemak, juga terdapat adanya faktor pertumbuhan yang
tidak mampu disintesis mikroorganisme. Medium NA berfungsi untuk membiakkan
berbagai macam mikroorganisme serta kultur bakteri. Medium NA dibuat atau disediakan
untuk medium bagi bakteri. Sedangkan medium NA yang instant merupakan media non
sintetik karena menggunakan bahan yang terdapat di alam biasanya tidak diketahui
kandungannya secara rinci. Struktur protein besar dan relatif insolubel yang mana hanya
sebagian kecil bakteri saja yang dapat langsung menggunakannnya, tetapi enzim yang
disebut pepton dapat mengurai protein menjadi rantai yang lebih kecil yang disebut pepton.
Bagian kecil dan solubel ini dapat dicerna oleh sebagian besar bakteri. Medium ini
memiliki komposisi kimia tertentu antara lain OXOID CMD003 Nutrient Agar, typcal
formula (g/l) yaitu :Lab-lemco powder 1.0, Yeast extract 2.0 (yang berfungsi sebagai
fermentor), Pepton 5.0 (sebagai sumber protein), Sodium Chlorida 5.0 (sebagai sumber
unsure S dan sumber garam mineral), Agar 15.0 (sebagai pemadat), Akuades
1000 ml, Ekstrak daging sapi : 3 gr, NaCl : 8 gr.
Pada praktikum ini kita mempelajari bagaimana melakukan teknik inokulasi biakan
mikroorganisme pada medium steril. Sehingga setelah melakukan serangkaian acara
praktikum ini dapat didefinisikan bahwa teknik inokulasi adalah pekerjaan memindahkan
bakteri dari medium lama ke medium baru dengan tingkat ketelitian sangat tinggi dan
dituntut sekali bekerja secara aseptik yaitu bebas dari pengaruh kontaminan
mikroorganisme pengganggu yang lain. Teknik aseptik dilakukan dengan penyediaan alat-
alat kerja yang steril dan bekerja di dekat api bunsen agar terhindar dari kontaminan udara.
Pada waktu inokulasi, jarum yang digunakan untuk memindahkan mikroba harus
dipijarkan di atas api segera sebelum dan sesudah melakukan pemindahan. Pemanasan ini
menghancurkan semua bentuk kehidupan yang ada pada permukaan jarum atau alat
pemindahan. Setelah diinokulasi, biakan bakteri disimpan atau diinkubasi dalam
lingkungan yang sesuai untuk pertumbuhan. Kumpulan dari sel-sel anakan akan tampak
dengan mata telanjang sebagai suatu kekeruhan dalam media cair atau populasi yang
terpisah yang disebut koloni pada media padat.

4.2.4 Esherichia coli

Escherichia coli adalah bakteri yang hidup dalam saluran usus manusia dan hewan
berdarah panas tetapi tidak pada ikan. Beberapa penelitian terdahulu menemukan bahwa
92,9 % Escherichia coli yang mencemari bahan makanan berasal dari tinja manusia.
Sehingga keberadaannya pada bahan makanan atau ikan segar menunjukkan adanya
ancaman kesehatan pada konsumen (manusia), sebab dapat diartikan bahwa bahan
makanan atau ikan telah tercemar oleh tinja manusia. Oleh karenanya maka, Escherichia
coli dipakai sebagai indikator cemaran yang berbahaya bagi manusia (Buckle, dkk. 1990).
Klasifikasi :
Superdomain:Phylogenetica
Filum:Proteobacteria
Kelas:GammaProteobacteria
Ordo:Enterobacteriales
Famili:Enterobacteriaceae
Genus:Escherichia
Spesies: E. coli

(Wikipedia, 2008)
 Escherichia coli merupakan mikroorganisme normal yang berasal dari kotoran
hewan atau manusia baik dalam kondisi sehat maupun sakit. Oleh karena itu, dikenal juga
dengan istilah koli tinja. Morfologi sel bakteri Escherechia coli berupa batang pendek (0,5-
1,0 X 1,0-3,0 µm), serta motil (sel-selnya peritrikus, yaitu flagela secara merata tersebar
diseluruh permukaan sel) dan ada juga yang non motil. Ciri-ciri biokimiawinya adalah
banyak sekali terjadi perubahan pada substrat. Keterangan ini memberikan cara-cara dasar
untuk membedakannya dengan yang lain. Habitatnya pada lingkungan aquatik, tanah,
makanan, air seni dan tinja (Pelczar, 1986).
Pada jurnal imiah analisa bakteri kloriform jenis E.coli pada air minum dilakukan
tes pelengkap menggunakan metode medium agar miring NA dengan jarum inokulasi
secara aseptik. Diinkubasi pada suhu 370C selama 1 x 24 jam. Bila hasilnya positif
terbentuk asam dan gas pada kaldu laktosa, maka sampel positif mengandung bakteri
Escherichia coli. Berdasarkan media agar miring NA, dibuat pewarnaan Gram dimana
bakteri Escherichia coli menunjukkan Gram negatif berbentuk batang pendek. Untuk
membedakan bakteri golongan koli dari bakteri golongan coli fekal (berasal dari tinja
hewan berdarah panas), pekerjaan dibuat Duplo, dimana satu seri diinkubasi pada suhu
370C (untuk golongan koli ) dan satu seri diinkubasi pada suhu 420C (untuk golongan koli
fekal). Bakteri golongan koli tidak dapat tumbuh dengan baik pada suhu 420C, sedangkan
golongan koli fekal dapat tumbuh dengan baik pada suhu 420C (Widiyanti et al, 2004).
 BAB V
KESIMPULAN

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan maka dapat diperoleh kesimpulan

bahwa teknik inokulasi merupakan teknik pemindahan bakteri ke dalam media dengan
perlakuan khusus untuk mempertahankan kemurnian biakan bakteri. Teknik inokulasi
dapat dilakukan dengan metode gores pada agar datar (streak plate method) dan metode
gores pada agar miring (streak plate method). Proses inokulasi harus benar-benar aseptik
atau steril supaya tidak terjadi kontaminasi oleh mikroorganisme lain. Pada hasil
pengamatan metode gores agar miring terlihat adanya garis zig-zag putih menyebar yang
menandakan koloni bakteri E.coli biakan tumbuh. Sedangkan pada metode gores agar datar
tidak ditemukan garis zig-zag putih yang menandakan belum tumbuhnya koloni bakteri
E.coli dan hal ini dapat dikarenakan oleh beberapa faktor penentu.
 DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 2008. www.google.com.images diakses pada tanggal 10 Nopember 2008 pukul

13.40 WIB

Anonim, 2008. www.wikipedia.com diakses pada tanggal 10 Nopember 2008 pukul 13.40
WIB

Buckle,K.A., J.A. Davey, M.J. Eyles, A.D. Hocking, K.G. Newton, and E.J. Stuttard.
1989. Foodborne Microorganisms of Public Health Significance. 4ed.. AIFST
(NSW Branch).Australia.

Cappuccino, J.G and N.Sherman. 1983. Microbiology: a Laboratory Manual. Adison-

Wesley Publishing company: California
Dwidjoseputro, D. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan : Malang.

Pelczar, M.1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi I. Erlangga : Jakarta.

Rohimat, I. 2002. Teknik Inokulasi Mycorrhizae arbuscular pada Bibit Jambu Mente.
Buletin Teknik Pertanian Vol.7 Nomor 2. Hal : 80-83.

Waluyo, L. 2005. Mikrobiologi Umum. MM Press: Malang.

Winarni, D. 1997. Diktat Teknik Fermentasi. Program Studi D3 Teknik Kimia FTI-ITS :
Surabaya.

Widiyanti, Ni Luh Putu Manik, Ni Putu Ristianti. Analisis Kualitatif Bakteri Koliform
Pada Depo Air Minum Isi Ulang Di Kota Singaraja Bali. Jurnal Ekologi
Kesehatan Vol 3 No 1, April 2004 : 64 - 73
 LAMPIRAN

Diskusi:
1. Mengapa pada saat dilakukan inokulasi bakteri pada media agar miring dimulai
dari dasar tabung menuju ke bagian atas tabung secara zig-zag?
2. Mengapa biakan yang baru diinokulasi harus disimpan dalam inkubator dalam suhu
tertentu?
Jawaban:
1. Supaya pertumbuhan bakteri tersebar pada seluruh bagian permukaan media dan
dilakukan secara zig-zag supaya pertumbuhan bakteri semakin banyak karena
penggoresan juga semakin banyak dan terjadi degradasi, pada akhir goresan akan
semakin jarang dan tampak bentukan koloninya.
2. Supaya biakan bakteri dapat tumbuh secara optimal sesuai dengan suhu yang
dibutuhkan. Karena tiap jenis bakteri membutuhkan suhu yang berbeda-beda dalam
pertumbuhannya, ada yang 1800C ada pula yang kurang dari 1000C.