Identificacin de Staphylococcus aureusy Staphylococcus coagulasa-negativa en un caso de Otitis Externa en canino

C.Cabrera1, K. Jimnez1, C. Noriega1, X. Olivares1

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Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Pedro de Valdivia, La Serena, Chile.

RESUMEN: La otitis externa es causada comnmente por infecciones de la flora bacteriana normal cuando se sobrepasan las barras de defensa. A partir de un canino de 10 aos con episodios intermitentes de OE, se realiza una toma de muestras, siembra, aislamiento para poder identificar el agente patgeno implicado. Se realiz tincin de Gram y se aplicaron las siguientes pruebas bioqumicas: Catalasa, O-F, Coagulasa, Voges Proskauer, Oxidasa, Antibiograma. El anlisis revela la presencia de Staphylococcus aureus y Staphylococcus coagulasanegativa en la muestra. PALABRAS CLAVE: Staphylococcus aureus, Staphylococcus coagulasa-negativa, Otitis Externa, Canino. ABSTRACT: The External Otitis is commonly caused by infection of normal bacterial flora when exceed the defend barrier. From a 10 years dog, with constant episodes of OE, we take a simple sowing isolation of pathogen agent involved. Gram staining was performed and applied the following biochemical test: Catalase, O-F, Coagulase, Voges Proskauer, Oxidase, Antibiogram. The analysis reveals the presence of Staphylococcus aureus and Coagulase-negative Staphylococcus in the sampling. KEY WORDS: Staphylococcus aureus, Coagulasenegative Staphylococcus, Otitis Externa, Canid.

infecciones de odo representan una de las principales razones por la que los perros se presentan al veterinario, y puede afectar alrededor del 20% de ellos (Carlotti, 1991 c.p. Lozina, 2010). Es una de las enfermedades ms comunes que afectan perros de diferente gnero, edad y raza. Se ha observado que los machos son ms susceptibles a la OE que las hembras. (Lozina et al, 2010). Al igual que toda la piel, el conducto auditivo externo tiene una flora bacteriana normal y permanece libre de la infeccin si no se interrumpen sus defensas. Cuando se produce la interrupcin, esta flora patgena (antes normal) se desarrolla (Sander, 2001). Las formas de otitis externa segn Prez (1995) normalmente son de origen bacteriano, siendo los grmenes patgenos ms comnmente observados Pseudomonas, Staphylococcus y Proteus. Sin embargo, puede encontrarse hongos como aspergillus y cndida. Los factores ambientales como altas temperaturas y humedad pueden influenciar la incidencia de OE en perros (Carlotti, 1991).

Introduccin La Otitis Externa (OE), comnmente conocida como infeccin del odo, es una condicin caracterizada por inflamacin del canal exterior. Las

Lozina en su experiencia en 2010 encontr que los microorganismos ms frecuentes aislados en medios de cultivo fueron: Malassezia pachydermatis (54.2%), Staphylococcus aureus (43.8%), Staphylococcus coagulasa-negativa (25.0%), Pseudomonas aeruginosa (20.8%), Candida albicans (18.8%), Proteus mirabilis (16.7%), Streptococcus spp. (16.7%), Enteroccocus faecalis (12.5%), Escherichia coli (12.5%), Staphylococcus intermedius (6.3%), Klebsiella spp. (4.2%), y Candida glabrata (2.1%). Aunque la flora microbiana de la oreja de perros se ha estudiado y algunos autores intentado correlacionar los signos de la enfermedad con un agente etiolgico, la identificacin en laboratorio del agente es generalmente aceptada (Kowalski, 1988 c.p. Silva, 2001). A partir de un canino de 10 aos de edad que presenta cuadros intermitentes de OE caracterizada por eritema y descamacin del pabelln auricular sin exudado y rascado frecuente de la oreja, se extrajeron muestras para realizar siembra, aislamiento e identificacin bacteriana. Material y mtodo Se realiz la toma de muestras con dos trulas estriles desde el pabelln auricular enrojecido de un can de 10 aos (Figura 1) que ha presentado en el pasado episodios de otitis. Las

trulas fueron colocadas en Medio de Transporte AMIES sin/con carbn activado (para G -) y Cary Blair (G+). Estos medios semislidos tienen un ph regulado y son esencialmente una mezcla de sustancias tamponadas que carecen de factores de crecimiento. Alrededor de 4 hrs ms tarde, se realiz una siembra desde Cary Bair en estra en Agar Triptona y Soja (TSA), y desde AMIES en TSA y Agar McConkey (MCK).

Figura 1: Toma de muestra desde pabelln y conducto externo de canino

24 hrs ms tarde, se evidenci crecimiento slo de la siembra realizada desde Cary Blair, Presumiendo la presencia de bacterias gram positivas, se realiza una siembra por agotamiento en Agar Sangre (AS) para aislar la bacteria. Despus de 24 hrs de incubacin, se realiz tincin de Gram (Cristal Violeta 1, Lugol 1, Alcohol-acetona 5, Safranina 30) desde el medio AS. Se visualiz la muestra en microscopio, determinndose la presencia de Staphylococcus. Luego, de acuerdo a las instrucciones del Manual de

Microbiologa de Medicina Veterinaria, se realizaron las siguientes pruebas bioqumicas de resultados inmediatos: Catalasa, Coagulasa; y OF. 24 hrs ms tarde, se recopilaron los resultados de las pruebas realizadas el dia anterior. Luego, se procedi a la realizacin de Antibiograma a travs del Mtodo de Kirby-Bauer, realizndose para esto una siembra en Mller Hinton Broth (MHB) con una concentracin de bacterias segn estndar 0,5 Mac Farland. Seguidamente, se realiz un csped microbiano desde MHB con una trula. Luego, se procedi a colocar los sensidiscos con correspondientes a los antibiticos Novobiocina (NO5) y Bacitracina (B10). Tambin se realiz la prueba de la Ureasa. Los resultados se recopilaron 24 hrs ms tarde (Tabla 1) y se realiz resiembra en AS. 72 hrs ms tarde, ante la presuncin de contaminacin, se realiz nuevamente siembra por aislamiento en AS. 24 hrs despus, a partir de una colonia aislada en AS, se realiz tincin de Gram, prueba de la Ureasa y Antibiograma con Novobiocina (NO5), Bacitracina (B10) y Vancomicina (VA30). Finalmente, se realiz cultivo en RMVP y 72 hrs despus se realiz la prueba de Voges Proskauer. Resultados Despus del aislamiento de la bacteria en medio AS, la observacin de la muestra en microscopio teida

con Gram revel bacterias azules de forma esfrica, agrupadas en racimo, y algunas agrupadas como diplococos (Figura 2). El crecimiento de stas en AS fue en forma de colonias esfricas que presentaron -hemolisis, que con el pasar de los das se haca ms notoria y se pigmentaba de color amarillo (Figura 3).

Figura 2: Observacin de la muestra con tincin de Gram al microscopio

En cuanto a las pruebas bioqumicas, la se observ la formacin inmediata de burbujas durante la prueba de la catalasa; xidofermentacin positiva en tubo abierto como el sellado con vaselina estril, evidenciando la presencia de una bacteria anaerobia facultativa; Coagulasa negativa; Ureasa positiva dbil (color anaranjado) luego de 24 hrs de incubacin y positivo a las 48 hrs, (color magenta). El antibiograma arroj halos de inhibicin de 16 mm (S) y 10 mm (S) de dimetro para Novobiocina y Bacitracina respectivamente. Los resultados de estas pruebas bioqumicas se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1: Resultados de Pruebas Bioqumicas n1

Prueba Prueba de la Catalasa OxidoFermentacin de la Glucosa Prueba de la Coagulasa Ureasa

Figura 3: Observacin de hemlisis en medio AS con 48 hrs de incubacin

Resultado Catalasa + xidoFermentacin positiva Coagulasa 24 hrs: Positivo dbil 48 hrs: Positiva NO5: 16 mm B10: 10 mm

Antibiograma

Las segundas pruebas se realizaron presumiendo la no obtencin de un cultivo aislado: la prueba de la OxidoFermentacin arroj como resultado negativa para ambos tubos; en la Coagulasa no se observ formacin de coagulo propiamente tal, sin embargo, se observ cierta formacin extraa; Ureasa negativa, evidenciada por la coloracin amarilla del tubo. El Antibiograma arroj halos de inhibicin de 26 mm (S), 16 mm (S) y 17 mm (S) de dimetro para Novobiocina, Bacitracina y Vancomicina respectivamente. Los resultados de estas pruebas se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2: Resultados de Pruebas Bioqumicas n2

Prueba OxidoFermentacin de la Glucosa Prueba de la Coagulasa Ureasa Antibiograma

Resultado xidoFermentacin negativa Coagulasa 24 hrs: negativa 48 hrs: negativa NO5: 26 mm B10: 16 mm VA30: 17 mm

Discusin Los cocos gram positivos son un grupo heterogneo de bacterias. Las caractersticas que tienen en comn son su forma esfrica, su reaccin a la tincin de Gram. Si un aislamiento se identifica como una especie de estafilococo o se sospecha con firmeza que esa es su identidad, se realiza una prueba para determinar la produccin de coagulasa a fin de diferenciar S. aureus de las otras especies que reciben el nombre colectivo de estafilococos coagulasanegativa o no productores de coagulasa (Forbes, 2009). El Staphylococus aureus es uno de los grmenes que puede verse como agente etiolgico de la OE. Su principal caracterstica para identificacin es ser coagulasa positivo y presentar -hemlisis. Segn Sardias y col. (2006), slo es infeccioso cuando se encuentran en gran nmero y habitualmente

requiere una disrupcin de las barreras del husped para penetrar. El cultivo rara vez produce falsos negativos en las infecciones por estafilococos. Ante cualquier caso de sospecha, se debe incluir el antibiograma para guiar el tratamiento si es necesario. Presenta colonias de 1 a 3 mm de dimetro, lisas, levemente elevadas, de bordes enteros, levemente convexas y generalmente pigmentadas con un color crema-amarillo. La produccin de pigmento se ve favorecida si se incuban los cultivos por 24-48 hrs. adicionales a temperatura ambiente. S. epidermidis presenta colonias generalmente de menor tamao y estas no presentan pigmentacin. Pottumarthy et. al. (2004) indica que Staphylococcus intermedius exhibe propiedades fenotpicas propias de S. aureus y S. epidermidis, intermedias. Es coagulasa-positivo y presenta hemolisis. Descartamos la presencia de este estafilococo dado el resultado de la prueba de Vogues Proskauer que sirve para diferenciar S. aureus (positiva) de S. intermedius y S. hycus (negativo). Los papeles desempeados por los diferentes microorganismos patgenos y saprfitos implicados en la otitis externa son claros (Silva, 2001). Sin embargo, hay pocos informes acerca de la importancia de los estafilococos coagulasa negativos en otitis y lesiones cutneas caninas (Acosta et al., 1992 c.p. Silva, 2001).Los estafilococos

coagulasa negativos son las bacterias ms comnmente aisladas en los laboratorios microbiolgicos. Entre ellos S. epidermidis, que se caracteriza por ser coagulasa negativo y Novobiocina sensible. Al ser un comensal habitual de la piel, la distincin entre infeccin y contaminacin puede resultar en ocasiones difcil. Lilenbaum et al. (2000), c.p.Lozina (2010) reportan que los Staphylococcus coagulasa-negativos son las bacterias aisladas ms comunes en exudados de odo de perros con OE, pero el can en observacin no presentaba tal estadio avanzado de otitis. Presumimos que el resultado negativo para la prueba de la Coagulasa se debe a la contaminacin del cultivo con algn Staphyloccoccus coagulasa-negativo. Esto se apoya con el resultado de los Antibiogramas, dado que S. epidermidis es sensible a la Novobiocina, en cambio S. aureus presenta resistencia para sta, pero es sensible a la Bacitracina. Algunos estafilococos son ureasa positivos, incluidos S. epidermidis (coagulasa-negativo), S. intermedius y la mayora de las cepas de S. saprophyticus (Winn et. al., 2008). Conclusin La presencia de S. aureus en cultivos es comn. Pertenece a la flora nativa del cuerpo y eventualmente puede causar infecciones en la piel, como foliculitis, fornculos, imptigo y

celulitis, que se limitan a una pequea rea de la piel. Los estafilococos coagulasa negativos son un grupo de microorganismos frecuentes en la piel, causa de infecciones nosocomiales sobre todo en recin nacidos de bajo peso y pacientes inmunocomprometidos. La causa especfica de la otitis externa puede determinarse por cultivo de material obtenido del conducto auditivo afectado; no obstante, debe tenerse en cuenta que la contaminacin superficial y la flora cutnea normal pueden originar cultivos mixtos que son origen de confusin. Bibliografa lvarez, H., Santanana, J., Castillo, L., Garca, E., & Mara, . (2010). Comportamiento de la otitis externa en pacientes diabticos. AMC [online], 14(5), 0-0. Forbes, B., Sahm, D., & Weissfeld, A. (2009). Diagnstico Microbiologico. Buenos Aires: Editorial Mdica Panamericana. Gorrotxategi, P., & Manterola, J. (2011). Otitis externa por Staphylococcus aureus resistente a meticilina en un lactante. Pediatria de Atencin Primaria(13), 585-90. Lozina, L., Peichoto, M., Boehringer, S., Koscinczuk, P., Granero, G., & Acosta, O. (2010). Efficacy of Argentine propolis formulation for topical treatment of canine otitis externa. Arquivo Brasileiro

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