ISOLASI DAN PEMISAHAN PROTEIN

Pendahuluan
Protein merupakan molekul organik terbanyak dalam sel. Lebih dari 50% berat kering sel terdiri atas protein. Selain itu, protein adalah biomolekul sesungguhnya, karena senyawa inilah yang menjalankan berbagai fungsi dasar kehidupan, diantaranya yaitu protein berkontraksi melakukan gerak, menjalankan berbagai proses metabolisme dalam bentuk enzim. Protein dapat pula berperan membawa informasi dari luar ke dalam sel dan di dalam bagian bagian sel itu sendiri. Protein juga mengendalikan dapat tidaknya, serta waktu yang tepat untuk mengungkapkan informasi yang terkandung di dalam !"#, yang sangat diperlukan untuk sintesis protein itu sendiri. $adi, se%ara tidak langsung, protein mengatur penduplikasian diri sendiri dengan pengaturan !"# yang merupakan alat perekam informasi bagi protein itu. !engan demikian dapat disimpulkan bahwa mekanisme operasi !"# berada di bawah kendali protein. Se%ara kimia, protein adalah heteropolimer dari asam asam amino yang terikat antara satu sama lain melalui ikatan peptida. #da suatu uni&ersalisme di dalam molekul protein. Protein apapun dan berasal dari makhluk apapun juga ternyata hanya tersusun dari '0 ma%am asam amino saja. Perbedaan protein yang satu dengan yang lain disebabkan oleh jumlah kedudukan asam asam amino tersebut di dalam tiap tiap molekul. (edua puluh asam amino itu memiliki %iri umum yaitu sebagai berikut ) *. Semua asam amino tersebut mempunyai konfigurasi L. '. Sama sama mempunyai satu gugus COOH dan satu gugus NH2 yang terikat ke atom C. Perbedaan +ndi&idual dari masing masing asam amino tersebut disebabkan oleh asam amino perbedaan rantai samping. ,ang menyebabkan perbedaan kimia antara asam

tersebut, pada gilirannya akan menyebabkan perbedaan sifat kimia dan biologis dari molekul protein yang disusunnya. -antai samping R ini tidak ikut membentuk ikatan peptida. .uatan suatu protein dalam suatu larutan ditentukan oleh gugus "/' bebas di

suatu ujung dan gugus 011/ bebas di ujung yang lain serta jumlah rantai yang bermuatan. .olekul protein, melalui ikatan hydrogen, berinteraksi dengan molekul air membentuk suatu mantel air. (arena molekulnya besar, protein membentuk larutan koloid di dalam air. #danya sejumlah elektrolit dengan konsentrasi en%er sangat meningkatkan kelarutan suatu protein 2 salting in 3. Sifat ini. ,aitu kelarutan dalam bentuk larutan koloid yang dipermudah oleh mantel air dan elektrolit en%er, dimanfaatkan untuk pemisahan protein. Selain itu, sifat lainnya, yaitu ukuran molekul yang berbeda sebagai akibat dari jumlah asam amino penyusunnya dan muatan yang tidak sama antara protein yang satu dengan protein lainnya karena perbedaan jenis asam amino yang turut menyusunnya. (esemua hal ini menjadi dasar dari pemisahan protein yang akan dilakukan pada praktikum ini.

Tujuan Praktikum
.engenal reaksi umum berdasarkan adanya beberapa ikatan peptida pada suatu protein dan mampu menggunakannya untuk mela%ak protein dalam suatu bahan. .elakukan pemisahan suatu protein dari kelompok protein lain se%ara re&ersibel dengan menggunakan larutan garam di&alent konsentrasi tinggi 2 salting out 3 dan menerangkan mekanisme pemisahan tersebut. .elakukan pemisahan protein se%ara re&ersible, dengan menggunakan bahan higroskopis dan menerangkan mekanisme pemisahan tersebut. .elakukan pemisahan protein se%ara denaturasi ire&ersibel dengan menggunakan pereaksi alkaloid, menerangkan mekanisme kerjanya dan mampu menggunakan untuk mela%ak protein. .emperlihatkan kemampuan logam berat dalam mengendapkan dan mendenaturasi protein dan menjelaskan masalah yang ditimbulkan oleh logam berat sebagai pen%emar lingkungan. .engetahui %ara pemisahan suatu protein dari protein lain ataupun senyawa lain, berdasarkan perbedaan berat molekul, dengan menggunakan %ara kromatografi gel penyaring molekul sederhana.

'

Percobaan Protein

Uji Biuret
Tujuan :
.emperlihatkan bahwa protein mempunyai ikatan peptida yang bereaksi positif dengan uji biuret. -eaksi ini tidak terjadi pada makromolekul lain.

Dasar :
+katan ikatan peptida yang menyusun protein dan polipeptida, dalam larutan bersuasana alkali akan bewarna lembayung bila direaksikan dengan 0u 44 .

Bahan dan Pereaksi :

Larutan 5iuret 2 %ampuran dari larutan "a1/ dan 0uS16 dengan perbandingan *0 ) * atau * mL "a1/ 4 ' tetes 0uS16 3 Larutan #lbumin Serum #ir Liur #7uades Larutan #milum

Cara Kerja dan Hasil :

Siapkan 5 tabung reaksi yang bersih. Pipetkan ke dalam tabung reaksi seperti pada table. Tabung 1 2 3 4 #lbumin * mL 88888 88888 88888 Serum 88888 * mL 88888 88888 #ir Liur 88888 88888 * mL 88888 #7uades 88888 88888 88888 * mL #milum 88888 88888 88888 88888 !isiapkan 6 tabung reaksi yang bersih. !ireaksikan sesuai dengan tabel) 5 88888 88888 88888 88888 * mL

Reaksi
* ml air liur 4 *ml "a1/ 4 *8' tetes 0uS16 * ml #lbumin 4 *ml "a1/ 4 *8' tetes 0uS16 * ml #7uades 4 *ml "a1/ 4 *8' tetes 0uS16 * ml Pati;amilum 4 *ml "a1/ 4 *8' tetes 0uS16 * ml a7uades 4 *ml "a1/ 4*8' tetes 0uS16 Kesimpulan :

Pengamatan
:ngu muda 243 :ngu 243 5ening 283 5ening 283 5ening 283

:ji biuret positif terhadap larutan yang mengandung mengandung protein, namun negatif pada larutan yang tidak mengandung protein. Jawaban pertanyaan : *. ,a, uji ini akan positif terhadap asam amino. '. #sam amino yang menyusun protein antara lain ) <lisin, #lanin, =alin, Leusin, +soleusin, >enilalanin, .etionin, Prolin, ?riptofan, Serin, ?reonin, ?irosin, #sparagin, <lutamin, Sistein, #spartat, <lutamat, #rginin, Lisin, /istidin. 9. Pengelompokan asam amino adalah) #sam amino dengan gugus - nonpolar, #sam amino dengan gugus polar - netral, #sam amino dengan gugus - bermuatan.

Pemisahan Protein dengan Etano A!so ut

Tujuan :
.emperlihatkan bahwa sebagai makromolekul yang lerut, protein dapat dipisahkan dengan mengendapkannya dengan menambahkan etanol absolut.

Dasar :
@tanol absolut bersifat sangat kuat menarik air 2 higroskopis 3. Penambahan etanol absolut pada suatu larutan protein, akan menyebabkan molekul air yang berinteraksi dengan molekul protein melalui ikatan hydrogen ditarik oleh etanol. #kibatnya, molekul molekul protein beragregasi satu sama lain sehingga mengendap. 5ila agregat partikel protein tersebut dibiarkan bersentuhan dengan etanol untuk waktu yang lama, endapan yang terbentuk tidak dapat dilarutkan lagi sehingga denaturasi yang terjadi ire&ersibel. !engan menggunakan etanol berbagai konsentrasi dan suhu yang rendah, 0ohn pada tahun empat puluhan telah berhasil memisahkan protein serum dalam lima fraksi, dan fraksi = yang diperoleh sebagian besar terdiri atas albumin. Protein tidak dapat mengendap disebabkan oleh karena protein tersebut memiliki muatan listrik, gerak 5rown, dan mantel air yang mempengaruhi pengendapan protein tersebut dalam larutan tertentu.

Bahan dan Pereaksi :

#lkohol absolut Serum Larutan #lbumin (ertas Saring Larutan biuret

Cara Kerja dan Hasil :

Siapkan ' tabung reaksi yang bersih dan kering kemudian %ampurkan dengan al%ohol absolut. #pabila terbentuk endapan maka endapan tersebut disaring menggunakan kertas saring dan endapan tersebut ditetesi dengan larutan penguji biuret. !isiapkan A tabung reaksi yang bersih. !ireaksikan sesuai dengan tabel) Per%obaan pengendapan serum dengan larutan etanol absolut Reaksi

Pengamatan Pengamatan
5erwarna ungu 243 5erwarna biru muda 283

* ml serum 4 * ml etanol absolut ?erbentuk endapan Setelah disaring dan dipisahkan menjadi >iltrat dan @ndapan Reaksi @ndapan4 * ml "a1/ 4 *8' tetes 0uS16 >iltrat 4 * ml "a1/ 4 *8' tetes 0uS16

Per%obaan pengendapan albumin dengan larutan etanol absolut Reaksi

Pengamatan
Pengamatan 5erwarna ungu 243 5erwarna biru muda 283

* ml albumin 4 * ml etanol absolut ?erbentuk endapan Setelah disaring dan dipisahkan menjadi >iltrat dan @ndapan Reaksi @ndapan 4 * ml "a1/ 4 *8' tetes 0uS16 >iltrat 4 * ml "a1/ 4 *8' tetes 0uS16

Kesimpulan :
Protein dapat dipisahkan dengan mengendapkannya dengan penambahan etanol absolut.

Pengenda"an Protein dengan Larutan #aram $onsentrasi Tinggi % Sa ting Out &
Tujuan :
.emperlihatkan bahwa sebagai makromolekul yang larut dalam bentuk larutan koloid, protein dapat dipisahkan satu dari yang lain, dengan menggunakan larutan garam di&alen konsentrasi tinggi.

Dasar :
:ntuk larut dalam air, suatu molekul harus dapat berinteraksi dengan molekul air dengan %ara membentuk ikatan hydrogen sehingga molekul tersebut tersebar rata di antara molekul terjadi. Protein merupakan makromolekul karena memiliki 5. 2 berat molekul 3 besar. Pada umumnya, protein mudah larut dalam air karena protein mempunyai kedua sifat itu. <ugus 8018 dan 8"/8 yang ada pada ikatan peptida dapat berinteraksi dengan molekul air melalui ikatan hydrogen, sedangkan berbagai rantai samping, yang di antaranya ada yang hidrofilik, bahkan juga bermuatan, sangat mudah berinteraksi dengan molekul air. Selain itu, muatan listrik yang sama dalam dua partikel molekul protein yang sama akan bertolakan, sehingga membantu meningkatkan kelarutan protein 2 salting in 3. Setiap keadaan yang menyebabkan ditariknya air yang mengelilingi molekul protein, sangat mengurangi kelarutan protein, sehingga protein mengendap. Larutan garam berkonsentrasi tinggi bersifat demikian. Selain itu, larutan garam berkonsentrasi tinggi akan menetralkan muatan listrik, sehingga kelarutan akan makin berkurang. 1leh karena pengendapan dengan %ara ini hanya bersifat menarik air di sekeliling protein, sedangkan molekul protein sendiri tidak mengalami perubahan kimia, maka perubahan tersebut bersifat re&ersible. (elarutan dan fungsi protein pada umumnya akan pulih kembali bila dikembalikan ke keadaan semula. molekul air. #danya muatan listrik pada molekul terlarut sangat membantu kelarutan, karena muatan yang sama saling menjauhi, sehingga agregasi molekul tidak

Larutan garam di&alent lebih efisien dalam mengendapkan protein, karena di dalam air, garam tersebut akan berdisosiasi menjadi 9 ion, yang masing masing berinteraksi sempurna dengan air. Sebagai %ontoh, globulin dapat diendapkan oleh 2"/63'S16 setengah jenuh, sedangkan "a0l baru dapat mengendapkan protein tersebut bila berada di dalam larutan jenuh. #lbumin, yang baru akan mengendap oeh 2"/ 63'S16 jenuh, tidak dapat diendapkan oleh "a0l jenuh, ke%uali dengan penambahan asam mineral dalam jumlah yang sangat ke%il.

Bahan dan Pereaksi :

Serum <aram 2"/63'S16 Larutan 2"/63'S16 C (ertas saring Larutan uji biuret
C larutan 2"/63'S16 ditambahkan garam 2"/63'S16 merupakan larutan jenuh sedangkan larutan biasa merupakan bentuk setengah jenuhnya.

Cara kerja : !isiapkan A tabung reaksi yang bersih. !ireaksikan sesuai dengan tabel) Per%obaan pengendapan protein dengan larutan #mmonium Sulfat 2"/63'S16 setengah jenuh Reaksi * ml serum 4 * ml 2"/63'S16 Pengamatan ?erbentuk endapan

Setelah disaring dan dipisahkan menjadi >iltrat 2#lbumin3 dan @ndapan 2<lobulin3 Pengamatan Reaksi <lobulin 4 * ml "a1/ 4 *8' tetes 5erwarna ungu 0uS16 #lbumin 4 * ml "a1/ 4 *8' tetes 5erwarna ungu 0uS16 Per%obaan pengendapan protein dengan larutan #mmonium Sulfat 2"/63'S16 jenuh Pengamatan Reaksi * ml serum 4 * ml 2"/63'S16 4 (ristal ?erbentuk endapan 2"/63'S16 Setelah disaring dan dipisahkan

Reaksi @ndapan 2globulin dan albumin3 >iltrat Kesimpulan :

Pengamatan 5erwarna ungu jernih

Protein dapat diendapkan dengan menggunakan garam konsentrasi tinggi melalui proses salting out. Jawaban pertanyaan : *. Protein yang mengendap pada penambahan satu &olume amonium sulfat jenuh ke dalam satu &olume serum adalah protein #lbumin. '. ,ang tidak dapat diendapkan pada per%obaan tersebut adalah <lobulin. 9. >ungsi #lbumin adalah mengikat Ligand, albumin di sintesis di hati.

Pengenda"an Protein Se'ara Denaturasi Ire(ersi!e dengan Menggunakan Pereaksi #aram A ka oid
Tujuan :
.emisahkan protein dari larutan dengan %ara mengendapkannya dengan senyawa yang bereaksi dengan protein tersebut.

Dasar :
FPereaksi #lkaloidG adalah asam asam organi% yang dapat bereaksi dan mengendapkan alkaloid serta protein. .ekanisme pengendapan ini disebabkan adanya nitrogen tri&alent pada alkaloid dan protein. #sam trikloroasetat 2?0# H tri%loroa%eti%a%id3 sering dipakai untuk deproteinisasi 2penyingkiran protein3 dari suatu bahan. #sam sulfosalisilat sering dipakai untuk mela%ak ada tidaknya protein dalam urin patologis.

Bahan dan Pereaksi :

Serum Larutan #lbumin Larutan ?0# Larutan #sam Sulfosalisilat

Cara Kerja dan Hasil :

!isiapkan 6 tabung reaksi yang bersih. !ireaksikan sesuai dengan tabel) Per%obaan pengendapan protein se%ara denaturasi ire&ersibel dengan peraksi alkaloid Reaksi * ml Serum 4 I ml ?0# * ml Serum 4 I ml asam sulfosalisilat * ml #lbumin 4 I ml ?0# * ml #lbumin 4 I ml asam

Pengamatan
?erbentuk endapan putih ?erbentuk endapan putih ?erbentuk endapan putih ?erbentuk endapan putih *0

sulfosalisilat

Kesimpulan :
Protein dapat mengendap jika diberi pereaksi alkaloid Jawaban pertanyaan : *. ?0#H 0l90'11/ '. :rine normal tidak mengandung Protein. 9. Proteinuria terjadi misalnya pada keadaan penyakit !iabetes .ellitus, karena gangguan hormon insulin.

**

Pengenda"an Protein Se'ara Denaturasi Ire(ersi!e dengan #aram Logam Berat

Tujuan :
.emperlihatkan bahwa logam berat mengendapkan protein se%ara denaturasi ire&ersibel

Dasar :
Logam berat akan mendenaturasikan dan mengendapkan protein, Peristiwa itu terjadi, bila berbagai gugus di permukaan molekul protein bermuatan negatif, sehingga membentuk garam dengan kation logam berat. $umlah protein yang diendapkan sebanding dengan jumlah logam berat yang ditambahkan. .akin banyak logam berat yang ditambahkan, makin banyak protein yang mengendap, selama dalam larutan masih terdapat protein. Protein tertentu memerlukan penambahan beberapa tetes alkali supaya protein tersebut bermuatan negatif. Selain itu, kelebihan logam berat dapat pula melarutkan kembali kompleks logam berat denaturasi. protein, walaupun protein tersebut tetap dalam keadaan

Bahan dan Pereaksi :

Serum Larutan #lbumin Larutan /g0l' Larutan Pb #setat

*'

Cara Kerja dan Hasil :

Siapkan 6 buah tabung reaksi. (emudian teteskan larutan /g0l ' dan Pb dalam tabung berisi larutan tersebut sesuai prosedur table. Tabung #lbumin Serum /g0l' Pb #setat @ndapan 1 2 3 4 6 mL 6 mL 88888 88888 88888 88888 6 mL 6 mL ' ; 9 tetes 88888 ' ; 9 tetes 88888 88888 ' ; 9 tetes 88888 ' ; 9 tetes @ndapan putih @ndapan putih @ndapan putih @ndapan putih #setat ke

Kesimpulan :
Protein dapat mengendap jika diberi logam berat Jawaban pertanyaan : *. ,a, tiap kali penambahan logam berat diikuti oleh penambahan endapan protein. /al itu disebabkan jumlah protein yang diendapkan sebanding dengan jumlah logam berat yang ditambahkan selama masih terdapat protein di dalam larutan tersebut. '. !ibutuhkan sekitar *0 tetes logam berat untuk mengendapkan protein di kedua bahan tersebut. 9. Logam8logam berat yang menjadi pen%emar lingkungan %ontohnya adalah /g, Pb, #u yang bisa saja bersumber dari pabrik8pabrik industri. Logam8logam tersebut berbahaya karena tidak dapat diuraikan oleh lingkungan, sehingga akan tetap berada dilingkungan hidup kita dan bisa masuk ke dalam tubuh kita dalam makanan yang kita makan, atau bisa juga masuk ketubuh kita karena sentuhan dengan kulit kita. Penyakit karena kera%unan logam berat yang terjadi di $epang adalah minamata disease, yang disebabkan oleh /g. Logam /g bisa mera%uni manusia karena /g yang dilepaskan industri ke teluk tersebut masuk ke ikan8ikan di teluk itu dan tetap berada di tubuh ikan8ikan tersebut, manusia yang memakan ikan tersebut akan tera%uni /g karena /g tidak bisa diuraikan se%ara biologis.

*9

Skema Pengendapan protein dengan cara salting out

H H O H

O H H O H

C R!

RC

O ! " H #$%SO# O

H&!

Protein terlarut H&! H&! COO COO-

COOCOO-

H&! H&!

Protein 'eragregasi ( mengendap

*6