[2010]

[Type the document title]

[Rekayasa Genetika]
[KIM 451 Modul Kuliah]
[Modul ini memuat materi perkuliahan di Jurusan Kimia FMIPA UNILA tentang Rekayasa Genetik terutama mengenai definisi, teknik, dan hal-hal yang terkait dengan pekerjaan DNA Rekombinan.]

by Mulyono, Ph.D
[Dosen Jurusan Kimia FMIPA UNILA : Blog : http://blog.unila.ac.id/mulyono/]

Modul Kuliah : Rekayasa Genetika (KIM 451)

Rekayasa Genetika
By Mulyono, Ph.D.

Pretest Sebelum anda mempelajari lebih lanjut matreri perkuliahan ini, sangat disarankan bagi anda untuk menyegarkan kembali ingatan anda akan beberapa hal di bawah ini : a. Pengertian asam nukleat b. Struktur DNA dan Kode Genetik c. Pengertian kromosom Gen d. Transkripsi dan Translasi DNA ke Protein

A. PENDAHULUAN

Perkembangan ilmu pengetahuan mengenai pengkajian material biologi pewaris keturunan pada satu abad terakhir ini berkembang dengan sangat pesat. Pengendali sifat genetis ini (asam nukleat) di dalamnya mengandung banyak gen, yaitu suatu bagian molekul DNA yang menyandikan suatu protein tertentu. Sejak dikeluarkanya hukum Mendel pada tahun 1900-an, pengembangan sains yang ditujukan untuk memahami bagaimanakah sesungguhnya gen-gen dalam kromosom/asam nukleat suatu organisme bekerja, terus dilakukan. Inisiasi awal bermula dari pernyataan ilmiah W. Sutton (1903) bahwa gen terletak di dalam kromosom. Hal ini kemudian diteliti lebih lanjut oleh T.H. Morgan (1910), ng akhirnya Morgan bersama koleganya berhasil mengembangkan teknik pemetaan gen (gene mapping), dan pada 1922 memperoleh data analisis komprehensif posisi relatif kurang lebih 2000 gen pada kromosom lalat buah, Drosophila melanogaster. Studi mengenai genetika tersebut terus berlanjut, namun pendalaman hingga tingkat molekul gen itu sendiri dan baru terkuak mulai tahun 1940-an. Hal ini bermula dari eksperimen Avery, MacLeod, dan McCarty pada 1944, dan eksperimen Hersey dan Chase pada tahun 1952, sejak masa itu fungsi DNA sebagai material genetik dan konsep terbentuknya protein dari gen pada asam nukleat, menjadi semakin jelas. Peneltian selanjutnya dilakukan oleh peneliti-peneliti seperti Chargaff, Crick, dan Monod, memberikan kontribusi cukup besar perkembangan ilmu genetika. Pada 14 tahun antara 1952 1966 sturktur DNA telah berhasil dielusidasi, kode genetik pun telah dipecahkan, dan proses transkripsi dan translasi berhasil diungkapkan. Sejak saat itulah pengembangan ilmu Biologi Molekuler/DNA rekombinan/Rekayasa Genetika berkembang dengan cukup pesat. Kajian ilmu tidak dapat berdiri sendiri, namun memerlukan kajian ilmu-ilmu lain seperti biologi, mikrobiologi, kimia, biokimia, elektro, teknik kimia dan bioproses, teknik mesin dan lain sebagainya.

Mulyono, Ph.D. http://blog.unila.ac.id/mulyono/

Modul Kuliah : Rekayasa Genetika (KIM 451)

Definisi DNA Rekombinan / Rekayasa Genetika Istilah yang dipakai untuk kajian molekuler pada tingkat DNA untuk memanipulasi gen, yang umumnya dilakukan di luar proses reproduksi alamiah suatu mikroorganisme. Hal ini meliputi isolasi, manipulasi, dan pemasukan kembali DNA hasil rekayasa kedalam sel atau organinsme model. Tujuan dari rekayasa genetika adalah: (a) Untuk menghasilkan suatu protein tertentu sebagaimana yang diinginkan. (b) Untuk mengenalkan/memasukkan suatu karakteristik baru secara fisiologi pada organisme tertentu, misalnya : tanaman tahan hama ataupun buah yang tahan busuk dlsb. Beberapa contoh kegiatan yang telah berhasil dalam rekayasa genetika dan bahkan telah dipalikasikan dalam skala indusri adalah pembuatan hormon insulin manusia menggunakan mikroba bakteri.

B. CAKUPAN UMUM Hal-hal yang akan dikupas dalam pengetahuan DNA Rekombinan / Rekayasa Genetika, khususnya eksperimen kloning gen adalah sebagai berikut : (a) Penyiapan molekul DNA kromosom yang mengandung gen yang akan di-kloning. (b) Pemotongan molekul DNA kromosom, untuk memperkecil ukurannya serta analisa ukuran hasil pemotongan. Pemotongan ini diatur sedemikian hingga fragment molekul DNA (gen) yang dikehendaki tidak terpotong. (c) Peng-insersi-an Fragment DNA yang mengandung suatu gen yang akan diklon ke suatu molekul DNA sirkular (disebut dengan vektor) untuk menghasilkan suatu molekul DNA rekombinan (chimaera). (d) Bagaimana memasukkan (insersi/transformasi) molekul DNA rekombinan kedalam sel inang (host cell), umumnya bakteri atau sel hidup lainnya. (e) Bagaimana menumbuhkan sel hasil transformasi pada suatu medium untuk dapat diseleksi lebih lanjut nantinya. (f) Bagaimana vektor dengan gen terinsersi (molekul DNA Rekombinan) menggandakan diri menghasilkan sejumlah kopi yang sama. (g) Bagaimana sel inang membelah diri dan tentunya dengan mengkopi juga seluruh molekul DNA rekombinan yang ada di dalam sel-nya. (h) Setelah sejumlah kali ulangan pembelahan, suatu koloni, atau klon dengan kandungan molekul DNA rekombinan yang sama akan dihasilkan. (i) Setelah itu bagaimana memilih diantara koloni-koloni sel yang tumbuh, 1 atau lebih yang mengandung DNA rekombinan yang dimaksud. (j) Bagaimana mendapatkan (mengisolasi) DNA rekombinan dari sel pembawanya untuk diteliti lebih lanjut semisal ditentukan urutan DNA-nya, dan untuk di-insersi-kan ke dalam vektor ekspresi sehingga dapat diproduksi lebih banyak.

Mulyono, Ph.D. http://blog.unila.ac.id/mulyono/

Modul Kuliah : Rekayasa Genetika (KIM 451)

Hal-hal pokok dalam Kloning DNA Menurut Brown (1990) setidaknya ada 6 hal dasar yang harus difahami dan dikuasai untuk melakukan kegiatan eksperimen kloning gen, yang meliputi : Penyiapan sampel DNA kromosom murni Pemotongan molekul DNA Analisa ukuran fragment DNA hasil pemotongan Penggabungan molekul DNA dengan vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan e) Pengenalan (insersi) DNA ke dalam sel host f) Identifikasi sel yang mengandung molekul DNA rekombinan Secara umum gambaran kegiatan kloning dapat dilihat pada cuplikan video pembelajaran dari McGraw Hill, berikut ini : http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120078/micro10.swf Bahan kuliah yang lain dapat di unduh pada : http://ocw.mit.edu/OcwWeb/hs/biology/e/5/5.htm Urgensi Kloning Gen Alasan mengapa kloning gen sangat penting dikarenakan kloning dapat memberikan hasil sampel murni suatu gen tertentu, yang terpisah dari keseluruhan gen-gen lain yang umumnya mereka tergabung bersama dalam sel. Sebagai ilustrasi, seperti yang tersaji dalam cuplikan video di atas, fragment DNA yang akan diklon dapat merupakan bagian dari campuran berbagai fragment lain yang mengandung gen-gen lain. Gabungan gen-gen itulah yang menyusun keseluruhan sistem molekuler organisme tertentu. Dalam praktiknya, a) b) c) d)

Situs untuk mengetahui data gen tertentu dapat dilihat di : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene

Mulyono, Ph.D. http://blog.unila.ac.id/mulyono/

Modul Kuliah : Rekayasa Genetika (KIM 451)

Bab I Pemurnian Asam Nukleat dari Sel Hidup

Ada tiga jenis asam nukleat yang umumnya harus disiapkan sebelum kegiatan Kloning Gen. Pertama adalah total DNA (DNA Kromosom) yang umumnya adalah sumber gen yang akan diklon. DNA kromosom ini umumnya dipilih dari mikroba yang telah diketahui memiliki suatu enzim dengn keunggulan tertentu dan telah diketahui karakteristik biokimia-nya. DNA kromosom dapat berasal dari bakteri, tanaman, sel hewan, atau organisme apa saja.

Kedua, adalah DNA plasmid (pembahasan lebih lanjut pada Bab II). Molekul DNA
plasmid merupakan DNA lingkar, dengan ukuran yang kecil, umumnya dengan keunggulan khusus untuk proses kloning, yang digunakan sebagai pembawa molekul gen (vektor) kedalam sel inang. Ukuran DNA plasmid ini lebih kecil dibandingkan dengan DNA phage, dengan kemampuan membawa molekul gen yang lebih kecil tentunya. Ketiga, adalah DNA phage, dengan fungsi sama sebagaimana DNA plasmid sebagai vektor pembawa gen kedalam sel inang. Molekul DNA ini umumnya disiapkan dari bakteriofaga. Ukuran dan kemampuan membawa molekul gen juga lebih besar. Pada modul ini, isolasi asam nukleat hanya akan difokuskan pada DNA kromosom dan DNA plasmid saja. Penyiapan DNA Kromosom Dasar-dasar penyiapan molekul DNA kromosom adalah sebagaimana yang telah dibahas dalam matakuliah Teknik Penelitian Biokimia. Ada beberapa tahapan umum dalam isolasi DNA kromosom, untuk kasus ini bakteri sebagai model. Tahapan tersebut meliputi : a. Teknik pemeliharaan (kultur) dan dan pemanenan sel b. Teknik pemecahan sel c. Teknik pemisahan DNA kromosom dari material komponen sel lainnya d. Pemekatan DNA kromosom hasil isolasi Mikroba (bakteri) harus ditumbuhkan pada media yang sesuai dan dipanen ketika fase pertumbuhannya mencapai fase log. Hal ini mengingat pada usia ini sel lebih banyak melakukan aktivitas pembelahan dan belum memanfaatkan nutrien dalam kultur untuk penebalan dinding sel-nya. Pemanenan pada usia ini umumnya dapat diperoleh sel dengan usian muda sehingga lebih mudah untuk dilakukan pemecahan dinding sel-nya. Molekul DNA kromosom akan lebih mudah dikeluarkan dari sel ini dibandingkan bila sel telah masuk fase stasioner (baca kembali Modul Kuliah Teknik Penelitian Biokimia). Oleh sebab itu, sebelum melakukan isolasi DNA kromosom, profil kurva pertumbuhan mikroba tersebut sangat disarankan untuk diamati terlebih dahulu. Bagaimakah metodenya....?? Usia pemanenan sel sangat tergantung kepada jenis mikroba yang bersangkutan. Sebagai contoh sel E. coli, dapat melakukan pembelahan sel setiap 20 menit sekali. Pada kasus tersebut fase logaritma tercapai setelah sel mencapai kepadatan optik (optical density / OD) sekitar 2-3 x 109 sel/ml.

Mulyono, Ph.D. http://blog.unila.ac.id/mulyono/

Modul Kuliah : Rekayasa Genetika (KIM 451)

Tips 1: Pertumbuhan sel dapat diamati dengan mengukur nilai optical density sel (OD sel) pada panjang gelombang 660 nm. Nilai OD 1 berarti kultur memiliki kepadatan sekitar 0.8 x 109 sel/ml.

Berapakan kira-kira nilai OD600nm

Soal 1: untuk pemanenan sel E.coli yang ideal...?

Penyiapan DNA kromosom dalam jumlah besar umumnya sangat diperlukan untuk mendapatkan gen target dalam jumlah banyak. Kepertluan cara ini antara lain adalah untuk konstruksi DNA library (pustaka genomik). Namun untuk isolasi DNA kromoson dengan jumlah yang sedikit pun terkadang sering dilakukan untuk analisa yang dilakukan untuk amplifikasi dengan PCR (polymerase chain reaction : baca lagi Modul Kuliah Teknik Penelitian Biokimia), dalam hal pendeteksian secara cepat menggunakan primer yang spesifik. Untuk hal pertama, maka perlu sekali diperhatikan bahwa mikroba yang dikultur harus sel tunggal (single strain). Kenapa demikian....?? karena bila DNA kromosom yang diperoleh adalah campuran dari isolat lainnya, maka hasil yang diperoleh dalam konstruksi library dapat membingungkan (bias), terlebih bila gen yang diperoleh justru dari kontaminan, tujuan pemetaan gen dari mikroba yang diingikan tidak akan tercapai. Untuk amplifikasi gen dengan metode PCR yang akan dilanjutkan dengan proses kloning, maka kemurniaan DNA target tanpa adanya DNA kontaminan juga sangat penting. Sebaliknya untuk keperluan kedua (PCR), pendeteksian cara cepat, sembarang DNA bercampur pun tidak akan menjadi masalah (tentunya untuk batas-batas tertentu). Primer akan mengamplifikasi dan memberikan hasil yang positif hanya bila primer tersebut cocok dengan template DNA. Misalnya untuk pendeteksian mikroba Salmonella typhosa, penyebab penyakit tifus, maka meskipun sampel tercampur dengan DNA manusia ataupun mikroba kontamianan lainnya, pita hasil ampifikasi hanya akan diperoleh gen dari strain tersebut, tidak dari yang lainnya. Contoh lainnya adalah pada ampifikasi deteksi jenis-jenis mikroba tertentu dari suatu sampel dengan menggunakan primer PCR yang universal, pita DNA dapat diperoleh namun setiap strain yang berbeda akan memberikan panjang fragmen yang berbeda. Pemisahan dengan teknik DGGE memungkinkan untuk membedakan antara satu dengan yang lainnya. Pemecahan sel dapat dilakukan dengan setidaknya dua metode, yaitu pemecahan secara fisika (sonifikasi, frenc press, penggerusan); atau secara enzimatik menggunakan enzim lisozim dan Proteinase-K. Beberapa ion logam ditambahkan selama proses pemecahan sel dengan tujuan tertentu.
Soal 2: Apakah fungsi penambahan : larutan salin, EDTA, SDS, fenol, dan kloroform-isoamyl-alkohol; selama proses isolasi DNA kromosom...?

Mulyono, Ph.D. http://blog.unila.ac.id/mulyono/

Modul Kuliah : Rekayasa Genetika (KIM 451)

Setelah rangkaian kegiatan pemecahan sel selesai, maka molekul DNA kromosom harus dipisahkan dengan penambahan pelarut dan sentrifugasi pada kecepatan tinggi. Molekul DNA-RNA- dab protein akan terlarut pada fasa air, dan kemudian dimurnikan lebih lanjut sebelum pemurnian menggunakan fenol. RNA-ase dan Proteinase-K sering digunakan untuk menghilangkan kontaminasi RNA dan protein.
Soal 3: Kenapa protein dan RNA dapat bersama-sama dengan molekul DNA serta kenapa mesti dihilangkan...... ???

Molekul DNA yang telah murni dari RNA dan protein selanjutnya dipisahkan dari larutan untuk mendapatkan DNA konsentrasi tinggi menggunakan metode Pengendapan Etanol (ethanol precipitation). Pelilitan menggunakan batang pengaduk gelas umumnya dapat memperoleh DNA yang lebih murni dibandingkan menggunakan pengendapan menggunakan sentrifugasi. Hal ini dikarenakan rantai pendek DNA ataupun RNA akan tetap tertinggal dalam larutan mengingat ukuran RNA yang kecil. DNA terlilit kemudian di-resuspensikan kembali menggunakan buffer dan ditera konsentrasinya dengan mengambil sebagian kecil saja, dan diukur konsentrasinya menggunakan panjang gelombang UV.
Tips 2: Jumlah radiasi yang diserap oleh larutan DNA berbanding lurus dengan jumlah DNA dalam sampel. Pengamatan dilakukan pada panjang gelombang UV 260 nm dan 280 nm. Nilai Absorbans 1 pada 260nm berhubungan dengan sampel memiliki sejumlah sebanyak 50g/ml DNA double-heliks. Kemurnian DNA dilakukan dengan melihat rasio A260/A280. DNA murni memiliki nilai 1.8. Nilai lebih keci dari 1.8 menandakan kontaminasi protein maupun phenol.

Penyiapan DNA Plasmid Pemurnian plasmid dari kultur sel bakteri melibatkan langkah yang sama dengan penyiapan DNA kromosom (Total DNA). Satu hal utama yang membedakan adalah harus dipisahkannya DNA plasmid dari sejumlah besar DNA kromosom yang juga terdapat dalam sel. Ukuran DNA kromosom dan plasmid sangat jauh berbeda. Untuk sel E.coli misalnya, molekul plasmid hanya berukuran 8% dari ukuran DNA kromosomnya, lebih banyak ditemukan bahkan yang lebih kecil dari itu. Hal ini dapat menjadi dasar pemisahan Plasmid dari DNA kromosom. Selain itu konformasi DNA plasmid menguntungkan pada proses pemisahan dari molekul DNA kromosom. Meskipun DNA plasmid dan DNA kromosom awalnya mempunyai konformasi yang sama yaitu sirkular, namun selama proses penyiapan DNA kromosom dari sel ekstrak, fragmentasi dapat menyebabkan DNA kromosom menjadi potongan linear.
Mulyono, Ph.D. http://blog.unila.ac.id/mulyono/

Modul Kuliah : Rekayasa Genetika (KIM 451)

Mulyono, Ph.D. http://blog.unila.ac.id/mulyono/