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8.- Determinacion de Proteinas Sericas

8.- Determinacion de Proteinas Sericas

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Que el estudiante aprenda a manejar métodos colorimétricos en la determinación de proteínas
Que el estudiante aprenda a manejar métodos colorimétricos en la determinación de proteínas

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PRÁCTICA # 8
“ 
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS SERICAS TOTALES POR EL MÉTODO DE BIURET”
OBJETIVO
Que el estudiante aprenda a manejar métodos colorimétricos en la determinación de proteínas
INTRODUCCIÓN
Las proteínas son compuestos a base de carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno y generalmente azufre y fósforo. Elelemento característico es el nitrógeno. Todas las enzimas, algunas hormonas y muchos componentes estructuralesimportantes de la célula son proteínas.Las moléculas de proteína son muy grandes y contienen miles de átomos; su estructura es extremadamente compleja.Gran parte de las proteínas intracelulares son enzimas, sustancias que regulan la rapidez con que se han de tener numerosas reacciones celulares.Las moléculas de proteína están formadas por componentes más simples llamados aminoácidos. Puesto que cadaproteína puede tener cientos de aminoácidos combinados en ciertas proporciones y orden es posible una variedadprácticamente infinita de moléculas de proteína. Se han ideado métodos de análisis para reconocer la disposición exactade aminoácidos en una molécula proteínica. La insulina, hormona secretada por el páncreas y utilizada en eltratamiento de la diabetes, fue la primera proteína cuya estructura se conoció. La ribononucleasa, secretada por elpáncreas, fue la primera enzima de la cuál se conoció el orden exacto de aminoácidos.Pueden distinguirse varios niveles de organización en la molécula de proteína. El primer nivel es la llamada estructuraprimaria, que depende de la serie de aminoácidos en la cadena de polipéptidos. Esta serie, está determinada a su vez,por la serie de nucleótidos de RNA y DNA del núcleo de la célula. Un segundo nivel de organización de las moléculasproteínicas supone la adopción de la forma de hélice u otra configuración regular por la cadena de polipéptidos. Estascadenas ordinariamente no se encuentran planas en una molécula de proteína, sino que adoptan formas espiralazaspara dar una estructura tridimensional. Una de las estructuras secundarias comunes de las moléculas proteínicas es elhélice en
α
, que se supone una formación espiralaza de la cadena de polipéptidos básica. La hélice en
α
es unaestructura geométrica muy uniforme con 3.6 aminoácidos que ocupan cada vuelta de la hélice. La estructura helicoidales determinada y mantenida por la formación de enlaces de hidrógeno entre residuos de aminoácidos en vueltassucesivas de espiral.Un tercer nivel de estructura de moléculas proteínicas es el desdoblamiento de la cadena de péptidos sobre sí mismapara formar proteínas globulares. De nuevo enlaces débiles como enlaces de hidrógeno, iónicos e hidrofóbicos seforman entre una parte de la cadena de péptidos y la otra parte, de modo que la cadena se desdobla de una maneraespecífica para dar una estructura general específica de la molécula proteínica. Enlaces covalentes como los dedisulfuro (-S-S-) son importantes en la estructura terciaria de muchas proteínas. La actividad biológica de una proteínadepende en gran parte de la estructura primaria específica que es mantenida junta por esos enlaces.Cuando una proteína se calienta o trata con cualquiera de una variedad de productos químicos, se pierde la estructuraterciaria. Las cadenas de péptidos espiralazas se desdoblan para dar una configuración aleatoria acompañada por unapérdida de la actividad biológica de la proteína. Este cambio se llama
“desnaturalización
”.Los 20 aminoácidos aminados que suelen encontrarse en las proteínas poseen todos un grupo amino (-NH
2
) y un grupocarboxílico (-COOH), pero sus cadenas laterales son distintas. El mas simple de todos, la glicina, tiene como cadenalateral un H; la alanita, un grupo –CH
3
. El grupo amino permite al aminoácido aminado actuar como base y combinarsecon ácidos; el grupo ácido, le permite combinarse con las bases.Los aminoácidos y las proteínas sirven de
amortiguadores
y pueden resistir a cambios de acidez y alcalinidad. Losaminoácidos se unen entre sí para formar proteínas mediante un
enlace peptídico
entre el grupo amino de una moléculay el grupo carboxilo de la otra.Los aminoácidos puros obtenidos de las proteínas tienen sabor dulce. Cuando se ingieren proteínas son hidrolizadas aaminoácidos antes de ser absorbidas a la corriente sanguínea. Los aminoácidos son llevados a todas las regiones delorganismo, donde sirven para la elaboración de nuevas proteínas, o son metabolizados para liberar energía. Lasproteínas tienen importancia primordial como componentes estructurales de las células y como constituyentesfuncionales de enzimas y algunas hormonas, pero pueden servir también como combustible para producción de energía.Los aminoácidos pierden primero su grupo amino por una reacción enzimática llamada
desaminación.
El grupo aminoreacciona con otras sustancias para formar urea, que se excreta. El resto de la molécula puede transformarse por unaserie de fases intermedias en glucosa, que se utiliza pronto como combustible, o almacenarse como glucógeno.
 
Las plantas pueden sintetizar todos los aminoácidos a partir de sustancias simples. Los aminoácidos que los animalesno pueden sintetizar y que deben obtener en su alimentación se llaman
aminoácidos esenciales.
Debe comprenderseque estos aminoácidos no son más esenciales que otros; sólo lo son respecto a la alimentación, pues no es posiblesintetizarlos.
Identificación de aminoácidos y proteínas:
Reacción de NinhidrinaReacción para la detección de aminoácidos, actualmente acoplada asistemas de valoración automática Tiene como objetivo detectar ycuantificar cantidades de aminoácidos libres. Los aminoácidos, engeneral reaccionan con la ninhidrina cuando son calentados con unexceso de la misma. Todos los aminoácidos que poseen un grupoamino libre reaccionan y forman dióxido de carbono, amoníaco y unaldehído que contiene un átomo de carbono menos que el compuestooriginal. Esta reacción da lugar a la formación de un producto color azul o rpura (que posteriormente puede ser utilizado paracuantificar el amincido). En el caso de la prolina, queestructuralmente no posee el grupo amino libre, sino un grupo imino,la coloración final es amarilla. El amoníaco, la mayoa de lospolipéptidos y las proteínas pueden desarrollar coloración en estareacción, pero a diferencia de los aminoácidos, no liberan CO
2
. Lacoloración azulada o violeta será proporcional a la concentración delaminoácido.La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) es un oxidante energéticoque por una desaminación oxidativa de los aminoácidos conduce a laformación del aldehído correspondiente, con liberación de amoniaco ygas carbónico y formación de la ninhidrina reducida o hidrindrantina.La molécula de hidridantina, en presencia de otra de ninhidrina,condensa a través del amoniaco produciendo una estructuradenominada indanona o púrpura de Ruhemann, manifestando uncolor rojizo, excepto para la prolina, hidroxiprolina y en menor medidapara la histidina. Presenta su máximo de absorbancia a los 570 nm, exceptuando los tres aminoácidos reseñadosanteriormente.
Reacción de BiuretEl nombre de la reacción procede del compuesto coloreado formado por lacondensación de dos moléculas de urea con eliminación de amoníaco. Estareacción está dada por aquellas sustancias cuyas moléculas contienen dos gruposcarbamino (-CO.NH) unidos directamente o a través de un solo átomo de carbonoo nitrógeno. El reactivo de Biuret contiene Cu
2
SO
4
en solución acuosa alcalina(gracias a la presencia de NaOH o KOH). La reacción se basa en la formación deun complejo de coordinación entre los iones Cu
2+
y los pares de electrones nocompartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos. Esta últimareacción provoca un cambio de coloración: violeta púrpura o violeta rosado. Debeseñalarse que el color depende de la naturaleza de las proteínas; proteínas ypéptidos dan un color rosado; la gelatina da un color azul
Reacción de MillónLa reacción del Millón se debe a la presencia del grupo hidroxifenilo en la molécula proteica. Cualquier compuestofenólico que no esté sustituido en la posición 3,5 como la tirosina, el fenol y el timol producen resultados positivos enesta reacción. De estos compuestos, sólo la tirosina está presente en las proteínas, de manera que sólo las proteínasque tienen este aminoácido ofrecen resultados positivos.En esta prueba los compuestos mercúricos en medio fuertemente ácido (ácido nítrico del reactivo) se condensan con elgrupo fenólico formando un compuesto de color rojo ladrillo o rojizo. La prueba no es satisfactoria para soluciones quecontienen sales inorgánicas en gran cantidad, ya que el mercurio del reactivo del Millón es precipitado y se vuelvenegativo, razón por la cual este reactivo no se usa para medir albúmina en orina. Debe tomarse en cuenta que en elcaso de que la solución a examinar sea muy alcalina, debe ser previamente neutralizada, ya que el álcali precipitaría al
2
 
ion mercurio en forma de óxidos amarillos. Además, proteínas como la ovoalbúmina producen un precipitado blanco queprogresivamente por acción del calor se torna rojo; pero las peptonas dan solamente una solución de color rojo.
Reacción de XantoproteicaEsta prueba caracteriza a los aminoácidos aromáticos (tirosina, fenilalanina, triptófano. Esta reacción se debe lapresencia de un grupo fenilo en la molécula proteica. Los complejos de la molécula proteica que son de importancia enesta reacción son la tirosina y el triptófano. La fenilalanina no reacciona en las condiciones que se realiza en ellaboratorio. Para esta prueba se produce la nitración del anillo bencénico presente en los aminoácidos obteniéndosenitrocompuestos de color amarillo, que se vuelven anaranjado en medio fuertemente alcalino (formación de ácidopicrámico o trinitrofenol). No puede realizarse esa reacción para identificar albúmina en orina, por el color anaranjado dela reacción final. Las proteínas que tienen en su composición estos aminoácidos también darán la reacción. Lapositividad se reconoce por la aparición de un color amarillo o verde debido a la formación de nitrocompuestos.
Prueba de los grupos SH:Es una prueba para identificar aminoácidos azufrados y las proteínas que loscontienen, se reconocen por la formación de una coloración negra o gris.
Prueba de SakaguchiEsta prueba es positiva para compuestos que contengan el grupo guanidinio como la arginina yaque casi todas las proteínas poseen ese aminoácido.El reactivo que se utiliza contiene α-naftol ehipoclorito sódico, en medio alcalino. La aparición de una coloración roja es indicativa de una reacción positiva. Eldesarrollo de un color rojo marca la reacción positiva y se debe a la presencia del grupo guanidina, que caracteriza laarginina.
Prueba de Hopkin-ColeImplica la reacción del grupo indol del triptofano con el ácido glioxílico y las proteínas que locontienen, en presencia de ácido sulfúrico concentrado. La positividad se reconoce por laaparición de un anillo color violeta-rojizo.
Prueba de JafféSi acontece la aparición de una coloración roja, se tratará de una prueba positiva para lacreatinina. Puede ser leída a 520 nm, detectándose hasta 5 μg/mL.
Prueba de coagulación:Es una prueba para identificar: albúminas, globulinas, glutelinas y prolaminas. La positividad se manifiesta por laformación de un coágulo. No se conoce exactamente el mecanismo de reacción, se cree que ocurre ciertadeshidratación de la molécula proteica.
Prueba de Sulfato de amonio:Las proteínas, como otros coloides son precipitadas por soluciones concentradas de sales de amonio [NaCl. (NH
4
)
2
SO
4
y NaSO
4
]. Aparentemente la precipitación se debe a la neutralización y deshidratación de la molécula, seguida deagregación y precipitación.
Reacción de EhrlichLa presencia de anillos aromáticos fenólicos o nitrogenados en la cadena lateral de los Aminoácidos se puede identificar mediante la reacción con ácido sulfanílico y nitrito de Sodio por formación de sales de Diazonio fuertemente coloreadaspermitiendo así detectar la presencia de Tirosina e Histidina libres o formando péptidos y proteínas.
Reacción con acetato de Plomo alcalinoLos Amincidos azufrados como Metionina, Cisteina y Cistina se reconocen por la formacn deprecipitados de Sulfuro de Plomo de color gris oscuro o negro que se forman cuando reacciona con Acetato de Plomoen medio alcalino.
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