Unida 5

Parte I
Captulo 1 Introduccin
El cultivo de clulas con el objeto de obtener productos tiles, es una actividad que ha realizado el hombre prcticamente durante toda su historia. Recientemente a esta actividad se le ha denominado Biotecnologa. Esta ha evolucionado a partir de los conocimientos generados en diversas disciplinas, tanto del rea de las ciencias bsicas como de las ingenieras. Hoy la Biotecnologa puede ser definida como la coleccin de procesos industriales que involucran el uso de sistemas biolgicos (Wang, 1988). Las operaciones que comprenden los procesos biotecnolgicos a escala comercial, se han dividido tradicionalmente en operaciones previas (procesos "upstream") y operaciones posteriores o bioseparaciones (procesos "downstream"). Dentro de las primeras se considera la preparacin del medio, la esterilizacin y el funcionamiento del biorreactor (Cooney, 1990). Los procesos de bioseparacin como se muestra en la Figura 1.1, involucran la recuperacin y purificacin de productos provenientes del biorreactor. Comprenden todos los tratamientos que requiere el caldo de cultivo para la obtencin del producto en las condiciones de pureza y actividad deseadas. En un proceso dado, la parte correspondiente a las bioseparaciones puede representar hasta un 60% del costo total de produccin sin considerar las materias primas (Kalk, 1986). Debido a lo anterior, exite una relacin inversa entre el precio de venta de un producto biotecnolgico y la concentracin de ste en el caldo del biorreactor (Figura 1.2). Puede decirse entonces que el xito comercial de un proceso biotecnolgico
CAPTULO!. INTRODUCCIN
depende en gran medida de la adecuada seleccin del proceso de bioseparacin.
1.1
Evolucin de los Bioprocesos
Actualmente se pueden distinguir de manera general tres generaciones de procesos biotecnolgicos, en relacin al tipo de bioseparaciones que stos involucran. La primera generacin comprende el conjunto de procesos desarrollados mediante cultivos de organismos no recombinantes, cuyos productos se obtienen en forma activa tanto si son intracelulares o si son secretados al medio de cultivo. En esta generacin se encuentran los procesos de la Biotecnologa tradicional como los de la produccin de etanol, enzimas, cido ctrico, y antibiticos. Los productos de estos procesos se presentan en concentraciones altas al inicio de la etapa de separacin y no requieren de una extremada pureza para su venta. Los descubrimientos asociados con la Biologa Molecular y la Ingeniera Gentica logrados particularmente en las ltimas dos dcadas, han ampliado las capacidades biotecnologas del hombre. En esta etapa podemos situar una segunda generacin de productos de la Biotecnologa como la insulina humana, la hormona de crecimiento, y alfa interfern, entre otros. Estos son producidos intracelularmente utilizando clulas recombinantes de Escherchia coli. Se caracterizan por encontrarse en bajas concentraciones dentro de la clula, son de elevado peso molecular, tienen propiedades similares a los contaminantes y requieren un alto grado de pureza. Ademas, generalmente al producirse en la clula no poseen actividad biolgica por tratarse de cadenas peptdicas sin la conformacin o estructura apropiada; lo que se traduce en la necesidad de aplicarles tratamientos fisicoqumicos adicionales para lograr el producto en su estado activo. La tercera generacin de la Biotecnologa, la podemos caracterizar por procesos mediante los cuales se obtienen productos extracelulares en clulas recombinantes, la mayora de las cuales son eucariticas. En estos sistemas se ha observado la capacidad no slo de producir exgenamente el producto deseado, sino que ste se obtiene en forma activa. El factor VIII de la sangre y el agente tromboltico Activador
1.1. EVOL UCIN DE LOS BIOPROCESOS
Inoculo
Esterilizacin y preparacin del medio
Producto intracelular
Esterilizacin del caldo si es recombinante
Producto extracelular
Rompimiento celular
' Remocin de desechos celulares
Separacin celular
Recuperacin y concentracin del producto
Purificacin del producto
Figura 1.1: Operaciones de un proceso biotecnolgico: a). Operaciones previas b). Operaciones posteriores o bioseparaciones. Adaptada de: Bujurstrom, 1985.
Reproducida reservados. con el permiso de Me Graw Hill. Copyright 1985. Todos los derechos
CAPTULO 1. INTRODUCCIN
(g/i)
.Etanol .Acidoctrico MSG , Penicilina ,Treonina > Cefalosporna kGentamioina . Acido Giberflico . Enzimas a granel . Glucosa oxidas Anticuerpos Enzimas d investigacin y diagnstica GlioroHosatodeshidrogenas* LucHerasa Factor VIII Urakinasa Enzimasteraputicas^"^
"* 10*
wr
IOZ ' K) I01 K)2 I03 K>4 K)5 O6 KJ7 K)" O9
Precio
de
venta
$/Kg
Figura 1.2: Relacin entre la concentracin inicial del producto en el caldo y el precio final de venta del producto. Fuente: Dwyer, 1984.
Reproducida con el permiso de Nature Publishing Co. Copyright 1984. Todos los derechos reservados.
1.2. CARACTERSTICAS DE LOS BIOPROCESOS

Tabla 1.1: Caractersticas de los Procesos Biotecnolgicos.
Caracterstica Perodo Tipo de clulas Fortaleza de las clulas Conocimiento de propiedades bsicas Conocimiento Tecnolgico Primera
- 1975 No recombinantes Alta
Generacin Segunda
Tercera
1975Recombinantes Alta
Bajo Bajo
1985Recombinantes Baja
Bajo Bajo
Alto Alto
Tabla 1.2: Caractersticas de los Productos Biotecnolgicos

Caracterstica Producto tipo Idealizacin Tamao Actividad al secretarse Pureza deseada Similitud con contaminantes Valor Primera Antibiticos Aminocidos Extracelular e intracelular Intermedio
Si
Generacin Segunda Insulina humana

HC
Tercera Factor VIII

tPA
Intracelular Macromolculas
No
Extracelular Macromolculas
Si
Alta Baja Bajo
Muy alta Alta Alto
Muy alta Alta Alto
del Plasmingeno tisular (t-PA de sus siglas en ingls) son productos caractersticos de esta generacin. Debido a su empleo con fines teraputicos, estos productos deben ser obtenidos con un alto grado de pureza (Datar et a/, 1993) .
1.2
Caractersticas de los Bioprocesos
En la Tabla 1.1 y en la Tabla 1.2 se presentan algunas caractersticas asociadas a los procesos y a los productos de las tres generaciones de la Biotecnologa, aqu descritas.
10
CAPTULO 1. INTRODUCCIN
Los procesos biotecnolgicos tanto de la segunda como de la tercera generacin, se encuentran en una etapa de desarrollo que requiere ampliar el conocimiento de las propiedades fisicoqumicas de los productos y sus contaminantes, con el objeto de seleccionar las operaciones de separacin adecuadas debido al alto grado de pureza requerido por los productos. Los aspectos de rendimiento y pureza del producto son bsicos para determinar la viabilidad de un bioproceso, debido a que para lograr el grado de purificacin requerido por este tipo de productos, generalmente la purificacin debe realizarse en varios pasos. Un ejemplo de lo anterior se muestra en la Figura 1.3 con un diagrama de flujo del proceso para la obtencin de insulina humana a partir clulas de E. coli recombinante. Las operaciones de bioseparacin para un proceso deben seleccionarse cuidadosamente con el fin de que el costo sea mnimo. Es decir, si el rendimiento por paso de purificacin es bajo y se requieren varias pasos, puede tenerse un proceso no viable econmicamente debido a su an ms bajo rendimiento global. La Figura 1.4 muestra como decrece el rendimiento global en funcin del nmero de pasos de purificacin, considerando rendimientos por paso de 95 %, 90 %, 80 % y 60 %. Por ejemplo, si el rendimiento promedio por paso en un proceso de purificacin de 10 pasos es de 60 %, el rendimiento global del proceso de purificacin es de 0.6 %. Si debido a la desnaturalizacin del producto el rendimiento desciende a 30 % por etapa, el rendimiento global del proceso es 0.0006%. Esto significa que se require 1000 veces ms cantidad de materia prima para lograr la misma masa de protena purificada. Por otra parte si el rendimiento promedio por paso fuese de 95 %, el rendimiento total alcanzado sera del 60 % (Hearn y Anspach, 1990). Ejemplo 1.1: Estimacin de la pureza y el rendimiento de una enzima en un proceso de purificacin. En el desarrollo de un proceso para la obtencin de una enzima a partir de E. coli, se sabe que sta tiene un 80 % de humedad y que el 60 % de su peso seco es protema. El proceso de purificacin de la enzima consta de 4 pasos (Figura 1.5). En la tabla siguiente se presenta
1.2. CARACTERSTICAS
DE LOS BIOPROCESOS
11
Salida delire este'ril
Esterilizador continua (A)
uu
. i[ J
Tanques de m
lLJJ
1 Sedimentador o*1 Sedimentador2 (B) ' filtra de aire esteVH
TSrfii r tH i hi
I ** t Fermentadorde produccin (O) Centrifugas
Tanque de almacenamiento
intercambiador de calor
e
(E)
'.
Compresor Tratamiento de i* desechos Tanque de

* 4sterilizaon
^ t t
1 1 1
otras corrientes de desecho CNBr formato
n n i_r
.f , 1
Reactor para eliminacin de CNBr (H)
Reactor de solubilizacin
Figura 1.3: Representacin esquemtica del proceso para la obtencin de Insulina Humana. Fuente: Datar y Rosen, 1990.
Reproducida con el permiso de Marcel Dekker Inc. Copyright 1985. Todos los derechos reservados.
12
CAPTULO 1.
INTRODUCCIN
Del tratamiento dCNBr
bufer tris
enzimas
Reactor de cuMonan (K) bufer bufer Iris tris*NaCt _,;?
?
T
d**eho i HiPLC (O) enzimatico (NJ
^
desecho (M) acetato de amonio
Reactor de renaturalizacin (L)
3r
1
IjU
Uhrafihraein vapor PRODUCTO Reactor de cristalizacin (Q) Centrifugacin Evaporador instantneo
Figura 1.3: Continuacin.
1.2. CARACTERSTICAS
DE LOS BIOPROCESOS
13
Rendimiento ( % )
100 _
95%
90%
4 6 8 Nmero de pasos
Figura 1.4: Representacin grfica del rendimiento global de un proceso de purificacin de un producto biotecnolgico en funcin del nmero de pasos. Fuente: Hearn y Anspach, 1990.
14
CAPTULO 1.
INTRODUCCIN
la cantidad de enzima y de protena total al final de cada paso. Protena Enzima Fraccin total (g) total (g) enzima xlO~ 3
Paso Rompimiento celular Precipitacin Intercambio inico Crom atografa gel
12.000 1.800 0.240 0.036
0.080 0.060 0.048 0.036
6.667 33.333 200.000 1000.000
Se desea obtener el factor de purificacin de la enzima en cada paso, el rendimiento por paso y el rendimiento global.
/-'
Solucin:
El factor de purificacin, el rendimiento por paso y el rendimiento global del proceso se presentan junto con los datos del problema en la tabla siguiente:
Paso Rompimiento celular Precipitacin Intercambio inico Cromatografa
gel
Prot. tot. (g)
Enzima tot. (g)
Fraccin enz. XlO~ 3
Factor de purific.
% Recup* racin Por etapa Global
12.000 1.800 0.240 0.036
0.080 0.060 0.048 0.036
6.667 33.333 200.000 1000.000
1 5 30 150
100 75 80 75
100 75 60 45
a). El factor de purificacin se obtiene mediante el cociente de la fraccin de enzima en cada paso, entre la fraccin de enzima inicial. b). El rendimiento en cada paso est dado por el cociente de la cantidad de enzima total obtenida en cada paso, entre la cantidad total de enzima al inicio del paso. c). El rendimiento global al final de cada paso est dado por el cociente de la cantidad de enzima total obtenida en ese paso entre la cantidad total de enzima inicial.
1.2. CARACTERSTICAS DE LOS BIOPROCESOS
15
Rompimiento celular con sulfato de amonio
i Precipitacin
Fraccin colectada
35
40
45
50
55
60
70
100
% de saturacin Cromatografa de intercambio inico
Carga
Elucin Nmero de fraccin
Cromatrografia de filtracin por gel
Producto
Nmero de fraccin
Figura 1.5: Proceso hipottico de cuatro pasos para la purificacin de una enzima.
16
CAPTULO 1.
INTRODUCCIN
El conocimiento tecnolgico de los procesos biotecnolgicos de segunda y tercera generacin es limitado. Actualmente es necesario profundizar en los mtodos de escalamiento de algunas operaciones, ya que generalmente se han adaptado a escala comercial a partir del laboratorio. En el proceso de escalamiento es necesario considerar los volmenes y normas del mercado para el producto (Nuil, 1987). La Biotecnologa ha adoptado con xito operaciones de la Ingeniera Qumica, en la purificacin de productos biotecnolgicos tradicionales. Sin embargo, existen limitantes para lograr sto cuando se trata de obtener productos caractersticos de la segunda y tercera generacin. Existe una necesidad real de desarrollar procesos de bioseparaciones apropiados, con la participacin de bioqumicos y bilogos con el propsito de lograr, tanto la pureza deseada del producto, como la eficiencia y rentabilidad del mismo (Wang, 1988).
1.3
Sumario
Los procesos de bioseparacin involucran la recuperacin y purificacin de productos provenientes del biorreactor. Las bioseparaciones comprenden todos los tratamientos que requiere el caldo de cultivo para obtener un producto biotecnolgico en las condiciones de pureza y actividad requeridas. La economa de los procesos biotecnolgicos depende en gran medida de las operaciones de bioseparacin que involucran, de tal manera que la correcta seleccin de estas operaciones tiene un fuerte impacto en el xito del proceso.
1.4.
PROBLEMAS
17
1.4
Problemas
1.1 .-Efectuar un anlisis comparativo en relacin a las operaciones de separacin que utilizan, de los procesos para la produccin de cido ctrico, penicilina e insulina. 1.2.- Un proceso para la recuperacin de hidroxibutirato deshidrogenasa consta de tres pasos: Un rompimiento de las clulas para liberar la enzima intracelular, seguido de dos pasos de adsorcin/ desorcin por afinidad. En la siguiente Tabla se presentan los datos obtenidos de actividad de enzima y protena total al final de cada paso. Calcular la actividad especfica, el ndice de purificacin y el % de recuperacin. Paso Rompimiento Ads/Des (1) Ads/Des (2) Actividad Total Protena Total (Unidades) (mg) 6,860 6,800 5,380 76,200 2,200 267
1.3.- Completar la siguiente tabla relacionada con la purificacin de una enzima:

Vol.
Material Extracto ler. piso
mi
500
50
Conc. prot. mg/ml

14 10
Prot. total "IR

7 60
Act. enzim. U/ml
Act. total U
Act. esp. U/mg
Rend. Total Etapa
Fac. purif.
1.4.- En un proceso biotecnolgico para producir una enzima que se encuentra en desarrollo, se obtiene una concentracin de 0.1 mg/ml de la enzima en el caldo inicial. Si a los proyectos se les exige un margen sobre ventas del 50 %, estime el costo de produccin mximo del producto utilizando la Figura 1.2
18
CAPTULO!.
INTRODUCCIN
1.5
Bibliografa
Bujurstrom, E. 1985. Biotechnology. Chem. Eng. Feb. 18. Me Graw Hill. New York. 126-158. Cooney, C. L. 1990. Separations for biotechnology. Trends in Biotechnology. 8, 338-340. Datar, R.V., Cartwright, T. y Rosen, C.G. 1993. Process economics of animal cell and bacterial fermentations: A case study analysis of tissue plasminogen activator. Bio/Technology. 11, 349-357. Datar, R. y Rosen C. G. 1990. Downstream process economics. En: Separations Processes in Biotechnology. Asenjo, J.A. (Ed.). Marcel Dekker Inc. New York. 741-793. Dwyer, J. 1984. Scaling up bioproduct separaton with high performance liquid chromatography. Biotechnology. 2, 957-964. Hearn, M. T., y Anspach, B. 1990. Chemical, physical and biochemical concepts in isolation and purification of proteins. En: Separations Processes in Biotechnology. Asenjo, J.A. (Ed.). Marcel Dekker Inc. New York. 17-63. Kalk, J. P. y Langlykee, A. F. 1986. Cost estimation for biotechnology projects. En: Industrial Microbiology and Biotechnology. Demain, A.L. y Solomon, N. (Eds.). American Society for Microbiology. New York. 363-384. Nuil, H. R. 1987. Selection of a separation process. En: Handbook of Separation Process Technology. Rousseau, R.W*, (Ed.). John Wiley & Sons. New York. 982-995. Wang, D. I. C. 1988. Biotechnology: Status and perspectives. AIChE, 84-18, 1-21.
Captulo 2 Seleccin del Proceso

2.1 Introduccin
El desarrollo de un proceso biotecnolgico para la obtencin de un producto de inters comprende varios aspectos, fundamentalmente los econmicos relacionados con el mercado y los tcnicos que involucran el diseo del proceso . El estudio de mercado permite evaluar el potencial econmico del proceso y es requisito indispensable para la formulacin del proyecto a desarrollar. Por ejemplo, an cuando la factibilidad tcnica de un proceso dado pueda ser atractiva, el valor esperado del producto pudiera no justificarlo (Knight, 1990). En el diseo de un proceso es necesario un trabajo completo y cuidadoso que permita desarrollar y evaluar varios esquemas de operacin con el propsito de aproximarse al diseo ptimo, bajo las restricciones presupustales establecidas. (Kelly, 1987). Un aspecto central en el diseo de un bioproceso, es la especificacin de la secuencia de operaciones de separacin que se requieren, debido al alto costo que stas representan. En este captulo en la seccin 2.2 se presenta los principales aspectos econmicos y tcnicos a considerar para la seleccin de un proceso biotecnolgico, particularmente en su secuencia de operaciones de bioseparacin. Los equipos ms comunes para realizar dichas operaciones se describen en la seccin 2.3. Las metodologs utilizadas para
19
20
MERCADO
CAPTULO 2. SELECCIN DEL PROCESO
ESPECIFICACIN DEL PRODUCTO
PROCESO - Operaciones y secuencia -Escala Etapas o tiempo por operacin -Costo
PRODUCTO
Figura 2.1: Elementos para la seleccin de un bioproceso. la seleccin apropiada de la secuencia de bioseparaciones para un proceso se establecen en la seccin 2.5.
2.2
Fundamentos
Los factores que intervienen en la seleccin de un proceso biotecnolgico son de dos tipos (Figura 2.1): Econmicos: Relacionados principalmente con el mercado y las especificaciones del producto. Tcnicos: Relacionados directamente con el el proceso.
2.2.
FUNDAMENTOS Tabla 2.1: Influencia del mercado en el precio del producto.

Caso tipo Compaa Producto Precio por dosis Demanda Anual (USA). No. de Dosis Masa
21
1 2
GENENTECH Diversas
t-PA
BST*
$ 2000.00
$
100,000
5 X 10*
10 Kg
100 Tons.
0.50
Datos de: Spalding, 1991. * Somatotropina de Bovino
2.2.1
Mercado y Especificacin del Producto
El mercado es un factor muy impoortante para el establecimiento de un bioproceso, ya que determina el precio del producto. El mercado de los productos biotecnolgicos puede enmarcarse entre dos casos extremos (Tabla 2.1): 1. Productos de alto valor, bajo volumen de produccin y libres de competencia, como el t-PA. 2. Productos de alto volumen de produccin, en mercados muy competitivos, como la BST. En los productos libres de competencia, es posible que se seleccione el primer proceso exitoso que se logre en el laboratorio. Sin embargo, si el mercado del producto aumenta y aparecen nuevos competidores, la economa del proceso cobra especial importancia (Spalding, 1991). Actualmente varios productos biotecnolgicos modernos estn libres de competencia, pero existe una tendencia hacia un incremento en la competitividad del mercado. Es en esta transicin donde el diseo adecuado de los bioprocesos presenta especial relevancia. El primer paso en la seleccin de un proceso es la definicin del objetivo del mismo, especificando claramente la pureza y recuperacin que se desea obtener. Con frecuencia las especificaciones sobre pureza
22
del producto son establecidas por regulaciones legales o por el mercado. Las especificaciones de recuperacin son fijadas para asegurar la economa del proceso. Idealmente la recuperacin debe ser una variable dependiente del diseo de proceso, en la bsqueda de la optimizacin del mismo. En la prctica, debido a limitaciones de tiempo esta fase no siempre se concluye (Nuil, 1987).
2.2.2
El Proceso
El diseo de un proceso comprende todo el trabajo conceptual que es necesario realizar antes de construir una planta productiva, y tiene como objetivo definir las principales caractersticas del proceso como: La secuencia de operaciones de proceso. La escala del proceso. Nmero de etapas por operacin. El costo del proceso.
Operaciones de Separacin y su Secuencia

Una vez definido el producto (o productos) que se desea obtener, as como su pureza y la recuperacin deseada, el siguiente paso es determinar que operaciones son capaces de realizar la produccin y la separacin del producto. En este trabajo slo se abordan estas ltimas. Las operaciones de separacin se basan en las diferencias que existen entre las propiedades fsico-qumicas de los componentes presentes en el caldo de cultivo. El objetivo del diseo de un proceso de separacin es explotar esta diferencia en las propiedades en la forma mas econmica. Generalmente existe una propiedad diferente que es la base primaria para la separacin. Los mtodos de separacin usados con ms frecuencia, as como la propiedad en que se basan, se muestran en la Tabla 2.2 En un anlisis realizado con datos de 100 artculos publicados sobre purificacin de protenas, se observa que hay una secuencia preferencial aunque no estricta, con la cual se desarrollan las operaciones de separacin (Bonnerjea y Hoare, 1986). Tal y como se observa en la
2.2.
FUNDAMENTOS
23
Tabla 2.2: Operaciones de separacin y su propiedad bsica. Mtodo (Operacin) Propiedad
Destilacin Extraccin Cristalizacin Adsorcin Osmosis Inversa Ultrafiltracin Intercambio Inico Dilisis Electrodilisis Membranas Lquidas Electroforesis Cromatografa Filtracin por Gel
Presin de vapor Distribucin entre fases b'quidas inmiscibles Punto de fusin o solubilidad Sorcin superficial Difusividad y solubilidad Tamao molecular Equilibrio Difusividad Carga elctrica y movilidad inica Difusividad y equilibrio Carga elctrica y movilidad inica Depende del tipo de fase estacionaria Tamao y forma molecular
24
s
Afinidad
__ Homogmizactn Intercambio inico Filtracin n Gl
PrecipiUcin
Figura 2.2: Secuencia de operaciones utilizadas en un proceso de purificacin de protenas. Fuente: Bonnerjea et al, 1986.
Figura 2.2 frecuentemente la homogeneizacin va seguida de una precipitacin, despus la cromatografa de intercambio inico, la separacin por afinidad y finalmente la filtracin por gel. Esta secuencia es valida generalmente en el caso en que el producto sea una protena, la realidad es que cada producto presenta una secuencia de separacin ptima diferente.
Escala de Operacin
Frecuentemente la escala de operacin es el factor econmico determinante en la seleccin entre procesos de separacin alternativos. Cualquier proceso de separacin que se escoja, deber ser compatible con la escala industrial a la cual se va a disear. Esto es importante porque varios procesos desarrollados en el laboratorio no tienen su contraparte
2.2. FUNDAMENTOS
25
industrial. Muchas operaciones de separacin tienen un lmite respecto de la capacidad mxima que pueden manejar y esto limita la escala de produccin para la cual esa operacin puede ser considerada. En algunos casos, este lmite superior se debe a una restriccin impuesta por un fenmeno fsico inherente a la operacin de separacin, mientras que en otros casos el lmite superior se debe simplemente a las limitaciones que ofrece la fabricacin de equipo comercial. En la Tabla 2.3 se pueden observar las capacidades mximas en una sola etapa de algunas operaciones de separacin. Cada operacin de separacin tiene en s misma una determinada confiabilidad que es producto de la experiencia y conocimiento de la misma. As se tiene que la destilacin es la operacin ms confiable de los procesos de separacin por el conocimiento que de ella se tiene. La electroforesis en cambio, es una operacin que se realiza a pequea escala, entonces la nica forma de tener confiabilidad a gran escala es usando mltiples unidades en arreglo paralelo. Debido a consideraciones de confiabilidad del diseo, puede ser necesaria una planta piloto para probar la operacin integrada del proceso. En tal caso, todas las operaciones deben ser incluidas en la planta piloto an cuando no se requieran pruebas individuales de confiabilidad de cada una de ellas. Nmero de Etapas por Operacin Otra variable importante en la seleccin de un proceso de separacin (Figura 2.1), es el nmero de etapas de contacto que se realizan por operacin. En la mayora de los casos una operacin de una sola etapa es ms econmica que una operacin de etapas mltiples. Las operaciones de separacin que aparecen en la Tabla 2.1 tienen diferente habilidad para realizar una separacin en una sola etapa. As por ejemplo, la destilacin es una operacin capaz de separar una mezcla binaria en una sola etapa, siempre y cuando no haya formacin de mezclas azeotrpicas entre los componentes que sern separados. La extraccin requiere de al menos dos etapas de contacto para separar un flujo de alimentacin en dos corrientes y obtener el producto en condiciones aceptables. La adsorcin es una operacin que consiste de
26
Tabla 2.3: Capacidades mximas por operacin.

Operacin de Separacin Destilacin Extraccin Cristalizacin Adsorcin Osmosis Inversa Lmite Comercial por Operacin Simple Sin lmite Sin lmite 10-70xl06 kg/ao Sin lmite 0.45xl06 kg/ao flujo de agua por mdulo, con varios mdulos por unidad 0.45xl06 kg/ao de flujo de agua por mdulo, con varios mdulos por unidad 450xl06 kg/ao de ' flujo de agua 0.45x106 kg/ao de flujo de agua 1000 kg/ao de producto O.OQxlO6 kg/ao de lquido 100 kg/ao de producto
Ultrafiltracin
Intercambio Inico Electrodilisis Electroforesis Separaciones Cromatogrficas Filtracin por Gel
Fuente: Nuil, 1987.

Reproducida con el permiso de John Wiley and Sons. Copyright 1987. Todos los derechos reservados.
2.2. FUNDAMENTOS
27
dos etapas, la adsorcin en si misma, y la regeneracin del adsorbente. Tericamente la ultrafiltracin puede separar dos solutos de alto peso molecular si la diferencia en tamao molecular es del orden de 10; en caso de que esto no sea as, la separacin requiere varias etapas. En cualquier caso de los sealados anteriormente, se requieren etapas de procesamiento adicionales para obtener el producto con la pureza deseada. En el caso de las operaciones de electroforsis, cromatografa, y la filtracin en gel; dado que separan el producto por dilucin, requieren etapas de concentracin posteriores.
Costos
Una vez que ha sido definido el objetivo de la separacin, esto es, que se ha identificado el producto que se desea obtener y se ha establecido el proceso, se debe estimar el costo del mismo. Esto comprende la estimacin del costo total del producto y del capital necesario para la inversin. Ambos parmetros, conjuntamente con los ingresos esperados, determinan la rentabilidad del proceso. Costo Total del Producto.- Como se muestra en la Tabla 2.4, el costo total del producto se divide comunmente en dos partes: costos de fabricacin y gastos generales. En los costos de fabricacin se ubican los costos de operacin, los costos fijos y la parte proporcional de los gastos generales de la planta. Dentro de los costos de operacin directos se puede resaltar los costos de las materias primas que son consumidas directamente en el proceso de produccin del producto o que son usadas en la recuperacin del mismo, debido a que stas constituyen la'mayor parte de estos costos. Los costos de las materias primas son ms relevantes en sistemas de produccin basados en procesos biolgicos que en plantas qumicas convencionales. En los primeros las materias primas pueden representar del 30 al 80 % del costo de produccin, mientras que en los convencionales slo representan del 10 al 50 % de ese costo (Kalk y Langlykke, 1986). En los procesos de produccin biotecnolgicos, no solamente las materias primas principales (aquellas que se convierten directamente a producto) tienen un impacto significativo sobre la economa del proceso, sino que
28
Tabla 2.4: Factores que intervienen en el costo total del producto.

I.
Costos de Operacin Directos A. Materias primas y suministros a. materia prima primaria b. materia prima secundaria c. fletes d. operacin e. mantenimiento f. laboratorio g. otros B. Mano de obra y supervisin a. salarios y estmulos b. horas extras C. Servicios a. b. c. d. vapor electricidad agua tratamiento de desechos
II.
Costos Fijos A. Depreciacin B. Impuestos C. Seguros D. Renta
III.
IV. V. VI.
Proporcin de Gastos Generales de la Planta Administracin Mercadotecnia Investigacin y Desarrollo Para estimacin de costos: Costo de Fabricacin (CF) = I+II+IH Gastos Generales (GG) = IV+V+VI Costo Total del Producto =CF-f GG
2.2.
FUNDAMENTOS
29
I. Costos de Operacin Directos (59 % ) II. Costos Fijos ( 1 1 % ) III. Proporcin de Gastos Generales de la Planta ( 1 0 % ) IV. Gastos Generales (20 % )
de
0stos
?ara
un
Producto biotec-
tambin las materias primas secundarias como cofactores, enzimas inductores y materiales de recuperacin, influyen considerablemente en los costos de produccin. Los sueldos y salarios representan una fraccin importante del total de los costos de fabricacin, esto es, del 10 al 40 %. Los costos fijos comprenden la depreciacin de maquinaria y equipo impuestos y seguros principalmente. ' La parte proporcional de los gastos generales de la planta que se le asignan al producto, son aquellos que se requieren para la operacin eficiente de la planta pero no son asignables directamente al producto y se estiman entre el 10 y 50 % de los sueldos y salarios (Kalk y Langlykke, En la Figura 2.3 se presenta una estructura de costos tpica para un producto biotecnologa). Estimacin del Capital de Inversin.- El capital de inversin total se conforma del capital fijo y del capital de trabajo. El capital fijo se refiere a todos los fondos necesarios para el diseo, construccin y
30
arranque de la planta. Es en este punto donde se hacen las estimaciones de escala del proceso y la estimacin del costo de los equipos necesarios para las operaciones previas y las bioseparaciones. Cuando se comparan dos procesos de separacin alternativos, se escoge el que requiere mayor capital solamente si la rentabilidad generada es tan grande que justifica la diferencia de requerimientos de capital entre ambas alternativas. Los costos de arranque son difciles de estimar y pueden ir desde menos del 5 % del capital de inversin fijo para una planta basada en una tecnologa ya establecida, hasta ms del 50 % del capital fijo para nuevas tecnologas donde no se tiene experiencia, como son los proyectos biotecnolgicos. El capital de trabajo es la inversin necesaria para la operacin normal de la planta una vez contruda, y comprende los requerimientos de sueldos e inventarios. Ejemplo 2.1- Produccin de somatotropina porcina. Cuando se administra a cerdos la hormona somatotropina porcina (SP) se incrementa la velocidad de su crecimiento hasta en un 30 % y disminuye su contenido de grasa. Cada cerdo requiere de una sola dosis de 200 mg. Para producir SP mediante un cultivo de clulas recombinantes, se cuenta con los siguientes datos: 1. Mercado: Produccin estimada = 6,000 Kg/ao Precio por dosis de 200 mg = $6.00 dlls. (base: 1988) 2. Tcnicos: Concentracin celular al final de la fermentacin en peso seco 35
g/i
Peso protena/peso celular: 57 % Protena SP/protena total : 20 % Recuperacin total esperada: 25 % Duracin del ciclo de fermentacin: 30 h Das de operacin anual: 330 das
2.2. FUNDAMENTOS Impuesto sobre la renta (ISR): 45 % 3. Estimados: (a) Produccin de peso seco celular:
31
= 6000
ao 0.25 Kg = 210,500 Kg/ao
1 Kg 1 Kg 1 Kg x . . x ___ ? x *
0.2 Kg
0.57
(b) Volumen de fermentacin total (Vt): 210,000 Kg

*
35 f = 6,015,037 /
(c) Volumen por ciclo de fermentacin
Vc =
Vc
6,015,037 /
dias x ^ ciclo ., "24 h ~ ~ x
= 22,784 I ciclo
Este volumen de 22,784 I/ciclo puede ser manejado por un solo fermentador. Si se considera el volumen de fermentacin como el 70 % del volumen total del fermentador, entonces el volumen de fermentacin V/ es:
Vj = 32,500 /
Considerando este fermentador se realizan las siguientes estimaciones de costos.
32
CAPTULO 2. SELECCIN DEL PROCESO 4. Costos (dlls. base 1988)

I. Costos de operacin directos. (A) Materias primas y suministros: (B) Mano de obra y supervisin: (C) Servicios (agua, vapor, electricidad y tratamiento de desechos): II. Costos fijos. (A) Depreciacin: (B) Impuestos: (C) Seguros: (D) Renta: (E) Mantenimiento: III. Gastos generales de planta: IV. Administracin: V. Mercadotecnia: VI. Investigacin y Desarrollo: Total: 6,315,581.00 580,720.00 1,054,864.00 Subtotal: 2,939,746.00 587,949.00 293,975.00 000 000.00 1,763,848.00 Subtotal: 5,585,518.00 1,469,873.00 85,680.00 000.00 2,500,000.00 $ 17,592,236.00 7,951,165.00
5. Capital de inversin:
Inversiones fijas. (A) Equipo de proceso, instalacin e instrumentacin: (B) Instalaciones elctricas: (C) Edificios: (D) Instalaciones: Inversiones diferidas. (A) Ingeniera, construccin y contratos: Capital de trabajo. 2 meses de materias primas, servicios e investigacin y desarrollo:
10,618,780.00 487,100.00 2,191,950.00 2,679,050.00 Subtotal: 13,420,579.00 Subtotal: 1,756,141.00 Subtotal: Total: 1,756,141.00 $ 31,153,600.00 13,420,579.00 15,976,880.00
Estimar para este proceso: 1. El retorno sobre la inversin. 2. El costo promedio del producto.
2.2. FUNDAMENTOS 3. El costo porcentual de cada concepto del producto.
33
Solucin:
1. Clculo del retorno sobre la inversin: Ingreso anual: 6,000 j x ^92 Menos costo anual Utilidad bruta Menos 45 % ISR Utilidad neta Mas depreciacin 180,000,000 17,592,236 162,407,764 73,083,494 89,324,270 2,939,746
Flujo de efectivo neto
$ 92,264,016
El retorno sobre la inversin RSI expresado en porcentaje, est dado por el cociente del flujo efectivo neto y el capital de inversin por 100, por lo tanto:
RSI
$3115300 RSI = 296%

Esto significa que el proyecto es muy atractivo bajo las condiciones establecidas. 2. Costo promedio del producto: El costo promedio del producto se obtiene mediante el cociente del costo anual y la produccin estimada del producto, esto es: $17,592,236/ano G ost o F promedio = --6, 000 Kg/ao Costo promedio = 2, 932 $/Kg
$92,264016
3. Costo porcentual del producto por concepto.
34
Este costo est dado por el cociente del costo de cada concepto entre el costo de operacin: Concepto Materias primas y suministros Servicios Depreciacin Mantenimiento Gastos generales Inversin y desarrollo Otros Costo porcentual
6,315.581 17,592,236
X
1,054,864 .. 17.592,236 X 2.939,746 17,592,236 1,763,848 17,592,236 1,469,873 y 1 00 - 8 4% 17,592,236 X 1UU ~ O.1VO 2,500,000 . . 17,592.236 X
8.8%
100 - 1 16 7% x iuu D - /0 ~ '
Total:
100.00 %
2.3
Equipo
Parte importante en la seleccin de un proceso biotecnolgico consiste en determinar el equipo necesario para realizar una determinada operacin. Varios tipos de equipos pueden ser empleados para una misma operacin y la seleccin depende en gran medida del tipo de producto que va a obtenerse. La Tabla 2.5 muestra las operaciones ms comunes por etapa en funcin de las caractersticas de los procesos y productos biotecnolgicos. Algunos de los equipos ms usados en cada una de esas etapas son los siguientes: 1. Remocin de insolubles: Con frecuencia se usan sistemas de filtracin al vacio, sistemas de filtracin intermitentes, as como centrfugas tubulares, de discos con descarga intermitente o de canasta.
2.3. EQUIPO
35
Tabla 2.5: Operaciones de bioseparacin empleadas de acuerdo a las caractersticas del proceso
Generaciones Etapa Primera Segunda Tercera
Remocin de Insolubles
Filtracin Centrifugacin
Filtracin Microfiltracin Ultrafiltracin Centrifugacin
Microfiltracin Ultrafiltracin Centrifugacin
Rompimiento - Homogeneizacin - Abrasin - Permeabilizacin
Concentracin - Extraccin por solventes - Adsorcin - Destilacin Extraccin en dos fases acuosas Adsorcin Precipitacin Ultraftracin
Purificacin - Adsorcin - Cromatografa - Cromatografa - Ultrafiltracin - Electroforesis
36
CAPTULO 2. SELECCIN DEL PROCESO 2. Rompimiento celular: En esta etapa los equipos que ms se manejan son los homogeneizadores y los molinos de perlas. 3. Concentracin: En la concentracin del producto se emplean extractores que pueden funcionar en forma continua o intermitente, as como tambin tanques agitados y lechos empacados con diversos tipos de adsorbentes. 4. Purificacin: En esta etapa se emplean diversos sistemas cromatogrficos que se traducen en la utilizacin desde equipos muy sencillos como puede ser una simple columna, hasta equipos muy sofisticados como los utilizados en cromatografa liquida de alta resolucin. Tambin son utilizados en esta etapa sistemas de electroforsis. 5. Acabado: En la etapa de acabado, dependiendo de la presentacin con que se va a lanzar el producto al mercado, pueden utilizarse liofilizadores secadores y cristalizadores.
2.4
Diseo
El diseo de un proceso biotecnologa) comprende diversas actividades basadas en la experiencia, la teora y el apoyo computacional disponible. Entre estas actividades podemos destacar las siguientes: Sntesis: Establecimiento de las operaciones del proceso o diagrama de flujo. Anlisis: Modelacin y establecimiento de los valores de las variables del proceso. Evaluacin: Economa, seguridad y confiabilidad del proceso. Optimizacin: Determinacin de las condiciones para lograr el valor ptimo de una funcin objetivo. El xito de un diseo depende fuertemente de la sntesis del proceso ya que las tres actividades restantes: anlisis, evaluacin y optimizacin, se derivan del diagrama de flujo seleccionado.
2.4. DISEO
37
Actualmente existe un gran inters por el desarrollo de mtodos computacionales para el diseo de procesos que incluyan la sntesis de los mismos y que permitan el anlisis y la evaluacin de diversas alternativas, para encontrar en forma rpida el diseo ptimo. En la prctica los procesos rara vez se seleccionan de esta manera, dado que ni los algoritmos computacionales, ni las descripciones cuantitativas de los mtodos de separacin estn suficientemente desarrollados. Sin embargo, estos mtodos cada vez son ms utilizados como apoyo en algunas fases de la seleccin del proceso. En esta seccin se describen los dos enfoques complementarios utilizados para la seleccin de un proceso: Desarrollo de un Caso Base. Sntesis de procesos. Mtodo heurstico Mtodo algortmico Sistemas expertos
2.4.1
Desarrollo de un Caso Base
En la prctica normal el caso base representa el juicio cualitativo del ingeniero de diseo y presupone ser el proceso de separacin ms econmico que pueda ser desarrollado dentro de las restricciones que en tiempo y dinero tiene el proyecto (Nuil, l)87). Una vez que el caso base ha sido seleccionado, el diseador de proceso determinar los costos de operacin y capital con el mayor detalle posible. Cuando el caso base ha sido evaluado, se hace un juicio sobre el ms prximo proceso econmicamente competitivo. El proceso alternativo se evala con las mismas restricciones que el caso base. Si el proceso modificado tiene costos de operacin y capital ms bajos, entonces ste nos lleva a un nuevo caso base de diseo. Este nuevo caso base vuelve a probarse hasta encontrar un caso base ptimo.
38
2.4.2
Sntesis de Proceso
La investigacin que se realiza para seleccionar un proceso, es decir la secuencia de operaciones para transformar una serie de materias primas en productos, se llama sntesis de proceso. El mtodo heurstico, el mtodo algortmico y los sistemas expertos, son producto de este tipo de trabajos.
Mtodo Heurstico
El mtodo heurstico trata de limitar las alternativas posibles para un proceso usando reglas desarrolladas a travs de diseos previos y la experiencia. Al basarse en la experiencia, el sentido comn y la intuicin del ingeniero, la aproximacin heurstica no garantiza la solucin ptima. An as, estos mtodos han probado ser una herramienta valiosa en la optimizacin de la estructura del proceso. Algunas de estas reglas heursticas son generales y aplicables para la sntesis de procesos de bioseparacin. Cuatro de tales reglas heursticas son (Petrides et a/, 1989): 1. Primero remover el componente ms abundante. 2. Primero remover lo que sea mas fcil. 3. Hacer las separaciones mas caras y difciles al final. 4. Seleccionar el proceso que permita aprovechar al mximo las diferencias entre las propiedades del producto y los contaminantes. Existen reglas heursticas ms especficas que las mencionadas anteriormente, como las usadas en el diseo de procesos de purificacin de protenas a gran escala: 1. Si el producto es intracelular, se requiere romper la clula. 2. Si la clula cultivada es de mamfero, el producto es extracelular. 3. Si el rompimiento de la clula se lleva a cabo por mtodos mecnicos, se requiere precipitar los cidos nucleicos.
2.4. DISEO
39
4. Si la concentracin de la protena total al final de la recuperacin y antes de la purificacin, es menor que 60 g/l, se requiere concentrar el producto. 5. Si la alimentacin para la purificacin por cromatografa no es un caldo claro, se requiere un pretratamiento. 6. Si uno o dos pasos de intercambio inico producen una pureza similar a la de cromatografa de afinidad, debe escogerse el intercambio inico. 7. La filtracin en gel se puede utilizar como una etapa de separacin intermedia slo para la eliminacin de sales. 8. La filtracin por gel se puede utilizar como un paso de acabado slo para separar fracciones proteicas. Este tipo de reglas son utilizadas conjuntamente con otras an ms especficas, en el desarrollo de bases de conocimientos para sistemas expertos (Prokopakis y Asenjo, 1990). Aproximacin Heurstica para la Seleccin de un Proceso de Bioseparacin.- Se presenta en esta seccin una aproximacin heurstica de la sntesis de un proceso de bioseparacin de materiales biolgicos tpico (Petrides et a/, 1989). El primer paso en la sntesis de un proceso, consiste en desarrollar un diagrama de bloques de sus principales etapas. Posteriormente, se seleccionan para cada etapa las operaciones alternativas posibles. El desarrollo del diagrama de bloques est basado en la estructura general que se prqsenta en la Figura 2.4 1. Etapas de Recuperacin Primarias: Productos Intracelulares. En el desarrollo de un diagrama de bloques para un nuevo proceso, es necesario distinguir entre productos extracelulares e intracelulares. La recuperacin y purificacin de los productos extracelulares es comparativamente ms fcil de realizar que la de los productos intracelulares. En el caso de los productos intracelulares, las operaciones que se utilizan son las siguientes:
40
BtORREACTOR
Producto intracelular COSECHA DE CLULAS Centrifugacin Microfirtracin UKraftracin
Producto extraoelular REMCOON DE BIOMASA Filtracin al vaco Centrifugacin Microfiltracin Ultrafiltradn Filtracin en prensa Filtracin en cmara Rotacin
ROMPIMIENTO DE CLULAS Homogenizacin Molino d perlas Choque osmtico EXTRACCIN DELPROOUCTO Solventes orgnicos REMOCIN DE DESECHOS Centrifugacin Micfufilb acin Filtracin al vaco Filtracin por presin Polmero -s Ruidos supx Adsorcin Micelas inv Destilacin
RENATURAUZACION Solubilizacin Reoxidacin
CONCENTRACIN Ultrafiltradn Evaporacin Osmosis inversa Precipitacin Cristalizacin Extraccin Adsorcin Destilacin
Especificaciones de afta pureza
Especificaciones de baja pureza
PURIFICACIN FINAL Adsorcin Filtracin gei Eledrodialisis Diafiltracin Electroforesis
DESHIDRATAOON Secado por aspersin Secado por Ikrfilizaon Secado en lecho fluidizado
Figura 2.4: Diagrama de flujo de un proceso de bioseparacin. Fuente: Petrides et al, 1989.
Reproducida con el permiso de American Institute of Chemical Engiixeers. Copyright 1989 AIChE. Todos los derechos reservados.
2.4. DISEO
41
(a) Cosecha de Clulas: El primer paso en un proceso para la recuperacin de productos intracelulares es la cosecha de clulas. Remover primero el lquido extracelular, est en completa concordancia con la primera regla heurstica: primero remover el componente ms abundante. Como se establece en la Figura 2.4, la centrifugacin y la filtracin por membrana son las nicas tcnicas usadas para cosecha de clulas a gran escala. La centrifugacin tiene ventajas para microorganismos grandes (dimetro mayor que 2 mieras y densidad mayor que 1030 kg/m3). Para microorganismos ms pequeos pueden usarse tcnicas de coagulacin para aumentar el tamao de la partcula que sedimentar. La filtracin por membrana tiene ventajas para cosechar clulas pequeas como la de E. coli. Cuando el flujo es mayor que 20 //m 2 h, la filtracin por membrana es la que produce mejores resultados. Otra ventaja de la filtracin por membrana es la recuperacin del producto. Con la centrifugacin siempre se pierden de 1 a 5 % de las clulas. Con filtracin por membrana se recuperan todas las clulas, siempre que no se presente rompimiento o lisis. (b) Rompimiento de Clulas: Con frecuencia el segundo paso en la obtencin de productos intracelulares es el rompimiento de la clula. El rompimiento de bacterias y levaduras es realizado por homogeneizadores a alta presin o con molinos de perlas. Para altas capacidades (varios m3/h) solamente se puede disponer de homogeneizadores. Para el rompimiento celular, tambin se utilizan mtodos qumicos. Dentro de stos se puede destacar el uso de la digestin enzimtica para liberar protena intracelular de bacterias gram-positivas, la disolucin lipdica para el caso de bacterias gram-negativas, as como el choque osmtico que puede utilizarse para liberar protenas del espacio periplsmico. (c) Remocin de Desechos Celulares: Una vez que la clula se rompe y el producto es liberado, los desechos son eliminados por medio de una o varias operaciones como: centrifugacin, microfiltracin o filtracin por presin.
42
CAPTULO 2. SELECCIN DEL PROCESO Cuando el producto es soluble, ste es recuperado en la fase ligera de una centrfuga o en el filtrado de un filtro. Las centrfugas son eficientes para la separacin de partculas grandes como los restos celulares, de tal manera que cuando se usen para este efecto, deben ser acompaadas de una operacin de filtrado para eliminar las partculas ms pequeas; debido a que stas pueden ocasionar problemas en etapas de bioseparacin posteriores, principalmente en las de cromatografa. Cuando se usan microfiltros para remover los desechos, se requiere posteriormente realizar una diafiltracin. Cuando el producto es insoluble (por ejemplo los cuerpos de inclusin), debe ser separado primero de otras partculas y posteriormente tratado para que adquiera su forma activa. Este es un problema comn de muchas protenas eucariticas producidas por microorganismos procariotes, por ejemplo la hormona de crecimiento producida por E. coli. Las protenas recombinantes forman cuerpos de inclusin dentro de la clula husped. Estos pueden ser separados de los restos celulares con una centrfuga de discos. La purificacin es realizada por resuspensin y recentrifugacin de la fase pesada en 2 o 3 pasos. Posteriormente se pueden usar detergentes para remover otros contaminantes. La separacin del producto de los desechos puede ser llevada a cabo tambin por extraccin con solventes orgnicos o con algunas soluciones de polmeros. Los sistemas de dos fases acuosas han sido aplicados para la recuperacin de protenas. La separacin del producto de los desechos y su concentracin simultnea puede ser alcanzada utilizando tcnicas de extraccin-adsorcin utilizando ya sea adsorbentes de afinidad o de intercambio inico. En este proceso, las clulas rotas y el producto son mezclados en un tanque agitado con un adsorbente. Posteriormente sigue un paso de lavado en el cual muchos de los desechos y contaminantes son eliminados.
2.4. DISEO Etapas de Recuperacin Primaria: Productos Extracelulares.
43
(a) Eliminacin de Biomasa: La eliminacin de biomasa es el primer paso que se realiza en un proceso de separacin cuando el producto es extracelular. Este paso se ajusta a la segunda regla heurstica. En esta operacin los equipos ms empleados son: la centrfuga decantadora, los filtros prensa y los filtros con membranas. Cada uno de ellos tiene ventajas y desventajas segn el tipo de producto y tipo de clula, haciendo de la seleccin un problema difcil. No hay una alternativa nica para todos los productos. 2. Operaciones de Alta Resolucin. Una vez realizada la separacin primaria del producto ya sea ste intracelular o extracelular, la purificacin es llevada a cabo mediante operaciones de alta resolucin. Si el producto es soluble, primero es necesario concentrarlo. Si el producto es insoluble y se encuentra desnaturalizado, entonces primero se renaturaliza y despus se purifica. (a) Concentracin. Despus de una primera clarificacin del caldo obtenido del biorreactor o una vez rota la clula, el producto se encuentra diluido; para su concentracin las operaciones alternativas son: Ultrafiltracin, Extraccin, Osmosis inversa, Evaporacin, Precipitacin y Destilacin. i. Ultrafiltracin: Es una operacin usada ampliamente para la concentracin de protenas. La presin de operacin tpica vara entre 0.2 y 0.5 MPa y el flujo promedio entre 20 y 50 l/m2 - h. ii. Extraccin: La extraccin con solventes es una operacin ampliamente usada en la concentracin de productos biotecnolgicos, particularmente en la obtencin de antibiticos. Se requiere que el coeficiente de particin del sistema sea alto para poder llevar a cabo la concentracin del producto en el menor nmero de etapas de contacto.
44

iii. Osmosis Inversa: Se usan unidades con membranas de tamao de poro pequeo para la concentracin de soluciones de productos con bajo peso molecular. Operan a altas presiones (4 a 6 MPa) y a bajas temperaturas. iv. Evaporacin: Se utilizan evaporadores de pelculas delgadas los cuales operan a bajas temperaturas (4050(7) al vaco. Estas unidades compiten en el mercado con la ultrafiltracin y la osmosis inversa para la concentracin de compuestos tanto de alto como de bajo peso molecular. v. Precipitacin: Es una operacin usada para concentracin y purificacin. Comnmente se usan sales, solventes y polmeros para la precipitacin selectiva de compuestos de inters. La precipitacin es usada para remover contaminantes. vi. Destilacin: En los procesos de bioseparacin esta operacin se utiliza generalmente para la recuperacin de solventes orgnicos. (b) Renaturalizacin. Las protenas eucariticas producidas por organismos procariticos, frecuentemente forman cuerpos de inclusin en la clula recombinante. Estos cuerpos de inclusin pueden ser solubilizados mediante el uso de sales y agentes reductores. Despus que la protena desnaturalizada es solubilizada, se eliminan los solubilizantes utilizando cromatografa o diafiltracin. Al final se obtiene una solucin de protena diluida. 3. Purificacin. Las operaciones para la purificacin final dependen fuertemente de la pureza requerida del producto, distinguindose los productos farmacuticos por su alta pureza en comparacin a la de los productos industriales. Para productos de pureza relativamente baja como las enzimas para detergentes, la operacin de purificacin final consiste slo en la eliminacin del solvente. Para productos de alta pureza, las operaciones de purificacin finales son normalmente la cromatografa y la ultrafiltracin.
2.4. DISEO
45
(a) Cromatografa: Es una operacin que se realiza al final de un proceso, en concordancia con la regla heurstica "hacer las separaciones ms difciles y caras al final". Existen diferentes tipos de cromatografa como la de intercambio inico, la de filtracin por gel y la de afinidad, entre otras. Normalmente se requiere de una secuencia de varias operaciones cromatogrficas para alcanzar la pureza deseada del producto. En la seleccin de la secuencia de estas operaciones debe observarse la cuarta regla heurstica: "seleccionar el proceso que permita aprovechar al mximo las diferencias entre las propiedades del producto y los contaminantes. i. Cromatografa de Filtracin en Gel: Este tipo de cromatografa separa molculas en base a su tamao molecular; tiene dos aplicaciones principales: remocin de pequeas molculas de las protenas y remocin de protenas contaminantes de la protena producto. En el fraccionamiento de protenas, la filtracin por gel es lenta comparada con otras tcnicas cromatogrficas. ii. Cromatografa de Intercambio Inico: Esta separacin se basa en la diferencia de la carga molecular de las biomolculas. Puesto que el la carga depende del pH y la fuerza inica, cualquier anin o catin en un soporte puede ser usado para realizar la separacin. En la prctica sin embargo, la seleccin normalmente est determinada por el pH al cual es estable el producto que se desea purificar. iii. Cromatografa de Afinidad: Las separaciones por afinidad o reconocimiento molecular, estn basadas en las interacciones especficas entre biomolculas. Es una operacin apropiada en cualquier etapa de la purificacin del producto y particularmente lo es para el manejo de grandes volmenes de material con baja concentracin de producto y gran cantidad de contaminantes. Es una operacin altamente eficiente ( ms del 90 % ). Su limitante es el alto costo de los materiales (ligandos) involucrados.
46
4. Acabado.
Las operaciones de acabado comprenden aquellas que se realizan para la esterilizacin y estabilizacin del producto. Los microfiltros de membrana son utilizados para esterilizar soluciones biofarmacuticas, removiendo cualquier contaminacin bacteriana. Una limitante de estas membranas es la incapacidad para la remocin de pirgenos y virus. Para minimizar el riesgo de contaminacin el agua utilizada deber estar libre de pirgenos. Para incrementar la vida del producto se utilizan como agentes estabilizadores algunas sales como sulfato de amonio, cloruro de calcio o cloruro de sodio. Algunos productos son ms estables como slidos. Las tcnicas ms comunes de deshidratacin para productos inestables son la liofilizacin y la cristalizacin. Mtodo Algortmico El uso de algoritmos matemticos para desarrollar la sntesis de un proceso, es en teora el nico camino vlido para desarrollar un proceso ptimo. Esto se basa en el hecho de que todas las secuencias posibles para el procesos pueden considerarse rigurosamente. El desarrollo de estos algoritmos se lleva a cabo mediante tcnicas de programacin matemtica. Actualmente la lnea principal de investigacin en tcnicas de programacin matemtica, aplicadas a la optimizacin estructural de un proceso, se basa en el uso de la programacin lineal (o no lineal) entera mixta (MILP o MINLP de sus siglas en ingls). La idea principal de estas tcnicas es la formulacin de una superestructura que consiste en un diagrama de flujo que contiene todas las posibles alternativas de diseo. A cada operacin unitaria de la superestructura se le asocia una variable binaria (una variable que slo puede tomar los valores O 1) y se construye una formulacin ptima. A continuacin se presenta una descripcin de estas tcnicas para una situacin particular. Generalmente el problema consiste en separar una mezcla que tiene TV componentes: /4, B, (7,. . . y esta separacin puede ser realizada mediante M mtodos de separacin. La sntesis consiste en obtener la
2.4. DISEO
47
secuencia ptima de separacin utilizando el costo total como funcin objetivo. Para desarrollar este problema se hacen las siguientes consideraciones: 1. Se parte de una mezcla ternaria (ABC) y como resultado de una separacin o varias separaciones de la mezcla se obtienen los subgrupos: 1. (ABC), 2. (AB), 3. (BC\ 4. (AC), 5. (A), 6. (), 7. (C) 2. Los mtodos de separacin son: 1. destilacin y 2. extraccin 3. Los componentes en cualquier mezcla estn colocados en orden descendente con respecto a la propiedad caracterstica en la que se basa el mtodo de separacin. En el caso de la destilacin el orden de los compuestos de la mezcla es (ABC), lo que significa que el compuesto A tiene mayor volatilidad que el compuesto C. De esta manera pueden tener lugar dos separaciones en la columna de destilacin: (A/BC) o (ABIC). En el caso de la extraccin el orden en el cual se encuentran los componentes de la mezcla es (BAC), lo que significa que el componente B tiene mayor solubilidad que el componente C. En el extractor las separaciones que tienen lugar son: (B/AC) o (BA/C). 4. La funcin primaria de una etapa de separacin es separar los dos componentes adyacentes. Se denominan fase ligera y fase pesada a los componentes adyacentes entre los cuales tiene lugar la separacin. En la Figura 2.5. se muestra a superestructura que origina el problema de separacin de la mezcla ternaria considerando slo los mtodos de separacin alternativos: destilacin y extraccin. En la parte superior de dicha figura se muestra el proceso utilizando como operacin de separacin la destilacin y en la parte inferior se muestra la separacin por extraccin. La destilacin o la extraccin pueden ser usadas en cualquier nivel de la separacin.
48
(ABC)]
->(AB/C) DESTILAaON EXTRACCIN
-H (B/A) -H (A/B)
-4(BAq
-J (A/C)
Figura 2.5: Superestructura de todas las secuencias de separacin alternativas para una mezcla ternaria. Fuente: Prokopakis y Asenjo, 1990.
Reproducida con el permiso de Marcel Dekker Inc. Copyright 1990 . Todos los derechos reservados.
2.4. DISEO
49
Para sistematizar el anlisis se emplean las convenciones siguientes: 1. Se definen los siguientes ndices: i: subgrupo j: mtodo de separacin empleado k: fase ligera obtenida en la separacin 2. Se introduce una variable binaria 3/,,jk para cada operacin. Por ejemplo la variable binaria 3/1,1,1 se asocia a la separacin que se realiza en el grupo ABC ', por medio de la destilacin y cuya fase ligera es A. 3. Se define la variable costo C,,jt, para cada operacin. Esta variable es funcin de parmetros operacionales como : temperatura (T), presin (P) y flujo (F). 4. Se establece la funcin objetivo que permite la optimizacin del proceso, para la obtencin de la secuencia de separacin de costo mnimo. Esta funcin puede puede formularse como:
de tal manera que el costo total CT sea mnimo. La funcin objetivo est sujeta a las siguientes restricciones: 1. Una y solamente una separacin que involucre al subgrupo con N componentes (mezcla original) de,be existir en la secuencia.
M
N-l
y^k = l
j=l k=\
Para = 1, . 2" - 1
(2.2)
2. Para cualquier subgrupo, cuando mucho una separacin que involucre a ese subgrupo puede existir en la secuencia. Cualquier subgrupo que haya sido procesado no puede aparecer nuevamente en otra separacin.
50

M Ni-1
Z/ZXfc = 1 P<* = 3, .. . , J V - 1 j=i k=i donde TV,- es el nmero de componentes en el subgrupo.
(2.3)
3. Cualquier separacin (i,j,k) produce dos subgrupos. Si la separacin (i,j,k) existe, entonces existe una y solamente una separacin para para cada uno de los dos subgrupos. Sean m y n dos subgrupos, entonces:
M
p=l
Nm-l
E **.
g=l
g=l
M Nn-l
p=l
Resolver el sistema de ecuaciones a que da lugar la ecuacin (2.1) no es fcil, y su complejidad aumenta conforme aumenta el nmero de mtodos de separacin considerados y el nmero de componentes de la mezcla respectiva. En algunos casos la formulacin matemtica de un problema de secuenciacin de operaciones de separacin puede simplificarse, dando indicaciones al programa que le permitan la eliminacin de algunas operaciones de separacin. Por ejemplo: nunca usar la cromatografa de afinidad en presencia de partculas celulares o no usar la centrifugacin despus de la filtracin. En particular, los tres conjuntos de ecuaciones de restriccin dados en la formulacin anterior conjuntamente con las restricciones de los parmetros operacionales, garantizan la viabilidad de la solucin (Prokopakis y Asenjo, 1990). Sistemas Expertos Un sistema experto es un programa de computadora diseado para tomar decisiones fundamentadas en una base de conocimientos y en un sistema de inferencia. Una vez que el diseador ha alimentado al sistema experto (SE) con datos relativos al producto y a la fuente de
2.4.
DISEO
Parmetros generales Parmetros especficos Base de datos
51
Sistema Experto - Base de conocimientos Sistema de inferencia
Secuencia de Proceso
Figura 2.6: Diagrama de operacin de un sistema experto. donde se va a obtener, el sistema debe ser capaz de generar un proceso de recuperacin. En la Figura 2.6 se muestra un diagrama de operacin de un SE. En los procesos biotecnolgicos para obtencin de protenas, el diseo de la secuencia de las operaciones de recuperacin y purificacin utilizando un sistema experto, se inicia con la respuesta del usuario a preguntas bsicas sobre el producto y sobre la clula de la cual se va a obtener. Una pregunta tpica es la siguiente: Qu tipo de clula est siendo crecida para generar la protena en cuestin? cual es la concentracin?. Se preguntar tambin sobre algunas propiedades de la protena de inters que puedan afectar el proceso de separacin, como son: punto isoelctrico, hidrofobicidad superficial, peso molecular, localizacin dentro de la clula y concentracin. Una vez que se ha alimentado la informacin bsica al sistema, ste genera el diagrama de bloques de todas las etapas del proceso. Este diagrama contiene una descripcin de aquellas operaciones en la secuencia de separacin que deben ser llevadas a cabo para para obtener el producto con el rendimiento y pureza deseada por el usuario. Posteriormente el sistema decide sobre la operacin unitaria particular que
52
debe emplearse en cada etapa. En este tipo de sistemas la informacin cualitativa se proporciona mediante conjuntos de reglas inferenciales SI - ENTONCES". Ejemplo 2.2.- Funcionamiento de los sistemas expertos. Se desea seleccionar un proceso mediante un sistema experto, para la obtencin de insulina pura a partir de un caldo de E. coli recombinante que produce TrpE-Met-proinsulina intracelularmente (Prokopakis y Asenjo, 1990; Datar y Rosen, 1990). Solucin: 1. Deben alimentarse al SE los parmetros que caracterizan al proceso que en este caso son: Parmetros Generales Tipo de clula: E. coli recombinante Producto de inters: protena Localizacin celular: intracelular Nombre: insulina Presentacin en el mercado: cristales de insulina Parmetros Especficos Peso molecular Hidrofobicidad Punto isoelctrico Curva de titulacin Base de datos sobre liberacin diferencial del producto Base de datos de equilibrio en dos fases
2.4. DISEO
53
2. El sistema experto revisa las reglas de la base de conocimientos para seleccionar el equipo de cosecha (EC). Cuando existen equipos alternativos para realizar la misma operacin, el sistema cuenta con ponderaciones heursticas que auxilian la seleccin.
SI ENTONCES
Microorganismo = EC = EC =
Levadura Centrfuga de Discos Microfiltracin
0.6 0.4
SI ENTONCES
Microorganismo = EC = EC =
Bacteria Centrfuga de Discos Microfiltracin
0.5 0.5
En este caso debido a las caractersticas de la E. coli y al conocimiento experimental que se proporciona al SE, ste elige la opcin "centrfuga de discos" para la operacin de cosecha de clulas. 3. Una vez que se ha definido el equipo de cosecha debern establecerse los parmetros de la corriente de salida de la unidad, como son: concentracin, viscosidad, densidad y otros. El SE consulta al usuario sobre estos parmetros ya sea que hayan sido medidos o estimados estimados. 4. El SE decide sobre las operaciones siguientes en base a la informacin que le proporcione el usuario sobre la localizacin del producto, usando las siguientes reglas:
54
SI ENTONCES

Microorganismo = El Producto es Extracelular Mamfero
SI ENTONCES
El Producto es Intracelular Se Requiere Rompimiento Se Requiere Separacin de Desechos Se Requiere Precipitacin de cidos Nucleicos
El Producto es Extracelular No se Requiere Rompimiento No se Requiere Separacin de Desechos No se Requiere Precipitacin de cidos Nucleicos
5. En este caso como la protena de inters es intracelular, el SE establece la necesidad de realizar operaciones de rompimiento celular y separacin de desechos. Posteriormente el SE selecciona el equipo requerido para cada una de las operaciones. 1. En el caso de la operacin de rompimiento celular, utiliza las siguientes reglas para seleccionar el equipo de rompimiento celular (ER).
2.4. DISEO
55
SI ENTONCES
Se Requiere Rompimiento y Microorganismo = ER = Tamao de los Desechos =
Bacteria Homogeneizador Pequeo
SI
ENTONCES
Se Requiere Rompimiento y Microorganismo = y las proteasas son altas Agregue un inhibidor de proteasas al medio
Bacteria
SI ENTONCES
Levadura Homogeneizador Pequeo
SI ENTONCES
Hongo Molino de Perlas Medio
2. El sistema decide la separapacin de los cuerpos de inclusin del homogeneizado utilizando el mismo equipo de centrifugacin empleado en la cosecha celular.
56
Con las letras a, 6, c se muestran en la Figura 2.7 las tres primeras operaciones generadas con el SE. Hasta este punto del proceso la TrpEMet-proinsulina obtenida se encuentra formando cuerpos de inclusin. 6. Se establece la necesidad de solubilizar los cuerpos de inclusin con una solucin de cido clorhdrico-guanidina (GuHCl) y 3 mercaptoetanol en un reactor qumico, para obtener una solucin de TrpEMet-proinsulina. 7. Se establece la necesidad de concentrar la solucin de TrpE-Metproinsulina. Para decidir sobre el mtodo de concentracin y el equipo (EC) el SE utiliza las siguientes reglas:
SI
ENTONCES
Se Requiere Concentracin y la Eficiencia de la Separacin en Dos Fases = y la Eficiencia de Adsorcin = IMPRIME: Debido a que ambas operaciones tienen una eficiencia alta, el equipo ms adecuado ser aquel que se haya utilizado experimentalmente
Alta Alta
SI
ENTONCES
Se Requiere Concentracin y la Eficiencia de la Separacin en Dos Fases = y la Eficiencia de Adsorcin = EC =
Alta Mediana o Baja Separacin en Dos fases
2.4. DISEO SI Se Requiere Concentracin y la Eficiencia de la Separacin en Dos Fases = y la Eficiencia de Adsorcin = y la Eficiencia de la Interaccin Hidrofbica = ENTONCES EC =
57
Baja Baja Baja Precipitacin (sulfato de amonio)
En los procesos establecidos para la obtencin de insulina, la concentracin se realiza mediante una precipitacin. 8. Se decide utilizar el mismo equipo de centrifugacin empleado en la cosecha de clulas para separar el precipitado de la solucin anterior. 9. El concentrado se somete a un tratamiento en un reactor qumico para liberar la proinsulina. 10. La solucin obtenida en g est compuesta de proinsulina, fragmentos de TrpE y residuos de metionina, que podrn separarse por un proceso de ultrafiltracin para obtener un concentrado de proinsulina cruda (operacin h de la Figura 2.7). La concentracin de proinsulina se incrementa mediante una evaporacin. El concentrado de proinsulina cruda se renaturaliza en un reactor qumico. 11. Una vez renaturalizada la proinsulina debe ser purificada en una operacin de alta resolucin. El SE cuenta con reglas para la seleccin del equipo de alta resolucin (EAR) como las siguientes:
SI ENTONCES
Bioespecificidad es posible EAR = EAR = EAR =
Cromatografa Cromatografa Inico de Alta Cromatografa Hidrofbica
de Afinidad de Intercambio Resolucin de Interaccin
0.3 0.6 0.1
58
SI ENTONCES
Producto = EAR = EAR =
IgG Monoclonal Cromatografa de Afinidad Bioespecfica Cromatografa de Intercambio Inico (1 o 2 etapas)
0.6 0.4
SI ENTONCES
Producto = EAR = EAR =
No est Definido Cromatografa de Afinidad Cromatografa de Intercambio Inico
0.2 0.8
12. Al llegar a ciertos puntos de la secuencia el SE puede hacer preguntas adicionales al usuario, para poder determinar la operacin ms apropiada. Una pregunta puede ser: "Tendr el producto usos teraputicos?". Si el usuario a su vez pregunta "por qu?", el sistema responder: "Si el producto va a tener uso mdico la protena debe tener una pureza de 99.98% y debe estar libre de pirgenos". Cuando el usuario responde "s" a la pregunta del SE., entonces ste decide que la operacin de purificacin de insulina proveniente del reactor enzimtico (en el cual la proinsulina se transform en insulina) debe ser una cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), operaciones /, m de la Figura 2.7. 13. Finalmente se puede mencionar que para la seleccin de las operaciones de acabado el sistema toma en cuenta la presentacin del producto en el mercado, seleccionando para ello las operaciones o, p, </, de la Figura 2.7 y que producen la insulina humana recombinante, purificada al 99.9%, lista para su comercializacin. De lo antes expuesto se desprende que los sistemas expertos pueden ser una herramienta muy til en la sntesis de procesos de bioseparacin.
2.4.
DISEO
59
Fermentador
(a)
Cosecha de Clulas con centrifuga de discos
Clulas de E. cot
(b)
Rompimiento de Clulas con homogeneizador Cuerpos de inclusin de TrpE-Met-Proinsulina + desechos
(c)
Separacin por Centrifugacin con centrfuga de discos
Cuerpos de inclusin de TrpE-Met-Proinsulina

(d)
Solubilizacin en reactor qumico con GuHCI Solucin de TrpE-Met-Proinsulina
(e)
Precipitacin en reactor
Precipitado de TrpE-Met-Proinsulina
Figura 2.7: Diagrama de bloques para el proceso de obtencin de insulina humana.
60
(f)
Concentracin por Centrifugacin con Centrfuga de Discos
Concentrado de Trp E -Met-Proinsulina
(g)
Separacin Qumica de Trp-Met-Proinsulina en Reactor Qumico Proinsulina + TrpE + Metionina
\r
(h)
Separacin por UHrafittracin Concentrado de Proinsulina cruda
1r
Secado con Evaporador Centrfugo
ir
Concentrado de Proinsulina cruda
(i)
Renaturalizacin en Reactor Qumico Proinsulina activa en solucin
\r
Purificacin en Columna de Intercambio inico Proinsulina activa
1'2
Figura 2.7: Continuacin...
2.4.
DISEO
61
(i)
Transformacin en Reactor Enzimtico
ir
Purificacin > 99 % con HPLC
Insulina
Insulina Pura
\r
(n)
Concentracin por UKrafiltran Concentrado de Insulina
ir
(o)
Cristalizacin en Reactor Qumico Cristales de Insulina6-Zn2
ir
(P)
Concentracin con Centrfuga de Discos Pasta cristalina de Insulina6-Zn2
\r
(q)
Secado con Evaporador instantneo
Insulina Humana Recombinate 99.9 % de pureza
62
2.5
Sumario
La seleccin de un proceso de separacin para la obtencin de un producto biotecnolgico se basa fundamentalmente en el mercado del producto y en sus especificaciones. Existen varios mtodos que contribuyen a seleccionar el proceso de bioseparacin ptimo, sin embargo el proceso final generalmente es obtenido mediante una combinacin de la teora y la experiencia de que se dispone.
2.6.
PROBLEMAS
63
2.6
Problemas
2.1.- Desarrollar un diagrama de flujo de un proceso para la obtencin de un producto biotecnolgico. 2.2.- El proceso de obtencin de una enzima consta de cuatro operaciones de separacin, cada una de ellas presenta una eficiencia de recuperacin del 80 %. Estime la recuperacin global del proceso. 2.3.- Se cuenta con los siguientes datos para producir insulina recombinante: (A) Mercado: Produccin (B) Costos anuales:
ao 1: ao 2-10:
1,000 kg/ao $34,877.00 $31,525.00 $2,766.00 $30,468.00 $2,742.00
(C) (D) (E) (F)
Depreciacin: Inversin fija y diferida: Capital de Trabajo: ISR: 45%
Estimar el precio de venta para obtener un Retorno Sobre la Inversin (RSI) de 40%. Resp. $53,664.00/Kg
64
2.7
Bibliografa
Bonnerjea, J., Oh, S. y Hoare, M. 1986. Protein purification: The right step at the right time. Bio/Technology. 4, 954-958. Datar, R. y Rosen, C. 1990. Downstream process economics. En: Separation Processes in Biotechnology. Asenjo, J. A. (Ed.). Marcel Dekker Inc. New York. 741-793. Kalk, J. P. y Langlykee, A. F. 1986. Cost estimation for biotechnology projects. En: Industrial Microbiology and Biotechnology. Demain, A. L. y Solomon, N. (Eds.). American Society for Microbiology. New York. 363-384. Kelly, R. M. 1987. General processing considerations. En: Handbook of Separation Process Technology. Rousseau, R. W. (Ed.). John Wiley & Sons. New York. 4, 197-225. Knight, P. 1990. Bioseparations: Media and modes. Biotechnology. 8,200-201. Nuil, H. R. 1987. Selection of a separation process. En: Handbook of Separation Process Technology. Rousseau, R. W. (Ed.). John Wiley & Sons. New York. 22, 982-995. Petrides, D. P., Cooney, C. R. y Evans, L. B. 1989. An introduction to biochemical process design. En: Chemical Enginnering Problems in Biotechnology. Shuler, M. L. (Ed.). AIChE. New York. 351-391. Prokopakis, G. J. y Asenjo, J. A. 1990. Synthesis of downstream processes. En: Separation Processes in Biotechnology. Asenjo, J. A. (Ed.). Marcel Dekker Inc. New York. 571-601. Spalding, B. 1991. Downstream processing: Key to slashing production cost 100 fold. Bio/Technology. 9, 229-240.
Parte II Remocin de Insolubles y Ruptura Celular.
67
Del conjunto de operaciones que integran normalmente un proceso de bioseparacin, en esta parte se revisan las relacionadas con la remocin de insoluoles y la ruptura celular, que son utilizadas en las primeras etapas de recuperacin del producto de acuerdo a las tres primeras reglas heursticas de la seleccin del proceso de separacin. En las operaciones de remocin los principales insoluoles que se consideran son clulas enteras, restos celulares y cuerpos de inclusin. Para la remocin de insoluoles de un caldo pueden ser utilizados diversos tipos de equipos; la seleccin depende de varios factores como el tipo de clula, la disponibilidad de equipos, eficiencias y costos. Las operaciones tpicas de remocin de insolubles son la filtracin tradicional, muy utilizada para la separacin de hongos filamentosos; y la centrifugacin, empleada en la separacin de levaduras, bacterias y clulas de mamferos. Estas operaciones se tratan en los captulos 3 y 4, respectivamente. Cuando el producto de inters es intracelular despus que las clulas han sido separadas del caldo es necesario romperlas. En el captulo 5 se presentan los principales equipos que se emplean en esta operacin a nivel industrial y los principales factores para su diseo.
Captulo 3 Filtracin
3.1 Introduccin
La filtracin consiste en la separacin de un slido de un fluido por accin de un medio filtrante y un gradiente de presin. Normalmente en los procesos biotecnolgicos se utilizan tres tipos de mecanismos de filtracin (Figura 3.1): - Filtracin de lecho profundo. - Filtracin con formacin de torta o filtracin convencional. - Filtracin por membranas (Microfiltracin y Ultrafiltracin). En la filtracin de lecho profundo los slidos se depositan dentrc del medio filtrante. En la filtracin con formacin de torta los slido; se depositan sobre el medio filtrante formando una pasta. La filtracii por membrana se realiza utilizando membranas especiales de tamaru de poro muy pequeo, que generalmente operan con flujo paralelo a 1; membrana (cruzado), de tal manera que no hay un depsito de slido sobre la membrana sino una concentracin del caldo. De los tres mecanismos de filtracin descritos, dos son de partcula inters en las bioseparaciones slido-lquido: La filtracin convencionc y la filtracin con membranas.
70
CAPTULOS.
FILTRACIN
Suspensin
a). Filtracin de lecho profundo
l i l i
Suspensin Suspensin
Medio filtrante
b). Filtracin con formacin de torta f\
> Retenido Membrana Filtrado c). Filtracin con membrana
Figura 3.1: Mecanismos de filtracin.
3.2. FUNDAMENTOS
71
El objetivo este captulo es presentar los aspectos fundamentales de la filtracin convencional y su aplicacin a la filtracin de caldos biolgicos. La filtracin por membranas se revisa en el captulo 10. En la seccin 3.2 de este captulo se centra la atencin en los fundamentos de la filtracin convencional. Los principales equipos que se utilizan en este tipo de filtracin se presentan en la seccin 3.3. La seccin 3.4 se dedica a presentar los aspectos ms relevantes del diseo de filtros convencionales.
3.2
Fundamentos
La filtracin convencional forma parte de un conjunto de operaciones llamadas Bioseparaciones Slido-Lquido (BSL). Para llevar a cabo un proceso de BSL generalmente es necesario seleccionar entre una operacin de filtracin y una operacin de sedimentacin (como la centrifugacin), y frecuentemente la decisin es instrumentar una combinacin de estos dos tipos de operaciones. Debido a la naturaleza de los caldos que se manejan en bioseparaciones, es comn que stos sean pretratados mediante agentes fsicos o qumicos para mejorar su comportamiento en las operaciones de separacin slido-lquido a que van a ser sometidos. Un aspecto fundamental en el tratamiento de la operacin de filtracin es la teora bsica existente, la cual contribuye al diseo, seleccin y operacin racional de los diferentes equipos de filtracin. De particular inters es observar como esta teora puede ser utilizada en la filtracin de caldos biolgicos. En base a lo anterior, esta seccin se entra en tres aspectos fundamentales: La filtracin como parte de los sistemas de BSL. El pretratamiento de caldos biolgicos. La teora de la filtracin convencional.
72
Caldo
CAPTULOS.
FILTRACIN
lquido
liquido
Figura 3.2: Etapas y mtodos de las BSL. Adaptada de Tiller, 1974.

Reproducida con el permiso de Me Graw Hill Inc. reservados. . Copyright 1974. Todos los derechos
3.2.1
La Filtracin corno parte de los Sistemas de BSL
Un proceso de separacin slido-lquido (Figura 3.2) consta generalmente de una o ms etapas (Tiller, 1974 ), entre las que destacan las siguientes: - Pretratamiento. - Concentracin. - Separacin de slidos. - Postratamiento. El pretratamiento mejora las propiedades del caldo para facilitar la separacin. La concentracin de slidos permite una separacin gruesa de slidos que disminuye el volumen a manejar, y puede disminuir los
3.2.
FUNDAMENTOS
73
Tabla 3.1: Factores para el diseo y seleccin de procesos de BSL.

Requerimientos del Proceso Flujo Intermitente o continuo % Separacin Postratamientos Esterilidad Propiedades del Caldo Tamao de partcula densidades Viscosidad Tiempo sedimentacin % Slidos Tipo de torta Espumeo Toxicidad Labilidad Caractersticas del Equipo Capacidad Intermitente o continuo Tamao de partcula Conc. mxima Capacidad de lavado Esterilidad Claridad descarga
costos del proceso global de separacin slido- lquido. La mayor parte de los slidos es obtenida en la etapa de separacin . Los slidos recuperados pueden requerir un postratamiento de lavado o secado de acuerdo con los requerimientos del proceso. En el diseo y seleccin del proceso de BSL es necesario considerar varios factores de orden tcnico que deben conjuntarse para una adecuada decisin. En la Tabla 3.1 se presentan algunos de estos factores agrupados de acuerdo a los requerimientos del proceso, las propiedades del caldo y los equipos disponibles. En general todos los sistemas mecnicos de BSL estn basados en dos principios (Svarovsky, 1979) que dan origen a las operaciones de: - Sedimentacin. - Filtracin. En el proceso de sedimentacin la separacin se basa en una diferencia de densidad entre la fase slida y la fase lquida. Entre mayor sea esta diferencia la separacin es ms fcil. Cuando esto no ocurre, la diferencia puede ser aumentada aparentemente aplicando una fuerza centrfuga o incrementando la densidad de la partcula por medio de una coagulacin o una floculacin. Los principales equipos utilizados en BSL que se basan en el principio de sedimentacin, son los sedimentadores por gravedad y las centrfugas.
74
CAPTULOS.
FILTRACIN
En la filtracin la separacin se logra utilizando un medio fsico que no permite el paso de slidos a travs del cual el fluido se hace pasar por medio de un gradiente de presin. En general los sistemas de sedimentacin son ms baratos y pueden operar continuamente, pero no recuperan el 100% de los slidos. Sin embargo, an cuando el sedimentador no alcance la separacin deseada, es posible utilizarlo conjuntamente con un filtro como una operacin de concentracin previa a la de acabado que realiza la filtracin. En el diseo y seleccin de sistemas para BSL es necesario considerar algunos factores de orden prctico que permiten complementar los anlisis que se efectan en cada uno de los captulos de esta parte del libro, dentro de los cuales se puede destacar los siguientes: - Varias combinaciones de equipos pueden ser tcnicamente factibles para lograr una determinada separacin . Sin embargo, tratndose de materiales biolgicos el nmero de posibilidades se reduce considerablemente. - El anlisis terico que se dispone de las BSL es limitado, as como el conocimiento de las propiedades bsicas de los medios (porosidad, permeabilidad, tiempo de sedimentacin, etc.), de tal manera que en el diseo y seleccin del equipo las pruebas experimentales directamente con el material, y la experiencia, juegan un papel muy importante. - Parte considerable de la informacin, la experiencia y los equipos para pruebas experimentales, est en manos de las compaas fabricantes y/o distribuidoras del equipo. - La escala de experimentacin vara con el tipo de operacin. En el diseo de filtros puede ser suficiente los datos obtenidos en el laboratorio. En el caso de centrfugas es generalmente necesario realizar pruebas a nivel piloto o a escala industrial.
3.2.2
Pretratamiento de Caldos para BSL
Las propiedades de los caldos sujetos a BSL pueden ser mejoradas por medio de pretratamientos fsicos, qumicos o biolgicos con el objeto de
3.2. FUNDAMENTOS
75
facilitar estas operaciones. A continuacin se describen tres tipos de pretratamientos comnmente empleados para caldos biolgicos.
Pretratamiento Trmico
El calentamiento de los caldos permite reducir su viscosidad, su volumen y romper estructuras gelatinosas que dificultan las operaciones posteriores. En el caso de caldos de clulas recombinantes esta operacin es obligada por cuestiones de seguridad ambiental. Por otro lado, esta operacin es de uso limitado cuando se manejan productos termolbiles.
Coagulacin y Floculacin
Debido a que los caldos biolgicos sujetos a BSL presentan partculas muy pequeas (0.5 a 100 /m), los pretratamientos para incrementar el tamao de partcula facilitan su manejo. Las partculas coloidales (tamao en el rango de una miera) no sedimentan fcilmente debido a que por accin de sus cargas superficiales forman suspensiones muy estables llamadas soles, a diferencia de las suspensiones formadas por partculas de mayor tamao que sedimentan con relativa facilidad. Las soles pueden ser alteradas por medio de agentes qumicos. En el proceso de coagulacin se emplean electrolitos simples que neutralizan las cargas repulsivas superficiales de las clulas o partculas, lo cual genera fuerzas de atraccin del tipo de London- Van Der Waals entre ellas, que permiten formar partculas ms grandes y densas. Los electrolitos ms empleados son derivados de iones polivalentes positivos como fierro, aluminio y calcio. La coagulacin tambin puede ser efectuada empleando sustancias que varen el pH del caldo y por lo tanto la carga superficial de las partculas. En el proceso de floculacin se utilizan sustancias qumicas sintticas de alto peso molecular llamadas polielectroltos. Estos producen un efecto combinado (Figura 3.3) ya que actan neutralizando las cargas superficiales de las partculas y provocan su atrapamiento por medio de las redes que forman. Los polielectroltos pueden ser aninicos, catinicos o neutros. Los
76
CAPTULOS.
FILTRACIN
Figura 3.3: Mecanismo de floculacin. materiales disponibles comercialmente son derivados de la poliacrilamida, polietilenimina y la poliamina. Es importante sealar que los pretratamientos qumicos son de uso limitado dado que implican la adicin de sustancias al caldo que pueden agregar toxicidad o impurezas a ste. Uso de Ayudas-Filtro En las operaciones de filtracin convencional se emplean sustancias slidas llamadas Ayudas-Filtro (AF). Estas sustancias se adicionan al caldo antes de la filtracin y/o se utilizan como precubierta del filtro. Los AF actan como adsorbentes de las partculas coloidales mejorando el tamao de partcula, y mejorando la incompresibilidad y permeabilidad de los slidos, de tal manera que se facilite su filtracin. Los AF mas utilizados son las tierras diatnicas (Rees, 1990) y las perlitas. Las tierras diatnicas son restos de esqueletos de pequeas plantas acuticas prehistricas que se obtienen de depsitos naturales. Las perlitas se obtienen de vidrios volcnicos que contienen de 2 a 5% de agua, que permite romperlos por accin trmica o de presin, formando un polvo con caractersticas apropiadas como AF.
3.2. FUNDAMENTOS
77
Con el uso de los AF la filtracin se convierte en una operacin de tres pasos: - Primero se forma una precubierta de AF sobre el medio filtrante haciendo reciclar sobre ste una lechada de AF. - Una vez formada la precubierta se inicia la alimentacin del caldo a filtrar, al cual se le agrega continuamente una dosis de AF. Esto permite que las caractersticas de la superficie de filtracin se mantengan uniformes. - Al final del ciclo la precubierta de AF debe ser removida. La precubierta de AF permite retardar el taponamiento del filtro, facilita su limpieza, disminuye la cada de presin y produce un filtrado de calidad uniforme. La adicin continua de AF al caldo es uno de los mtodos ms efectivos para minimizar los costos de filtracin. La dosis de AF que es necesario agregar continuamente es funcin directa de la concentracin y compresibilidad de los slidos del caldo. Asimismo, entre ms rpido se desee efectuar la filtracin, la dosis necesaria es mayor, ya que para aumentar la velocidad de filtracin se requiere un mayor gradiente de presin, lo que hace necesario aumentar la incompresibilidad y porosidad del material slido. Existen diversas marcas comerciales de AF que difieren bsicamente en el tamao de partcula. Los de partculas ms grandes facilitan la filtracin pero producen filtrados ms turbios. La seleccin implica un compromiso entre el flujo deseado y la claridad aceptable.
3.2.3
Teora de la Filtracin,
La filtracin convencional (Figura 3.4) puede ser definida como la separacin de los slidos de un lquido. Esta se efecta haciendo pasar una suspensin a travs de un medio permeable que retiene los slidos utilizando un gradiente de presin. La teora de la filtracin convencional se deriva de los estudios de la mecnica de fluidos en medios porosos. La ecuacin que describe el movimiento de fluidos newtonianos a travs de medios porosos, fue formulada en 1856 por el gelogo Francs D'Arcy. La aplicacin de
78
CAPTULOS.
FILTRACIN
/ i
O
Fuerza impulsora Presion Vaco
N 4>
Suspensin
. 0 * 0
oo0oo0o0c?o0o0cP
Medio filtrante
l i f l l l l l l
r
Filtrado
EQUIPO DE FILTRADO
Figura 3.4: Concepto de filtracin. esta ecuacin al caso particular donde se desprecian los efectos gravitacionales (lechos cortos), puede ser escrita como:
v=
donde 1 :
kAP V*
(3.1)
Las unidades de los miembros de las ecuaciones se presentan en trminos de dimensiones fundamentales y entre parntesis cuadrados. Las dimensiones fundamentales se representan como: F: Fuerza. M: Masa. L: Longitud, : Tiempo. : Temperatura. Las unidades bsicas empleadas en la mayor parte del texto corresponden a las del Sistema Internacional de medidas (SI).
3.2. FUNDAMENTOS
79
v: Velocidad superficial de lquido (flujo volumtrico por rea de filtracin). [L/t]. k: Permeabilidad del lecho. [Z/2]. AP: Cada de presin a travs del lecho. [F/L2]. i\ Profundidad del lecho filtrante. [L]. fj,: Viscosidad del fluido. [M/L t]. La velocidad de filtracin puede ser descrita en trminos del volumen de filtrado y el rea de filtracin (dos parmetros ms fcilmente medibles) como:
Combinando las ecuaciones (3.1) y (3.2) y expresando la relacin i/k como una resistencia /?, se puede obtener la ecuacin diferencial bsica de la filtracin convencional:
A dt
En la ecuacin (3.3) R es la resistencia total a la filtracin. Esta resistencia puede expresarse como la suma de dos resistencias en serie:
R = Rt + Rm
(3.4)
donde Rt es la resistencia de la torta y Rm es la resistencia del medio filtrante. Combinando la ecuaciones (3.3) y (3.4) se obtiene:
}
A dt
^ '
Las ecuaciones (3.3) y (3.5) slo pueden ser aplicadas a soluciones diluidas en rgimen laminar, cuando el nmero de Reynolds modificado es menor a 5, :
80
CAPTULOS.
FILTRACIN
Lecho Marcos y Placas Batch a presin < Elementos Filtros Torta Charolas Hojas
Continuos al vacio
Uttrafiltradn Membrana
Microfiftractn
Figura 3.5: Clasificacin de filtros.
<5
(3.6)
donde dp es el dimetro de partcula o dimetro del poro en la torta, p es la densidad del fluido y e es la fraccin de espacio vaco del lecho. En general las biofiltraciones cumplen con esta condicin.
3.3
Equipo de Filtracin
Existe una gran variedad de filtros (Figura 3.5) cuyo mecanismo de filtracin es la formacin de torta (Moir, 1982). Estos tipos de filtros se pueden dividir en dos grandes grupos: Filtros intermitentes a presin. Filtros continuos al vaco.
3.3.1
Filtros Intermitentes a Presin
En los filtros intermitentes a presin la solucin que contiene el slido a separar, es alimentada continuamente al filtro. Una vez que se acu-
3.3. EQUIPO DE FILTRACIN
81
mua una determinada cantidad de slido sobre el medio filtrante, la operacin es interumpida para descargar la torta, limpiar el filtro e iniciar un nuevo ciclo. Este tipo de filtros pueden ser agrupados en dos categoras (Figura 3.6): - Filtros prensa de marcos y placas. - Filtros de cmara con elementos filtrantes (hojas, charolas o tubos). Los filtros intermitentes de uso ms amplio son los filtros de marcos y placas. La unidad de filtracin est formada por un marco que contiene dos placas formando una cmara de filtracin. Los filtros constan de varias de estas unidades que operan en paralelo produciendo un slido bastante seco. Los filtros de marcos y placas normalmente operan en contacto con el ambiente y no son recomendables para cuando se trabaja con sustancias txicas. Los filtros de cmara con elementos filtrantes toman su nombre del tipo y orientacin de los elementos filtrantes. Operan en ambientes cerrados, tienen una relacin de rea/volumen relativamente alta y son utilizados cuando los volmenes de filtracin son bajos. En los filtros intermitentes al finalizar cada ciclo de filtracin la torta debe ser descargada manualmente, por lo que este tipo de equipos puede tipificarse como de mano de obra intensiva, recomendables slo para bajas escalas de produccin.
3.3.2
Filtros Continuos al Vaco
Los filtros continuos ms utilizados en las bioseparaciones, principalmente en la produccin de antibiticos, son los tipo tambor rotatorio al vaco (Figura 3.7). Este tipo de filtros se distinguen de los intermitentes por el hecho de que al girar permiten una descarga continua de la torta, de tal manera que pueden operar continuamente por perodos largos de tiempo con flujos entre 200-1000 //m 2 h (Petrides et a/, 1989). Normalmente utilizan ayudas-filtro en dosis equivalentes a la concentracin de slidos del caldo que origina un problema de deseche de slidos.
82
CAPTULOS.
FILTRACIN
Placas
Marcos
+ Filtrado
Suspensin
Filtro de placa y marcos
Tela Placas Suspensin
Marcos
Mecanismo de filtrado Espacio torta
Figura 3.6: Filtros intermitentes. Tomada de: Svarouvsky, 1979.

Reproducida con el permiso de Me Graw Hill Inc. Copyright 1979. Todos los derechos reservados.
3.3. EQUIPO DE FILTRACIN
83
Mecanismo de descarga de torta
Suspensin
nitro horizontal con hojas verticales
Venteo nitrado
Tubos
Formado de torta e lpade extema del tubo
Suspensin Filtrado Suspensin Filtro tubular Filtro de hojas
84
CAPTULOS.
FILTRACIN
Rotacin Sistema de ' aspersin
Descarga torta
Caldo
Figura 3.7: Vista lateral de filtro continuo tipo tambor.
3.4
Diseo de Equipo de Filtracin
En esta seccin se centra la atencin en el uso de la teora fundamental de la filtracin en el diseo de dos tipos de filtros: Filtros Intermitentes. Filtros Continuos. En primer trmino se revisa el caso de la filtracin intermitente donde la torta es incompresible y la filtracin se realiza con un gradiente de presin constante. En segundo trmino se revisa este mismo desarrollo pero para el caso donde la torta es compresible, que es el tipo de filtracin ms comnmente empleada en bioseparaciones a escala moderada. Finalmente, se aborda el diseo de los filtros continuos con tortas compresibles que es el caso ms comn para las filtraciones de caldos biolgicos a gran escala.
3A. DISEO DE EQUIPO DE FILTRACIN
85
3.4.1
Filtracin Intermitente
En la filtracin intermitente con formacin de torta la separacin depende de varios factores dentro de los que destacan la permeabilidad de la torta que forme el slido que se desea separar, el tamao del poro de la torta, el tamao de la partcula del slido y la compresibilidad de la torta. Desde el punto de vista de los parmetros de operacin dos tipos particulares de filtracin intermitente son industrialmente importantes (Brown, 1982): - La filtracin intermitente a flujo constante. - La filtracin intermitente con cada de presin constante. La filtracin intermitente a flujo constante se produce debido a que algunos tipos de bombas producen el mismo flujo a diferentes cabezales. En la filtracin intermitente con cada de presin constante, se produce una disminucin gradual del flujo conforme aumenta el espesor de la torta. Este tipo de filtracin es especialmente til en la adquisicin experimental de datos para diseo, ya que el seguimiento del volumen del filtrado con el tiempo es relativamente fcil de medir. Tanto en el caso de la filtracin intermitente a cada de presin constante, como en la de flujo constante , la resistencia de la torta vara conforme avanza el tiempo de filtracin al irse acumulando slidos. Sin embargo, la resistencia especfica de la torta puede ser variable o no. Esta variacin depende de la naturaleza de la torta. El anlisis general de la filtracin intermitente que se desarrolla en este captulo, inicia con el tratamiento de tortas incompresibles cuya resistencia especfica es constante. Posteriormente este tratamiento se aplica al caso particular de tortas compresibles, las cuales son caractersticas de materiales biolgicos. Este desarrollo slo ser referido al caso en el cual la cada de presin es constante. Filtracin Intermitente: Tortas incompresibles y AP constante En el caso de tortas incompresibles la resistencia de la torta puede suponerse directamente proporcional a la cantidad de slidos (peso seco) depositados por unidad de rea. Esto puede expresarse como:
86
Rt = aw
CAPTULOS.
FILTRACIN
(3.7)
donde w es la cantidad de slidos secos depositados por unidad de rea y a es la resistencia especfica de la torta. La ecuacin (3.7) puede ser expresada en trminos de parmetros ms fcilmente medibles:
R, = <*P, -r
(3-8)
donde p0 es la cantidad de masa slida seca por unidad de volumen libre de slidos o volumen de filtrado del caldo a separar. Combinando las ecuaciones (3.5) y (3.8) se tiene:
di ~ p [ap0 (
La ecuacin (3.9) puede escribirse en su forma recproca, e integrarla con las siguientes condiciones iniciales: para t =Q V=0
y obtener la siguiente ecuacin:
M V
ta V V2AP/ A +
,
l
'
La ecuacin (3.10) puede ser utilizada para la obtencin de parmetros de filtracin en equipos intermitentes a presin constante. Guando se grfica At/V vs V/A se produce una lnea recta con: pendiente = ordenada en el origen =
2AP
AP Un caso particular de la ecuacin (3.10) se presenta cuando la resistencia del medio es despreciable, entonces la ordenada en el origen toma el valor de cero y la ecuacia se reduce a:
V
(3J1)
3.4. DISEO DE EQUIPO DE FILTRACIN
87
Cido de Operacin
Rujo constante
Cada de
Descarga
AP
Figura 3.8: Cada de presin contra tiempo en una filtracin intermitente. Otro caso particular de la filtracin intermitente con cada de presin constante se produce cuando se desea asegurar una formacin uniforme de la torta evitando flujos altos al inicio de una corrida, que inducen la penetracin de slidos sobre el medio filtrante. En este caso la cada de presin se incrementa gradualmente hasta alcanzar una cada de presin constante (Figura 3.8). Bajo estas condiciones la integracin de la ecuacin (3.9) se efecta en el rango de cada de presin constante, con las condiciones iniciales para t = ts obtenindose la ecuacin: (t-ts)A _ _ anp0(V + V,) i ^rim ' V = Vs
(V-VS)
2AP
AP
(312) '
la que nos permite calcular parmetros experimentales al graficar: (t-t,)A
(v-vs)
vs
88
CAPTULOS.
FILTRACIN
Filtracin Intermitente: Tortas compresibles y AP constante La compresibilidad de una torta se caracteriza por un aumento de su resistencia especfica al aumentar el gradiente de presin que acta sobre la torta. La mayora de las tortas de material biolgico son compresibles. En estos casos la resistencia especfica puede ser correlacionada con el gradiente de presin mediante la siguiente ecuacin emprica (Silverblatt et al, 1974): a = a'(AP)5 (3.13)
donde a1 es una constante relacionada principalmente con el tamao y forma de las parculas de la torta, y s es el ndice de compresibilidad. Este vara de cero para una torta incompresible a 0.8 para una torta altamente compresible (la correlacin es aceptable para s < 0.6 y AP > 0.2 atmsferas). La determinacin experimental de 5 y a1 requiere la realizacin de varias corridas de filtracin con cada de presin constante a varios niveles. Los datos pueden ser correlacionados en una grfica log(a) vs log(AP). Entre mayor sea el valor de s el efecto de la presin sobre la resistencia de la torta es ms severo, en estos casos es recomendable utilizar ayudas-filtro. Combinando las ecuaciones (3.10) y (3.13) se puede obtener la ecuacin para describir la filtracin intermitente de tortas compresibles con cada de presin constante:
Ai = pa>p0 V ^
2AP -* A
AP
' '
Ejemplo 3.1.- Filtracin de actinomicetos. Es bien conocido que los cultivos de actinomicetos como el Streptomyces griseus presentan una gran resistencia a la filtracin (Aiba et a/, 1972). En una filtracin intermitente a presin constante con un filtro de laboratorio de 110 era2 de rea y una cada de presin de 70,000 N/m 2 ,
3.4. DISEO DE EQUIPO DE FILTRACIN Tabla 3.2: Datos y clculos de filtracin del ejemplo 3.1. Datos t ( s ) V(cm 3 ) Clculos V/A (cm) At/V (s/cm) 0.91 20.90 1.82 44.00 2.73 77.00 3.64 104.50 4.55 154.00 5.45 179.30 5.91 205.61
89
19 80 210 380 700 978 1215
100 200 300 400 500 600 650
se procesa un caldo de una concentracin de 0.015 Kg/1 peso seco de clulas y una viscosidad de 0.0011 N s/ra2 (el caldo se adicion con 1% de tierras diatomeas, a un pH de 3.7 y una temperatura de 10C), obtenindose los datos que aparecen en las primeras dos columnas de la Tabla 3.2: Estimar la resistencia especfica de la torta a y la resistencia del medio
Solucin:
En base a la ecuacin (3.10) y los datos que se presentan, se calculan primeramente los grupos At/V y V/A. Estos clculos se muestran en las columnas 3 y 4 de la Tabla 3.2 y se presentan en forma grfica la Figura 3.9 . , a).- Clculo de la resistencia del medio. De acuerdo a la Figura 3.9 la ordenada en el origen es cero y por lo tanto la resistencia del medio no tiene un valor significativo:
b).- Clculo de la resistencia especfica de la torta. De acuerdo al resultado del inciso a) se utiliza la ecuacin (3.10) para calcular la resistencia especfica de la torta.
90
CAPTULOS.
FILTRACIN
zoo
Figura 3.9: Datos de filtracin ejemplo 3.1.
91
pendiente = F 2AP
/120 -40 _ 2 V4-1.23,/ cm " 2x70,000 $ 28.88-^ x 140,000 a= .0011 x .015 cm

a = 2.45 x 1011
cm
Optimizacin de la Filtracin Intermitente.- En la filtracin intermitente se presenta un problema de optimizacin relacionado con el tiempo de duracin de cada ciclo o tiempo de procesamiento de un lote de caldo: Si el tiempo de duracin de cada ciclo se acorta, el tiempo total de descarga y limpieza del filtro se incrementa. Por otro lado, conforme se incrementa el tiempo del ciclo, la velocidad de filtracin promedio disminuye. En el siguiente ejemplo se aborda este tipo de problema.
Ejemplo 3.2.- Clculo del nmero de ciclos ptimo para una filtracin intermitente.
En el procesamiento de un caldo micelial para la recuperacin de un antibitico, en un filtro de laboratorio de 110 cm2 de rea a una presin de 19.6 x 104 N/rn?, se obtuvieron los datos que aparecen en las columnas 1 y 2 de la Tabla 3.3. i La viscosidad del caldo fue de 2 x 10~3 N-s/m2 y la masa de slidos secos por unidad de volumen de filtrado de 40 Kg/m3 Estimar: a).- La resistencia especfica del caldo a. b).- El nmero de ciclos del filtro por da, si cada operacin de descarga y limpieza del filtro tiene una duracin de 0.5 h y el filtro opera 24 h al da.
Solucin:
92
CAPTULOS. Tabla 3.3: Datos y clculos de ejemplo 3.2. Datos

t(s) V x 10 m 9 1.0 46 2.0 126 3.0 240 4.0 405 5.0 610 6.0 860 7.0
4 3
FILTRACIN
Clculos Ai IV (s/m) VI A (m) 990.0 0.009 0.018 2530.0 0.027 4620.0 0.036 6600.0 8910.0 0.045 0.055 11183.3 0.064 13514.3
a).- De acuerdo a la ecuacin (3.10), a partir de los datos es necesario calcular los grupos At/V y V/A. Estos clculos se presentan en las columnas 3 y 4 de la Tabla 3.3. Mediante una regresin lineal es posible obtener la pendiente de los datos ajustados a dicha ecuacin, (pendiente)(2)(AP)
x 104 -^
a =
(232451.7 -V a = ( 2 x II
a = 1.14 x 1012
b).- El nmero de ciclos por da est dado por: Nmero de ciclos = donde tc es el tiempo de filtracin por ciclo. El volumen total de filtrado Vt se relaciona con el volumen de filtrado por ciclo Vc mediante la siguiente expresin:
24 h 0.5 + 1
V,
93
la resistencia del medio filtrante puede ser despreciada, entonces puede ser utilizada la ecuacin (3.11) para obtener:
v
de tal manera que:
-v
derivando la expresin anterior con respecto al tiempo del ciclo e igualando el resultado a cero, se obtiene el tiempo de duracin del ciclo para el cual el volumen total de filtrado es mximo, es decir: dVL_d_ I ti dt ~ dt \tc + 0.05 de donde se obtiene que el tiempo ptimo t* :
f* = 0.5 h
el nmero de ciclos por da est dado por: Nmero de ciclos =

24 h ; = 24 ciclos 0.5 /*+ 0.5fc
Filtracin Intermitente en Paralelo.- En el caso de los filtros de marcos y placas, cada marco consta de dos caras de filtracin. La alimentacin a cada marco se hace de man'era independiente de tal manera que cada superficie de filtracin acta en paralelo respecto al flujo de alimentacin. Debido a lo anterior los datos de diseo de este tipo de filtros pueden ser generados en un filtro intermitente de laboratorio. El siguiente ejemplo se refiere a este procedimiento. Ejemplo 3.3.- Filtracin de cristales de un esteroide. Con datos de una filtracin de laboratorio de una suspensin de un esteroide se desea disear un filtro intermitente de marcos y placas.
94
CAPTULOS.
FILTRACIN
Las pruebas de laboratorio se realizan en un tubo de vidrio con una malla en el extremo inferior de resistencia despreciable. Los datos de los resultados del laboratorio son los siguientes: Peso seco de los cristales Volumen de la torta Profundidad de la torta Tiempo de filtracin Gradiente de presin Torta incompresible 0.063 Kg. 253 era3 12.5 cm 9780 s
1.01 Kg/cm2
si
Estimar el nmero de marcos de 430 x 430 x 30 mm y el tiempo de filtrado, para procesar 40 Kg/lote de peso seco de producto. Suponer que la bomba de alimentacin produce una presin a la entrada del filtro de 0.68 Kg/cm2 y que descarga a la atmsfera.
Solucin:
a).- Estimacin de parmetros a partir de datos de laboratorio. De acuerdo con los datos de laboratorio es necesario utilizar la ecuacin (3.11) arreglada de la siguiente forma:
lia _ t&PA2 2p0 ~ W2

donde W = p0V es el peso seco de la torta, sustituyendo valores en la expresin anterior se obtiene: Ha (9780 5)(1.0: (0.063 Kg)<
= 1.01 x 109 s cm'
b).- Clculo del nmero de marcos necesarios para la filtracin de 40 Kg peso seco del esteroide. El clculo se basa en el hecho t[ue el volumen de todos los marcos del filtro debe ser suficiente para alojar el volumen de la torta hmeda, de tal manera que :
95
Nmero de marcos = Nmero de marcos =
volumen torta hmeda volumen de un marco 253 cm3 Ka\( ^ A Q. .Q63
(43 x 43 x 3) cm3 Nmero de marcos = 29
c).- Clculo del rea de filtracin del filtro prensa. El rea de filtracin para filtros prensa de marcos se calcula tomando en cuenta que por cada marco existen dos placas o superficies de filtracin. rea de filtracin rea de filtracin rea de filtracin Arta por marco x 2 x Nmero de marcos = (43 x 43) cm2 x 2 x 29 = 107,242 era2
d).- Clculo del tiempo de filtracin en el filtro prensa. El tiempo de filtracin puede ser calculado mediante la modificacin de la ecuacin (3.11),
APA*
s cm
t = (1.01 x 109 t = 206 s
Kg
(40 Kg)<
(0.68 ^ ) x (107,242 cm2)2
Ejemplo 3.4.- Clculo del ndice eje compresibilidad. Se desea correlacionar la resistencia especfica de la torta que forma una levadura con la cada de presin, para lo cual se realizan pruebas de filtracin bajo las siguientes condiciones: rea de filtracin Viscosidad Masa de slido seco por volumen de filtrado 9.3 era2 0.001 N-s/m 2
10g/l
96
CAPTULOS.
FILTRACIN
Las pruebas se realizan a cuatro gradientes de presin diferentes. Los datos de cada corrida fueron correlacionados mediante la ecuacin (3.10) obtenindose los siguientes resultados:
Corrida AP Pendiente Ordenada Num. Atm. Origen s/cm. s/cm2 1 0.68 26 3.00 2 1.36 12 2.00 2.04 3 8 1.60 4 3.40 5 1.10
Estimar el ndice de compresibilidad s para este material. Solucin: El empleo de la ecuacin (3.13) permite calcular el ndice de compresibilidad, para lo cual es necesario el clculo de a para cada corrida mediante la ecuacin (3.10), pendiente =
2AP
Para la primera corrida se tiene: 0.001 *? x a, x 10 *f x Ofit x 2 x 0.68 Atm x ''*"< f Atm
cm
ai =4.13 x 10 10
De igual manera pueden obtenerse a 2 > 3 y #4- Estos valores son los siguientes:
97
10.9Log a
10.8-
10.7-
10.6
-0.2
0.2
Log AP
0.4
Figura 3.10: Resistencia especfica contra cada de presin.
Corrida Nmero 1 2 3 4
AP
Atmsferas 0.68 1.36 2.04 3.40
a cm/g
4.13 5.51 6.61 7.58
xlO 10 xlO10 xlO 10 xlO 10
Los datos de a y AP para cada una de las corridas pueden ser correlacionados de acuerdo con la ecuacin (3.13) en una grfica log(AP) vs log(a), tal como aparecen en la Figura 3.10. Se puede estimar con la pendiente de la curva el valor:
s = 0.42
98 3.4.2 Filtracin Continua
CAPTULOS.
FILTRACIN
En un filtro continuo (Figura 3.7) el ciclo de filtracin consta de tres pasos principales: - Formacin de la torta. - Lavado de la torta. - Descarga de la torta. Los primeros dos pasos se relacionan con el proceso de filtracin en s y el tercero es un aspecto de diseo mecnico. Esta seccin enfatiza lo referente a los dos primeros pasos.
Formacin de la torta
En los procesos de filtracin intermitente el rea de filtracin es constante y el espesor de la torta vara con el tiempo de filtrado. En la filtracin continua se puede suponer que el espesor de la torta es constante y el rea de filtracin vara con el tiempo. La ecuacin (3.14) puede ser adaptada a la filtracin continua. Esta ecuacin cuando la resistencia del medio es despreciable puede ser expresada como:
Vf
2AP1- A
donde tj es el tiempo que dura un paso de la formacin de la torta y Vf es el volumen de filtrado colectado en ese perodo. A es el rea expuesta de filtracin por ciclo o por revolucin. Esta ecuacin es til para diseo de filtros continuos a partir de datos de filtracin intermitente. La ecuacin (3.15) puede ser expresada en trminos de los parmetros de diseo siguientes: Q: Flujo de filtrado. [L3/t]. *
(j>: ngulo de formacin de la torta. [Radianes].
3.4. DISEO DE EQUIPO DE FILTRACIN TV: Velocidad angular del tambor. [ t~1]. R: Radio del tambor. [L]. L: Longitud del tambor. [L].
99
Entonces es posible relacionar el volumen de filtrado de un ciclo por unidad de rea, con el gasto Q :
T=
Vj
Q
,
donde 27rRL = rea lateral del filtro.
El tiempo que dura cada etapa de filtracin se puede relacionar con el ngulo de filtracin y la velocidad de giro del tambor, mediante la ecuacin siguiente:
Combinando las ecuaciones (3.15), (3.16) y (3.17) se obtiene el flujo defiltracin:
P<*Po
o en trminos de la velocidad de formacin de la torta W = p0Q :

2
JLO'
(3,9)
Las ecuaciones (3.18) y (3.19) pueden ser utilizadas para predecii cambios de la velocidad de filtracin con respecto a cambios de las variables de diseo y operacin en filtros continuos al vaco.
100
CAPTULOS.
FILTRACIN
1.00
_ Caso ideal: desplazamiento hidrulico
0.10 -
Control de la transferencia de masa
0.01
volumn d* liquido d layado volumen d liquido retenido
Figura 3.11: Mecanismos de lavado.
Lavado de la torta
Una vez que se ha formado la torta sobre la superficie del filtro, mediante un lavado se remueve del soluto retenido en el lquido y en la masa celular de la torta. Existen diferentes tcnicas de lavado, siendo la ms utilizada la de lavado por desplazamiento. En esta tcnica el lquido de lavado se aplica directamente sobre la superficie de la torta. Inicialmente el lquido de lavado produce un desplazamiento hidrulico del filtrado retenido por la torta. Si el lavado contina parte del soluto contenido en el interior de la biomasa puede pasar al lquido de lavado mediante mecanismos de transferencia de masa (Figura 3.11). En la etapa de lavado la cantidad de solutos que puede ser recuperada depende del volumen del lquido de lavado que se emplee. Un factor de diseo es el tiempo requerido para aplicar el lquido de lavado o tiempo de lavado, el cual depende de la naturaleza de la torta. Debido a lo anterior el anlisis de la etapa de lavado se efecta en dos pasos: 1.- Clculo del volumen de lavado en funcin de la recuperacin de soluto que se especifique.

2.- Clculo del tiempo de lavado en funcin del tipo de torta.
101
Clculo del volumen del lquido de lavado.- Si el desplazamiento por lavado del lquido retenido en la torta extrajera todo el soluto, el volumen necesario de lquido de lavado sera equivalente al volumen del lquido retenido por la torta (fraccin vaca del lecho). La operacin de lavado sera 100 % eficiente. Sin embargo, debido a los fenmenos de difusin y mezclado en el lecho, esto no ocurre en la prctica. Conforme la eficiencia de lavado disminuye debido a los mecanismos de difusin y mezclado, para lograr una determinada extraccin del soluto, la razn del volumen del lquido de lavado al volumen de lquido retenido se incrementa. Existen varios anlisis tericos para correlacionar los parmetros de lavado, pero debido a lo complejo del fenmeno frecuentemente se utilizan correlaciones empricas que ofrecen buenos resultados. Una correlacin emprica que ha sido utilizada para materiales biolgicos est dada por la siguiente ecuacin:
r = (l-e)n
donde: Soluto retenido en torta Soluto inicial en la torta e = Eficiencia de lavado. Volumen de liquido de lavado n = Volumen del liquido retenido por la torta
(3.20)
La ecuacin (3.20) puede ser utilizada en grficas semilogartmicas para correlacionar datos de lavado (Figura 3.12). Con estas correlaciones es posible calcular el lquido de lavado necesario para lograr un determinado porciento de extraccin. Clculo del tiempo de lavado.- Para el clculo del tiempo de lavado, se puede suponer que el gasto durante la fase de lavado es constante dado que el lquido de lavado no tiene slidos. Este gasto puede igualarse al gasto final de la fase de filtrado. En base a lo anterior, la ecuacin (3.9) con Rm = O y a = a'APs se escribe:
102
LOO
CAPTULOS.
FILTRACIN
Predomina el desplazamiento hidrulico
3.0
! _ Volumen lquido de lavado ~~ Volumen liquido retenido
Figura 3.12: Curvas de lavado.
dV_ dt
El gasto cuando V = V/ es constante e igual a:
(3.21)
dV_ dt ~
Integrando la ecuacin (3.22) con los lmites:
(3.22)
donde V es el volumen del lquido de lavado y ti es el tiempo de lavado requerido, se obtiene la siguiente ecuacin:
VL =
(3.23)
3.4. DISEO DE EQUIPO DE FILTRACIN Combinando las ecuaciones (3.15) y (3.23) se obtiene:
103
VL A
i-3 ii/2 *L (3-24)
Los volmenes y tiempos, de filtrado y lavado, se relacionan directamente mediante las ecuaciones (3.15) y (3.24) obtenindose: - = 2^ (3.25)
Es conveniente expresar la ecuacin (3.25) en trminos de parmetros de diseo, como la relacin de volumen de lavado a volumen retenido n, y la relacin de la fraccin del lquido retenido con respecto al volumen del filtrado /, de tal manera que
r = 2-^ = 2n/ tf VR Vf
Ejemplo 3.5.- Filtracin continua al vaco.
ir
V,
I/D
(3-26)
Se dispone de un filtro tipo tambor rotatorio continuo de 3 m de dimetro y 4.3 m de largo, el cual puede ser operado a 1.2 rpm con un ngulo de filtracin efectiva dej65. Con este filtro se desea separar un caldo de eritromicina. El caldo pretratado se puede suponer incompresible. La resistencia del medio filtrante es muy pequea comparada con la resistencia de la torta. El filtro opera a 51 cm de mercurio de vaco. Bajo estas condiciones: 2AP era2
Se desea extraer el 99% de los solutos retenidos en la torta. Debido a las caractersticas de la torta se espera un 80% de eficiencia en el lavado y que la torta retenga 1% del volumen de filtrado. a).- Estimar el tiempo de filtrado. b).- El gasto que puede manejar el filtro. c).- El tiempo de lavado. Solucin:
104
CAPTULOS.
FILTRACIN
a).- Clculo del tiempo de filtrado. La ecuacin (3.17) permite estimar el tiempo de filtrado en base a los parmetros del filtro, de tal manera que,
2?r x 1.2
(El ciclo del filtro es de 50 segundos) b).- El gasto que puede manejar el filtro puede ser estimado por medio de la ecuacin (3.18).
= RL(
V>0i'pc
por las caractersticas de la torta s = O y a' = a, entonces la ecuacin anterior se puede expresar como:
sustituyendo valores: /2?r x ^ x 2?r x 1.2 min"l\l/2 Q = 150 C mx430 C T n( -g _^-J

x
Q = 4520 cm /5 O = 16,272 L/h c).- Clculo del tiempo de lavado. Mediante la ecuacin (3.20) se calcula n. De acuerdo a los datos del ejemplo : *
r = (1 - e)"
cm2
mtn
o '-
o, -.
3.5. SUMARIO^
r
O
"
105
0.01 = (1 - .8)*
entonces,
n = 2.86
Volumen de lavado Volumen retenido
Aplicando la ecuacin (3.26) conociendo que el volumen retenido e 0.01 volumen del filtrado, iL = (9 s)(2)(0.01)(2.86)
tL = 0.5 s
3.5
Sumario
La filtracin es ampliamente utilizada en los procesos biotecnolgicc para remover slidos de lquidos. La teora bsica conjuntamente co algunos experimentos de laboratorio permiten el diseo y operaci racional de los procesos de filtracin. i Los equipos de filtracin empleados en bioseparaciones operan m< diante la formacin de una torta sobre una superficie filtrante por accic de un gradiente de presin. El filtro ms empleado en bioseparaciom es el filtro continuo tipo tambor operado mediante vaco, y en men< proporcin el filtro intermitente de marcos de placas. Los procedimientos de diseo de filtros que se presentan, considere la compresibilidad caracterstica de las tortas que forman los material biolgicos, tanto para la operacin intermitente como para la continua
106
CAPTULOS.
FILTRACIN
3.6
Problemas
3.1.- En la filtracin a nivel laboratorio de un caldo para la recuperacin de gentamicina, la solucin present una viscosidad de 1.2 cp y un contenido de slidos de 5 g/1. El rea de filtracin empleada fue de 100 crn2 y el gradiente de presin de 1.8 m de agua. Los datos de filtracin son los siguientes:
Estimar el tiempo de filtrado para procesar 5000 1 de este caldo en un filtro de 1.5 m2 de rea, si el proceso se realiza con un gradiente de presin igual al empleado en el laboratorio. Resp. 12 h 3.2.- Los datos de filtracin de S. griseu a un pH de 3.8 y a 2 atm de presin, se ajustan a una recta que pasa por los puntos (V/A, At/V) siguientes: (3,70) y (6,180), donde V/A est en cm y At/V en s/cm. Calcular el rea de filtracin necesaria para procesar 1000 1 de este caldo en un tiempo de 15 min bajo las mismas condiciones. Resp. 18 m2 3.3.- Se efectuaron pruebas de filtracin con un filtro prensa de marcos y placas bajo las siguientes condiciones: Po = 10.037 Kg/m3 l = 0.001 N - s/m2 Marcos = 430 x 430 x 30 mm Los datos obtenidos durante el experimento aparecen en las primeras tres columnas de la Tabla siguiente:
3.6.
PROBLEMAS Datos t s 447 1262 1886 2552 3381 3686 4043 4793 5652 6610 8680 9256 Clculos
107
P N/m 2 0.4 0.7 1.1 1.3 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
Estimar: a).- a
V m3
(V + V.)/A (t-f,)/(V-V.) s/m3 m

0.9 1.1 1.2 1.4. 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0 2.2 2.3
4609.3 4484.4 4757.1 5244.8 5642.5 6604.5 6826.5 7274.2 7727.7 8399.0 8587.1
0:04
0.10 0.16 0.22 0.28 0.30 0.32 0.36 0.40 0.44 0.52 0.54
a).- Resp. a = 1.069 x 1011 m/Kg b).- Resp. Rm = 6.61 x 1010 m"1 3.4.- Un caldo de actinomicetos adicionado con 5 % de ayudas-filtro se procesa en un filtro prototipo de 35 cm2 de rea y a una presin de 99,990 7V/m2, obtenindose los datos siguientes:
t(s) V x 106 20 40 60 120 180 300 420
(m3) '9.5 16.5 22.0 35.0 45.0 61.0 74.5
108 Estimar : a).- //a/>0/2AP. a).- Resp. 674,356.5 s/m2 b).- Resp. 5367.71 s/m
CAPTULOS.
FILTRACIN
3.5.- Considerando los datos del ejemplo 3.3. a).- Cuntos marcos se requieren si la dimensin de stos es de 75 x 75 x 3 crn b).- Calcular el tiempo de filtrado si la descarga del filtro se localiza a 3 m de altura. 3.6.- Estimar Rm y a' para la filtracin del ejemplo 3.4. 3.7.- Se desea filtrar un caldo que contiene cristales de un antibitico. Las pruebas de filtracin en el laboratorio presentan los siguientes datos: rea = 89 crn2
AP = 2.6 m de Hg
o = 0.34 t(s) 10 20 30
100 era3
V (litros) 0.500 0.707 0.866
Estimar el tiempo de filtracin si el volumen que se desea filtrar es de 7300 litros en un filtro de 1.3 m2 de rea y la solucin tiene una p0 de 0.28 g/cm3. La presin a esta escala es la misma. Resp: 23 horas. 3.8.- Las levaduras forman tortas compresibles (Gerstenberg y Sitting, 1980) cuya resistencia especfica ha sido correlacionada con la expresin emprica , a= 1.25 x 10n(AP)
3.6. PROBLEMAS
donde a tiene unidades de cm/g y AP de atmsferas.
109
Estimar el tiempo necesario para procesar 3000 1 de un caldo que contiene 30 g/1 de la levadura y presenta una viscosidad de 1.2 cp, en un filtro piloto de 5 m2 de rea con una cada de presin de 4 atmsferas. Resp. 19.6 h 3.9.- El procesamiento de 30 cm3 de un caldo de P. chrysogenum (de 86 h de cultivo) en un filtro utilizado para medicin de biomasa en linea, produjo los siguientes datos:
AP (cm de Hg) tiempo de filtracin 10 271 20 191 30 163 40 138
Estimar el ndice de compresibilidad de la torta considerando despreciable la resistencia del medio. Resp. 0.52 3.10.- Calcular el incremento en flujo de un filtro continuo tipo tambor giratorio al vaco cuando: a).- Se incrementa la velocidad del filtro de 0.3 rpm a 0.5 rpm, mantenindose el resto de los parmetros constantes. b).- Se incrementa de 30 a 40 % el porcentaje de rea sumergida (rea sumergida/ rea total de filtracin). a).- Resp. 29 % b).- Resp. 15 %
110
CAPTULOS.
FILTRACIN
3.7
Bibliografa
Aiba, S., Humphrey, A.E. y Mills, N.F. 1972. Biochemical Engineering. Academic Press. New York. 355-356. Brown, T.R. 1982. Designing batch pressure filters. Chem. Eng. Julio 26. 58-63. Moir, D.N. 1982. Selecting batch pressure filters. Chem. Eng. Julio 26. 47-57. Gerstenberg, H. y Sitting, W. 1980. Recovery of fermentation products. Chem. Eng. Technol. 52, 1, 19-31. Petrides, D.P., Cooney, C.L. y Evans, L.B. 1989. An intoducction to biochemical process design. En: Chemical Engineering Problems in Biotechnology. Shuler, M.L. (Ed.). AIChE. New York. 351-391 Svarouvsky, L. 1979. Filtration and allied operations. Chem. Eng. Julio 2. 63-76 Rees, R.H. 1990. Let diatomite enhance your filtration. Ch. Eng. Agosto 30. 76-79. Tiller, F.M. 1974. Bench-Scale design of SLS systems. Ch. Eng. Abril 29. 117-119.
Captulo 4 Centrifugacin
4.1 Introduccin
La separacin de substancias de diferente densidad mediante movimiento giratorio se conoce como centrifugacin. La centrifugacin es una de las principales operaciones utilizada para la separacin de clulas de caldos biolgicos (Wiesmann y Eider, 1982), especialmente cuando los caldos no son fcilmente filtrables, o la adicin de ayudas-filtro no es recomendable por razones de costos o de produccin excesiva de desechos contaminantes. La centrifugacin tambin es empleada en la remocin de desechos celulares de caldos de clulas que han sido sujetas a rompimiento, separacin de precipitados proteicos (Bell et a/, 1983) y para recuperacin de productos insolubles como los cuerpos de inclusin. Estos ltimos debido a su tamao (de 0.3 a 1 /zm) y alta densidad (1.3-1.5 g/cm3) pueden ser separados de los restos celulares por centrifugacin en dos o tres pasos, utilizando agua de lavado y detergentes para facilitar la separacin. Cuando se utiliza la centrifugacin la diferencia entre la densidad de los slidos (clulas o partculas) y el caldo, se incrementa por la accin de las fuerzas centrfugas que se generan por las altas velocidades de rotacin de los equipos que se emplean (Bjurstrom, 1985). En la seccin 4.2 de este captulo se presentan los fundamentos de la centrifugacin que se derivan de la Ley de Stokes la cual describe
111
112
CAPTULO 4.
CENTRIFUGACIN
los aspectos bsicos del movimiento de un slido en un lquido cuando existe un gradiente de densidad. Existen diferentes tipos de centrfugas que se utilizan tanto a nivel laboratorio como a escala industrial y su aplicacin depende de varios factores anlogos a los mencionados para la filtracin en la Tabla 3.1. En la seccin 4.3 se hace una descripcin general de estos equipos. La seccin 4.4 se centra en los aspectos bsicos del diseo de centrfugas.
4.2
Fundamentos de la Centrifugacin
El estudio de las separaciones slido-lquido por centrifugacin est basado en la teora de la sedimentacin. Esta permite desarrollar algunas predicciones del comportamiento de los equipos centrfugos, no slo para poder especificarlos y dimensionarlos, sino que tambin ofrece un apoyo adecuado para su correcta operacin. La teora de la sedimentacin est basada en la Ley de Stokes que establece los aspectos bsicos del movimiento de un slido en un lquido cuando existe un gradiente de densidad. Este movimiento puede ser causado por la fuerza gravitacional o por una fuerza centrfuga. En base a lo anterior, esta seccin se centra en cuatro aspectos fundamentales: La Ley de Stokes. La sedimentacin por accin de la gravedad. La sedimentacin por accin de una fuerza centrfuga. El factor G
4.2.1
Ley de Stokes
La velocidad de sedimentacin de una partcula esfrica en un medio continuo para Reynolds menores a 1 (regin de resistencia viscosa), est descrita por la Ley de Stokes (Figura 4.1). Se puede suponer que para las suspensiones diluidas caractersticas de los caldos biolgicos esta ley es aplicable. La Ley de Stokes establece que cuando se aplica una fuerza a una partcula en un medio continuo sta se acelera (F = ma), hasta que
4.2. FUNDAMENTOS DE LA CENTRIFUGACIN
11
1O 9
\ \
ir
Ie '
a
10
l': 1 ii " *i
2
9 2
k 1
\ ^ \ ^*
Asntota *=-|-
SV
X
-^
> s v.
9^22
-> ^1 := _> ^^ m^m 5: 1 = 0.4A i

9^2 3 |Q4 2 5^
O.1
1( 32
3
6^22
9l(J2
9 ^2
Nmero d Reynolds
Re = Ou,, /><l
Figura 4.1: Factor de friccin para esferas. Fuente: Bird et a/, 1964.
Reproducida con el permiso de Reverte S.A. Copyright 1964. Todos los derechos reservados.
114
CAPTULO 4.
CENTRIFUGACIN
alcanza una velocidad a la cual la resistencia a su movimiento iguala a la fuerza aplicada. En una sedimentacin libre la fuerza que acta sobre la partcula es la de la gravedad, y en una sedimentacin centrfuga la fuerza es la del campo centrfugo. Las fuerzas que se oponen al movimiento de las partculas pueden agruparse en la fuerza de empuje descrita por el principio de Arqumides, y la fuerza de arrastre (resistencia de forma y de friccin) descrita por la Ley de Stokes. De acuerdo a lo anterior, el balance de fuerzas para una partcula en equilibrio en un medio continuo se expresa de la siguiente manera: Fuerza de aceleracin = Fuerza de flotacin -f Fuerza de arrastre Para el caso de partculas esfricas el balance anterior puede expresarse como:
, . (4.1)
donde: dp: Dimetro de la partcula. [L]. pp: Densidad de la partcula. [M/L3]. a: Aceleracin. [L/t2]. />,: Densidad del fluido. [M/L3]. \\ Viscosidad del fluido. [M/L t]. VQO'. Velocidad terminal de la esfera. [L/t]. Es importante hacer notar que si la partcula parte del reposo en el proceso de sedimentacin, conforme la velocidad de la partcula se incrementa la fuerza de arrastre se incrementa. Al alcanzar el equilibrio de fuerzas la partcula se mueve a la velocidad constante VQQ (velocidad terminal).
115
La ecuacin (4.1) puede ser modificada para presentarse como una expresin de la Ley de Stokes, de la siguiente manera: (pp - PL)
(4.2)
La velocidad de sedimentacin de una partcula de acuerdo a la ecuacin (4.2) es la siguiente:
" =
donde: A/> = pp pL Se puede expresar la velocidad de sedimentacin de la partcula en dos casos lmites de inters: - Sedimentacin por accin de la gravedad. - Sedimentacin por accin de una fuerza centrfuga.
4.2.2
Sedimentacin por Accin de la Gravedad
En varios procesos de separacin slido-lquido la fuerza impulsora de la sedimentacin es slo la de la gravedad. La velocidad de sedimentacin por gravedad de una sustancia, proporciona informacin bsica necesaria para el diseo de cualquiera de los procesos de sedimentacin. De acuerdo a la Ley de Stokes si la aceleracin de la sedimentacin es la de la gravedad, la velocidad de sedimentacin que se obtiene por medio de la ecuacin (4.3) es: (
(A A\ (4 4)
donde: a = g: Aceleracin de la gravedad. [L/t2]. vg: Velocidad terminal en un campo gravitacional. [L/t].
116
CAPTULO 4.
CENTRIFUGACIN
4.2.3
Sedimentacin Centrfuga
En las separaciones centrfugas slido-lquido la velocidad de sedimentacin es mayor que la sedimentacin libre o gravitacional, debido a que los equipos al girar producen una mayor aceleracin de las partculas (Brunner y Hemfort, 1988). Bajo estas condiciones la velocidad de sedimentacin derivada de la ecuacin (4.3) es:
2
donde: a =w2r: Aceleracin centrfuga. [L/t2]. u>: Velocidad de rotacin en radianes, ["1]. r: Distancia radial del eje de rotacin a la partcula. [L]. Varias aplicaciones importantes pueden obtenerse de los principios inherentes a las ecuaciones (4.4) y (4.5), a continuacin se presentan algunas de ellas: El dimetro aparente de las bacterias es del orden de diez veces menor que el de las levaduras, por lo que su velocidad de sedimentacin es cien veces menor, ya que sta es proporcional al cuadrado del dimetro de la partcula. Las clulas contienen ms del 70 % de agua por lo que su densidad es muy semejante a la de los caldos, por lo tanto el parmetro A/9 puede ser muy bajo. Algunos caldos biolgicos son muy viscosos propiedad que dificulta la sedimentacin. La velocidad de sedimentacin puede ser incrementada en un equipo centrfugo aumentando la velocidad de rotacin o la distancia de sedimentacin (dimetro de la centrfuga).
117
Para obtener una expresin para flujo no laminar la ecuacin (4.2) puede ser expresada como:
24
o
donde:
AKf
A: rea caracterstica. [L2]. K: Energa por unidad de volumen. [M/Lt2]. f : Factor de friccin. [Adimensional.] En la Figura 4.1 tambin se presentan correlaciones de factores de friccin para casos diferentes a la Ley de Stokes. Ejemplo 4.1.- Separacin centrfuga diferencial. El principio de separacin por centrifugacin diferencial se basa en las diferentes velocidades de sedimentacin de las partculas.En el caso de hornogeneizados biolgicos las diferentes partculas celulares suelen ser separadas por centrifugacin diferencial. Estimar el tiempo de sedimentacin relativo de una partcula celular de dimetro 5 /zm (ncleo) con respecto al de una de dimetro de 1 fim (mitocondria), suponiendo que ambas tienen la misma densidad y estn sujetas al mismo campo centrfugo1 en una centrfuga de tubos (Figura 4.2) los cuales giran perpendicularmente al eje . Solucin: De acuerdo a la ecuacin (4.5) y a la geometra del sistema, la velocidad de sedimentacin est dada por:
dr v,,, = = dt
18/i
118
CAPTULO 4.
CENTRIFUGACIN
s
Fuerza Centrfuga
Figura 4.2: Centrifugacin diferencial. Fuente: Bailey y Ollis, 1986

La expresin anterior puede ser utilizada para el clculo del tiempo de sedimentacin integrando entre los lmites:
una vez realizada la integracin se obtiene la expresin siguiente:
t=
In
Ri
Aplicando la expresin anterior a cada partcula, (al ncleo N y a la mitoconda M) se pueden obtener las siguientes proporciones:
N
M
=
25
119
donde tjy es el tiempo que tarda la partcula N en avanzar de R\ a R<. Anlogamente, M es el tiempo que tarda la partcula M en avanzar de R\ a /22Ejemplo 4.2.- Tiempo de sedimentacin. La centrfuga del ejemplo anterior va a ser utilizada para separar levaduras con dimetro de Stokes de 10 //m y 1.05 g/cm3 de densidad. Las propiedades del caldo se pueden suponer iguales a las del agua. La distancia del eje de giro a la superficie del lquido en los tubos es RI = 3 cm y la longitud del tubo es de 10 cm . La centrfuga gira a 400 rpm . Estimar el tiempo para lograr una sedimentacin completa de las levaduras de la suspensin. Solucin: Se debe estimar el tiempo que tardan en sedimentar las levaduras que estn ms apartadas del fondo del tubo, es decir en la superficie del lquido del tubo. Aplicando la expresin desarrollada para el tiempo de sedimentacin en el ejemplo anterior se tiene:
_ ~
>< 0-01 lr. >< h f (10 x 10- ) cm' x (1.05 - 1) ^3 x = 2471 s

4 2
18
4.2.4
Factor G
En la caracterizacin y escalamiento de centrfugas frecuentemente se emplea el factor G, que es una medida relativa de la velocidad de sedimentacin de una partcula en un campo centrfugo con respecto a su velocidad de sedimentacin en el campo gravitacional. De acuerdo a lo anterior mediante las ecuaciones (4.4) y (4.5) se obtiene:
120
CAPTULO 4.
CENTRIFUGACIN
(4.6)
G puede ser referida a un radio caracterstico el cual generalmente es el radio exterior del campo centrfugo. Esto permite desarrollar expresiones prcticas para estimar la G como la siguiente: G = 5.6 x W~7N2D donde N est en rpm, el dimetro del tazn de la centrfuga (o punto de inters) D en mm y G es adimensional.
4.3
Equipo de Centrifugacin
La filtracin y la sedimentacin centrfuga constituyen los principios bsicos de los principales equipos de centrifugacin que se emplean para separar lquidos, o lquidos de slidos (Svarousky, 1979). La principal clasificacin de los equipos de centrifugacin se basa en el diseo de su tazn o tina, y en la forma como se descargan de los slidos sedimentados (Figura 4.3). En esta seccin se presentan los principales equipos de centrifugacin existentes de acuerdo a su clasificacin, en dos grupos: Equipos de Centrifugacin-Filtracin. Equipos de Sedimentacin Centfuga: Centrfugas tubulares, de cmara mltiple, de tazn slido, decantadoras y de discos.
4.3.1
Equipos de Filtracin-Centrfuga
Los equipos de filtracin centrfuga constan de una tina o canasta perforada la cual est recubierta con un medio filtrante (una tela o membrana). La suspensin de slidos es alimentada a la tina que al girar a altas velocidades provoca el depsito de slidos sobre el medio filtrante y la salida de lquido claro. Estos equipos funcionan como un filtro, slo que la fuerza impulsora del filtrado es la centrfuga y no una diferencia de presin (Figura 4.4).
4.3. EQUIPO DE CENTRIFUGACIN
121
Tubular
Cmara mltiple
Sedimentadoras
Tazn slido
Decantadoras
Discos Centrfugas <
Filtrantes
Figura 4.3: Clasificacin de centrfugas.
4.3.2
Equipos de Sedimentacin Centrfuga
En los equipos de sedimentacin centrfuga tambin llamados de tazn slido o canasta no-perforada (para distinguirlos de los de canasta perforada), la suspensin se alimenta a un tazn que se hace girar provocando que los slidos se colecten sobre una pared y el sobrenante se recupere por rebosamiento o por accin de un colector de lquido. En relacin a la forma de descargar los slidos las centrfugas sedimentadoras pueden operar en forma intermitente, semintermitente o continua. i Las centrfugas sedimentadoras se pueden utilizar en operaciones de separacin slido-lquido tanto para remocin de biomasa (clarificacin) como para recuperar slidos durante la cosecha celular. En las operaciones de clarificacin el caldo a procesar generalmente contiene una baja cantidad de slidos, del orden del 1 %, y el objetivo es producir un lquido claro de tal manera que en las operaciones de separacin posteriores la interferencia por slidos sea mnima. En las operaciones de recuperacin de slidos las corrientes de salida pueden
122
CAPTULO 4.
CENTRIFUGACIN
Alimentacin
-#
nitrado
Figura 4.4: Centrfuga de canasta perforada. Fuente: Jacobs y Penney, 1987.

Reproducida con el permiso de Jolm Wiloy and Suns. Copyright 1987. Todos los derechos reservados.
123
Sobrenadante
Alimentacin
Figura 4.5: Centrfuga tubular. contener hasta un 40 % de slidos en volumen. A continuacin se efecta una breve descripcin de los principales tipos de centrfugas sedimentadoras utilizadas en las bioseparaciones.
Centrfuga Tubular
Las Centrfugas Tubulares (CT) consisten bsicamente de un tubo vertical esbelto que gira a altas velocidades por la accin de un motor elctrico, o una turbina de aire o vapor (Figura 4.5). Este tipo de centrfuga es uno de los mas eficientes y sencillos, capaz de separar partculas hasta de 0.1 //m. Las CT pueden contar con un sistema de enfriamiento por lo que son empleadas en el manejo de caldos con enzimas o protenas. Como se observa en la Figura 4.5, durante la operacin de la CT la suspensin es alimentada por la parte inferior y los slidos sedimentan en la pared del tubo. El lquido claro se colecta por rebosamiento en la parte superior. Conforme se forma la torta el rea de flujo se reduce y el tiempo de residencia del lquido disminuye. Esto se traduce en un aumento gradual del contenido de slidos en el sobrenadante que puede ser determinado por mediciones de turbidez. La torta tiene que
124
CAPTULO 4.
CENTRIFUGACIN
ser descargada manualmente, por lo que su operacin es intermitente. Un modelo tpico de laboratorio consta de un tubo de 4.5 cm de dimetro por 25 cm de longitud, el cual puede girar a una velocidad de hasta 50,000 rpm, desarrollando campos hasta de 62,000 G, con una capacidad de hasta 100 1/h. Los modelos industriales tpicos cuentan con un tubo de 11.5 cm de dimetro por 76 cm de longitud, el cual puede girar hasta con 15,000 rpm desarrollando campos de hasta de 12,000 G, con capacidad entre 500 y 3,500 1/h. La capacidad de slidos es de 2 a 4 Kg por lote. Este tipo de centrfugas presentan algunos modelos completamente sellados para minimizar problemas de formacin de espuma y aerosoles, lo cual puede ocasionar fugas del sistema y debe ser evitado cuando se trabaja con sustancias txicas o clulas recombinantes.
Centrfugas de Cmara Mltiple Las centrfugas de cmara mltiple (Figura 4.6) fueron creadas para incrementar la capacidad de manejo de slidos de las centrfugas tubulares. Estas centrfugas consisten de una serie de tazones concntricos con deflectores que provocan un flujo en serie de la suspensin. Su operacin permite la clasificacin de las partculas conforme pasan de una cmara a otra. El lquido claro se obtiene por rebosamiento en la ltima cmara. Este arreglo genera un mayor tiempo de residencia del lquido, en relacin al de la centrfuga tubular, as como mayor capacidad de manejo de slidos. El dimetro de los equipos de cmara mltiple vara de 335 a 615 mm, con velocidades de rotacin entre 5,000 y 8,400 rpm, produciendo campos entre 5,000 y 9,000 G, respectivamente. Los tipos ms comunes constan de 2 a 6 cmaras. La capacidad de manejo de slidos vara entre 2.5 y 60 litros dependiendo del material y el nmero de cmaras. La descarga de slidos y mantenimiento de estos equipos es ms difcil que el de las centrfugas tubulares, ya que la centrfuga tiene que ser desmantelada para sacar los slidos. Este tipo de equipo no permite el lavado de la torta.
125
Alimentacin Sobrenadante
Figura 4.6: Centrfuga de cmara mltiple. Fuente: Axelsson, 1985.

Reproducida con el permiso de Ekevier Science Inc. Copyright 1985. Todos los derechos reservados.
126
Alimentacin
CAPTULO 4.
CENTRIFUGACIN
Rasador
Torta
Sobrenadante
Figura 4.7: Centrfuga de tazn slido. Centrfugas de Tazn Slido

Las centrfugas de tazn slido (Figura 4.7) o centrfugas intermitentes son muy similares a las centrfugas tubulares pero menos esbeltas; su relacin de longitud a dimetro es de alrededor de 0.6 mientras que el de las tubulares es de 4-8. Las centrfugas de tazn slido normalmente son operadas con su eje en posicin vertical. La alimentacin de la suspensin se efecta en el fondo de el tazn, el cual al girar permite que los slidos se depositen sobre la superficie de la pared del tazn y el sobrenadante se obtenga por rebosamiento en la parte superior en forma continua. En algunos modelos el ciclo se controla por medio de un detector del espesor de la torta. El lquido residual sobre la torta puede ser removido utilizando un tubo rasador mvil. La forma de descarga de los slidos depende de su naturaleza. Los slidos muy fluidos pueden descargarse sin parar la centrfuga y los slidos muy compactos pueden descargarse) utilizando una cuchilla interior de la centrfuga que permite raspar la pared del tazn para des-
127
j Sobrenadante
Alimentacin
Figura 4.8: Centrfugas de tazn triple. Fuente: Svarousky, 1979.

prender la torta. Ambos tipos de descarga se realizan a travs de la parte inferior de la centrfuga. Un tipo especial de centrfuga intermitentes es la de tazn triple (Figura 4.8). Las centrfugas intermitentes en su versin de laboratorio presentan tazones de 15 cm de dimetro y las de planta piloto entre 23-53 cm, con capacidades volumtricas de 2.7 a 27 litros. Las industriales tienen tazones entre 95-125 cm con capacidades volumtricas de 100 a 300 litros. Centrfugas Decantadoras o de Tornillo Las centrfugas decantadoras (Figura 4.9) 'se caracterizan por un tazn horizontal con una seccin cilindrica y una seccin cnica, con una relacin de longitud a dimetro entre 1.5-3.5. El tazn contiene un tornillo transportador que gira en la misma direccin, pero a una velocidad ligeramente superior o inferior que el tazn (entre 5 - 1 0 0 rpm de diferencia). Las velocidades de rotacin son de 1,600 a 6,000 rpm por lo que los campos centrfugos son menores que los de los otros equipos. En las centrfugas decantadoras la suspensin es introducida a travs de perforaciones por un tubo axial concntrico a la flecha del tornillo, al
128
CAPTULO 4.
CENTRIFUGACIN
Alimentacin
Sobrenadante
Slidos
Figura 4.9: Centrfuga decantadora. Fuente: Axelsson, 1985.

Reproducida con el permiso de Elsevier Science Inc. Copyrigllt 1985. Todos los derechos reservados.
final de la seccin cnica o de compresin de slidos. Los slidos que se depositan en la pared son transportados y descargados continuamente por el extremo cnico de la centrfuga, donde escurren antes de salir. El lquido claro se obtiene por rebosamiento en el extremo opuesto a travs de orificios de descarga que fijan el nivel del lquido en la centrfuga. Existen diversos diseos de centrfugas decantadoras. Los dimetros de los tazones varan de 15 a 140 cm para los modelos piloto e industriales. La descarga de slidos vara de 30 Kg/h hasta 60 Ton/h, con alimentaciones entre 3.8 y 1890 1/min, respectivamente. La longitud de la seccin cilindrica y la seccin cnica pueden variar de acuerdo a las aplicaciones. Entre ms larga sea la seccin cilindrica mayor es la clarificacin alcanzada. Por otro lado, el aumento de longitud en la seccin cnica permite la obtencin de tortas con menor contenido de agua. Entre mayor sea el nivel de lquido dentro de la centrfuga se obtendr una mejor clarificacin, pero un menor escurrimiento de la torta en la seccin cnica. La disminucin de la velocidad de rotacin del tornillo transportador aumenta la capacidad de desage de la torta

Alimentacin
129
Sobrenadante
Figura 4.10: Centrfugas de discos, a) Retencin de slidos, b) Tazn abierto. Fuente: Jacobs y Penney, 1987.
pero disminuye la capacidad de manejo de slidos. La centrfuga de tornillo es una de las ms utilizadas en bioseparaciones principalmente para manejo de grandes cantidades de slidos como es el caso del tratamiento de aguas residuales. Centrfuga de Discos La centrfuga de discos consta de un eje vertical sobre el cual se montan un conjunto de discos en forma de conos truncados, uno sobre otro. El rotor de la centrfuga provoca el giro tanto de los discos como del tazn de la centrfuga (Figura 4.10). Las centrfugas de discos son las ms utilizadas en BSL. Los discos constan de bordos internos que permiten mantener pequeas separaciones entre ellos, del orden de 0.5 a 2.0 mm. El ngulo que forman los conos con la vertical vara entre 35 y 50 dependiendo de la apli-
130
CAPTULO 4.
Alimentacin
CENTRIFUGACIN
_.
Descarga de slidos
Figura 4.10: Continuacin ... cacin particular. Entre la pila de discos y el tazn existe un espacio que permite la acumulacin de los slidos. o, Durante la operacin de la centrfuga de discos la suspensin es alimentada continuamente en el fondo del tazn a travs de la parte central de la flecha, y fluye hacia arriba entre las placas hacia la salida en la parte central superior del equipo. Debido a la fuerza centrfuga los slidos se depositan en la cara interna de los discos, resbalando hacia la cmara colectora debido al ngulo de los discos. Existen diferentes centrfugas de discos en relacin a la forma de descarga de slidos, las principales son las siguientes: Las de operacin intermitente con respecto a la descarga de slidos, tambin llamadas de retencin de slidos. Las de tazn abierto de descarga intermitente de slidos. Las de vlvula tipo boquilla de descarga intermitente de slidos. Las de boquilla para la descarga continua de slidos.
131
En las centrfugas de retencin de slidos (Figura 4.10a) stos se acumulan hasta que la cmara se llena. La centrfuga tiene que ser detenida y descargada manualmente o con auxilio de un forro que se coloca previamente sobre la pared del tazn. Debido a la forma de su descarga de slidos, este tipo de centrfuga es recomendable slo para suspensiones diluidas conteniendo alrededor de 1% en volumen de slidos. El dimetro de los tazones de las centrfugas de retencin de slidos vara de 24 a 44 cm y las fuerzas centrfugas de 5,000 a 8,000 G. La capacidad de slidos vara de 5-20 litros y los flujos de 0.4 a 1,500 1/min. Las centrfugas de disco de tazn abierto (Figura 4.10b) constan de dos piezas cnicas unidas horizontalmente por sus caras ms grandes. La descarga de slidos se realiza por medio de un sistema hidrulico que permite abrir y cerrar los orificios de descarga entre las piezas. La duracin y frecuencia de la apertura de la descarga depende de la cantidad y fluidez de los slidos. Los valores tpicos son de 0.13 a 0.3 segundos de apertura por minuto de operacin. Esta frecuencia es controlada con relojes acoplados a medidores de lodo o medidores de turbidez en el lquido de salida. Este tipo de centrfugas permite manejar caldos con contenido de slidos hasta del 10 % . Las fuerzas centrfugas varan de 5,000 a 7,000 G y los gastos de 3.8 a 1,500 1/min. En las centrfugas con vlvulas tipo boquilla la descarga de slidos se controla con este tipo de vlvulas situadas en la periferia del tazn. Sus ciclos varan de 0.07 a 0.10 segundos de apertura por minuto de operacin. Tal precisin no puede ser lograda por las centrfugas de tazn abierto. La ventaja de este tipo de centrfugas, debido a que generan campos de hasta 15,000 G, es que son especialmente tiles para caldos biolgicos donde el diferencial de densidad suele ser bajo y la viscosidad alta. Las suspensiones que pueclen ser manejadas, alcanzan hasta un 10 % en volumen de slidos. En las centrfugas de boquillas con descarga continua stas se sitan en la periferia del tazn. El nmero y el tamao de las boquillas se ajusta de tal manera que exista un flujo continuo de slidos, sin que stos se acumulen. El espaciamiento de las boquillas debe prevenir zonas muertas de depsitos de slidos. La principal ventaja de este tipo de unidades es que pueden manejar suspensiones ms concentradas. Las centrfugas de discos en general poseen una gran capacidad de
132
CAPTULO 4.
CENTRIFUGACIN
sedimentacin debido principalmente a su gran rea, a sus cortas distancias de sedimentacin y a los altos campos centrfugos que generan. Por otro lado, requieren de medidas de higiene y seguridad especiales como: Manejo mecnico seguro. Proteccin contra ruido y daos corporales. Proteccin contra incendios, explosiones o diseminacin de sustancias txicas o contaminantes.
4.4
Diseo de Equipo de Centrifugacin
El diseo de los equipos de centrifugacin est basado en la teora de sedimentacin, lo cual puede visualizarse .ms fcilmente en el caso de las centrfugas tubulares debido a la sencillez de su geometra. Este anlisis puede ser extendido al caso de las centrfugas de discos. Por otro lado, los equipos que operan por filtracin centrfuga presentan variantes de diseo respecto a los dos anteriores. En base a lo anterior esta seccin se centra en cuatro aspectos : Diseo de Centrfugas Tubulares. Diseo de Centrfugas de Discos. Escalamiento de Centrfugas. Diseo de Equipo de Filtracin Centrfuga.
4.4.1
Diseo de Centrfugas Tubulares
En el diseo de los equipos de centrifugacin se debe considerar los siguientes hechos: De acuerdo con la teora de sedimentacin desarrollada en la seccin 4.2, las propiedades del caldo (tamao de partcula, diferencia de densidad entre el slido y el lquido, y la viscosidad del lquido).
DISEO DE EQUIPO DE CENTRIFUGACIN
133
Torta
Ro
m Sobrenadante OOU
Trayectoria de^x las partculas
u,
z
**
Interfase liquida
Alimentacin
Figura 4.11: Esquema de una centrfuga tubular. la velocidad de rotacin y el radio del giro de la centrfuga, determinan la velocidad de sedimentacin que se puede lograr en un equipo de sedimentacin centrfugo. La velocidad de sedimentacin cojuntamente con la distancia de sedimentacin, determinan el tiempo de sedimentacin. El gasto determina el tiempo de residencia de las partculas en un equipo dado. El gasto manejable en una sedimentacin centrfuga depende de la geometra especfica del equipo, de su velocidad de giro y de las propiedades del caldo. Para producir un lquido libre de slidos, el tiempo de sedimentacin en el equipo debe ser igual o menor al tiempo de residencia de las partculas impuesto por el flujo o gasto volumtrico. Esto constituye una condicin de diseo para este tipo de centrfugas. La Figura 4.11 muestra una centrfuga tubular que al girar forma una capa anular de lquido sobre la pared del tazn. La posicin de las
134
CAPTULO 4.
CENTRIFUGACIN
partculas en esta capa vara tanto por el flujo convectivo axial como por la sedimentacin radial. Se puede desarrollar un anlisis sencillo e ilustrativo de la centrfuga tubular mediante las siguientes suposiciones: - La alimentacin es una solucin diluida. - Las partculas se distribuyen uniformemente en la capa anular. - Las partculas sedimentan de acuerdo a la Ley de Stokes. - La distancia entre la superficie del lquido y la pared de la centrfuga es constante. - No existe retroflujo (flujo tapn). En el anlisis primero se desarrolla una expresin para el tiempo de residencia en la centrfuga, posteriormente una expresin para el tiempo de sedimentacin y finalmente se combinan ambas expresiones para relacionar el gasto volumtrico manejable con las propiedades del caldo y la geomertra de la centrfuga.
Tiempo de Residencia
La velocidad del fluido en el sentido axial est dada por:
dz
donde: Q: Gasto volumtrico. [L3/i\. A: rea de flujo. [L2]. vz: Velocidad de la partcula en el sentido axial. [L/t]. El rea de flujo es igual a la seccin transversal de la capa anular de fluido y est dada por: = 7r(R20 - R\) donde: (4.8)
4.4. DISEO DE EQUIPO DE CENTRIFUGACIN

Ri'. Distancia radial del eje de giro a la superficie del lquido. [Lj. R0: Distancia del eje de giro a la pared del tazn. [L].
135
Con los lmites de integracin apropiados se puede obtener una ecuacin para el tiempo de residencia de las partculas dentro de la centfuga empleando las ecuaciones (4.7) y (4.8), esto es:
*
donde: L: Longitud de la centrfuga. [L]. tr: Tiempo de residencia de la partcula, [t].
(4 9)
'
La integracin de la ecuacin anterior permite obtener la expresin para el tiempo de residencia de la partcula siguiente:
(4.10) Tiempo de Sedimentacin y Gasto Volumtrico

Para desarrollar la expresin del tiempo de sedimentacin de una partcula, que a su vez permita desarrollar una expresin para el gasto manejable en una centrfuga tubular, se consideran dos casos de inters: - Tiempo para el 100 % de sedimentacin. - Tiempo para el 50 % sedimentacin. Tiempo para el 100% de Sedimentacin y Gasto Volumtrico .- El tiempo de sedimentacin ts de una partcula localizada en la superficie de la capa anular del fluido en R\ (que es la ms alejada de la pared, o ms difcil de sedimentar), puede ser obtenido a partir de la Ley de Stokes considerando el movimiento de la partcula en el sentido radial,
136
CAPTULO 4.
CENTRIFUGACIN
dr vr = = -
dt
(4.11)
'
en este caso inicialmente la partcula se localiza en RI y en el momento ta de alcanzar la pared en R01 de tal manera que: ' dr dApu> fts = * / dt r 18/ J0 (4.12) V
'
y la expresin para el tiempo de sedimentacin de la partcula en este caso es:
Es ms conveniente expresar la ecuacin (4.13) en trminos de vg dada por la ecuacin (4.4), para obtener:
La condicin de diseo donde el tiempo de sedimentacin debe ser menor o igual al tiempo de residencia, puede alcanzarse mediante la igualacin de las ecuaciones (4.10) y (4.14). Este resultado permite obtener una expresin para el gasto manejable en una centrfuga tubular para producir un lquido claro o lograr un 100 % de sedimentacin. Esta expresin es la siguiente:
Q = [,]
<J
(4.15)
En el resultado anterior es importante hacer notar que el flujo es funcin de las propiedades del caldo contenidas en vg, y de las caractersticas de la centrfuga contenidas en el parntesis cuadrado de la derecha. Tiempo para el 50 % de Sedimentacin y Gasto Volumtrico.- Es una prctica comn en las bioseparaciones slido-lquido, el que los equipos se especifiquen para la remocin del 50 % de las partculas de una suspensin de un tamao dado o tamao de corte.
137
Otra interpretacin del tamao de corte, es la de especificar el tamao de partcula para el cual todas las partculas mayores sedimentan en mayor proporcin y todas las menores de ese tamao sedimentan en menor proporcin. Si se considera que en la capa anular del lquido de una centrfuga tubular las partculas del slido se distribuyen uniformemente, stas se encontrarn en cantidades iguales en subcapas anulares de caldo de igual rea transversal. El radio R50 que divide la capa anular en dos subcapas de igual volumen puede obtenerse de la igualdad siguiente:
*(Rl - R250)L = 7r(RlQ - R\)L

de tal manera que:
(4.16)
(4.17) La ecuacin (4.11) debe ser integrada para este caso con lmites nuevos para expresarla en la forma siguiente: * dr c??0A/9a;2 f t s = / dt r 18/ JQ (4-18)
El resultado de la integracin anterior expresado en trminos de vg
es:
(4.19) v '
R50
donde ts es el tiempo para lograr un 50 % de sedimentacin. Combinando las ecuaciones (4.17) y (4.19) se obtiene la expresin para el tiempo de sedimentacin en trminos de parmetros medibles. (4.20)
La igualacin de las ecuaciones (4.10) y (4.20) permite obtener una expresin para el flujo para este caso:
138
CAPTULO 4.
- R\
CENTRIFUGACIN
ln
(4.21)
donde Q' es el flujo para sedimentar el 50 % de las partculas de dimetro c/so en una centrfuga tubular. La ecuacin (4.21) puede ser expresada de otra forma considerando la siguiente igualdad:
T 2
ln 2 '"/*
para obtener:
R0
r*)
- - 1 ln ~2
RO
.V*)
7TU>2 tf2 _
(4.22)
Definicin de Sigma.- El concepto sigma ha sido muy utilizado en el campo de la sedimentacin centrfuga desde que ste fue desarrollado (Ambler, 1957). Sigma es un rea caracterstica de cada tipo de centrfuga y se utiliza para efectuar comparaciones y escalamiento de equipo. En el caso de la centrfuga tubular el valor de sigma puede ser definido a partir de la ecuacin (4.22) de la siguiente manera:
Q' =
donde:
E=
(4.23)
(4.24)
La ecuacin (4.24) es la expresin bsica del concepto sigma, el cual es una constante que contiene slo parmetros relacionados a la geometra de la centrfuga y su velocidad angular (es independiente del tipo de caldo). Por otro laclo vg se relaciona slo con las propiedades del caldo y es independiente del tipo de centrfuga.
139
En la subseccin (4.4.2) se presenta para las centrfugas de discos un desarrollo anlogo al efectuado para la centrfuga tubular, obtenindose tambin una expresin para sigma. La aplicacin de este concepto a problemas de escalamiento se revisa en la siguiente seccin. Ejemplo 4.3.- Separacin Centrfuga. Al separar clulas de E. coli de un caldo diluido en una centrfuga tubular, se obtiene un lquido claro bajo las siguientes condiciones: Propiedades del caldo 0.001 N - s/m2 J* 3 A, 50 Kg/m Carac. Centrfuga N 20,000 rpm R 0.022 m Ri 0.011 m L 0.2 m
0
dp
10-6 m
Se desea utilizar la misma centrfuga para separar restos celulares de dimetro promedio 0.5 x 10~6 m. Se estima que la viscosidad del caldo se incrementa a 0.004 Ns/m2 al salir del equipo de rompimiento celular. Se pide : a) Calcular el flujo manejado en la separacin de clulas. b) Calcular la relacin de flujos para claridad completa de sobrenadante con respecto al flujo para 50 % de corte, en la separacin de clulas. c) Calcular el flujo para separacin completa de los restos celulares. Solucin: a) Para el clculo del flujo manejado eri la separacin de clulas se supone que todas las partculas de la suspensin sedimentan, entonces se utilizar la ecuacin (4.15), para lo cual es necesario calcular primero
Vg-
Sustituyendo datos en la ecuacin (4.4) se tiene: (10-6m)2(50)

18 x 0.001
vn =
x9.8^
N S
m-s
140
CAPTULO 4.
vg = 2.7 x 1(T8 s 6 vg = 2.7 x 10- s
CENTRIFUGACIN
Mediante ecuacin (4.15):

2.7 X 10~ 6 22- X 7T X (2*X'0Y V 60 / S~2 X 20 C77?
Q =
980 ^
cm
- .
\2
ln-T5-
rr
g = 3.97
<3 = 14.31 a
b) Para el clculo del flujo para un corte del 50 % se utiliza la ecuacin (4.22), sustituyendo valores se tiene: _ 2 x 2.7 x 1Q-6 aa x TT x (27rx620'000)%-2 x 20 cm 980 3? 2 2 2 (2.2) -(l.l) cm
x\
In
5
2(2.2) 2
Q' = 42.19 l-
por lo tanto:
Q' _ 42.19 <9 ~~ 14.31 { - = 2.94
141
Tambin puede ser demostrado utilizando las ecuaciones (4.15) y (4.22) que:
Q'
2/
"gf
En la expresin anterior es importante hacer notar que cuando la pelcula de fluido al interior de la centrfuga es muy delgada, R\ tiende a R0 entonces:
c) Para facilitar los clculos se puede calcular el cociente de los flujos de cada tipo de caldo empleando la ecuacin (4.15) y obtener:
Qc
& MC
Donde el subndice R se refiere a los restos celulares y el C a las clulas enteras de tal manera que: acUR 3.97 2 x (0.5 x 10-4)2 cm2 x 0.01 QR = 2 (1 x 10-4) cm2 x 0.04 -Jv ' cms 3 3.97 cm QR = -77 16 5
QR =
QR = 0.89 [ a
La reduccin del tamao de partcula y el aumento de viscosidad reduce dramticamente la capacidad de la centrfuga.
4.4.2
Centrfuga de Discos
En esta seccin se desarrolla un anlisis para la centrfuga de discos anlogo al efectuado para la centrfuga tubular. La geometra del sistema es diferente (Figura 4.12), entonces se puede intuir que la expresin para el clculo del flujo en este caso tambin es diferente.
142
CAPTULO 4.
CENTRIFUGACIN
Figura 4.12: Esquema de una centrfuga de discos. En el anlisis se supone que el flujo global Q se divide equitativamente entre los espacios formados por todos los discos, de tal manera que el flujo en cada espacio es Qn = Q/n, donde n es el numero de espacios formados entre los discos . El flujo se presenta tanto en la direccin angular como en direccin paralela a los discos. En el sentido angular se supone que el lquido gira a la misma velocidad que los discos. Primero se desarrolla una expresin para el tiempo de residencia en la centrfuga, posteriormente una expresin para el tiempo de sedimentacin, y finalmente se combinan ambas expresiones para relacionar el gasto volumtrico manejable con las propiedades del caldo y la geometra de la centrfuga. Tiempo de Residencia en una Centrfuga de Discos En una centrfuga de discos la partcula que se desea sedimentar se mueve por conveccin y por sedimentacin. El movimiento convectivo es paralelo a los discos y el movimiento por sedimentacin es en sentido horizontal.
Si los ejes de referencia se fijan como aparece en la Figura 4.12, el
143
Figura 4.13: Perfil de velocidades en una centrfuga de discos. movimiento producido por sedimentacin tiene componentes tanto en x como en y, de tal manera que la velocidad neta de la partcula en la direccin x, es la resultante de la velocidad convectiva del fluido (aqu se supone que la partcula se mueve a la misma velocidad que el fluido) y la componente en x de la velocidad de sedimentacin que se opone a este movimiento. Una condicin necesaria para alcanzar una separacin efectiva, es que la velocidad convectiva de la partcula sea mucho mayor que el componente de la velocidad de sedimentacin que acta en sentido opuesto. En el siguiente desarrollo se parte de este supuesto cuando se analiza la velocidad de la partcula en el sentido x. Expresin para vx.- Para obtener una expresin del tiempo de residencia de una partcula en una centrifuga de discos es necesario primero desarrollar una expresin para la velocidad de la partcula en el sentido , vx. En el desarrollo de la expresin para vx se supone un arreglo geomtrico sencillo como se muestra en la Figura 4.13. La velocidad vx vara con la distancia x dado que el gasto es constante en toda la seccin de cada pelcula y dado que la seccin transversal de flujo disminuye conforme x aumenta (se supone que el lquido es incompresible). La velocidad vx tambin vara en el sentido y formando
144
CAPTULO 4.
CENTRIFUGACIN
un perfil de velocidades con vx = O en las superficies de los discos. Si se considera una seccin de pelcula de longitud L, donde la velocidad vx slo depende de y pero no de x; cuando se desprecian los efectos inerciales, se considera que el sistema se encuentra en el estado estacionario y el flujo es laminar, la ecuacin de movimiento para este sistema puede ser escrita de la siguiente forma: (4.25) dx dy2 Esta expresin puede ser integrada dos veces entre los lmites: a Para y = - , vx = O Para y = , vx = O y obtener la expresin: APa2 (4.26)
a
p_
donde a es el espesor de la pelcula y P la presin. La ecuacin (4.26) se puede expresar en trminos de Qn si se integra a lo largo del rea de flujo con los lmites apropiados. Considerando que la rea de flujo puede ser aproximada por un rectngulo de ancho a y largo 2?rr entonces: dydz (4.27) Jo 7^ 8/^L L \a J. donde Qn es el flujo volumtrico entre dos discos de la centrfuga. La integracin de la ecuacin (4.27) conduce a:
Qn=
I
Q
[*** rf APa 2 [
,
/2y\]
1-1
7rAP 3 r Qn = 6/L Combinando las ecuaciones (4.26) y (4.28) se tiene que:
(4.28)
(4.29)
47T7Y

o bien en trminos del flujo volumtrico total:
u =
145
( 3Q \ x 4ri7rra
(4.30)
La ecuacin (4.30) describe el perfil de la velocidad de la pelcula as como su comportamiento en diferentes planos en funcin de la velocidad promedio. De la ecuacin (4.30) se puede obtener una expresin para un diferencial de tiempo de residencia de la siguiente forma:
dtr = -p-=2 ) i 1 _ f^)

ara / [
dx
(4.31)
V a/ J
Clculo del Tiempo de Sedimentacin y el Gasto Volumtrico Para desarrollar la expresin del tiempo de sedimentacin de una partcu la, que a su vez permita desarrollar una expresin para el gasto manejable en una centrfuga de discos, al igual que en en las centrfugas tubulares se consideran dos casos de inters: - Tiempo para el 100 % de sedimentacin - Tiempo para el 50 % sedimentacin. Tiempo para el 100 % de Sedimentacin y Gasto Volumtrico.- En este caso la partcula ms difcil de capturar se localiza en la parte inferior derecha de la pelcula eni (x = O , y = ^r), y la parte mas lejana en la que puede sedimentar es en la parte superior izquierda de la pelcula en [x =(R0 Ri)/senO , y = |]. La velocidad de sedimentacin en el sentido radial est dada por la Ley de Stokes:
dr u2r = vg dts g
por lo tanto:
, . (4.32)
146
CAPTULO 4.
CENTRIFUGACIN
dt, = -gL
(4.33)
La condicin de diseo que establece que el tiempo de sedimentacin debe ser menor o igual que el tiempo de residencia puede lograrse igualando las ecuaciones (4.31) y (4.33) para obtener la expresin:
9dr
4nirra
dX
I -(**)'
V a /
(4.34)
de acuerdo a la geometra del sistema se puede efectuar el siguiente cambio de variables: dy cosOdr
r = R0 xsenO con estas nuevas variables la ecuacin (4.34) se transforma en:

/o \ (2y\
2
2a
- IT)
Para rara
Qg
- \(R0 - xsenO)2 x cosOdx
(4.35)
la ecuacin (4.35) puede ser integrada utilizando el cambio de variable u = (R0 xsenO) y los lmites siguientes:
x = O, y
L
x =
R0 RI a , y= senO 2
obtenindose:
^ Rocoto
(4.36)
La ecuacin anterior tambin puede ser expresada en funcin del parmetro E de la siguiente manera:
147
Q = vgX
(4.37)
donde E para este caso est definida por la expresin dentro del parntesis cuadrado de la ecuacin (4.36). Tiempo para el 50 % de Sedimentacin y Gasto Volumtrico.- Para calcular el gasto que puede manejar la centrfuga para un corte del 50 %, debido a la separacin tan pequea de los discos una buena aproximacin est dada por: Q- = 2vgZ (4.38)
donde E est dada por la misma expresin que la de la ecuacin (4.36).(ver ejemplo 4.3 inciso b). Ejemplo 4.4.- Separacin de E. coli mediante una centrfuga de discos. Estimar el gasto volumtrico para producir un lquido claro de E. coli en una centrfuga de discos (Brunner, 1983) bajo las siguientes condiciones: Datos Centrfuga Datos caldo radio externo dimetro celular 0.8 fim 8.1 cm radio interno 3.6 cm densidad celular 1.05 g/1 nmero de discos 72 densidad del medio 1.02 g/1 velocidad 1.02 xlO'3 8,400 rpm viscosidad ngulo 38 Solucin: El gasto de la centrfuga de discos puede ser calculado mediante la ecuacin (4.36). Para aplicar esta ecuacin es necesario calcula: primero vg. De acuerdo a la ecuacin (4.4),
vn
(0.8 x 10~4 cm)' (1.05 - 1.02) x 980 ^

18 x 1.02 x
x
x
148
CAPTULO 4.
CENTRIFUGACIN
v9 = 1.02 x 1(T6 s en seguida se calcula S de la ecuacin (4.36),

L =
/
x 72 \ /2?r x8400\ 2 ... ._ s' 3 x 980 2? j V 6 0 )

/l /"v I \ I iH XN <J-W \
x(S.l3 -3.63) cm3 x co 38 E - 7.39 x 107 cm2 El gasto volumtrico que puede manejar la centrfuga es:
Q = 1.02 x 10~6 x 7.39 x 107 cm2
5
<3 = 75.35^
S
Q = 271 |
4.4.3
Escalamiento
En el anlisis de la operacin de la sedimentacin centrfuga se han desarrollado expresiones para el clculo del gasto manejable por una centrfuga de una geometra particular. Este enfoque es debido a que los equipos disponibles se construyen en tamaos especficos, de tal manera que gran parte del problema de separacin centrfuga se reduce a una seleccin del equipo ms que a un diseo especfico para un trabajo particular. Por otro lado, las velocidades de sedimentacin que se predicen con la Ley de Stokes pueden ser adecuadas para el caso de las centrfugas tubulares, pero pueden resultar hasta dos veces mayores de las realmente obtenidas en las centrfugas de discos. En la seleccin de equipo de centrifugacin una combinacin adecuada de los principios tericos con pruebas experimentales directamente con el material, es lo ms recomendable.
Existen dos enfoques para el escalamiento de datos, uno basado en el tiempo equivalente de centrifugacin y otro en el rea de centrifugacin.
DISEO DE EQUIPO DE CENTRIFUGACIN Tabla 4.1: Valores de Gt. Partcula Ncleo Mitocondria Ribosomas
G t (min)
149
600 15,000 100,000
Gt (min) 5 3,000 5 75,000 60 6,000,000
Tiempo Equivalente Este enfoque consiste en determinar el producto Gt, donde G est dado por la ecuacin (4.6) y t es el tiempo necesario para producir una centrifugacin aceptable, de tal manera que la igualdad: G& = G2t2 (4.39)
puede ser utilizada como un criterio de escalamiento. Los subndices 1 y 2 se refieren a las escalas estudiadas. Las pruebas de sedimentacin sobre las muestras se pueden realizar en el laboratorio en una centrfuga de tubos o en una centrfuga de tazn. Las muestras se hacen girar a velocidades especficas a diferentes tiempos hasta producir un sobrenadante claro. El valor de Gt obtenido se usa para la seleccin de equipos a escala industrial. La consistencia de los slidos puede ser estudiada preliminarmente utilizando una varilla de laboratorio sobre la torta despus de decantar el sobrenadante. En la Tabla 4.1 se presentan valores de Gt caractersticos de algunas partculas biolgicas. Factor Sigrna La expresin para calcular el parmetro Sigma de cada tipo de centrfuga es caracterstica de cada geometra particular (Axelsson, 1985). Esta rea caracterstica o factor S ha sido empleada para escalar equipos con similitud geomtrica. En Ja Tabla 4.2 se presentan los rangos de los factores E para diferentes tipos de centrfugas. El escalamiento utilizando el factor sigma supone que para una
150
CAPTULO 4.
Tabla 4.2: Factores Sigma. Centrfuga Intermitente Decantadora Tubular Discos
E , m2 20 - 200 150 - 2,500 2,000 - 3,000 400 - 120,000
CENTRIFUGACIN
Fuente: Moir, 1988

misma suspensin la velocidad de sedimentacin de las partculas es independiente de la escala. Este supuesto es ms utilizado cuando se escalan centrfugas del mismo tipo, de tal manera que:
y utilizando la ecuacin (4.23) se obtiene:
(4.40)
Se debe recordar en este punto que la seleccin del equipo de centrifugacin debe combinar la teora, la experimentacin directa con el material (incluyendo pruebas a nivel piloto) y la experencia (Moir, 1988). En la Tabla 4.3 se presenta una gua general para la seleccin de centrfugas sedimentadoras. El tamao de partcula a que se refiere la Tabla 4.3 est basado en la sedimentacin en agua de esferas de cuarzo de densidad relativa 2.65. Para calcular el dimetro equivalente de las partculas de cuarzo, al de las partculas de inters en una suspensin dada, se establece que las velocidades de sedimentacin son iguales en ambos medios, obteniendo la siguiente expresin:
PP ~ PL pe - PA
1/2
(4.41)
4.4. DISEO DE EQUIPO DE
CENTRIFUGACIN
151
Tabla 4.3: Gua para la seleccin de centrfugas.

Caractersticas manejables de la Alimentacin Tipo de Centrfuga Tubular Cmara Mltiple Discos y boquillas Discos Tazn abierto Discos y boquillas Discos Intermitente Tazn Slido Decantadora Tipo de Centrfuga Tubular Cmara Mltiple Discos y boquillas Discos Tazn abierto Discos y boquillas Discos Intermitente Tazn Slido Decantadora Tamao de Partcula mieras 0.1 - 200 0.5 - 5,000 0.5 - 200 0.5 - 200 0.5 - 200 0.25 - 200 2 - 5,000 2 - 5,000 Mtodo de descarga de slidos Intermitente Intermitente Continuo Intermitente Intermitente Intermitente Intermitente Continuo Contenido Slidos % < 0.5 1 -5 2-20 < 10 < 10 <1 1-5 2 - 60 Capacidad lavado de torta Ninguna Ninguna Moderada Ninguna Ninguna Ninguna Ninguna Moderada Prueba de Sedimentacin a 1,000 G (min) 2 - 20 2 - 20 1 - 10 1 - 10 1 - 10 1 - 10 0- 3 0- 3 Flujo de la Alimntacin 1/min 8- 120 1.5 - 335 38 - 3,780 3.8- 1,500 3.8 - 570 0.38- 1,500 1.5- 250 3.8- 1,890 Prueba de Consistencia de los slidos torta firme torta firme lodo lodo lodo torta firme torta firme lodo - torta Fuerza g Mxima 12,000- 16,000 5,000 - 9,000 5,000 - 8,500 5,000 - 7,000 14,000- 15,000 5,000 - 8,000 500 - 800 2,000 - 3,200
Caractrsticas de Procesamiento
Adaptada de: Moir, 1988 Reproducida con elpermisode Me Graw Hill Inc. Copyright 1988. Todos los derechos reservados.
152
donde:
CAPTULO 4.
CENTRIFUGACIN
pe'- Densidad del cuarzo (2.65). [M/L3]. pp: Densidad de la partcula en suspensin. PL: Densidad del lquido . [M/L3]. p: Densidad del agua. [M/L3]. HA'- Viscosidad del agua. [M/L t]. HL'- Viscosidad del lquido. [M/L t]. dp: Dimetro partcula. [L]. dc: Dimetro equivalente de una esfera de cuarzo. [L]. Ejemplo 4.5.- rea de centrifugacin. Una centrfuga de discos de laboratorio produce un sobrenadante claro con una alimentacin de 2.1 1/h de una solucin diluida de clulas. El rea caracterstica de la centrfuga es de 233 ra2. Estimar el rea necesaria para manejar un flujo de 1,000 1/h en una centrfuga similar. Solucin: Se puede utilizar la ecuacin (4.40) para el caso de manejo de un flujo claro a la salida de la centrfuga: [M/L3].
1 nivel laboratorio, 2 nivel industrial, sustituyendo valores, <2 2 i (1000 ///i)(233 m 2 )
Qi
= 111,000 m
2
(2.1 ///O
153
Figura 4.14: Filtracin centrfuga.
4.4.4
Filtracin Centrfuga
La filtracin centrfuga combina los dos principios de separacin mecnica: filtracin y centrifugacin. La aplicacin de este mtodo ha conducido al desarrollo de diferentes tipos de equipos de diferentes geometras y formas de descarga de la torta. En esta seccin el tratamiento se limita al de geometra cilindrica. Considrese una tina o canasta de una operacin de filtracin centrfuga (Figura 4.14) donde se alimenta la suspensin a tratar, y por accin de la fuerza centrfuga se forma una torta homognea sobre la pared de la tina. La canasta perforada tiene un radio R0 y est recubierta de un medio filtrante de resistencia despreciable. En un instante t durante la operacin, la superficie del lquido est localizada en RI y la interfase lquido- slido se localiza en RTGeneralmente el inters de diseo es contar con expresiones para el clculo del gasto volumtrico manejable por la centrfuga y del tiempo de filtrado para realizar una determinada operacin en un equipo dado.
154 Gasto Volumtrico Q
CAPTULO 4.
CENTRIFUGACIN
El gasto volumtrico a travs de la torta en una operacin de filtracin centrfuga, est relacionado con la ecuacin de D'arcy para medios porosos. Debido a que la torta no es plana el rea de filtrado vara con r, entonces la ecuacin de D'arcy debe expresarse en forma diferencial como:
-dP (4.42) ar donde v es la velocidad superficial de filtrado. En el instante t el flujo volumtrico Q en la direccin radial es constante a lo largo del espesor de la torta, y se relaciona con la velocidad de filtracin (variable a lo largo del espesor de la torta) mediante la siguiente expresin:
v = -Q donde t es la altura de la canasta de la centrfuga. Combinando las ecuaciones (4.42) y (4.43) se obtiene:
(4.43)
v
'
(4 44)
la ecuacin (4.44) puede ser integrada entre R0 y RT para encontrar la cada de presin en la torta:
El gradiente de presin generado por el movimiento circular del lquido puede ser calculado utilizando la expresin:
(4.46)
donde pi es la densidad del lquido. Integrando la ecuacin (4.46) entre R0 y R\ se puede encontrar una expresin para el gradiente de presin generado por la fuerza centrfuga. Esta expresin es:
155
(4.47)
La ecuacin (4.47) puede ser sustituida en la ecuacin (4.45) para obtener una expresin del gasto volumtrico en cualquier instante , obtenindose: (4.48) La ecuacin anterior concuerda con el hecho que durante una operacin de filtracin centrfuga, R? disminuye conforme transcurre el tiempo de filtracin (al aumentar el espesor de la torta), disminuyendo tambin Q.
Tiempo de Filtracin-Centrfuga
La ecuacin (4.48) puede ser utilizada para desarrollar una expresin para calcular el tiempo necesario para procesar un volumen de caldo dado (o una torta de un espesor fsicamente alcanzable). Es necesario efectuar primero algunos cambios de variables. El gasto volumtrico Q puede ser relacionado con el volumen de filtrado por la ecuacin: (4.49) dt Por medio de un balance de masa en la pelcula cilindrica que forma la torta se obtiene que: ,
-
T/ _
I"
/ 02
D2 \
f\
CQ\
donde px es la densidad de la torta en peso seco por unidad de volumen. A partir de la ecuacin (4.50 ) se puede definir el diferencia de volumen de filtrado siguiente:
dV =
Po
(4.51;
156
CAPTULO 4.
CENTRIFUGACIN
Combinando las ecuaciones (4.48), (4.49) y (4.51) e integrando la expresin resultante entre los lmites:
i - O
RT = O
t = t
RT
se obtiene:
- R\]
(4.52)
donde t es el tiempo necesario para obtener una torta de espesor (R0 RT) De acuerdo a la ecuacin (4.52) el tiempo de filtrado es funcin de la resistencia especfica de la torta entre otros parmetros. Debido a que la torta puede sufrir compactacin cuando se expone a un campo centrfugo, las mediciones de resistencia especfica hechas en equipos de laboratorio de filtracin intermitente pueden conducir a resultados incorrectos. Entonces es preferible realizar estas mediciones en equipo de laboratorio apropiado para la filtracin centrfuga. Ejemplo 4.6.- Tiempo de Filtracin. Se desea estimar el tiempo de filtracin centrfuga de 1,600 litros de una suspensin que contiene 0.02 (//cm3 de una hormona. Las pruebas de laboratorio indican que la torta que forma esta suspensin tiene una resistencia especfica de 2.67 x 1010 cm/g y una densidad de 1.1 g/cm3 de slidos secos de torta hmeda. Las propiedades del lquido pueden ser consideradas iguales a las del agua. La centrfuga que se va a utilizar gira a 650 rpin, tiene un radio de 51 cm y una altura de 45 cm. Una vez llena la centrfuga y girando puede formar una pelcula de 5.5 cm de lquido y torta. Solucin: cin (4.52). Para tal efecto es necesario calcular primero la Idealizacin
. SUMARIO
157
de la superficie de la torta RT mediante la ecuacin (4.50) de tal manera que:
0.02
x 1600 x 103 cm311/2
1.1 -^j crn1* x TT x 45 era
= 48.9 era
entonces de acuerdo a la ecuacin (4.52) el tiempo de filtrado es:
-l-21n4? 0.01-^ x 2.67 x 1010p ^ x 1.1-Ay cmo cm

2x
X
48.92 cm2
(512 -45.52) cm2
'_5T 48.9 v
-l-21n
51
48^9
8.6 min
La centrifugacin se emplea para separar diversos tipos de slidos (clulas, desechos, precipitados y cuerpos de inclusin) de caldos biolgicos. La teora de la sedimentacin combinada con la experimentacin en equipos pilotos, permite operar y disear racionalmente los equipos de centrifugacin. Existen varios tipos de equipos para efectuar la operacin de centrifugacin los cuales pueden operar tanto en forma intermitente como en forma continua. De acuerdo con la teora de la sedimentacin, el gasto manejable en una centrfuga depende de la geometra especfica del equipo, de la velocidad de giro y de las propiedades del caldo que se desea procesar.
158
CAPTULO 4.
CENTRIFUGACIN
4.6
Problemas
4.1.- Estimar la velocidad de sedimentacin de una partcula de 5 de dimetro y 1,100 Kg/m3 de densidad, en agua a 20 C con una viscosidad de 1.01 x 10~3 N-s/ra2 y una densidad de 1,000 Kg/m3, cuando: a).- Sedimenta libremente. b).- Se localiza en un punto r = 0.15 ra y gira a 3,000 rpm. a).- Resp. 1.35 x lO"6 m/s b).- Resp. 2.04 x 10"3 m/s 4.2.- Una centrfuga tubular de 12.4 x 72.5 cm gira a una velocidad tal que genera un campo de 15,600 G. La pelcula que forma el lquido al girar tiene un espesor de 5 cm. Estimar el gasto volumtrico que puede manejar este equipo en la separacin de restos celulares de E. coli que presentan un dimetro promedio de 0.25 firn y se encuentran en una solucin con 4 cp de viscosidad. La diferencia de densidad entre las partculas y la solucin es de 0.03 g/cm3. Resp. 1.18 l/h 4.3.- Estimar el rea caracterstica de centrifugacin para procesar 3.34 x 10~3 m3/s de un caldo de cultivo bacteriano. Las clulas del caldo presentan un dimetro promedio de 1 m y una densidad de 1096.7 Kg/m3. La viscosidad del caldo es de 2.682 x 10~3 N - s/ra2 y su densidad de 997 Kg/m3. Resp. 82,670 m2 4.4.- Una centrfuga tubular que gira a 4,000 rpm cuando se alimenta con un caldo de levaduras a razn de 12 1/min, logra recuperar el 60 % de slidos. Sabiendo que la recuperacin es inversamente proporcional al flujo, estimar: a).- La velocidad a la que debe girar la centrfuga para obtener un 95 % de recuperacin. b).- El flujo que puede ser alimentado a la centrfuga cuando gira a 4,000 rpm y se desea una recuperacin del 95 %. a).- Resp. 4,845 rpm
b).- Resp. 8.18 l/min
4.6.
PROBLEMAS
159
4.5.- El procesamiento inicial de 30,000 / de un caldo celular que contiene 0.15 /// de clulas (base hmeda de slidos) es necesario realizarlo de acuerdo a las siguientes tres etapas: i).- Concentracin del caldo hasta 0.8 ///. ii).- Resuspensin del caldo en una solucin amortiguadora apropiada hasta 0.5 ///. iii).- Rompimiento de las clulas mediante un homogeneizador. Los restos celulares obtenidos en este paso tienen la mitad del dimetro de las clulas originales y el caldo es cuatro veces ms viscoso. iv).- Separacin de los restos celulares del homogeneizado. Este paso debe ser realizado en menos de 15 horas para evitar degradacin del producto. a).- Estimar el nmero de centrfugas con capacidad de 400 1/h de homogeneizado para realizar el paso iv). b).- Estimar el tiempo necesario para el paso iv). c).- Estimar el tiempo necesario para realizar el paso i) con el mismo equipo. d).- Establecer de que otra forma se puede realizar este proceso. a).- Resp. 2 b).- Resp. 11.25 h
c).- 2.34 h
4.6.- En una operacin para la obtencin de una enzima se utiliza un sistema de extraccin de dos fases acuosas inmiscibles. Una vez realizada la extraccin las fases se separan mediante una centrfuga tubular. Las propiedades de las fases son las siguientes: Fase Ligera (B) Nombre PEG 4000 9 % Densidad 1046 Kg/m3 Viscosidad 0.008 Kg/m-s Temperatura 20C Fase Pesada (A) Nombre ( Dextrano T 5000 2 % Densidad 1144 Kg/m3 Viscosidad 0.008 Kg/m-s Temperatura 20C
La centrfuga gira a 12,000 rpm, tiene un radio externo R0 = 0.05 ra y una longitud L = 0.9 m. La salida de la fase pesada en la centrfuga se localiza a una distancia radial RB 0.02 ra. La salida de la fase ligera se localiza en RA 0.022 ra mediante un arreglo que la coloca por encima de la fase ligera,
160
CAPTULO 4.
CENTRIFUGACIN
de tal manera que la interfase lquido-lquido se forma a una distancia R mayor que R. a).- Desarrollar una expresin para obtener el gradiente de presin generado por la fase ligera al girar. b).- Desarrollar una expresin para obtener el gradiente de presin generado por la fase pesada al girar. c).- Desarollar una expresin para el clculo de la posicin de la interfase suponiendo que los gradientes anteriores son iguales. d).- Calcular la posicin de la interfase. d).- Resp. 3.76 x 10~2 m 4.7.- La centrfuga del problema anterior se alimenta con un flujo de 1 x 10~4 m3/s de una mezcla de las fases que se encuentra en una proporcin de 3.5:1 de fase pesada a fase ligera. a).- Calcular el flujo de la fase ligera que se alimenta a la centrfuga. b).- Utilizando la ecuacin (4.15) calcular la velocidad de sedimentacin mnima para la fase pesada en la fase ligera. c).- Calcular el da metro mnimo de las gotas de fase pesada para obtener un 100 % de separacin de las fases. a).- Resp. 7.78 x 10~5 m3/s c).- Resp. 4 //m 4.8.- La extraccin lquido-lquido del ejemplo anterior se desea escalar utilizando una centrfuga ms grande donde: RB = 0.06 m, RA = 0.066 m, L = 1.5 m y N = 8,000 rpm. Partiendo de que cuando se maneja el flujo de 1 x 10~4 rn3/s en la centrfuga ms chica se tiene una separacin adecuada de las fases, realizar los siguientes clculos: Sea: 1: Operacin en el equipo menor. 2: Operacin en el equipo mayor. a).- Calcular (5)1 b).- Calcular (Ri)2 c).- Calcular (E3)2 d).- Calcular (Qs)2 e).- Calcular el gasto total que puede manejar la nueva centrfuga. a).- Resp. 730 m2
4.6. PROBLEMAS c).- Resp. 4,782 m 2
161
d).- Resp. 6.56 x 10~4 m3/s
4.9.- Se desea procesar una suspensin diluida de levaduras de 10 /zra de dimetro y densidad de 1.01 g/cm3, con una centrfuga de tubos que opera a 8,000 rpm. Los tubos se llenan con la suspensin hasta una altura de 5 cm. Cuando la centrfuga est operando los tubos giran perpendicularmente al eje y el fondo de los tubos se localiza a 9 era del eje. Estimar el tiempo para sedimentar la mitad de las partculas si se supone que stas se distribuyen en forma uniforme en la suspensin. Las propiedades del lquido pueden ser tomadas como las del agua.
4.10.- Se desea procesar 1,000 l/rnin de una suspensin que contiene 20 % de levaduras. En pruebas de laboratorio la suspensin puede clarificarse en 6 min a 1,000 G. Se desea descargar los slidos continuamente. La torta que forman los slidos es bastante fluida. En base a los datos anteriores y utilizando la Tabla 4r3 efecte la seleccin de una centrfuga.
4.11.- Una centrfuga de discos recupera el 50 % de clulas a un gasto de 10 l/min. Qu gasto se puede manejar para lograr 80 % de recuperacin en la misma centrfuga?.
162
CAPTULO 4.
CENTRIFUGACIN
4.7
Bibliografa
Ambler, C.M. 1961. Centrifugation equipment: Theory. Ind. Eng. Chem. 53, 6, 429-433. Axelsson, H.A. 1985. Centrifugation. En: Comprehensive Biotechnology. Moo Young, M. (Ed.). Pergamon Press. Oxford. Seccin 2, Cap. 21, 325-330. Bailey, J.E. y Ollis, D.F. 1986. Biochemical Engineering Fundamentis. Segunda Edicin. Me Graw Hill. New York. 1, 10. Bell, D.J., Hoare, M. y Dunnill, P. 1983. The formation of protein precipitates and their centrifugal recovery. En: Advances in Biochemical Enginnering /Biotechnology. Vol. 26, Downstream Processing. Springer-Verlag. New York. 1-72. Belter, P.A., Cussler, E.L. y Hu, W. 1988. Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology. John Wiley and Sons. New York. 3, 47-75. Bird, R.B., Stewart, W.E. y Lightfoot, E.N. 1964. Fenmenos de transporte. Reverte, S.A. Mxico. 6-14. Bjurstrom, Ed. 1985. Biothechnology. Chem. Eng. Feb. 18. 126-158. Brunner, K.H. 1983. Separators in biotechnology: A new challenge to the centrifuge manufacturer?. Westfalia Separators AG. Oelde, Alemania. Brunner, K.H y H. Hemfort. 1988. Centrifugal Separation in Biotechnological Process. En: Downstream Process: Equipment and Techniques. Advances in Biotechnological Processes. Vol 8. Mizrahi, A. (Ed.). Alan R. Liss. New York. 1-50. Jacobs, L,J. y Penney, W.R. 1987. Phase segregation. En: Handbook of Separation Process Technology. Rousseau, R.W. (Ed.). John Wiley and Sons. New York. 3, 129-196.
4.7. BIBLIOGRAFA
163
Moir, D.N. 1988. Sedimentation centrifugas. Chem. Eng. Marzo 28. 42-51. Svarousky, L. 1979. Sedimentation, centrifugaron and flotation. Chemical. Eng. Julio 16. 93-105. Wiesmann, U y Binder, H. 1982. Biomass separation from liquids by Sedimentation and centrifugation. Adv. Biochem. Eng. 24, 119-171.
Captulo 5 Rompimiento de Clulas

5.1 Introduccin
El rompimiento celular es una operacin unitaria de gran importancia industrial. Algunos de los productos biotecnolgicos producidos a escala industrial son extracelulares y no requieren ser extrados de la clula. Cuando el producto de inters es intracelular (Tabla 5.1), una vez realizada la cosecha de clulas una operacin necesaria para la liberacin del producto es el rompimiento de la clula misma (Petrides et al, 1989). Algunas protenas eucariticas recombinantes producidas por microorganismos procariotes no son secretadas por la clula recombinante y constituyen productos intracelulares, los cuales pueden estar en forma activa o en forma desnaturalizada. Las protenas intracelulares desnaturalizadas con frecuencia forman cuerpos de inclusin insolubles. Otras protenas de inters permanecen en el espacio periplsmico entre la membrana y la pared celular. Slo algunas clulas presentan mecanismos de secrecin celular del producto de inters. Esto hace necesario contar con tcnicas de rompimiento celular eficientes y selectivas en la produccin de protena intracelular. La tcnica de rompimiento celular seleccionada determina el tamao de los desechos resultantes y la influencia que estos tendrn en las operaciones que se utilicen para su separacin. Asimismo, la. tcnica es funcin del tipo de microorganismo que contiene al producto de inters,
165
166
CAPTULOS.
ROMPIMIENTO DE CLULAS
Tabla 5.1: Productos que requieren de una ruptura celular. Tipo de Producto Protenas Recombinantes Enzimas Vacunas Otros Adaptada de: Foster, 1992
Ejemplos Insulina, HC, Protema A, Protena G. 1-Asparaginasa, Invertasa, Glucocinasa. Ttanos, Meningitis. DNA, Mitocondrias, Esporas, Toxinas.
particularmente en relacin a su estructura externa (Asenjo, 1990). En este captulo en la seccin 5.2 se presentan los fundamentos de la operacin de rompimiento. La seccin 5.3 se centra en los equipos de rompimiento que se utilizan a nivel industrial. El diseo de estos equipos se discute en la seccin 5.4.
5.2
Fundamentos
La recuperacin ptima de productos intracelulares requiere del conocimiento de la estructura de las capas externas que protegen a las clulas: la membrana y la pared celular. Requiere adems del conocimiento de los sistemas que permiten a ciertas clulas secretar los productos de inters en forma activa, evitando con sto la necesidad de romper la clula para recuperar el producto. Existen varios mtodos para la recuperacin de productos intracelulares, los ms drsticos involucran el rompimiento completo de la clula. Los mtodos de recuperacin menos severos involucran una alteracin qumica de las cubiertas celulares o permeabilizacin que facilita la salida del producto. Esta seccin se centra en cuatro aspectos fundamentales para el anlisis de la operacin de rompimiento: Estructura de la pared celular.
5.2. FUNDAMENTOS Sistemas celulares de secrecin. Mtodos de rompimiento celular. Mtodos de permeabilizacin celular.
167
5.2.1
Estructura de la Pared Celular
En esta seccin se describe brevemente la estructura de las paredes microbianas, particularmente la estructura de las paredes bacterianas, debido al relevante papel que tienen las bacterias como la E. coli como organismos husped de varios productos biotecnolgicos recombinantes (Wang, 1988). Las paredes celulares de las bacterias son rgidas y porosas, debido a que las bacterias poseen una elevada presin osmtica interna y a que frecuentemente pueden hallarse expuestas a diferentes condiciones ambientales externas. Las paredes celulares de las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas poseen una caracterstica molecular comn: en ambas existe un rgido esqueleto peptidoglucano o murena. La unidad bsica que se repite en la estructura del peptidoglucano es la del disacrido constituido por N-acetil-D-glucosamina y el cido N-acetilmurmico. En las clulas Gram-positivas la capa de peptidoglucano es mucho ms gruesa que en las clulas Gram-negativas. En stas la capa de peptidoglucano se encuentra localizada en el espacio periplsmico enlazndose covalentemente a las lipoprotenas de la capa exterior de la pared celular. El espacio periplsmico est constituido por una sustancia semejante a un gel, que contiene una alta concentracin de enzimas degradativas y protenas de transporte. La estructura del peptidoglucano de la pared celular bacteriana es resistente a la accin de las enzimas que hidrolizan los pptidos, las cuales no atacan a los pptidos que contienen D-aminocidos como los que se encuentran en la estructura de la pared (como D-alanina y Dglutamina). En las clulas Gram positivas la enzima lisozirna se u t i l i z a para el rompimiento celular ya que su mecanismo de accin es el rompimiento
168
CAPTULO 5. ROMPIMIENTO DE CLULAS
de los enlaces glucosdicos del esqueleto polisacrido del peptidoglucano, que en este tip.o de clulas se localizan en la parte externa. Una vez roto el esqueleto de esta manera, la clula se expande con la consecuente ruptura de la membrana y liberacin del contenido celular (Lehninger, 1989). La diferencia en el grosor de la capa de peptidoglucano y su ubicacin, permite que las clulas Gram-positivas sean ms sensibles a la accin de la lizosima que las Gram-negativas. Las paredes celulares de las bacterias Gram-negativas que presentan dificultad al rompimiento por la lizosima, pueden romperse en molinos de perlas de vidrio. La pared celular de las levaduras consta de dos capas: una capa externa formada de un complejo manano-protena y una capa interne de glucano. Cuando es necesario romper completamente la clula recombinant* para liberar el material intracelular, deben considerarse las caracters ticas estructurales de la clula para la seleccin adecuada de la tcnic de rompimiento.
5.2,2
Sistemas Celulares de Secrecin
Se llama secrecin al movimiento de un soluto a travs de la men brana celular hacia el exterior de la clula. Tambin se considera corr secrecin cuando, como en el caso de algunas protenas, stas queda atrapadas en el espacio periplsmico o entre la membrana y la pare celular. En la produccin de protenas de inters comercial los mecanism de secrecin y la modificacin post-traduccional que sufren algunas < estas protenas en su ruta de secrecin, son de gran importancia en desarrollo de los procesos correspondientes. Cuando se utiliza E. coli para la produccin de protenas recom nantes se obtienen rendimientos muy altos, sin embargo este tipo clula presenta dos problemas caractersticos : - Las protenas no son secretadas por las clulas. - Las protenas no se producen en forma activa, permaneciendo er
5.2. FUNDAMENTOS
169
protoplasma en forma insoluble formando precipitados llamados cuerpos de inclusin. Cuando se presentan los problemas mencionados anteriormente, el proceso para la obtencin de la protena de inters debe incluir operaciones de rompimiento celular, reacciones equivalentes a las de modificacin post-traduccional "in vivo", y complejas operaciones de recuperacin y purificacin. El hecho de que varias de las modificaciones post-traduccionales sean realizadas en las rutas de secrecin de las clulas que tienen esta capacidad, conjuntamente con la eliminacin de la operacin de ruptura que sto implica, ha conducido al empleo de otro tipo de clulas recombinantes diferentes a la E. coli. El primer proceso industrial que utiliza clulas recombinantes de mamfero (clulas de ovario de hmster), se emplea para la obtencin del agente tromboltico llamado "Activador del Plasmingeno Tisular" (t-PA de sus siglas en ingls) (Datar et a/, 1993). La pureza y seguridad de los productos de ambos tipos de procesos es de gran importancia, particularmente en el caso de las protenas de uso clnico. Los productos de E. coli disminuyen el riesgo de transmisin de protenas carcinognicas, pero presentan riesgos potenciales de generacin de respuestas inmunolgicas.
5.2.3
Mtodos de Rompimiento Celular
Una gran variedad de tcnicas de rompimiento celular son usadas en el laboratorio, pero slo algunas de ellas a escala industrial. Los mtodos de rompimiento celular (Tabla 5.2) pueden ser divididos en mtodos qumicos y mtodos mecnicos. Dentro d los primeros se encuentra: el choque osmtico, la disolucin lipdica, la digestin enzimtica y el tratamiento alcalino. Dentro de los segundos se encuentran la agitacin con abrasivos y la homogeneizacin. Mtodos Qumicos Choque Osmtico.- El. rompimiento de clulas por medio de choque osmtico se fundamenta en el conocimiento del fenmeno de osmosis.
170
Tabla 5.2: Mtodos de rompimiento celular.

Mtodo Qumico Tcnica Choque osmtico Disolucin lipdica Digestin enzimtica Tratamiento alcalino Principio Ruptura osmtica de membrana Desestabilizacin de la pared celular por solventes org. Digestin de la pared celular Solubilizacin de membranas por saponificacin de b'pidos pequeo Las clulas son prensadas entre perlas de vidrio Las clulas se rompen por fuerzas de corte al pasar por un orificio pequeo Ejemplos Ruptura de glbulos rojos Rompimiento de levaduras por tolueno M. lysodeikticus tratados con lisozima
Mecnicos
Molido en Molinos de Perlas Homogeneizacin
Tratamiento de suspensiones celulares a gran escala Tratamiento de suspensiones celulares a gran escala
Adaptada de Scopes, 1994

Reproducida con el pernso de Spriiiger-Verlag. Copyrigllt 1994. Todos los derechos reservados.
5.2.
FUNDAMENTOS
171
a) 1 = 0
C, < C2 [conc. H2OJ
b) t = t C, = C,
Figura 5.1: Osmosis y presin osmtica. Cuando una membrana semipermeable separa dos soluciones de diferente concentracin de soluto (Figura 5.1), se produce un movimiento neto de agua a travs de la membrana hacia el compartimento que contiene el soluto ms concentrado. La presin osmtica es la fuerza que debe aplicarse para contrarrestar la fuerza del flujo osmtico producido. La presin osmtica es una de las propiedades coligativas de las soluciones; depende del nmero de partculas de soluto por unidad de volumen pero es independiente de la naturaleza molecular del soluto y de la forma de sus partculas. El rompimiento celular por choque osmtico consiste en la carga de un volumen dado de clulas dentro de agua pura (con frecuencia se utiliza el doble del volumen de las clulas por volumen de agua). La clula se expande debido a que contiene solutos que ocasionan un flujo osmtico del agua hacsu interior. Esta expansin puede conducir a su lisis o rompimiento. La factibilidad del uso de este mtodo depende de la resistencia mecnica de las clulas de inters. Se puede desarrollar una expresin para el clculo de la presin osmtica necesaria para romper una clula a partir de la definicin de equilibrio qumico. En el equilibrio el potencial qumico de las soluciones acuosas es igual en ambos lados de la membrana celular, de tal manera que:
172
///2o (externo) = ^H2o(interno)
(5-1)
El potencial qumico externo del agua pura debe incluir un valor de referencia y una correccin en la presin. El potencial qumico interno involucra un valor de referencia, la correccin en la presin y una correccin para la concentracin de la solucin; de tal manera que para una solucin ideal incompresible, la ecuacin (5.1) se expresa como: 4o + VH,oPe = 4o + VH0Pi + RTln(l - x,) donde: /4o: Ptencial de referencia. [/ atm/mol]. VHÔ' Volumen parcial molar del agua. [/ /mol]. x\ : es la fraccin molar de soluto dentro de la clula. Tomando el contenido celular como una solucin diluida, el volumen parcial del agua VHÔ es aproximadamente igual al volumen molar del agua V//2o, y Xi es pequea. De esta manera se tiene: VH*O
y finalmente:
i Pj /t- RTr P e Cj (^ ^} ^.Oy
(5.2)
Esta relacin es llamada ley de van't HofF y en ella c\ es la concentracin del soluto 1. Disolucin Lipdica.- La extraccin por solventes ha sido usada para la disolucin selectiva de ciertos componentes celulares. Un gran nmero de solventes orgnicos han sido investigados en el laboratorio para ser utilizados con este fin, sin embargo su uso es limitado debido a que pueden inhibir severamente las actividades biolgicas. La tcnica de disolucin lipdica es relativamente simple, se aade a la suspensin celular un volumen de tolueno aproximadamente igual al 10% de la biomasa. El tolueno es absorbido dentro de los lpidos de
5.2. FUNDAMENTOS
173
la pared celular, lo que produce la expansin de la pared y la ruptura de sta. El contenido celular es liberado y entonces puede ser separado el producto de inters. Otros tipos de solventes adems del tolueno tambin son efectivos para este propsito. El benceno es efectivo pero es carcinognico y altamente voltil. El tolueno tambin es carcinognico pero es menos voltil. Para la aplicacin de la tcnica de disolucin lipdica se requiere hacer con anticipacin un buen nmero de experimentos de laboratorio, para verificar los parmetros de solubilidad que reflejen las interacciones lpido-solvente. En la prctica los solventes con similares parmetros de solubilidad atacarn a las clulas en forma similar. Idealmente se deben seleccionar solventes cuyos parmetros de solubilidad sean apropiados para los lpidos de la pared celular pero inadecuados para disolver al producto de inters localizado dentro de la clula. Esto casi nunca se conoce entonces es necesario realizar experimentos. Digestin Enzimtica.- La digestin enzimtica consiste en el empleo de enzimas que atacan la pared y provocan el rompimiento celular. Una de las enzimas ms utilizada en la digestin enzimtica de bacterias es la lisozima. Esta enzima rompe el enlace (3 1-4 entre el cido N-acetilmurmico y la N-acetil glucosamina de la capa de peptidoglucano de la pared celular, provocando el rompimiento de la pared y consecuentementemente la ruptura de ,1a clula. A pH's menores de 5 las clulas no se rompen an cuando la pared celular haya sido destruida por digestin. Esto se debe a la baja solubilidad del protoplasma a estos pH's y enfatiza la necesidad tanto de rompimiento de la pared celular como de condiciones favorables de solubilidad, para una liberacin eficiente de los materiales intracelulares (Edebo, 1969). El alto costo de las enzimas no permite que esta tcnica sea usada ampliamente en el rompimiento celular a nivel industrial a pesar de ser altamente selectiva (Andrews ti a/, 1990).
174
CAPTULOS.
ROMPIMIENTO
DE CLULAS
Mtodos Mecnicos En el rompimiento d clulas a gran escala se han preferido los mtodos mecnicos. Las tcnicas empleadas son: la molienda hmeda en molinos de perlas agitados a alta velocidad y la homogeneizacin a alta presin (Bjustrom, 1985; Kula y Schtte, 1987). El equipo que se utiliza en estas tcnicas originalmente fue diseado para otros usos. El uso del molino de perlas se origin en la industria de la pintura por la necesidad de obtener mezclas homogneas de los pigmentos constituyentes de la pintura. El uso del homogeneizador se origin en la industria alimenticia, particularmente en la homogeneizacin de leche y productos lcteos (obviamente la ruptura celular no es una homogeneizacin). Estos equipos han sido adaptados para utilizarse en la desintegracin celular. La desintegracin celular no es una tarea fcil si se considera la alta resistencia mecnica de las paredes celulares y el tamao tan pequeo de los microorganismos (1-10 /m). Para poder alcanzar rendimientos altos, esto es, obtener un grado de desintegracin celular mayor que 90%, con frecuencia se requieren dos o tres pasos tanto en el homogeneizador como en el molino. El paso repetido de la suspensin celular a travs de los equipos de rompimiento produce una distribucin amplia del tamao de los residuos de la pared celular, extendindose hasta por abajo de las 3 fim. En esta operacin es importante controlar el tamao de los desechos celulares debido a que la separacin slido-lquido posterior depende del tamao de las partculas.
5.2.4
Mtodos de Permeabilizacin
Los mtodos de permeabilizacin (Figura 5.2) consisten en alterar la estructura de la pared y la membrana celular para facilitar la difusin del producto hacia el exterior de la clula. Debido a los problemas asociados con la purificacin de productos obtenidos por rompimiento celular, existe un gran inters en el empleo de estos mtodos alternativos a la ruptura mecnica empleada a nivel industrial. Existen diversos mtodos para realizar la permeabilizacin celular, varios de los cuales son iguales a los empleados en el rompimiento celular
5.2. FUNDAMENTOS
175
Figura 5.2: Comparacin conceptual de permeabilizacin (lado derecho) y rompimiento mecnico (lado izquierdo) Fuente: Naglak et a/, 1990.
Reproducida con el permiso de Marcel Deker Inc. Copyright 1990. Todos los derechos reservados.
pero se realizan a condiciones ms leves. Por ejemplo, mediante presin osmtica controlada es posible liberar protenas localizadas en el espacio periplsmico de clulas Gram negativas. Varios de los trabajos sobre permeabilizacin han sido desarrollados en bacterias gram-negativas, principalmente E. coli, usando solventes como tolueno al 5%, detergentes aninicos y no inicos como el dodecil sulfato de sodio (SDS) y Tritn X-100, agentes caotrpicos come guanidina y urea, y agentes quelantes como el EDTA (Naglak et al 1990). La base de una solubilizacin efectiva radica en la estructura qumi ca del detergente o agente solubilizante (Figura 5.3). Estas estructura? tienen una porcin hidroflica (generalmente inica) y una parte hi drofbica (generalmente un radical orgnico). Como resultado de k anterior, todos los detergentes son anfipticos, capaces de interacciona: tanto con el agua como con un lpido, esto permite que sean empleado: para solubilizar la pared de las bacterias Gram negativas. La naturaleza anfiptica se mantiene si los detergentes son ani
176
Dodedl Sulfato de Sodio (SDS) (aninico) CH3(CH2)nS03Na
Sultanato de Sodio (aninico)
CH3(CH2)9-
SCf, Na
Bromuro de Cetiltrimetil Amonio (CTAB) (catinico)
Tritn X - 100 (no inico, poli disperso)
CH3(CH2),5N*(CH3)3Br
OH
Taurocolato de Sodio (aninico)
OH
NCH2CH2SO3 Na
OH OH
Figura 5.3: Estructuras qumicas de agentes solubilizadores. Fuente: Belter et a/, 1988
5.2. FUNDAMENTOS
177
nicos, catinicos o no inicos. Dentro de los materiales amnicos se encuentran los jabones los cuales son sales de los cidos grasos. Debido a que los jabones presentan un grupo carboxilico slo son detergentes efectivos a pH altos, donde este grupo permanece ionizado (los jabones no son efectivos en aguas duras, donde los iones de calcio pueden reaccionar con ellos para formar precipitados insolubles). La desventaja de los jabones convencionales como permeabilizantes, puede ser evitada reemplazando el grupo carboxlico con un grupo sulfato. El sulfato puede estar ligado a un anillo bencnico formando un sulfonato semejante al que se muestra en la Figura 5.3. Este sulfonato es ms efectivo que los sulfates alcalinos en la ruptura de clulas; por esta misma razn los sulfonatos no son fcilmente degradados microbiolgicamente. Los detergentes no inicos comerciales como el Tritn X-100 estn menos definidos qumicamente. Las molculas de este detergente tienen tambin una porcin hidrofbica y una hidroflica. La parte hidroflica no es un sulfato sino un alcohol. El aspecto importante de estos detergentes es su habilidad para solubilizar lpidos de la pared celular y de esta manera modificar la estructura de la clula. En soluciones muy diluidas de detergentes, casi no hay disolucin de lpidos. Existe una concentracin a la cual los lpidos repentinamente comienzan a solubilizarse; arriba de esta concentracin la solubilidad de los lpidos vara linealmente con la concentracin de detergente como se muestra en la Figura 5.4. Permeabilizando la clula de E. coli con guanidina y Tritn X-100, en concentraciones de 0.1 M de guanidina y 0.5% de Tritn, se libera cerca del 50% de la protena intracelular (Naglak ti a/, 1990). La protena recombinante /3 - lactamasa ha sido recuperada con toda su actividad (de E. coli) utilizando una solucin 0.2 M de guanidina. A concentraciones de guanidina cercanas a 2 M, las protenas pueden desnaturalizarse an cuando este proceso sea irreversible. Se ha encontrado que con la permeabilizacin con guanidina a concentraciones de 6 M, algunas protenas como las que se encuentran en cuerpos de inclusin, conservan toda o parte de su actividad biolgica. Por esta razn, este mtodo de permeabilizacin celular puede ser muy apropiado para algunos productos recombinantes . Debido a que la permeabilizacin qumica puede ser llevada a cabo en un simple recipiente agitado, sus costos de operacin y de inversin
178
CAPTULO 5. ROMPIMIENTO
DE CLULAS
Figura 5.4: Efecto de la concentracin de detergentes sobre la disolucin de lpidos. Fuente: Belter et a/, 1988
son ms bajos que los de los mtodos de rompimiento celular mecnicos. La principal desventaja de la permeabilizacin con respecto a los mtodos mecnicos y a la lisis enzimtica, es que libera menos protena por unidad de tiempo.
5.3
Equipo de Rompimiento Celular
La operacin de rompimiento celular a nivel industrial actualmente se realiza en tres tipos de equipos de rompimiento mecnico: Molinos de Perlas de Alta Velocidad. Homogeneizadores de Alta Presin. Microfluidizadores.
5.3.1
Molino de Perlas de Alta Velocidad
Los molinos de perlas de alta velocidad (Figura 5.5) constan fundamentalmente de un cilindro en posicin horizontal (o vertical) llamado
5.3. EQUIPO DE ROMPIMIENTO CELULAR
179
cmara de molienda, un agitador (Figura 5.6) que consiste de una flecha giratoria sobre la que se monta un sistema de discos, barras o anillos que provoca el movimiento del contenido del molino, y una gran cantidad de pequeas perlas de vidrio que son los elementos activos de molienda. El material celular se introduce por uno de los extremos de la cmara de molienda . El agitador produce el movimiento necesario de la masa celular y las perlas de vidrio. Los discos presentan perforaciones cubiertas con membranas que permiten el paso del material celular pero no as el de las perlas. Los discos o impulsores pueden montarse sobre la flecha ya sea en forma concntrica o excntrica. El tipo de agitador est directamente relacionado con el transporte de energa ptimo de las partes en rotacin a las perlas de vidrio. El tipo de flechas e impulsores que se utilicen depende de la aplicacin concreta que se le dar al molino. Los molinos de perlas agitados a alta velocidad que se encuentran disponibles en el mercado, difieren en la relacin de longitud a dimetro de la cmara de molienda. La relacin ptima se encuentra entre 1:2.5 y 1:3.5. Los volmenes varan entre 50 mi y 250 litros para equipos de laboratorio, planta piloto y produccin a escala industrial. Estos ltimos permiten manejar flujos de hasta. 2,000 l/h. Desafortunadamente los modelos de laboratorio no son geomtricamente similares a los usados a nivel industrial, lo que dificulta el escalamiento de datos. Una variante del molino de perlas es el molino de cmara mltiple. Mecanismo de Desintegracin Celular El transporte de energa cintica desde el agitador a las perlas de vidrio se efecta por fuerzas de adherencia en combinacin con fuerzas de desplazamiento. Ambas relacionadas con el diseo geomtrico, y con las propiedades de la superficie y del impulsor. El volumen de la cmara de molienda se activa a travs de la aceleracin de las perlas en direccin radial formando capas de corriente de diferente velocidad. Los perfiles de velocidad diferencial generan considerables fuerzas de corte dependiendo de la velocidad y el tamao de las perlas de vidrio. Las fuerzas de corte generadas, conjuntamente con la frecuencia y la fuerza de las colisiones entre las perlas, son la causa de la desintegracin de
180
Medio
(b)
Figura 5.5: Esquema del Molino de Perlas: a) vista lateral; b) corte transversal. Fuente: Schtte y Kula, 1990
5.3. EQUIPO DE ROMPIMIENTO
CELULAR
181
Impulsor Concntrico
Impulsor Excntrico
Figura 5.6: Diferentes arreglos de impulsores, excntrico. Fuente: Kula y Schtte, 1987
AIChE. Todos los derechos reservados.
a) concntrico b)
Reproducida con el permiso de el American Institute of Chemical Engineers. Copyright 1987
182

Tabla 5.3: Molino de perlas agitado. Parmetros Operacionales. Velocidad del agitador Velocidad de alimentacin de la suspensin celular Diseo del agitador Tamao de las perlas de vidrio Carga de las perlas de vidrio Concentracin celular Temperatura Adaptada de: Kula y Schtte, 1987
Reproducida con el permiso de el American Institute of Chemical Engineers. Copyright 1987 AIChE. Todos los derechos reservados.
las clulas.
Parmetros Operacionales
El molino de perlas est caracterizado por un gran nmero de parmetros (Kula y Schtte, 1987). Los ms importantes para la desintegracin celular se muestran en la Tabla 5.3 y algunos de ellos son discutidos a continuacin.
Velocidad del Agitador. El agitador es responsable de la transferencia de energa y de la activacin de las perlas en la cmara de molienda. La velocidad perifrica normalizada de los anillos se utiliza para comparar molinos diferentes, debido a que proporciona mayor informacin tcnica al agrupar varios parmetros relacionados con la velocidad de agitacin. Para impulsores montados excntricamente, se toma un promedio de velocidades perifricas U el cual es calculado ce acuerdo a la ecuacin: _ Dmirn 60 x 1000
(5.4)

con:
*-^ Yft
183
~~~
(2\/e2 4- d2/4
J\/
1^ **
donde: Dm: Dimetro promedio de los anillos excntricos, [mm]. e: Dimetro de la flecha del agitador, [mm]. d: Dimetro de los anillos del agitador, [mm]. n: Velocidad angular del agitador, [rpm]. En el caso de impulsores concnticos en la ecuacin (5.4) se utiliza directamente el dimetro del impulsor. Normalmente la velocidad perifrica flucta entre 5 y 15 ra/s. Al incrementar la velocidad perifrica la fuerza de corte generada se incrementa, y con sta la frecuencia de colisin. Paralelamente la temperatura se incrementar dependiendo de la carga de perlas la cmara de molienda. La erosin de las perlas tambin se incrementar y con esto, la energa necesaria para manejar el agitador. La Figura 5.7 muestra el efecto de la velocidad del agitador sobre la desintegracin de Sacharomises cerevisiae en un molino de perlas agitado de 4 litros. Se puede observar que a una velocidad perifrica de 8 m/s (1500 rpm) se obtiene la velocidad ptima para la desintegracin celular (velocidades mayores producen slo ms calentamiento). En microorganismos pequeos como las bacterias, la velocidad perifrica ptima para este tipo de molino se encuentra alrededor de 10 m/s (1900 rpm). Para un flujo de alimentacin constante, no existe una relacin lineal entre el grado de desintegracin celular y la velocidad perifrica, lo cual puede ser atribuido a los cambios en la distribucin del tiempo de residencia con la variacin de la velocidad de agitacin. Velocidad de Alimentacin de la suspensin celular. El flujo permisible en un molino de perlas es funcin del volumen del molino, de la carga de perlas y de la velocidad del agitador.
184
20
20H
- 10 -o
1000
1500 2000 Velocidad del agitador (rpm )
2500
Figura 5.7: Efecto de la velocidad del agitador sobre la liberacin de enzima y protena intracelular en S. cerevisiae. Molino de perlas: Netzsch LME4. Fuente: Kula y Schtte, 1987
CELULAR
185
El molino Netzsch LME4 (Netzsch-Feinmahltechnik GmbH, Selb, F.R.G) cuyo volumen es de 4 litros, puede ser operado con flujos de alimentacin mayores de 100 l/h. El consumo de potencia del molino depende en primer lugar de la velocidad del agitador y slo ligeramente del flujo de alimentacin. Por lo tanto, los flujos de alimentacin altos pueden ser ms econmicos. En teora el grado de desintegracin celular alcanzado por paso, es inversamente proporcional al flujo de alimentacin. Para levaduras sin embargo, esto no se cumple. La Figura 5.8 muestra la poca influencia del flujo de alimentacin sobre el grado de desintegracin de Sacharomyces cerevisiae. Un incremento de un orden de magnitud en la velocidad de alimentacin, desde 10 a 100 l/h produce un decremento en el grado de desintegracin del microorganismo de solamente 18%. Por otra parte, la liberacin de enzima intracelular a partir de Brevibacterium ammoniagenes disminuye en forma ms marcada con el incremento en la razn de alimentacin (esto se debe principalmente a la diferencia de tamao y a la mayor resistencia de la pared de las bacterias Gram positivas). Considerando los tiempos de residencia y la demanda de energa, es aconsejable operar los molinos de perlas a altos flujos de alimentacin y utilizar varios pasos para alcanzar el rendimiento requerido. Diseo del Agitador y Efectos del Mezclado. El comportamiento de un molino de perlas depende en gran medida del patrn de flujo y mezclado que produce el agitador. El patrn se sita entre los patrones de mezclado ideal conocidos: el tipo tapn (sin mezclado) y el tipo tanque continuo completamente agitado (100 % agitado). El comportamiento de mezclado en un molino de perlas puede ser determinado mediante tcnicas con trazadores (tintas, sales, etc) que permiten establecer la distribucin de tiempos de residencia de los elementos del fluido en el molino (Levenspiel, 1972). El rompimiento celular es funcin de la velocidad del agitador y del flujo de alimentacin de la suspensin. Esta funcionalidad es lineal slo si los microorganismos son transportados como flujo tapn (sin mezclado axial), lo que significa idnticas velocidades de transporte axiales a travs de la cmara de molienda. Sin embargo, en los agitadores de
186
DE CLULAS
too60 -
60-
40 -
20 -
20
40
60
80
100
Velocidad de Alimentacin (l/h) Fumarasa: (o) de S. cerevisiae: () de B. ammoniagenes
Figura 5.8: Efecto del flujo de la alimentacin sobre la liberacin de fumarasa en S. cerevisiae y B. ammoniagenes. Fuente: Kula y Schtte, 1987
Reproducida con el permiso de el American Iiistitute of Chemical Engineers. Copyright 1987 AIChE. Todos los derechos reservados.
CELULAR
187
1.0-
0.8-
0.6-
A\
**t-
0.4-
0.20.0
=-T *R
Figura 5.9: Efecto de la geometra del agitador sobre el tiempo de residencia, a un flujo de alimentacin de 180 l/h. Fuente: Kula y Schtte, 1987
los molinos comerciales se presentan efectos que provocan el mezclado de todas las partculas introducidas en la cmara. Ocasionalmente, un microorganismo a la entrada de la cmara que tiene un tiempo de residencia igual a cero, tendr la misma probabilidad de dejar la cmara de molienda que un microorganismo que haya entrado en ella previamente. La Figura 5.9 muestra la distribucin d tiempos de residencia en un molino Netzsche LME 20 en respuesta a un pulso de colorante, usando tres tipos diferentes agitadores con la misma cmara. La distribucin de la concentracin de tinta en la corriente de salida puede ser correlacionada directamente con la distribucin normalizada de tiempos de residencia. En general se requieren cuatro o cinco tiempos de residencia ideales para cambiar completamente el contenido de la cmara de molienda. Puesto que la clula est presente en la cmara de molienda con una
188
CAPTULOS.
ROMPIMIENTO DE CLULAS
probabilidad y perodos de tiempo diferentes, el tiempo de residencia promedio , no es idntico al tiempo de residencia ideal IR. Con los tres tipos de agitadores a que se refiere la Figura 5.9 se ha observado que un incremento en la velocidad de rotacin produce una distribucin ms amplia de tiempos de residencia. Se ha observado tambin que un incremento en la velocidad de alimentacin produce una distribucin ms estrecha de tiempos de residencia con los tres tipos de agitadores. Esto permite incrementar, la eficiencia de los molinos y explica por que la velocidad de alimentacin aparentemente no afecta considerablemente el grado de desintegracin alcanzado en un solo paso. Tamao de las Perlas de Vidrio. En la desintegracin celular se utilizan perlas de vidrio libres de plomo con un dimetro entre 0.2 y 1.5 mm. En molinos de laboratorio pueden utilizarse perlas hasta de 0.2 mm. Sin embargo a escala industrial el tamao de las perlas debe ser mayor 0.4 mm para facilitar su separacin continua. Algunas observaciones experimentales indican que el tamao ptimo de las perlas depende del tipo de clula: para levaduras, se requieren dimetros mayores a 0.5 mm y para bacterias menores que 0.5 mm. Las enzimas localizadas en el espacio periplsmico son ms fcilmente liberadas utilizando perlas de vidrio mayores en relacin a las utilizadas para liberar enzimas protoplasmticas (Keshavarz et a/, 1987). Existe un dimetro ptimo para las perlas. Dada una relacin de volumen del molino a volumen de perlas, el nmero de perlas aumenta al disminuir el dimetro de stas. Esto aumenta la frecuencia de las colisiones entre las perlas y por lo tanto la eficiencia de la ruptura. Por otro lado, al disminuir el dimetro de las perlas aumenta su tendencia a flotar produciendo el efecto contrario. Carga de Perlas. La cantidad de perlas que debe ser cargada al molino depende del tipo de clulas y del tamao de las perlas. Una carga baja de perlas produce una eficiencia baja, mientras que una carga alta genera mayor consumo de potencia y libera ms calor. Empricamente se ha determinado que la carga ptima de un molino flucta entre el 80 y 90 %. Con perlas de 0.5 mm se recomienda una carga del 85 % y de 80 % cuando las perlas son de 1 mm. La carga de
5.3. EQUIPO DE ROMPIMIENTO CELULAR perlas se define como: Carga = ^ donde: Vp: Volumen del lecho de perlas. [L3].
Vc = Vt- Va.
189
(5.5)
Vt: Volumen de la cmara de molienda. [L3]. Va'. Volumen del agitador (discos o barras y flecha). [L3].
Ejemplo 5.1.- Carga de un molino de perlas.

El lecho formado por las perlas de un molino tiene una porosidad de 0.375. Estimar la fraccin de volumen vaco de la cmara del molino cuando la carga es del 80%. Solucin: De acuerdo con la ecuacin (5.5),
-*
la fraccin vaca est dada por: _ .. (VJ)(0.375) + 0.2VC r raccin =
'C
combinando las expresiones anteriores, (0.8V C )(0.375)+0.2V;
r raccion = Fraccin
= 0.5
Cuando la carga de perlas es del 80% el volumen de las perlas es igual al volumen libre total VM-
190
Concentracin de la Suspensin Celular. La concentracin de clulas en la suspensin no afecta considerablemente la efectividad de la desintegracin celular. Se ha reportado un grado de desintegracin idntico para clulas de levadura en concentraciones de 4 a 20% de peso seco de clulas, en un molino Dyno KD5. La generacin de calor disminuye con el decremento de la concentracin celular mientras que el consumo de energa por unidad de peso se incrementa. El peso hmedo de clulas ptimo para la desintegracin celular en un molino de perlas agitado se encuentra entre el 40 y 50% . Efecto de la Temperatura La temperatura de molienda facilita el rompimiento celular pero puede afectar al producto. En general el rompimiento celular se realiza a una temperatura de entre 5 y 15 C. Es difcil llevar un control preciso de la temperatura puesto que una gran parte de la energa introducida por el agitador dentro de la mezcla es transformada en calor. Por ejemplo, en un molino Netzsch LME20 que consume una potencia de 7.5 Kwh aproximadamente cerca de 6000 kcal/h tienen que ser removidas por el sistema de enfriamiento.
5.3.2
Homogeneizador de Alta Presin
Los homogeneizadores de alta presin son los equipos ms ampliamente utilizados para el rompimiento celular gran escala (Keshavarz ti a/, 1987). El homogeneizador de ms amplio uso es el Mantn-Gaulin, sin embargo existen otros tipos de homogeneizadores como el Microfluidizador. Un homogeneizador de alta presin del tipo Manton-Gaulin consta de dos partes principales: una bomba de pistn de alta presin y una vlvula. El nmero de pistones de la bomba depende del tamao del homogeneizador, en los equipos de laboratorio las bombas constan de uno o dos pistones, mientras que las de los equipos industriales tienen de tres a cinco. Durante una operacin normal, se utiliza una bomba de alimentacin para transportar la suspensin celular con una presin entre 0.1 y 0.5 MPa (millones de Rscales) a la bomba de alta presin, donde la suspensin es comprimida hasta 60 MPa. La vlvula acoplada a la bomba (Figura, 5.10), se abre cuando la presin excede un valor
CELULAR
191
Vlvula plana anillo de impacto
suspensin celular producto homogenizado
Vlvula de cuchilla anillo de impacto

\ / / ,
suspensin celular * r.
i
*< producto ) homogenizado
Figura 5.10: Configuracin de las vlvulas usadas en el homogeneizador: a).- Unidad plana b).- Unidad de cuchilla. Fuente: Kula y Schtte, 1987
determinado. La suspensin de clulas es liberada a travs de la vlvula con una velocidad muy alta, y despus de cambiar dos veces de direccin choca contra un anillo de impacto.
Mecanismo de Desintegracin Celular

La desintegracin celular se inicia cuando la suspensin celular pasa a alta presin por la vlvula de descarga, donde las clulas se someten a turbulencia, cavitacin y esfuerzos de corte lquido. En experimentos realizados cuyos resultados se muestran en la Figura 5.11, parece razonable suponer que en el homogeneizador de Gaulin, la fuerza del choque sobre el anillo es directamente proporcional a la presin de operacin y es la causa principal del rompimiento.
192
50-
20
30
40
50
Presin (MPa) Vlvula: ( + ) de cuchilla; ( o ) plana
Figura 5.11: Rompimiento de Sacharomyses cerevisiae con homogeneizador a alta presin usando diferentes vlvulas. Enzima glucosa -6-fosfato hidrogenasa. Fuente: Kula y Schtte, 1987

Tabla 5.4: homogeneizador de alta presin. Parmetros Operacionales. Presin de operacin Diseo de la vlvula Concentracin celular Temperatura
193
Adaptada de: Kula y Schtte, 1987

Reproducida con el permiso de el American Institua of Chemical Engineers. Copyright 1987 AIChE. Todos los derechos reservados.
El mtodo de rompimiento por homogeneizacin no es selectivo. No existe forma de diferenciar entre la liberacin de protenas del espacio periplsmico y las protoplasmticas, por lo que no es recomendable como rompimiento selectivo. La homogeneizacin no es efectiva para la desintegracin de algunas bacterias Gram-positivas que presentan una pared celular muy gruesa y aparentemente no pueden ser desintegradas en el homogeneizador de alta presin, al menos a presiones hasta de 55 MPa. Sin embargo, se ha realizado con xito el rompimiento de levaduras y de bacterias Gram-negativas como la Alcaligenes eutrophus (Harrison et a/, 1990).
En la Tabla 5.4 se listan los parmetros Operacionales que tienen influencia en el rompimiento celular en el homogeneizador de alta presin (Kula y Schtte, 1987). Como puede observarse el nmero de parmetros es menor que los correspondientes al molino de perlas lo que facilita la optimizacin de este tipo de procesos.
Presin de Operacin. Para lograr un rompimiento eficiente de clulas la presin de operacin del homogeneizador debe ser superior a 35 MPa (la industria alimenticia opera sus homogeneizadores a una presin de 35 MPa). En la Figura 5.11 se muestra como vara con la presin
194
DE CLULAS
de operacin en un solo paso, la liberacin de la enzima D-glucosa-6fosfato-deshidrogenasa de S. cerevisiae. Se puede observar que a 55 MPa hay tres veces mas enzima en la fraccin libre de clulas, que a 30 MPa. Sin embargo, la enzima liberada en un solo paso representa solamente cerca del 45% de la cantidad total presente en la suspensin. La presin de operacin del homogeneizador depende del producto que se desee liberar. Durante una operacin se empieza a observar liberacin de protena soluble a presiones mayores que 10 MPa, sin embargo para liberar ADN se requieren presiones por arriba de 25 MPa. En general las presiones de operacin ms usadas son de 55 MPa. Diseo de la Vlvula. En la Figura 5.10 se muestran las configuraciones de las vlvulas que se usan con ms frecuencia en los homogeneizadores: la unidad plana y la unidad de cuchilla. En la Figura 5.11 se muestra el comportamiento de los dos tipos de vlvulas en el rompimiento celular como una funcin de la presin de operacin, se puede observar que por arriba de una presin de 20 MPa la vlvula de cuchilla libera mayor cantidad de enzima que la vlvula plana, por abajo de esta presin la cantidad de enzima liberada es aproximadamente igual para ambos tipos de vlvulas. En la Figura 5.12 se presenta el comportamiento de la liberacin de una enzima en funcin del tiempo de recirculacin a tres diferentes presiones y para dos tipos de vlvula, se puede observar que la cantidad de enzima liberada aumenta con la presin, y para una presin dada el incremento es mayor si se utiliza una vlvula de cuchilla. Concentracin de la Suspensin Celular y Temperatura. La desintegracin celular es independiente de la concentracin de clulas de levaduras en concentraciones entre 100 y 600 gramos de peso seco por litro. Durante la homogeneizacin la temperatura de la suspensin celular es un parmetro que no se mantiene constante y por lo tanto es difcil correlacionarlo. La constante especfica de la velocidad de homogeneizacin vara directamente con la temperatura hasta un valor de 30C. Se han observado diferencias de alrededor de 40% en este parmetro en el rango de 5 a 30C. An as, se requieren tres pasos a
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195
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-
60
Tiempo de Recirculacin ( min ) Vlvula: ( o ) de cuchilla: ( * ) plana Presin: ( ) 55 MPa: ( ) 30 MPa; ( ) ISMPa
Figura 5.12: Efecto del tipo de vlvula sobre la liberacin de enzima Fuente: Kula y Schtte, 1987
196
una presin mxima de 55 MPa y a 30C para alcanzar una desintegracin celular mayor del 90%.
5.3.3
Microfluidizador
El microfluidizador es un homogeneizador de alta_4êsin_que tiene un mecanismo de rompimiento celular diferente al del homogeneizador Manton-Gaulin. Su mecanismo de rompimiento utiliza una bomba de alta presin manejada con aire y una cmara especial de rompimiento conectada a un dispositivo de contrapresin, como se muestra en la Figura 5.13. La suspensin celular se divide en dos corrientes hacindola pasar a presin a travs de dos microcanales de seccin transversal de 2 x 100 //ra. Seguidamente las corrientes son impactadas a alta velocidad y mezcladas en una pared estacionaria de la cmara de rompimiento (Figura 5.14). Mediante este mecanismo la energa de entrada se disipa casi instantneamente producindose la ruptura celular. Los lmites de operacin del microfluidizador estn dados por: la presin de aire requerida para manejar la bomba, las propiedades fisicoqumicas del lquido bombeado y la presin mxima de trabajo permitida que es de 140 MPa. Alguna ventajas que presenta el microfluidizador en comparacin con el homogeneizador Manton-Gaulin (Sauer et a/, 1989) son las siguientes: Es muy compacto, se puede montar sobre una charola de acero inoxidable de 30 x 35 cm. Permite un mayor enfriamiento del sistema: Adicionalmente a los serpentines de enfriamiento que tambin presenta el Manton-Gaulin, la cmara de rompimiento puede colocarse en un bao de hielo. Puede alcanzarse un rompimiento celular ms eficiente (en el caso de bacterias). Permite flujos ms bajos (2 23 l/h con presiones de operacin de 10 95 MPa] y maneja volmenes menores (30 m/), lo que lo hace compatible con operaciones de flujo continuo.
CELULAR
197
Figura 5.13: Diagrama del Microfluidizador; BA: bomba accionada por aire; CC: cmara de contrapresin; SE: serpentn de enfriamiento; CR: cmara de rompimiento; MP: medidor de presin; RP: regulador de presin; C: contenedor; V: vlvula. Fuente: Sauer et a/, 1989
198
Figura 5.14: Representacin esquemtica de la cmara de rompimiento del microfluidizador. Fuente: Sauer et a/, 1989
Es relativamente fcil de operar.
A continuacin se describe el efecto de la temperatura, del tamao de los restos celulares y de la concentracin celular en el proceso de ruptura utilizando un microfluidizador. Temperatura de Operacin. Generalmente cuando se trabaja con presiones altas es necesario enfriar el sistema. Si el homogeneizador no tiene un sistema de enfriamiento eficiente de la cmara de rompimiento, puede presentarse un incremento hasta de 80C en la temperatura de la suspensin celular, lo cual puede ocasionar la desnaturalizacin de la protena de inters. El microfluidizador permite mantener incrementos de temperatura menores a 20(7 en la cmara de rompimiento, que es la parte de mayor temperatura. Por otro lado, el tiempo durante el cual las clulas estn expuestas a temperaturas elevadas es muy corto, dado que el tiempo de residencia de las clulas en la cmara de rompimiento es de 0.025 a 0.04 segundos. Ambos efectos contribuyen a, incrementar la eficiencia de la operacin.
5.4. DISEO DE EQUIPO DE ROMPIMIENTO
199
En estudios sobre el rompimiento de clulas de E. coli (Agerkvist y Enfors 1990), se enfri la cmara de rompimiento por inmersin en un bao de agua helada para proporcionar enfriamiento adicional al proporcionado por el serpentn del equipo. La suspensin celular se aliment a una presin de 60 MPa y a un flujo de 18 l/h. La temperatura de la suspensin a la entrada vari entre 8 y 10C. Despus del primer paso la temperatura a la salida fue aproximadamente de 23C, de cerca de 27 C despus del segundo y aproximadamente de 28C despus de tres pasos. Tamao de los restos celulares. El microfluidizador produce restos celulares de mayor tamao que los producidos en el homogeneizador Manton-Gaulin, generndose suspensiones de menor viscosidad. Ambos efectos facilitan la separacin de los restos celulares durante la centrifugacin. Este efecto disminuye al aumentar el nmero de pasos (Agerkvist y Enfors, 1990). Concentracin Celular. En investigaciones realizadas con E. coli (Sauer et a/, 1989), se encontr que el microfluidizador puede romper clulas que se encuentran en soluciones cuyas concentraciones varan de 5.6 a 174 gramos de peso seco por litro. El hecho de que en el microfluidizador puedan manejarse concentraciones hasta de 5.6 gramos de peso seco por litro tiene implicaciones en el diseo ptimo del proceso de bioseparacin, dado que es posible pasar el caldo del fermentador directamente al microfluidizador para efectuar la ruptura celular. De esta manera puede eliminarse la operacin de cosecha de clulas, o disminuir el grado de concentracin necesario previo a la ruptura. El costo del proceso en forma integral puede ser menor an cuando las etapas de concentracin y purificacin posteriores a la ruptura tambin se vean modificadas.
5.4
Diseo de Equipo de Rompimiento
En esta seccin se presentan los principios de diseo de los dos tipos de equipos ms empleados en el rompimiento celular a nivel industrial:
200
CAPTULO 5. ROMPIMIENTO DE CLULAS Molino de Perlas de Alta Velocidad. homogeneizador de Alta Presin.
5.4.1
Molino de Perlas de Alta Velocidad
Los molinos de perlas de alta velocidad pueden ser operados en dos formas: - Operacin Intermitente. - Operacin Continua. Operacin Intermitente Los molinos de perlas pueden ser operados en forma intermitente cuando el volumen de la suspensin celular a tratar es bajo, o cuando se desea efectuar experimentos para generar datos de diseo. En una operacin intermitente, inicialmente se carga el molino con las perlas y la suspensin celular. Durante la operacin se cierra la salida de suspensin y se agita a la velocidad establecida. El grado de rompimiento logrado puede ser determinado de dos formas: - Directamente: Contando el nmero de clulas intactas por unidad de volumen. - Indirectamente: Mediante la medicin de un componente liberado durante el rompimiento. En el caso de productos de tipo proteico la determinacin de protena total y/o la actividad enzimtica son mediciones comnmente utilizadas. El rompimiento celular intermitente en molinos de perlas agitados a altas velocidades sigue una cintica de primer orden. El balance de masa de protena liberada puede ser expresado mediante la ecuacin siguiente:
df
(5.6)
201
La ecuacin anterior establece que la velocidad de liberacin de la masa de protena (clulas rotas) es proporcional a la masa de protena presente no liberada. donde: VM- Volumen libre del molino. [L3] Rm: Concentracin mxima de protena obtenible. [M/L3] R: Concentracin de protena liberada en el tiempo t. [M/L3] t: Tiempo de operacin. En el caso de la molienda intermitente el tiempo de operacin t es igual al tiempo de residencia de las clulas en el molino, [t] k: Constante de velocidad especfica de primer orden que depende del tipo de clula, del tipo y velocidad del agitador, de la carga y tamao de las perlas, de la concentracin celular y de la temperatura. [t'1} La ecuacin anterior puede ser integrada arreglndola de la siguiente forma:
f
O JO
dt
m
0
(5 7)
'
Para obtener la ecuacin de la operacin intermitente:

(5.8)
/tm
t
De acuerdo a la ecuacin anterior las grficas de InRmHRn-R)] vs t
producirn rectas de pendiente k y ordenada al origen cero. En la Figura 5.15 se muestra la liberacin de protena a partir de Sacharomyses cerevisiae utilizando un molino Netzsch LME20 con diferentes tipos de agitadores. El resultado muestra claramente que la desintegracin celular sigue una cintica de primer orden independiente
202
0.70.6-
_
D?
0.50.4 -\
KW
0.30.20.1 0.0
10
20
30
Impulsores: ( A ) de postes: ( o ) de discos; ( a ) excntrico.
Figura 5.15: Liberacin de protena a partir de Sacharomyses cerevisiae en experimentos con recirculacin para diferentes tipos de agitadores. Fuente: Kula y Schtte, 1987
Reproducida con el permiso de el American Institute of Chemical Engiiieers. Copyright 1987 AIChE. Todos los derechos reservados.
203
del tipo de agitador. Observndose tambin diferentes valores de k para cada tipo de agitador. En el caso que el grado de rompimiento sea seguido mediante la actividad enzimtica /I, la ecuacin (5.8) puede ser expresada como:
In
= kt
(5.9)
Ejemplo 5.2.- Cintica de rompimiento intermitente. En el rompimiento intermitente para la obtencin de una enzima de S. cerevisiae, se utiliz un molino de perlas de alta velocidad de 4 litros obtenindose los siguientes datos: tiempo (s) 00 15 30 45 60 Max.
Rx 102 (Kg/Kg) 0.000 1.025 2.150 2.525 3.425 10.000 x 102 (mol/min-Kg) 0.000 0.625 1.150 1.675 2.150 6.700
a).- Calcular la constante cintica para la liberacin de protena, b).- Calcular la constante cintica para la liberacin de enzima. Solucin: Las constantes cinticas pueden ser obtenidas mediante el empleo de las ecuaciones (5.8) y (5.9). Los clculos necesarios son los siguientes: tiempo (s)
00 15 30 45 60
1n ln rtm
Rm-R
in A A
mA
0.0000 0.1081 0.2421 0.2910 0.4193
0.0000 0.0979 0.1883 0.2877 0.3870
204
a).- Mediante un ajuste de los datos por mnimos cuadrados se puede obtener para la liberacin de protena la constante, k = 6.984 x 1(T3 s~l b).- De igual manera, para la liberacin de enzima la constante es:
ib = 6.412 x 1(T3 s~l
Operacin Continua Durante la operacin continua del molino de perlas la suspensin celular a tratar es alimentada continuamente al molino en uno de sus extremos y retirada continuamente en el extremo opuesto. En el diseo de los molinos de perlas es necesario considerar el grado de dispersin de los tiempos de residencia de las clulas en el molino. A diferencia de la operacin intermitente, en una operacin continua el tiempo de residencia vara para las diferentes clulas de la suspensin, generndose una distribucin de tiempos de residencia de la poblacin celular. El tiempo de residencia medio t de la distribucin de tiempos de residencia es diferente al tiempo de residencia ideal R dado por:
donde: R: Tiempo de residencia ideal, [t]. VM'- Volumen libre del molino. [L3]. F: Flujo alimentado al molino. [L3/t]. Grado de Mezclado en un Molino de Perlas. El grado de desviacin del flujo tapn ideal en los molinos de perlas comerciales, ha sido simulado utilizando el modelo de "Reactores continuos en serie tipo tanque perfectamente agitados". Mediante el uso de este modelo los experimentos con pulsos de tinta permiten determinar el nmero
205
de tanques perfectamente agitados en serie a que equivale el grado de mezclado que se presenta en el molino (Shtte y Kula, 1990). Al aplicar un pulso de tinta en la primera etapa de una serie de tanques perfectamente agitados, el balance de la masa de tinta para cualquier etapa n est dado por la expresin:
-0.)
donde: N: Nmero de etapas de la serie. Cn: Concentracin de tinta en la etapa n. [M/ L3]. Utilizando un tiempo adimensional definido por:
(5,0)
la ecuacin (5.10) puede expresarse como:

\r1f~i C* \ -TT-- YV(C n _i - G n )
n
av
(t 1 1 \ (5.11J
con las condiciones:
e<o
0=0
d =o
d = A^Co
<9 > O
C0 = Q
Para la etapa nmero 1 la ecuacin de balance se reduce a:
e
y la forma integrada es: I ' ^r = -N dO
JNC0
(5.12;
(5.13;
206
CAPTULO 5. ROMPIMIENTO DE CLULAS de tal manera que:
Q- = Nexp(-N0) (5.14) Co Sustituyendo la expresin anterior en la ecuacin de balance para la segunda, etapa y efectuando la integracin correspondiente, es posible obtener una expresin para la concentracin en la segunda etapa. Siguiendo este procedimiento es posible demostrar que para la etapa TV se tiene que: CN _NffN C0 ~ ( En los estudios de mezclado al cociente CN/CQ se le denota como E y es una medida de la distribucin de tiempos de residencia del fluido dentro del recipiente (Levenspiel, 1972). La aplicacin prctica del desarrollo anterior puede visualizarse derivando la ecuacin (5.15) respecto a 6 e igualando el resultado a cero para obtener: N = I (5.16)
] ] j
donde 9max es el tiempo adimensional al cual E es mxima. De tal manera que el nmero de etapas a que equivale el grado de mezclado de un molino, puede ser determinado a partir de los datos experimentales de concentracin contra tiempo que resultan al aplicar un pulso de trazador. Eficiencia de los Molinos de Perlas. El nmero de etapas de un molino de perlas obtenido mediante experimentos de pulsos, puede ser empleado para calcular la eficiencia de rompimiento esperada. Para relacionar el nmero de etapas con la eficiencia de rompimiento es necesario realizar un balance de protena liberada (clulas rotas) considerando que el molino consta de ,/V etapas tipo tanque perfectamente mezclados en serie, y que el rompimiento sigue una cintica de primer orden. El balance de protena liberada en la primera etapa de la serie est dado por:
207
donde: RI: Concentracin de protena liberada en la etapa 1. [M/L3]. t: Tiempo de operacin, [t] k: Constante de velocidad especfica de primer orden. [-1] La ecuacin anterior puede ser expresada en funcin de un tiempo adimensional dado por:
y obtener, f,
jn .* . -mjt ,
IcV*,
_, y--~7fi "!/ lm-R\)
(5.19)
La ecuacin anterior puede ser integrada con las condiciones:

O= O
RI = O
=_ 0
E> R l
D = Rl
y obtener:
/
kV\f
i \
(5.20)
" NF
La ecuacin anterior tambin puede ser expresada como:
Continuando con este procedimiento puede ser demostrado que para la etapa TV se tiene:
208
Rr
= 1 + NF ) RN
kV
(5.22)
Ejemplo 5.3.- Determinacin del nmero de etapas equivalentes de un molino de perlas.
Un molino de perlas tipo piloto con cmara de 4 litros de volumen, se carga de perlas de tal manera que la fraccin de volumen libre es de 0.48 respecto al volumen de la cmara. Para determinar el nmero de etapas del molino de acuerdo al modelo de tanques en serie, se introduce un pulso de tinta al molino cuando ste opera en forma estacionaria con un flujo de 50 l/h. Los datos de concentracin a la salida del molino aparecen en las columnas (1) y (2) de la Tabla siguiente :
t(s) 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425
(1)
(2) C(U) 11.5 52.2 93.0 107.3 101.7 85.3 65.0 47.5 32.8 21.8 14.1 8.8 5.4 3.3 1.9 1.1 0.6 Suma =
(3) CA 287.5 1305.0 2325.0 2682.5 2542.5 2132.5 1625.0 1187.5 820.0 545.0 352.0 220.0 135.0 82.5 47.5 27.5 15.0 16,332.5
(4)
0.18 0.36 0.54 0.72 0.90 1.09 1.27 1.45 1.63 1.81 1.99 2.17 2.35 2.53 2.71 2.89 3.07
(5) E 0.097 0.442 0.787 0.908 0.861 0.722 0.550 0.402 0.278 0.185 0.119 0.074 0.046 0.028 0.016 0.009 0.005
a).- Calcular el tiempo de residencia ideal.

b).- Estimar el valor de CQ. c).- Obtener la grfica de E vs 0. d).- Estimar el nmero de etapas N. e).- Calcular la eficiencia por etapa si k = 1.93 x 10~2 s~l f).- Calcular la eficiencia global de las N etapas. Solucin: a).- El tiempo de residencia ideal est dado por:
209
R =
-y 4 / x 0.48 x 3600 f
VM
** = 50 R = 138.24 s
b).- El valor de CQ puede ser estimado mediante la expresin:
Co=
De acuerdo a los clculos de la columna (3) de la Tabla anterior, _ 16332.5 ~ T38^4~ CQ = 118.15 Unidades
C
c).- En las columnas (4) y (5) de la Tabla anterior aparecen los clculos del tiempo adimensional 9 y la concentracin adimensional E La Figura 5.16 muestra la grfica de estos datos. d).- De la Figura 5.16 se puede determinar que cuando E present un mximo,
Vma.x
=
U. I O
Utilizando la ecuacin (5.16) se obtiene:
210
DE CLULAS
0.0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
e =t/t n Figura 5.16: Distribucin de tiempos de residencia del ejemplo 5.3.
211
N =
i-o,
N = -N = 4
e).- La eficiencia de rompimiento en cada etapa de acuerdo con la ecuacin (5.20) es: Eficiencia =
* ~^ V NF
el valor del grupo entre parntesis de la expresin anterior es:
WM _ _ __
(1.93 x 1Q-2 _ s-l)(m.24s) _
- -667
de tal manera que: Eficiencia Eficiencia = 0.667
i -t-
= 0.4
f).- La eficiencia global puede ser obtenida a partir de la ecuacin (5.22),
^
Rm R
= (1+0.667)"
= 7.716
de tal manera que:
RN -0.87
La eficiencia global de rompimiento en el molino es del 87%
212
5.4.2
homogeneizador de Alta Presin
La desintegracin celular en un homogeneizador de alta presin a una presin fija dada puede ser descrita mediante una cintica de primer orden respecto al nmero de pasos, de tal manera que: ~ = k'(Rm - R) donde: R: Concentracin de protema liberada (clulas rotas) despus de N pasos. [M/L3]. Rm\ Concentracin mxima de protena que puede ser liberada. [M/L3]. N: Nmero de pasos a travs de la vlvula del homogeneizador. k : Constante cintica de primer orden. [1/pasos] La ecuacin anterior puede ser integrada con las condiciones:
N =0 N =N R =0
R= R
(5.23)
obtenindose la ecuacin: \~~ = k'N
nm n
(5.24)
Se ha determinado experimentalmente que la constante k tiene una dependencia con la presin dada por: k' = k"Pa donde: P: Presin de operacin. [M/t2L}. (5.25)

fe": Constante dimensional de rompimiento. [M~at2aL2a /pasos].
213
a: Parmetro constante en rangos limitados de presin. Un valor tpico para levaduras es a = 2.9 y para E. coli a = 2.2. Combinando las ecuaciones (5.24) y (5.25) se obtiene: ln
Rm D D Rm R
= k"NPa
(5.26)
El proceso de rompimiento celular descrito por la ecuacin (5.26), es independiente de la concentracin celular. Por otra parte, se ha reportado que la actividad de enzima liberada en relacin a la protena total liberada, es independiente de la presin de operacin, de la temperatura, y de la concentracin inicial de clulas en el caso de levaduras. Sin embargo, la fraccin de enzima liberada respecto a la enzima total presente depende de la localizacin de la enzima particular dentro de la estructura celular (Sauer et a/, 1989).
Microfluidizador
En el caso del microfluidizador la cintica de rompimiento presenta una cierta dependencia no lineal con el nmero de pasos expresada mediante la ecuacin: ln
m
=k"NbPa
(5.27;
Rm R
donde 6 es un exponente que vara con el tipo de clula y tom valores entre 0.28 y 1.00 (Sauer et al, 1989).
I
Ejemplo 5.4.- Rompimiento de E. coli en un microfluidizador.

En la recuperacin de /3 galactosidasa de E. coli, se hace pasar poi un microfluidizador tipo M-110 una suspensin celular que contien* 47.6 g/l en peso seco. La presin de operacin utilizada fue de 60 MPa La cantidad de protena liberada despus de cada paso se present en las columnas (1) y (2) de la Tabla siguiente:
214
(1)
Paso
1 2 3 5 10
(2) ' (3) % Protena Liberada ln[Rm/(Rm - R)]
63.0 79.0 88.0 96.0 99.9
0.994 1.560 2.120 3.219 6.908
a).- Estimar el valor de la constante cintica de rompimiento considerando que para este caso a = 2.2 y 6 = 1. b).-Estimar el nmero de pasos para liberar el 93 % de protena en este proceso. Solucin: De acuerdo a la ecuacin (5.27) el grado de rompimiento para este caso puede ser expresado como:
In
Rr Rm R
de tal manera que de la pendiente de la grfica de ln[Rm/(Rm R)] contra TV es posible estimar k". Los clculos necesarios se muestran en la columna (3) de la Tabla anterior. Mediante un ajuste por mnimos cuadrados de estos datos se obtiene: k P' = 0.688 y para P=60 MPa, k" = 8.4 x 10~5 MPa~2'2
b).- El nmero de pasos requeridos para una liberacin del 93 % de protena es:
5.5. SUMARIO
215
yy
1.00-0.93 /
0.000084 x 602-2 N = 3.88 pasos Se necesitan 4 pasos de molienda. Comparacin de los Mtodos Mecnicos de Ruptura Celular La Tabla 5.5 muestra datos de produccin de algunas enzimas utilizando el molino de perlas y el homogeneizador Manton-Gaulin. La ruptura celular utilizando el molino de perlas permite la obtencin de un mayor porcentaje de enzima activa en un nmero menor de pasos en comparacin con el homogeneizador. Sin embargo, la produccin de protena en el molino es en general menor que la obtenida en el homogeinizador. La Tabla 5.6 muestra los datos para la liberacin de la enzima {3 galactosidasa de clulas de E. coli utilizando un molino de perlas tipo Dyno Mili, un homogeneizador tipo Manton-Gaulin y un Microfluidizador. Estos datos muestran que el Microfluidizador permite manejar mayores concentraciones de biomasa y produce un rendimiento mayor de enzima activa. Adems, el tamao medio de los restos celulares que se producen en un paso es mayor que el encontrado en las mismas condiciones en el homogeneizador Manton-Gaulin.
5.5
Sumario
El rompimiento celular es una operacin necesaria cuando el producto de inters se localiza al interior de la clula. Existen varios mtodos para efectuar esta operacin. A nivel industrial slo se emplean los molinos de perlas agitados y los homogeneizadores de alta presin. El diseo de los molinos est basado en ecuaciones empricas y en en experimentos piloto.
216
Tabla 5.5: Comparacin de mtodos de rompimiento celular.

Microorganismo Levaduras Saccharomyces carlsbergensis Saccharomyces cerevisiae Candida boidinii Bacterias B. cercus Brevibacterium ammoniagenes E. coli Laclo bacillus confuius Enzima liberada D-glucosa 6- fosfato deshidrogenasa D-glucosa 6-fosfato deshidrogenasa Formato Deshidrogenasa Leucina deshidrogenasa Fumarasa Penicilina acilasa D-Lactato deshidrogenasa Molino de Perlas** Act. Pasos Prod. solub.* No. kg/h
86% 1 60
homogenei zador * * * Act. Pasos Prod. solub.* No. kg/h

91% 95% 88% 4 60
98% 95%
1 1
70 40
4 3
60 65
84% 85% 95% 92%
2 3 3 2
16 12 7 20
82% 10% 89% 84%
3 4 3 3
67 67 65
* Actividad solubilizada ** Netzsch LME 20 *** Gaulin M3 Adaptada de: Kula y Schtte, 1987 Reproducida con el permiso de el American Iiistitute of Chemical Engineers. Copyright 1987 AIChE. Todos los derechos reservados.
5.5.
SUMARIO
217
Mtodo
Ruptura de clulas de E. coli con diferentes mtodos. Peso seco liberacin de Distribucin de Viscosidad de /3- G alactosidasa tamao a Pico(s) biomasa Protena 10 s~l Actividad media 100 s~l (mPa s) (mPa s) (nm) (nm) (9/1) (%) (%)
Molino de Perlas* 2 min. 3 min. 4 min. MantonGaulin** 1 paso 2 pasos 3 pasos Microflui dizador** 1 paso 1 paso 1 paso 2 pasos 3 pasos 5 pasos 10 pasos
49.5 49.5 49.5
62 72 79
62 74 79
612 553 529
461, 806 465, 787 471, 777
63 38 19
28 19 14
48.4 48.4 48.4
66 76 82
58 75 78
501 414 217
457 180, 457 191
113 8 8
30 6 6
101.9 73.2 47.6 47.6 47.6 47.6 47.6
62 65 63 79 88 96 100
62 61 61 76 87 97 100
693 693 673 480 451
493, 833 489, 800 486, 800 468 445
51 35 28 10 6
26 15 10 7 6
*Dyno Mili KDL a diferentes tiempos promedios de residencia ** homogeneizador Adaptada de: Agerkvist y Enfors, 1990 Reproducida con el permiso de John Wiley and Sons. Copyright 1990. Todos los derechos reservados.
218
5.6
Problemas
5.1.- En estudios de liberacin de protena intracelular en funcin de la velocidad del agitador empleando un molino de perlas tipo Netzsch LME 4, con perlas de dimetro entre 0.55 y 0.85 mm , se utiliz una suspensin celular de concentracin de 50% (peso/volumen), un flujo de alimentacin de 50 l/h y una carga de perlas del 85 %. Bajo estas condiciones se obtuvieron los siguientes datos:
Protena liberada
rpm 1200 1500 1750 2000 2250
(mg/ml) 15.88 22.35 22.90 22.94 23.00
a. Estimar la velocidad ptima para el agitador. a).- Resp. 1500 rpm b. Discutir sobre el consumo de potencia del agitador para velocidades superiores a la ptima. 5.2 .- La desintegracin celular intermitente con dos tipos de agitadores utilizados en un molino de perlas producen los siguientes datos: Agitador 1
Tiempo de residencia (min) 3 5 10 15 20 25 30 log[fl m /(# m - R)] Agitador 2 Tiempo log[# m /(#m - R)] de residencia (min) 0.060 3 0.150 5 0.225 10 0.325 15 0.425 20 0.525 25 0.650 30
0.037 0.090 0.160 0.225 0.300 0.365 0.437
5.6. PROBLEMAS
219
a).- Estimar la constante cintica k para cada tipo de agitador, b. Calcule el tiempo para el cual se obtiene el 80% de rompimiento con cada tipo de agitador. a).- Resp. ki = 0.015 min~l b).- Resp. t\ = 53.33 min 5.3.- Una suspensin celular que contiene la bacteria gram negativa Alcaligenes eutrophus, se hace pasar por un homogeneizador APV Gaulin 15M 8BA con el propsito de estudiar la recuperacin de poli(3- hidroxibutirato (PHB) un termoplstico potencial (Harrinson et al ,1990) . Cuando se opera a una presin constante de 15.2 MPa la constante k" del homogeneizador toma un valor 5.05 x 10~4 MPa~2-2. a).- Estimar el nmero de pasos necesarios para lograr el 63 % de rompimiento. b).- Si la presin de operacin se duplica en cuantos pasos se obtendr el mismo rendimiento. a).- Resp. 5 pasos. 5.4.- Ha sido reportado (Bjustrom, 1985) que el calor liberado por compresin adiabtica durante un proceso de homogeneizacin puede elevar la temperatura de la corriente que entra al homogeneizador 1.50(7 por cada 6.895 MPa de presin de operacin. Calcular cuanto representa este valor del correspondiente al 100 % de conversin trabajocalor. Resp. 91 % 5.5.- Obtener las ecuaciones (5.15) y (5.16) mediante el desarrollo descrito en el texto. 5.6.- En un rompimiento celular utilizando un homogeneizador es posible lograr 80 % de rompimiento bajo las dos diferentes condiciones siguientes:
Condicin 1 2
Presin (MPa)
90 50
Pasos
1 3
220
DE CLULAS
a).- Estimar los parmetros cinticos del homogeneizador. b).- Comparar la energa por unidad de masa de alimentacin necesaria para cada condicin. c).- Que condicin se recomienda para realizar la ruptura, a).- Resp. jfc" = 3.56 x 10~4 MPa~1-87 b).- Resp. 67 % de diferencia. 5.7.- Obtener la ecuacin (5.22) mediante el procedimiento descrito en el texto . 5.8.- Graficar la distribucin terica de E vs 9 de un molino de perlas al que se le ha aplicado un pulso de tinta, para valores de TV de 1, 2, 3, 5, 10 y 20, respectivamente. a).- Indique la forma que adopta la distribucin conforme TV crece. b).- Como se explica que C pueda ser mayor que CQ.
5.7. BIBLIOGRAFA
221
5.7
Bibliografa
Agerkvist, I. y Enfors, S. 1990. Characterization of E. coli cell desintgrales from a bead mili and high pressure homogenizers. Biotechnology and Bioengineering. 36, 1083-1089. Andrews, B. A., Huang, R. B. y Asenjo, J. A. 1990. Differential product relase from yeast cells by selective enzymatic lysis. En: Separations for Biotechnology. Pyle, D. L. (Ed.). Elsevier Applied Science. England. 21-28. Asenjo, J. A. 1990. Cell disruption and removal of insolubles. En: Separations for Biotechnology. Pyle, D.L. (Ed.). Elsevier Applied Science. England. 11-20. Belter, P.A., Cussler, E.L. y Hu, Wei-Shou. 1988. Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology. John Wiley &; Sons. New York. 77-88. Bjustrom, Ed. 1985. Biotechnology: Fermentation and downstream processing. Chem. Eng. 18, 2, 126-159. Datar, R.V. , Cartwright, T. y Rosen, C. 1993. Process economics of animal cell and bacterial fermentations: A case study analysis of tissue plasminogen activator. Bio/Technology. 11, 349-357. Edebo, L. 1969. Desintegration of cell. En: Fermentation Advances. Perlman, D. (Ed.). Academic Press. London. 249-271. Foster, D. 1992. Cell disruption: Breaking up is hard to do. Biotechnology. 10, 1539-1541. Harrison, S.T., Dennis, J.S. y Chase, H. 1990. The effect of culture history on the disruption of alcaligenes eutrophus by High Pressure homogenisation. En: Separations for Biotechnology. Pyle, D. L. (Ed.). Elsevier Applied Science. England. 38-47. Keshavarz, E., Hoare, M. y Dunnill, P. 1987. Biochemical engineering aspects of cell disruption. En: Separations for Biotechnology.
222
CAPTULO 5. ROMPIMIENTO DE CLULAS Verral, M. S. y Hudson, M. J. (Ed.). Ellis Horwood Limited. England. 62-79.
Kula, M.R. y Schtte, H. 1987. Purification of proteins and the disruption of microbial cells. Biotechnology Progress. 3, 1, 31-42. Lehninger, A. L. 1989. Bioqumica. Ediciones Omega. Espaa. Barcelona,
Levenspiel, O. 1972. Chemical Reaction Engineering. Segunda Edicin. John Wiley and Sons. New York. 9, 242-308. Naglak, T.J., Hettwer, D.J. y Wang, H.Y. 1990. Chemical permeabilization of cells for intracellular product relase. En: Separations Processes in Biotechnology. Asenjo, J.A. (Ed.). Marcel Dekker. New York. 7, 177-205. Naglak, T.J. y Wang, H.Y. 1990. Protein relase from the yeast Ichia pastoris by chemical permeabilization: Comparison to mechanical disruption and enzymatic Lysis. En: Separations for Biotechnology. Pyle, D. L.(Ed.). Elsevier Applied Science. England. 55-64. Petrides, D.P., Cooney, C.R. y Evans, L.B. 1989. An introduction to biochemical process design. En: Chemical Enginnering Problems in Biotechnology. Shuler, M.L. (Ed.). New York. 351-391. Sauer, T., Robinson, C., y Glick, B. 1989. Disruption of native and recombinant E. coli in a high-pressure homogenizer. Biotechnology and Bioengineering. 33, 1330-1342. Schtte, H. y Kula, M.R. 1990. Bead mili disruption. En: Separations Processes in Biotechnology. Asenjo, J.A. (Ed.). Marcel Dekker. New York. 5, 107-141. Scopes, R. 1994. Protein Purification: Principies and Practice. Springer-Verlag. New York. 3, 41-71. Wang, D.I.C. 1988. Biotechnology: Status and Perspectivas. AIChE. 84,18, 1-21.
Parte III Concentracin del Producto
Esta parte trata sobre las operaciones de extraccin y c que son utilizadas para concentrar los producto diluidos de L biolgicos que son obtenidos en la etapa de separacin de solide la extraccin como la adsorcin son tcnicas de separacin selectivas. Sin embargo, la adsorcin cuando se realiza por af una tcnica de separacin altamente selectiva y necesaria en la purificacin de productos en los cuales se requiere de una alt<
Captulo 6 Extraccin
6.1 Introduccin
La extraccin lquido-lquido es una operacin que permite la recuperacin de un soluto de una solucin mediante su mezcla con un solvente. El solvente de extraccin debe ser insoluble o soluble en grado limitado en la solucin que se va a extraer y el soluto a extraer debe presentar una elevada afinidad por el solvente de extraccin. La extraccin lquido-lquido se realiza bsicamente en dos pasos: - Mezcla ntima del solvente de extraccin con la solucin a procesar. - Separacin de la mezcla en dos fases lquidas inmiscibles. Las sustancias que componen la solucin original se distribuyen de diferente forma entre las dos fases lquidas y se logra un cierto grado de separacin, mismo que puede incrementarse mediante el contacto sucesivo entre los dos lquidos. En las operaciones de extraccin la solucin de la que se va a extraer el soluto se llama alimentacin y el lquido con el cual se pone en contacto la alimentacin se denomina solvente. El producto de la operacin rico en solvente se llama extracto y el lquido residual de donde se separ el soluto es el refinado. En muchos procesos tradicionales de la Ingeniera Qumica la operacin de separacin ms usada es la destilacin debido a su simplicidad.
228
CAPTULO ti.
Sin embargo, en muchas bioseparaciones la destilacin no puede ser utilizada debido a la sensibilidad de los productos a la temperatura, a su baja volatilidad y a las concentraciones tan bajas que se manejan. La extraccin es una tcnica de separacin que posee algunas ventajas que la hacen atractiva para los procesos de bioseparacin. Entre ellas se encuentran la vasta experiencia y desarrollo tecnolgico alcanzado en muchos aos, as como tambin la relativa facilidad con que se pueden escalar los procesos extractivos. La extraccin agua-solvente orgnico se emplea ampliamente en la industria de los antibiticos, mientras que la extraccin que utiliza dos fases acuosas inmiscibles se utiliza para concentrar protenas y separar componentes biolgicos. La extraccin tambin puede ser usada para remover impurezas de una corriente. En este captulo en la seccin 6.2 se abordan los aspectos fundamentales de la extraccin. Los equipos ms utilizados para realizar operaciones de extraccin se presentan en la seccin 6.3, y los aspectos bsicos del diseo de extractores intermitentes y continuos se revisan en la seccin 6.4.
La operacin de extraccin implica el uso de tres tipos de sustancias cuando menos: el soluto de inters y los componentes puros de cada una de las dos fases. La interaccin de estos componentes y/o la presencia de ms solutos o solventes genera cierto grado de complejidad de la operacin. El establecimiento de los aspectos termodinmicos bsicos de la extraccin permiten visualizar algunos caminos que contribuyen a realizar esta operacin en forma ms racional, particularmente contribuyen a una seleccin adecuada del solvente de extraccin y de las condiciones de operacin. Los principios bsicos de la extraccin convencional lquido-lquido pueden ser extendidos a los sistemas de extraccin de dos fases acuosas inmiscibles que son ms empleados en la recuperacin de protenas y en la separacin de algunas sustancias biolgicas. En base a lo anterior esta seccin se centra en cuatro aspectos:
Tipos de sistemas de extraccin lquido-lquido. Qumica de la extraccin. Seleccin del solvente. Sistemas de dos fases acuosas inmiscibles.
6.2.1
Tipos de Sistemas de Extraccin LquidoLquido
Los sistemas de extraccin existentes presentan diferente grado de complejidad debido principalmente a lo siguiente: - Las fases pueden ser completamente o parcialmente miscibles. En este ltimo caso, las relaciones de equilibrio y los balances de masa necesarios para el diseo de los equipos son ms complejos. - La presencia de otros solutos diferentes al soluto de inters. - La naturaleza de las fases. En la extraccin convencional lquidolquido generalmente una fase es acuosa y la otra la constituye un solvente orgnico. Otros sistemas emplean dos fases acuosas inmiscibles. En este captulo se analiza bsicamente los aspectos de la extraccin en sistemas de un soluto diluido en dos fases inmiscibles y la extraccin en dos fases acuosas.
i
6.2.2
Qumica de la Extraccin Lquido-Lquido
La extraccin de un soluto desde el agua a una fase no polar, involucra con frecuencia interacciones hidrofbicas. Las interacciones hidrofbicas son responsables de un gran nmero de fenmenos fsicos en soluciones acuosas. An en ausencia de interacciones especficas, le transferencia al solvente de un soluto no polar desde el agua, es favore cida debido al incremento en la entropa asociada con el desorden de agua.
6.2. FUNDAMENTOS
DE LA EXTRACCIN
229
Tipos de sistemas de extraccin lquido-lquido. Qumica de la extraccin. Seleccin del solvente. Sistemas de dos fases acuosas inmiscibles.
6.2.1
Tipos de Sistemas de Extraccin LquidoLquido
Los sistemas de extraccin existentes presentan diferente grado de complejidad debido principalmente a lo siguiente: - Las fases pueden ser completamente o parcialmente irascibles. En este ltimo caso, las relaciones de equilibrio y los balances de masa necesarios para el diseo de los equipos son ms complejos. - La presencia de otros solutos diferentes al soluto de inters. - La naturaleza de las fases. En la extraccin convencional lquidolquido generalmente una fase es acuosa y la otra la constituye un solvente orgnico. Otros sistemas emplean dos fases acuosas inmiscibles. En este captulo se analiza bsicamente los aspectos de la extraccin en sistemas de un soluto diluido en dos fases inmiscibles y la extraccin en dos fases acuosas.
6.2.2
Qumica de la Extraccin Lquido-Lquido
La extraccin de un soluto desde el agua a una fase no polar, involucra con frecuencia interacciones hidrofbicas. Las interacciones hidrofbicas son responsables de un gran nmero de fenmenos fsico en soluciones acuosas. An en ausencia de interacciones especficas, le transferencia al solvente de un soluto no polar desde el agua, es favore cida debido al incremento en la entropa asociada con el desorden de agua.
230
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
Cuando un soluto es repartido entre dos fases E y R formando soluciones diluidas, al alcanzarse el equilibrio los potenciales qumicos del soluto en ambas fases son iguales, es decir:
(6.1)
El potencial qumico de las fases est dado por: H(R) + RT ln AR = fi(E) + RT In AE (6.2)
donde AE y AR son las actividades del soluto en las fases E y R respectivamente, R es la constante .de los gases ideales y T es la temperatura. En el caso de soluciones diluidas ideales la concentracin es una medida apropiada de la actividad, de tal manera que la ecuacin anterior se puede escribir como: /jf(R) + RT ln y = fjf(E) + RT ln x (6.3)
En extraccin se define el coeficiente de particin como la relacin de las concentraciones de soluto en el equilibrio, es decir:
K, =
(6.4)
donde: Kp es el coeficiente de particin, x es la concentracin de soluto en la fase ligera J5, o fase rica en solvente y y es la concentracin de soluto en la fase pesada R, o fase correspondiente a la alimentacin. La ecuacin (6.4) es conocida como Ley de la distribucin de Nerst y establece que en el equilibrio existe una relacin constante de las actividades del soluto en las dos fases para una temperatura dada. La ecuacin (6.3) puede escribirse como:
(6.5)
o bien como:
(6.6)
6.2. FUNDAMENTOS DE LA EXTRACCIN
231
Tabla 6.1: Coeficientes de particin para algunos solutos de inters.

Compuesto Tipo Aminocidos Soluto Glicina Lisina Ac. Glutmico Celesticetina Eritromicina Novobiocina Penicilina F Penicilina K Protenas Glucosa isomerasa Catalasa Solvente n-butanol/agua n-butanol/agua n-butanol/agua n-butanol/agua Amil acetato/agua Butil acetato/agua Amil acetato/agua Amil acetato/agua PEG 1550/fosfato de potasio PEG/dextrano crudo
Kp
0.01 0.20 0.07

110.00 120.00 0.04 100.00 0.01 32.00 0.06 12.00 0.10
Observaciones. 25C
Antibiticos
a pH 7.0 a p H 10.5 a pH 4.0 a pH 6.0 a pH 4.0 a pH 6.0
3.00 3.00
Adaptada de: Belter ei al, 1988. Reproducida con el permiso de John Wiley and Sons. Copyright 1988. Todos los derechos reservados.
donde AG es cambio en energa libre en el estado estndar. El logaritmo natural del coeficiente de particin Kp es proporcional a la diferencia de los potenciales qumicos en los estados estndar de las fases puras. En la Tabla 6.1 se muestran los valores del coeficiente de particin Kp para algunos solutos de inters en sistemas especficos. Debido a la importancia del equilibrio };ermodinmico es conveniente puntualizar las propiedades del coeficiente de particin en la extraccin. - El coeficiente se define slo en un punto de equilibrio. No se aplica a todas las concentraciones posibles de encontrar en un sistema, sino nicamente en el equilibrio verdadero. En este sentido nc debe confundirse con la constante de equilibrio del sistema. El coeficiente de particin vara con el nivel de concentracin de equilibrio.
232
CAPTULO 6. EXTRACCIN
- Para sistemas diluidos el coeficiente de particin puede considerarse constante e igual a la constante de equilibrio. - La constante Kp a una temperatura dada, es independiente de la concentracin o presin global del sistema. - La magnitud de la constante Kp, determina la extensin a la cual proceder una extraccin particular bajo condiciones establecidas. Un valor alto de Kp indica que en el equilibrio la concentracin de soluto en el extracto es mayor que en el refinado. - Los valores de Kp deben ser determinados experimentalmente. Cuando se grfica el potencial qumico \i contra la concentracin de soluto en la fase ligera x (Figura 6.1), en condiciones tales que una pequea cantidad de fase ligera E est en equilibrio con un exceso de fase pesada R, se tiene lo siguiente: debido a que R est presente en exceso, el potencial qumico f(R) es constante, mientras que /(E) vara con la concentracin x. En la interseccin de //(-") y 1(R) se puede localizar la concentracin x, en equilibrio, de soluto presente en E. Cuando la concentracin x aumenta, f(E] aumenta y se aproxima a f(E). Entonces se puede establecer que los cambios en el tipo de solvente cambian la concentracin x en equilibrio. Por ejemplo, para el solvente 1 la concentracin de equilibrio es x\ y para el solvente 2 la concentracin de equilibrio es #2, entonces se puede concluir que el solvente 2 favorece esta extraccin. No slo los cambios en el tipo de solvente pueden mejorar la extraccin, sino tambin los cambios en el soluto que afecten su potencial qumico fj,(E). Cambios en el Solvente Lo primero que puede hacerse para mejorar un sistema de extraccin es cambiar el solvente de extraccin, esto es, elegir uno cuyo potencial qumico en el estado estndar est ms prximo a ^(R). Desafortunadamente esto no es fcil de lograr debido a que la teora termodinmica
233
Fraccin mol de soluto ( x ) en fase ligera
Figura 6.1: Comportamiento del potencial qumico en funcin de la concentracin x de soluto.
234
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
no puede predecir con segundad los potenciales qumicos para determinar el mejor solvente. Sin embargo, es posible utilizar enfoques aproximados para estimar 1(E) utilizando parmetros de solubilidad, en el clculo de coeficientes de particin . De acuerdo con esto, el coeficiente de particin Kp dado por la ecuacin (6.4) puede ser expresado como:
donde V son los volmenes molares parciales del solvente pesado /?, el solvente ligero E, y el soluto A respectivamente, y Si son los parmetros de solubilidad correspondientes. El grado de disolucin de slidos en lquidos vara considerablemente con la naturaleza del slido y del lquido, la temperatura y en grado menor con la presin. En todos los casos el lmite de solubilidad es la saturacin. En un sistema de un solvente y un soluto particular, la concentracin de saturacin a una temperatura y presin dadas es constante y no depende de la manera en que se prepara la solucin. La influencia de la temperatura sobre la solubilidad de un soluto en un solvente particular es generalmente muy pronunciada, debido a que la mayora de las sustancias absorben calor al disolverse y son ms solubles a una temperatura elevada. Para estimar el parmetro de solubilidad del soluto de inters u, es necesario realizar dos extracciones con diferente solvente cada una de ellas y cuyas solubilidades Si sean conocidas. Una vez determinado 8 se pueden estimar los coeficientes de particin para nuevos solventes a partir de los valores Si conocidos. Estas son slo estimaciones que pueden servir de gua para nuevos experimentos. En la Tabla 6.2 se muestran los parmetros de solubilidad para algunos solventes.
Cambios en el Soluto Cuando no es factible cambiar el solvente para mejorar una extraccin ya sea por razones econmicas o tcnicas, entonces es necesario ver la posibilidad de realizar cambios en el soluto. Dado que el soluto es el producto que se desea obtener mediante la extraccin, los posibles cambios deben ser de carter reversible.
FUNDAMENTOS DE LA
EXTRACCIN
235
Tabla 6.2: Parmetros de solubilidad para algunos solventes. Solvente Amilacetato Disulfuro de carbono Tetracloruro de carbono Cloroformo Ciclohexano Tolueno Agua 8 (ca/ 1 / 2 era -3/2)
8.0
10.0 8.6 9.2 8.2 8.9 9.4
Cambios en el Soluto por Pares de Iones.- Los cambios en c soluto dependen del comportamiento inico que ste pueda tener. Si < soluto tiene comportamiento inico y es posible encontrar un materi que permita suprimir esta ionicidad sin alterar el soluto, entonces 1 unin del soluto a este material permitir aumentar la solubilidad d< soluto en el solvente de extraccin. Los cambios a solutos empleando contraiones se basan en el hech de que un soluto que es inico en el agua, formar un par-in sin carg neta en un solvente orgnico. Esta formacin de par-in se puede ejemplificar de la siguiente m, era: Si de una solucin acuosa de cloruro de tetrabutilamonio se extr; el catin utilizando cloroformo, se tiene: _ [N(C4H9) en cloroformo] g)4 en agua] _
(6.
Si se agrega acetato de sodio a la solucin acuosa de cloruro < tetrabutilamonio y se realiza nuevamente la extraccin, se encuentra en cloroformo] = 132 en agua]
(6.
Puede observarse que en el primer caso se extrae una solucin dilu de par - ion de N(C^H^]\Cl" y que en el segundo caso, se obtiene u
236
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
Tabla 6.3: Contraiones tpicos usados en extraccin por pares de iones.

Ion
Estructura Qumica CH3COOCH3(CH2)2COO-
Observaciones Simple, no es muy soluble en solventes orgnicos. Ms soluble en solventes orgnicos que el Acetato. Slido Puede formar ncelas. Puede permanecer inico en solventes orgnicos. Puede formar ncelas. Puede formar cristales lquidos. Puede degradarse en varios solventes.
Acetato Butirato Tetrabutilamonio Hexadeciltributilamonio Perfluoroctanato Dodecanato Linolato Tetrafenilboruro
(C 4 #9)4W-
CH3(CH2)1&(dH9)3N+ CF3(CF2)6COO~ CH3(CH2)10COOCH3(CH2)tCH = CHCH2CH = (CH2)7COOB(C6H5)4~
Adaptada de: Belter ef al, 1988. Reproducida con el permiso de John Wiley and Sons. Copyright 1988. Todos los derechos reservados.
solucin ms concentrada de par - ion de CH^COO El empleo de pares inicos, requiere de la seleccin de contraiones solubles en la fase no polar. Este tipo de sustancias se conoce como sales grasas y se listan en la Tabla 6.3 Cambios en el Soluto por pH.- Algunos productos que son de inters biotecnolgico como las protenas o los constituyentes de stas los aminocidos, son sensibles a cambios en el pH por lo que el conocimiento y comprensin de las propiedades cido - bsicas de los aminocidos es sumamente importante en las bioseparaciones de protenas. Muchos de los solutos.que se desean aislar son cidos o bases dbiles, su extraccin puede ser fuertemente afectada por cambios en el pH. Un cido dbil puede ionizarse parcialmente en agua y no ionizarse significativamente en un solvente orgnico.
0.2. FUNDAMENTOS
DE LA EXTRACCIN
237
El cido dbil RCOOH, en solucin acuosa, se disocia de la siguiente manera: RCOOH ^ RCOO- + //+ as que su constante de disociacin Ka est dada por:
[RCOO-)R[H+]R [RCOOH]R
'
Cuando este cido dbil se distribuye entre dos fases, una orgnica E y una acuosa R, el coeficiente de particin aparente agrupa las concentraciones de la forma ionizada y no ionizada del cido en la fase acuosa. Este coeficiente de particin se expresa como:
"
[RCOOH}B [RCOOH}R + [RCOO-]R
'
Combinando las ecuaciones (6.10) y (6.11) se obtiene:
donde K{ es el coeficiente de particin intrnseco de las especies no ionizadas definido por:

Ki
_ [RCOOH}E ~ [RCOOH]R
(6J3)
se sabe que pKa logA^, entonces si se combinan las ecuaciones (6.12) y (6.13) se obtiene:
log 10
-}-l\=pH-pKa Kr
(6.14)
En la Tabla 6.4 se muestran los valores de pKa para algunos solutos de inters biolgico. El desarrollo anterior para el caso de una base dbil es anlogo y conduce a: (6-15)
238
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
Las ecuaciones (6.14) y (6.15) muestran que el coeficiente de particin puede ser alterado cambiando el pH de la solucin acuosa. Los cambios en el coeficiente de particin pueden ser usados tambin para seleccionar el pH al que debe extraerse preferentemente un soluto determinado. Para dos soluto A y B la selectividad de la separacin est dada por /?, donde:
Kr(B)
(6.16) es un indicador del grado de pureza que se puede lograr en un sistema de extraccin determinado. Ejemplo 6.1.- Disociacin de cido propinico. El pH de una solucin 0.1 M de cido propinico es de 2.935. Determinar: a).- La constante de disociacin aparente Ka. b). El pKa del cido. c).- El grado de disociacin del cido. Solucin: a).- La constante de disociacin de un cido est dada por la ecuacin (6.10), en este caso se tiene que:
^-a
_ [//+] (CH3 - CH;\

[CH3 - CH2 - COOH]
dado que la concentracin de la solucin es de 0.1 M, [C//3 - CH2 - COOH} + [//+] - 0.1 M y a un pH de 2.935, la concentracin de H+ es
[//+] L J =
-^ = 1.16 x 10~3 M
6.2. FUNDAMENTOS
DE LA EXTRACCIN
239
Tabla 6.4: Valores de pKa para algunos solutos biolgicos. Bases y cidos Simples Compuesto pKa Acido Actico 4.76 2.14 H3P04 CH3NH+ 10.6 Aminocidos Compuesto pK-2 pKi COOH aNH+ Leucina 2.36 9.6 1.82 Histidina 9.17 Lisina 2.18 8.95 Pptidos Compuesto pKi pffi COOH aNH+ 3.06 Gly-Gly 8.13 2.34 Ala 9.69 Gly-Asp 2.81 8.60 Ala-Ala-Lys-Ala 3.58 8.01 Antibiticos Compuesto pK'a* Cefalosporina C 3.9 5.3 7.6 Lincomicina (base libre) Penicilamina 1.8 , (carboxil)
+ + +
pKs Grupo R
6.0 10.53 - pK3 Grupo R
+ -f +
+ -I-f -f
4.45 10.58
+ 44-
10.5
Adaptada de Belter, P.A. et a/, 1988.

240 de tal manera que:
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
[C//3 - CH2 - COOH] = 9.88 x 10~2 M sustituyendo en (6.10) estos resultados se obtiene: (1.16 x 1Q-3 M) (1.16 xlQ- 3 M) ~~ 9.88 x 10-2 M = 1.36 x 10~5 M
Ka
b).- De acuerdo a la definicin de pKa->
pKa
= log(-)
pKa =
pKa = 4.87
c).- El grado de disociacin es igual a la concentracin de cido disociado entre la concentracin inicial de cido, de tal manera que:
Ejemplo 6.2.- Separacin de dos tipos de penicilina. En el sistema agua-amilacetato la penicilina "K" y la penicilina "F" tienen valores de K de 215 y 131, respectivamente. Sus pKa's son de 2.77 y 3.51. Si se desea recuperar penicilina "F", determinar como se alcanza mayor pureza del producto: Si se extrae a pH 3.0 o a pH 4.0. Solucin: La selectividad de la extraccin est dada por la ecuacin (6.16). Para aplicar esta ecuacin es necesario calcular primero Kp mediante la ecuacin (6.14), para cada penicilina a cada uno de los pH's de inters. Para la penicilina "K" a un pH de 3.0 se tiene:
6.2. FUNDAMENTOS
DE LA
EXTRACCIN
241
log10
- 1 = pH - PKa = 3.0 - 2.77 - 0.23
por lo tanto: Kp(uKn) = 79.68 Para la penicilina "F" a un pH de 3.0 se tiene:

log 10
= pH - PKa = 3.0 - 3.51 = -0.51
por lo tanto: KP(F") = 100.0 se tiene entonces que:

A
KP("F") 100.0 ^("/n 79.68 = L26
El clculo de /fp para las dos penicilinas a pH = 4.0 se realiza de manera similar, encontrndose para este caso que:
A = 2.67
Los resultados obtenidos para las dos penicilinas con los pH's respectivos se muestran en la siguiente Tabla:
PH
3.0 4.0
KP("K) 79.68
12.00
KP(UF) 100.00 32.00
' o_ A'pC'F") P ~ KP("K")
1.3 2.7
Estos resultados indican que si la extraccin se realiza a un pH = 4 se obtiene la penicilina "F" en forma ms pura, an cuando la extraccin es ms difcil dado que el A^C'/7"') = 32 es menor que el correspondiente al pH=3.0.
242
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
Tabla 6.5: Criterios utilizados en la seleccin de solventes. Selectividad. Coeficiente de particin adecuado para el producto. Grado de solubilidad. Facilidad de recuperacin. Densidad. Tensin superficial. Estabilidad para el soluto. Inocuo
6.2.3
Seleccin del Solvente
En la operacin de extraccin generalmente es posible seleccionar el tip de solvente que se va emplear para realizar la extraccin ( Mattiasso y Ling, 1989). Para tomar esta decisin es conveniente considerar h siguientes caractersticas (Tabla 6.5) del solvente:
Selectividad.- En el caso de que se desee adems de concentrar logn un cierto grado de purificacin, el solvente debe ser selectivo pai el soluto de inters. Coeficiente de particin.- Entre mayor sea el coeficiente de partici menor es la cantidad necesaria de solvente. Grado de solubilidad.- Entre ms insoluble sea el solvente en la a mentacin, la extraccin se realizar ms fcilmente. Facilidad de recuperacin.- Por cuestiones econmicas es necesario qi el solvente pueda ser recuperado para su reutilizacin. Densidad.- La separacin de las fases una vez que se efecta la e traccin, es ms rpida entre mayor sea la diferencia de densid. entre las fases.
243
Tensin superficial.- Un solvente con una tensin superficial alta, facilita la coalescencia de las emulsiones, en la separacin de las fases. Estabilidad para el soluto.- El solvente no debe alterar al producto. Otras.- El solvente debe ser inocuo, esterilizable, no-inflamable, barato y disponible en las cantidades deseadas.
6.2.4
Extraccin en Dos Fases Acuosas Inmiscibles
Cuando se opera con sistemas biolgicos hay un nmero limitado de solventes que pueden ser usados en los procesos de extraccin, esto es debido a que algunas de las biomolculas de inters como las protenas, son desnaturalizadas por los solventes orgnicos (Mattiasson y Rajni, 1991). Una tcnica de bioseparacin que preserva la actividad de las biomolculas, en este caso de las protenas, es la extraccin en sistemas de dos fases acuosas inmiscibles (SDFA). En la Tabla 6.6 se listan algunos sistemas que pueden ser usados para formar sistemas de dos fases acuosas. En general los sistemas de dos fases acuosas se pueden clasificar en dos tipos: - Los sistemas polmero-polmero. - Los sistemas polmero-sal. Los sistemas de dos fases acuosas inmiscibles polmero-polmero se forman cuando dos polmeros como el polietilen-glicol (PEG) y el dextrano (un carbohidrato) se mezclan en presencia de agua. En el caso de los sistemas polmero-sal, el sistema se forma por la mezcla en agua de un polmero y una sal como el fosfato de potasio. El hecho comn de estos sistemas es que ambas fases son acuosas, el contenido de agua de cada fase vara entre 85 y 99 %. Los sistemas de dos fases se caracterizan por presentar una baja tensin interfacial en el rango de 0.0001 a 0.1 d7ia/an. El tiempo de sedimentacin (separacin de las fases) slo por accin de la gravedad es
244
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
Tabla 6.6: Sistemas de dos fases acuosas. Componente 1 Polietilen-glicol Polietilen-glicol Polietilen-glicol Polietilen-glicol Ficoll Componente 2 Dextrano Hidroxipropil de almidn Fosfato de potasio Sulfato de potasio Dextrano Referencia Albertsson (1986) Tjerneld (1986) Albertsson (1986) Albertsson (1986) Albertsson (1986)
Fuente: Albertsson et a/, 1990.

de 5 min a varias horas debido a la pequea diferencia de densidades y a la relativamente alta viscosidad entre las fases. El tiempo de separacin puede reducirse utilizando centrifugacin a baja velocidad (Albertsson et al, 1990). El hecho de que ambas fases sean acuosas y tengan una tensin interfacial tan pequea, proporciona un medio ambiente tal que permite que las biomolculas y partculas celulares puedan repartirse entre las fases conservando su actividad (Diamond y Hsu, 1990). La extraccin en SDFA es un proceso sumamente atractivo para la separacin de enzimas y protenas de inters biotecnolgico debido principalmente a que: - El escalamiento es sencillo y puede realizarse a partir de datos de laboratorio en forma confiable, dado que el coeficiente de particin no vara con la escala. - La transferencia de masa es alta y el equilibrio se alcanza con poca energa de mezclado. - Se puede realizar en forma continua. - Los polmeros le confieren estabilidad a las protenas.
6.2.
FUNDAMENTOS DE LA EXTRACCIN
245
15-
10.
10
% (w/w)
15
Dextrano
Figura 6.2: Curva binodal para un sistema de dos fases acuosas inmiscibles PEG 3400/Dextrano T-5000/Agua. Adaptada de: Huddleston et al, 1991
Reproducida con el permiso de Elsevier Science Inc. Copyright 1991. Todos los derechos reservados.
- La separacin puede ser selectiva y rpida. - La separacin puede efectuarse a temperatura ambiente debido a su rapidez. - Es ms econmica que otros procesos. Diagramas de Fases Los sistemas de dos fases acuosas pueden ser caracterizados mediante diagramas de fases nicos donde se granean la composicin de las fases en el equilibrio. La Figura 6.2 muestra un diagrama de fases para el sistema PEG 3400/Dextrano T-5000/Agua. La curva binodal caracterstica de estos sistemas pasa por los puntos DPC.
246
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
- El punto P representa el punto crtico y es el punto donde tericamente la composicin y los volmenes de ambas fases son iguales. - El punto A se sita en una regin a la izquierda de la curva binodal donde el sistema consta de una sola fase. - El punto B se localiza en una regin donde coexisten las dos fases y representa la fraccin peso de cada uno de los componentes de una mezcla formada por fases de composicin C y D. - Las lineas como la CBD se conocen como lineas de unin. Si se considera la linea de unin que pasa por los puntos Ql, Q2 y Q3, todos los puntos estn formados por fases de igual composicin, pero en diferente proporcin de volumen. La proporcin de volmenes de las fases conjuntamente con el coeficiente de particin constituyen un factor de diseo fundamental de la extraccin. La proporcin de volmenes de las fases puede obtenerse grficamente utilizando balances de masa. Considrese la linea CBD de la Figura 6.2 y sea: M: Masa total del sistema de dos fases. [M]. ME'- Masa de la fase rica en PEG. [M]. MR: Masa de la fase rica en dextrano. [M]. qE'. Fraccin masa de PEG en fase rica de PEG. [Adim.j. PE'- Fraccin masa de dextrano en fase rica de PEG. [Adim.]. qpt: Fraccin masa de PEG en fase rica de dextrano. [Adim.]. PR: Fraccin masa de dextrano en fase rica de dextrano. [Adim.]. entonces el balance de masa total del sistema es: M = ME + MR el balance de PEG es: (6.17)
$.2. FUNDAMENTOS
DE LA EXTRACCIN
247
MqM = MEqE + MRqR
(6.18)
combinando las dos ecuaciones anteriores se obtiene:
qE - qM
La diferencia de fracciones masa de la ecuacin anterior puede encontrarse grficamente en la Figura 6.2. Asimismo por tringulos semejantes se puede demostrar que:
= BC
donde BD y BC son las longitudes de los segmentos entre los puntos respectivos. Cuando la densidad de las fases es muy prxima, la relacin de volmenes de las fases est dada por:
f = R BC
(6.21)
donde E y R son los volmenes de la fase superior e inferior, respectivamente. Comportamiento de las Fases El comportamiento de un sistema polmero A-polmero B-agua, depende de las interacciones entre las molculas presentes. Estas interacciones pueden ser puentes de hidrgeno, fuerzas de van der Waals o inicas, interacciones dipolo-dipolo e interacciones hidrofbicas. En un sistema pueden presentarse simultneamente varios tipos de estas interacciones dependiendo del tipo de polmeros que formen el sistema. Los polmeros que se utilizan para los SDFA se caracterizan por su capacidad para formar puentes de hidrgeno con el agua, de tal manera que las interacciones polmero A- polmero B estn en competencia con las interacciones polmero A-agua, polmero B-agua. Si las interacciones polmero-agua son ms fuertes que las interacciones polmeropolmero, entonces estas ltimas son menos frecuentes. Entonces se for-
248
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
man regiones en cada uno de los polmeros que estn estadsticamente excluidas de interaccionar. Este efecto de regiones excluidas de los polmeros produce la separacin de fases en la mayora de los sistemas de dos fases acuosas polmero-polmero. Los polmeros que se repelen debido a este efecto se denominan polmeros incompatibles. En el caso de los sistemas polmero-sal-agua la segregacin de las fases se puede deber al grado de hidratacin del grupo ter del PEG. Un estado de equilibrio se caracteriza por presentar energa de Gibss mnima a una temperatura, presin y composicin dadas. En un sistema de dos fases acuosas la separacin de fases ocurre en aquellas mezclas cuya energa de Gibss es menor cuando el sistema existe como dos fases que cuando permanece como una. El criterio de equilibrio puede ser expresado tambin en trminos de los potenciales qumicos //,- de los componentes como:
= 1,2,. ..TV
(6.22)
donde la prima (') y la doble prima ("), representan la fase superior y la fase inferior respectivamente, y N es el nmero total de componentes. Existen varios modelos que tratan de explicar el comportamiento terico de la particin o distribucin de las protenas en los sistemas de dos fases acuosas a partir de considerar una serie de factores que afectan la particin de este tipo de soluto en el equilibrio. Factores que Afectan al Coeficiente de Particin Los estudios empricos realizados en sistemas de dos fases acuosas han mostrado que la particin de protenas es una funcin compleja que depende de factores tales como: hidrofobicidad, tamao molecular, conformacin molecular, bioespecificidad de la protena, electroqumica, pH, concentracin del buffer, fuerza inica, temperatura y concentracin de la protena (Baskir et a/, 1989). En general la particin de protenas en sistemas de dos fases est definida por el coeficiente de particin
~ K- ~
(6.23)
6.2. FUNDAMENTOS
DE LA EXTRACCIN
249
donde [P]i y [P]2 son las concentraciones de soluto en este caso protena en las fases 1 y 2, respectivamente. Esta ecuacin es equivalente a la ecuacin (6.4). Debido a la dependencia del coeficiente de particin Kp de los factores arriba mencionados, ste se puede expresar como el producto de varias contribuciones: Kp = K Kdq Khf Kbioe Kam Kconf (6.24)
donde los subndices: elq, /i/, bioe, am, y conf, indican las contribuciones que sobre el coeficiente de particin tienen las propiedades electroqumicas, hidrofbicas, de bioespecificidad, tamao y conformacin, respectivamente, entre el soluto y los polmeros que forman las fases. K incluye otros factores tales como la solvatacin del soluto en las fases. Es til expresar el coeficiente de particin en la forma logartmica de la ecuacin (6.50) misma que se puede escribir como: In Kp = ln K + In Kelq + In Kh + In Kbioe + In Ktam + ln Kconf (6.25) A continuacin se describe el efecto especfico de algunos de estos parmetros sobre el fenmeno de particin en dos fases acuosas (Figura 6.3). Tamao de las Biomolculas.- Las molculas pequeas como los aminocidos se distribuyen uniformemente entre las fases. Con las partculas ms grandes la particin no es tan uniforme, de tal manera que las protenas grandes tienden a repartirse menos uniformemente que las protenas pequeas (Figura 6.4). Las molculas de peso molecular muy grande como el ADN y los virus se reparten casi por completo en una sola fase. Sin embargo, las partculas extremadamente grandes como las clulas, se distribuyen entre la interfase y una de las fases o pueden agruparse completamente en la interfase (Baskir et a/, 1989). Peso Molecular de los Polmeros.- El peso molecular de los polmeros utilizados en los sistemas de dos fases, tiene influencia sobre el reparto del biomaterial debido a que altera la composicin de las fases y cambia el nmero de interacciones protena - polmero. El coeficiente de particin de una protena en un sistema dextrano/polietilen-glicol se incrementar si el peso molecular del polietilen-
250
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
Caractersticas del Sistema:

1. Incrementar el pH arriba del Pl 2. Incrementar el peso molecular del Dextrano. 3. Promover interacciones especficas. 4. Reducir el peso molecular del PEG.
Caractersticas de la Protena de inters.

PEG
1. Incrementar los residuos hidrofbicos 2. Disminuir el nmero de cadenas laterales amino. 3. Incrementar el nmero de cadenas laterales carboxilo.
Se incrementa Kp Disminuye Kp
1. Reducir el peso molecular del Dextrano. 2. Disminuir el pH del sistema abajo del Pl 3. Incrementar el peso molecular del PEG
1. Disminuir los residuos hidrofbicos. 2. Disminuir el nmero de cadenas laterales carboxilo. 3. Incrementar el nmero de cadenas laterales amino.
Figura 6.3: Factores que afectan al coeficiente de particin. Adaptada de: Huddleston ti a/, 1991.
251
20Ovalbumina
1.0-
a-Amilasa (bactarial)
ABS
sozima (pollo y pavo) Papana

Tripsina a-Quimiotrpsina
Transferrina (humana) ft Galactosidasa (d* EcoiiVM y WL)
0.1
0.05
50
PMxIO"
Figura 6.4: Efecto del peso molecular de las biomolculas en el coeficiente de particin de una enzima. Fuente: Baskir, 1989.
Reproducida con el permiso de John Wiley and Sons. Copyright 1989. reservados. Todos los derechos
252
CAPTULO 6.
1.5 :
Composicin del Sistema 12 % de Oxido de Polietilen Glicol ( OPE ) 1 X de Dextrano ( Dx ) T- 500
EXTRACCIN
0.5 .
10000
20000
30000
40000
Peso Molecular del OPE
Figura 6.5: Efecto del peso molecular de los polmeros en el coeficiente de particin. Fuente: Baskir et a/, 1989.
glicol se reduce o el peso molecular del dextrano se incrementa. Inversamente, la particin de la protena decrecer si el peso molecular del polietilen-glicol se incrementa o el peso molecular del dextrano se reduce. Las protenas con peso molecular elevado son ms influenciadas por cambios en el peso molecular de los polmeros que las de peso molecular bajo, como se muestra en la Figura 6.5. Consecuentemente, pueden utilizarse polmeros de diferente peso molecular para optimizar la separacin de protenas de diferente tamao (Albertsson et al, 1990). Carga de la Protema.- Muchas protenas y enzimas contienen un gran nmero de grupos cargados o que pueden cargarse en solucin variando el.pH. Estos grupos generalmente tienen diferentes valores de pK. Cuando el pH de la solucin cambia desde valores cidos a bsicos, la protena incrementa su carga negativa y/o reduce su carga positiva. Cuando la protena est en su pH isoelctrico, la. suma de todas las
6,2. FUNDAMENTOS DE LA EXTRACCIN
253
cargas es cero. En todos los dems pH's la protena tiene una carga neta. Con frecuencia se observa que cuando se agregan sales a un sistema de dos fases en concentraciones entre 100 y 200 mM, se crea una distribucin de diferencia de potencial entre las fases. Esta diferencia de potencial resulta de las preferencias de los diferentes iones de la sal por las diferentes fases lo que puede afectar fuertemente la particin de las biomolculas cargadas . El pH de la Solucin.- Adems de los efectos del pH mencionados en el prrafo anterior, los cambios en el pH pueden inducir tambin cambios conformacionales en la estructura de la protena que alteran su particin. Concentracin de la Protena.- Si la concentracin de la protena permanece baja (un orden de magnitud ms baja que la concentracin del polmero), sta no afecta significativamente al coeficiente de particin. Sin embargo, a altas concentraciones de protena es posible que la concentracin afecte el coeficiente de particin ya que pueden alterarse significativamente las propiedades del sistema. Las protenas pueden inclusive formar fases separadas si su concentracin es suficientemente alta.
Modelos para el Coeficiente de Particin en Sistemas de Dos Fases

Existen varios desarrollos para obtener modelos que permitan predecir el coeficiente de particin en un sistema dado, de los cuales se presentan tres a continuacin. Modelo Emprico de Bronsted.- El primer modelo sobre la particin de partculas en sistemas de dos fases acuosas fue propuesto por Bronsted (Baskir et a/,1989) , quien desarroll una relacin aproximada para describir el efecto del tamao de la partcula sobre el coeficiente de particin. Esta relacin es: Kp = exp donde: (6.26)
254
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
M: Peso molecular de la partcula que se particiona. [M/mol]. /c: Constante de Boltzmann T: Temperatura absoluta. A: Constante que expresa tanto las caractersticas de las fases como las de la partcula que se particiona. La ecuacin (6.26) muestra que tan sensible puede ser el coeficiente de particin al tamao de la partcula, pero no considera la influencia de otros factores sobre el mismo coeficiente. Modelos Termo dinmicos Generales.- Los modelos termodinmicos para determinar el coeficiente de particin toman en consideracin la influencia de varios factores como la carga, hidrofobicidad de la partcula y composicin inica del sistema. El potencial qumico se expresa como una funcin de factores relacionados con la partcula tales como: la concentracin, la energa de superficie, el rea y la carga. Tambin incluye la diferencia de potencial entre las fases. (Baskir et al 1989).
/z, = ^ -f KT In di -f /^7 -f 2,
(6.27)
donde: /?: Potencial qumico en el estado estndar. a,: Actividad. A: rea superficial de la partcula. 7: Energa superficial de la partcula en una fase dada. Zii Carga total sobre la partcula. J-: Constante de Faraday. $: Potencial elctrico en la fase. N0: Nmero de Avogadro.

En la ecuacin anterior la actividad se puede expresar como:
255
donde /, es el coeficiente de fugacidad para la partcula y m t es la concentracin molal de la partcula en la fase. En el equilibrio los potenciales qumicos de las fases son iguales y la ecuacin (6.27) puede expresarse como:
TI '2 A O , T} 2 , ,,A , . -T In - - A-f /C-Tln -f A(\~f) -\ (m,-)i (/O o como:
- KT In K = A/.? + T In ^f + ( A7) + '" ~
(6-28)
donde A/? es la diferencia de potenciales qumicos en los estados estndar en las dos fases, A7 es la diferencia en la energa superficial de la partcula en las dos fases y A ^ es la diferencia en la distribucin de potencial entre las dos fases. En el caso de una solucin infinitamente diluida (cuando no hay interacciones partcula-partcula), la fugacidad se aproxima a la unidad, de tal manera que la ecuacin (6.28) puede ser escrita como:
z K = A/ + A( A 7 ) + '
(6.29)
en la ecuacin anterior la diferencia en los potenciales qumicos del estado estndar es una constante, de tal manera que en una serie de experientos con una misma partcula los cambios en K son resultado de cambios en la energa superficial de la partcula A7, la carga de la partcula Z{ y de la diferencia de potencial entre las dos fases A^. Modelo de Edmond y Ogston.- Otro modelo que puede ser usado para describir el comportamiento de un sistema de dos fases acuosas, fue propuesto por Edmond y Ogston (Clark, 1989). Este es un modelo en el cual los potenciales qumicos se expresan en trminos de la molalidad de los componentes del sistema. En este modelo los potenciales qumicos de los: solutos 2 y 3 (polmeros) se escriben como:
256
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
(2 = (2
2,2^2 + 2,3^3) RT(ln m3 + a3)3m3 + 2,3^2)
(6.30)
(6.31)
donde R es la constante de los gases ideales, m es la concentracin molal de soluto, // es el potencial qumico para el componente i en el estado estndar, 02,2, 3,3 y 2,3 son los coeficientes que caracterizan la interaccin de dos molculas del polmero 2, dos molculas del polmero 3 y una molcula del polmero 2 con una molcula del polmero 3, respectivamente. Esta interaccin se lleva a cabo en el solvente agua. El potencial qumico del agua se obtiene aplicando la ecuacin de GibbsDuhem, y est dado por: RTMl 1000(m 2 + m3
-f
(6.32)
donde MI es el peso molecular del solvente (agua). Los parmetros de interaccin a^j de este modelo pueden ser determinados ajustando las ecuaciones a datos experimentales de equilibrio, o por mediciones termodinmicas independientes en los sistemas binarios. Cuando los parmetros de interaccin son conocidos las ecuaciones de Edmond y Ogston pueden ser usadas para describir el comportamiento de las fases.
6.3
Equipo de Extraccin
Existen diferentes tipos de equipos para realizar una operacin de extraccin (Tabla 6.7). De acuerdo a la forma en que estos equipos pueden ser operados se dividen en extractores intermitentes y extractores continuos. A su vez los equipos de operacin continua pueden ser de contacto por etapas o de contacto diferencial. Otra caracterstica de los equipos de extraccin es la forma en que las fases se separan una vez realizada la extraccin, lo cual puede realizarse slo por gravedad o por medio de una fuerza centrfuga.
6.3. EQUIPO DE EXTRACCIN Tabla 6.7: Clasificacin y ejemplos de equipos de extraccin.

Separacin de las fases por: Gravedad Gravedad Gravedad Gravedad Gravedad Gravedad Gravedad Gravedad Centrifuga Tamao de gotas Agitacin Agitacin Gravedad Gravedad Agitacin Agitacin Agitacin Pulsos Deflectores Westfalia y Robatel Podbielniak y Alfa Laval Intermitente Equipo Continuo Etapas mltiples Columnas de contacto diferencial
M-S
257
M-S*
Aspersor Platos perforados Lecho empacado Aspersin tipo Rushton-Oldshue Discos giratorios Tipo Karr platos y empacadas
* M-S Mezclador-Sedimentador
En los equipos de extraccin el control del tamao de las gotas de la fase dispersa puede realizarse por medio de agitacin mecnica o por pulsaciones. En esta seccin se presentan algunos equipos de extraccin agrupndolos en: Extractores intermitentes Extractores continuos
6.3.1
Equipo de Extraccin Intermitente
En la extraccin itermitente o de una etapa la solucin que contiene el soluto de inters se mezcla con el solvente y posteriormente las fases se separan. En la Figura 6.6 se muestran algunos de los equipos utilizados para este tipo de extraccin. En la Figura 6.6(a) se muestra un mezclador sedimentador tpico donde el mezclador o agitador est completamente separado del sedimentador. La fase acuosa y la fase orgnica se alimentan al mezclador y las fases mezcladas se separan en el sedimentador. En la Figura 6.6(b) se muestra .una combinacin
258
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
de mezclador-sedimentador. Los mezcladores sedimentadores pueden combinarse en serie para extraccin en etapas mltiples o a contracorriente. Para obtener una transferencia de masa eficiente con frecuencia se usa un mezclador mecnico que proporciona un contacto ntimo entre las dos fases lquidas. En general una de las fases se dispersa en la otra en forma de gotas pequeas y debe existir un tiempo de contacto suficiente para que se realice la extraccin. Las gotas pequeas producen reas interfaciales grandes que provocan una extraccin ms rpida; sin embargo, las gotas no deben ser tan pequeas como para que el tiempo de sedimentacin o coalescencia subsecuente resulte demasiado largo.
6.3.2
Equipo de Extraccin Continua
Esencialmente existen dos tipos de equipos para realizar extracciones en forma continua: - Equipos continuos de etapas mltiples. - Equipos continuos de contacto diferencial Equipo de Extraccin de Etapas Mltiples El equipo utilizado en extraccin de etapas mltiples vara ampliamente, pero todas las modalidades involucran extracciones intermitentes repetidas. En la Figura 6.7 se muestra un sistema de este tipo donde el flujo de alimentacin y solvente se suministran a contracorriente en una serie de mezcladores sedimentadores. El tamao del mezclador debe dimensionarse para proporcionar suficiente agitacin y tiempo de contacto para lograr el equilibrio entre las fases. Este depender del flujo a ser procesado y de las propiedades fsicas de ambos lquidos. Cuando la extraccin involucra reacciones qumicas el tiempo de contacto puede ser muy importante. En el diseo de equipo de etapas mltiples hay un compromiso: Si los dos lquidos son mezclados intensamente pueden formar gotas pequeas las cuales permitirn una extraccin rpida pero una separacin lenta; si los lquidos son mezclados ligeramente se formarn gotas
6.3. EQUIPO DE EXTRACCIN
259
. XA E0 . X 0
En . X,
ay
a)
o
R.jfc
E0 . x a
E. x
OD
b)
Figura 6.6: Esquema de equipos utilizados en la extraccin intermitente: a), mezclador sedimentador separado; b). mezclador sedimentador integrado.
260
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
Et,apa
1
Etapa 2
Etapa
E.x
ÂT i JL L
U>~
L]
ÂJ
1
cJo
ÂJ
1
J\
C*0
\
t
'j
L]
\
\
.t.
.t.
) L*
Figura 6.7: Mezcladores sedimentadores conectados a contracorriente en etapas mltiples. grandes, habr menos rea de contacto, la extraccin es lenta, pero la separacin ms rpida. Algunos extractores de etapas mltiples como los Westfalia y los Robatel emplean fuerzas centrfugas para separar las fases durante la extraccin. Equipo de Extraccin Diferencial Las columnas de extraccin empacadas y las de aspersin, proporcionan contactos diferenciales donde el mezclado y la sedimentacin se suceden en forma continua y simultanea. En la Figura 6.8 se puede observar que en una columna de aspersin el lquido pesado entra por la parte superior y llena la columna formando la fase continua y sale por el fondo. El lquido ligero entra a travs de un distribuidor de tovera en el fondo, mismo que lo dispersa haca arriba en forma de gotas muy pequeas. El lquido ligero se coliga o junta en la parte superior y sale. En algunos casos el lquido pesado se dispersa haca abajo sobre la fase ligera continua que se va elevando. Tanto el lquido pesado como el lquido ligero se pueden introducir dentro de la columna como la fase dispersa. Las columnas de aspersin presentan por regla general bajas eficiencias debido al poco
EQUIPO DE
EXTRACCIN
salida del lquido ligero
261
coalescenda de la nterfase lquido pesado
gotas elevndose
lquido ligero
tobera de rociado
Figura 6.8: Columna de extraccin por aspersin. mezclado y como consecuencia su uso es reducido en la industria. El contacto entre las fases puede mejorarse proporcionando una superficie mayor. Esta superficie es proporcionada al rellenar la columna con un empaque como los anillos de Rasching o las sillas de Berl. Estos empaques promueven la unin de las gotas y la redispersin de las mismas a intervalos frecuentes a lo largo de la columna. Evidentemente en este tipo de columnas se pierde capacidad debido al espacio que ocupa el empaque, sin embargo esto se ve compensado por la gran mejora que se tiene en la transferencia de masa. Las columnas empacadas tienen una eficiencia mayor que las de aspersin, misma que puede incrementarse aplicando una pulsacin oscilante a los fluidos contenidos en la columna. En la Figura 6.9 se presentan esquemas de tres diferentes tipos de columnas de extraccin. La columna de platos perforados (Figura 6.10) proporciona un mtodo seguro y eficiente en los procesos de extraccin lquido-lquido. El esquema de la Figura 6.10 muestra una torre de extraccin de platos perforados donde se dispersan las gotas del lquido ligero que tienden a elevarse. Las gotas dispersadas se juntan debajo de cada plato y vuelven
262
CAPTULOS.
EXTRACCIN
E. x
E, x
empacado
ET.~D
discos
E0,
R. y
Figura 6.9: Columnas de extraccin: a) Lecho empacado b) Aspersin tipo Rushton-Oldshue c) Discos giratorios.
EXTRACCIN
263
Liquido pesado
O
Elevacin de gotas del disolvente ligero
O O O
o
_Coalescencia del disolvente
Figura 6.10: Seccin de una columna de extraccin de platos perforados. a formarse por encima de ste al pasar a travs de las perforaciones. El lquido pesado fluye hacia abajo de los platos donde se pone en contacto con las gotas y despus pasa hacia el plato inferior. Al igual que en las columnas empacadas, la eficiencia de separacin en las columnas con platos perforados puede incrementar mediante pulsaciones que promueven la coalisin y dispersin de la fase dispersa. Algunos equipos de extraccin diferencial utilizan la fuerza centrfuga para el manejo de las fases como el extractor Podbielniak y el extractor Alfa Laval.
6.4
Diseo de Equipo de Extraccin
Esta seccin se centra en los aspectos relevantes del diseo de de tres sistemas de inters en bioseparaciones: Extraccin intermitente. Extraccin continua
Extraccin fraccionaria
264
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
Solvente E..x
Figura 6.11: Esquema de un proceso de extraccin en una sola etapa. 6.4.1 Extraccin Intermitente
La extraccin intermitente, tambin llamada extraccin de una sola etapa, consiste en poner en contacto ntimo la solucin a tratar con el solvente de extraccin y formar dos fases. Despus de este contacto y una vez que se ha alcanzado el equilibrio, las fases deben separarse. En este proceso es conveniente que el contacto se realice con un alto grado de turbulencia para obtener altas velocidades de transferencia de masa. El proceso de extraccin en una sola etapa se presenta en la Figura 6.11. El separador est incluido en la etapa debido a que la extraccin del soluto persite en tanto las dos fases se encuentren en contacto y hasta que se alcance el equilibrio. Existen dos mtodos para el clculo de extractores intermitentes que dependen de la informacin disponible y de la complejidad de sta.
- Mtodos Analticos - Mtodos Grficos
6.4. DISEO DE EQUIPO DE EXTRACCIN Mtodo Analtico: Extractores Intermitentes
265
El rendimiento alcanzado en una operacin de extraccin es un factor de diseo importante y puede ser obtenido mediante el clculo de la concentracin final del soluto de inters en las fases. Como generalmente la extraccin se realiza de tal manera que las fases interactar hasta alcanzar el equilibrio, la concentracin final del soluto puede sei obtenida en algunos casos en forma analtica mediante el empleo de do ecuaciones. La primera de ellas es una relacin de equilibrio para la: soluciones que intervienen en el proceso y la segunda es un balance d< masa para el soluto. Cuando la relacin de equilibrio es lineal se tiene:
x = Ky
(6.33
donde x es la concentracin del soluto en la fase ligera E] y es 1 concentracin del soluto en la fase pesada /?, y K es la constante d equilibrio. La ecuacin (6.33) es la ecuacin de una recta que pasa po el origen. La segunda relacin es un balance de masa que indica que en ( proceso de extraccin: el soluto inicial = al soluto final. El balance de masa para el soluto, referido a la Figura 6.12 es: R0yA + E0x0 = Ry + Ex (6.3<
donde y es la concentracin de soluto en la alimentacin o fa: pesada, y es la concentracin de soluto en el refinado, esto es, la coi centracin del soluto que permanece en la alimentacin despus de extraccin, x0 es la concentracin inicial de soluto en el solvente < extraccin y generalmente es igual cero, x es la concentracin de solu en el extracto al final de la extraccin . En esta ecuacin se supone qi E y R son constantes. Para encontrar una expresin para calcular la concentracin al fin de la extraccin o de equilibrio, se sustituye el valor de x dado por ecuacin (6.33) en la ecuacin (6.34). El valor para y se obtiene manera similar. Esta combinacin de ecuaciones conduce a:
266
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
. X0
E. x
o . XA
ay
Figura 6.12: Esquema para el balance de masa del soluto en extraccin intermitente.
x=
Ky,
(6.35)
y=
1 +F
(6.36)
donde F es el factor de extraccin y est dado por:

171
KE
R
(6.37)
El factor de extraccin rene dos factores de diseo importantes, la constante de equilibrio y la relacin de las fases. Es posible desarrollar una expresin para calcular el rendimiento de la operacin o la fracin extrada p, definida por:
p=
Ex
(6.38)
misma que puede ser escrita en trminos del factor de extraccin para dar:
F \ +F
(6.39)
6A. DISEO DE EQUIPO DE EXTRACCIN
267
Consecuentemente la fraccin de producto no recuperado es igual a uno menos la fraccin extrada. Las expresiones desarrolladas son diferentes en el caso que la extraccin se realice de la fase pesada a la ligera. Ejemplo 6.3.- Clculo de la fraccin extrada de un producto proveniente de un caldo de fermentacin. En la recuperacin de productos de fermentacin con frecuencia se emplean extractores agitados. En este caso se ponen en contacto 10 litros de un caldo de fermentacin acuoso que contiene 10 g/1 del producto que quiere extraerse con 1 litro de un solvente orgnico. Si el coeficiente de distribucin es 20 y se establece el equilibrio en el extractor, calcule la fraccin extrada de producto. Solucin: El esquema que representa el sistema de extraccin es similar al de la Figura 6.12. El balance de masa para el soluto en este sistema es: R0yA + E0x0 = Ry + Ex como inicialmente en el solvente de extraccin la concentracin del producto es cero, el balance de masa del soluto queda como: RoVA = Ry + Ex (a)
combinando la ecuacin anterior con la ecuacin de equilibrio x = Ky y suponiendo R0 = /?, se obtiene la concentracin del soluto en el solvente de extraccin en el equilibrio. Esta concentracin est dada por:
KyA
con
F=
KE
sustituyendo los datos del problema se tiene:

=
_ 10 /
la concentracin x es:
268
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
*AS
T ~~
KyA = 20(10 g/l) - 66.6 g/l 1 + F 1+2
y la fraccin extrada p es:
Ex P = Ry A
F 1 + F
1+2
= 0.666
despus de la extraccin el porcentaje del producto en el extracto es de 66.6% y en el refinado es de 33.3%. Si se desea extraer casi todo el producto se debern realizar ms etapas de contacto entre las fases 0 aumentar el volumen del solvente de extraccin. Ejemplo 6.4.- Sistema de dos fases acuosas para separar virus. Se emplea un sistema de extraccin de dos fases acuosas para separar y concentrar virus de un caldo biolgico. El volumen inicial V0 de la solucin que contiene los virus es de 3 x 10~3 m3 y el volumen inicial V de la solucin de polmeros es de 1 x 10~4 m3. El coeficiente de particin Kp es de 4 x 10~4. Una vez que se mezclan ambas soluciones el volumen R de la fase pesada formada es de 5 x 10~5 m3. a).- Estimar las veces que se concentr la solucin o grado de concentracin obtenido. b).- El rendimiento de la operacin. Solucin: a).- El grado de concentracin GC puede ser expresado como:
GC =
y
C0
donde C0 es la concentracin de partculas en la solucin original. Mediante un balance de virus se puede obtener la siguiente expresin:
5.4. DISEO DE EQUIPO DE EXTRACCIN combinando ambas expresiones se obtiene:

V y xE + yR
269
GC = GC =
donde:
F=
V0
Para utilizar la ecuacin anterior es necesario calcular primero el valor de E mediante un balance,
entonces,
E = (3 x 1(T3 + 1 x 10~4 - 5 x 10~5) m5 E = 3.05 x 10~3 m3

y el grado de concentracin est dado por:
3 x 10~3 m3
n in 5 *> 1\ (\ . (4xlO- )x(3.05xlO; (5 x 10~ m3 ) 1+ i ;n-53 ^ ' \ Ov X 1U 771
4 3
GC =
GC = 58.57 b).- El rendimiento de la operacin puede expresarse como:
y R p= CV 0 0
combinando la expresin anterior con la del balance de virus se obtiene:
270
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
P = xE + yR
y en trminos del grado de concentracin:
yR
R
sustituyendo valores,
p = (58.57) 0.976 97.6%
5 x 1Q-5 m3 3 x 10~3 m3
Mtodo Grfico: Extractores Intermitentes En la solucin de problemas de extraccin intermitente se emplean con mucha frecuencia mtodos grficos. Estos mtodos son tiles en situaciones en las que el equilibrio es complejo y no se ajusta a una relacin lineal como la ecuacin (6.33). Al igual que el mtodo analtico el mtodo grfico tambin depende de dos ecuaciones bsicas: una relativa al equilibrio y otra al balance de masa del soluto. La relacin de equilibrio establece que la concentracin x del soluto en el solvente de extraccin despus de que las fases se ponen en contacto, es una funcin que depende de la concentracin y del soluto en el refinado,
=
f(y)
(6.40)
Atendiendo al esquema de la Figura 6.12 la ecuacin para el balance de masa del soluto es:
R0yA = Ry + Ex
consecuentemente:
0.4. DISEO DE EQUIPO DE EXTRACCIN
271
lnea de equilibrio -
(*.y)
(* - " o )
Fraccin mol de soluto en el refinado ( y )
Figura 6.13: Extraccin intermitente: En la interseccin de la lnea de operacin con la de equilibrio se obtienen las concentraciones que se alcanzan al final de la operacin.
(6.41) La ecuacin anterior es la de una recta llamada lnea de operacin cuya pendiente es m = R/E y cuya ordenada al origen es b Ry/ E Si se grafican los datos de equilibrio (ya sea en forma de una ecuacin o de datos tabulados) y la lnea de operacin como se muestra en la Figura 6.13, en la interseccin de las curvas se obtienen los valores de equilibrio y y x.
Ejemplo 6.5.- Extraccin de un aminocido.
La relacin de equilibrio entre el tolueno y el agua pura en la extraccin de un aminocido no esencial est dada por:
272
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
En = 4.7 0.006 M
E =4.7 I x =
Ro-1
yA=o
R =1 I
Figura 6.14: Esquema de la extraccin de un aminocido en un sistema intermitente tolueno- agua. Ejemplo 6.5.
*> = (0.001 Estimar la fraccin de aminocido extrada al poner en contacto 4.7 litros de solucin de tolueno, con una concentracin 0.006 M del aminocido, con un litro de agua. Solucin: El esquema del proceso se presenta en la Figura 6.14: El balance de masa para el aminocido es: R0yA + E0x0 = Ry + Ex (a)
de tal manera que la expresin de linea de operacin est dada por:
y = ~^(x0 - x)
sustituyendo valores se obtiene:
y
=4.7(0.006 - x
273
0.012 -
(0.006 . 0)
Figura 6.15: Curva de equilibrio y lnea de operacin para el sistema tolueno- agua. Ejemplo 6.5. En la Figura 6.15 se muestra la curva de equilibrio y la lnea de operacin para este sistema. En la interseccin de estas dos lneas se puede encontrar la concentracin y de soluto al final de la extraccin. Esta concentracin en el equilibrio es:
y = 0.012
la fraccin extrada p es:
Ex0 _ (LO /) (0.012 2^ P = ~ (4.7 /) (0.006 2^ P = 0.43
Ry
6.4.2
Extraccin Continua
El tratamiento del diseo de extractores continuos puede dividirse en : - Extraccin en etapas mltiples - Extraccin diferencial
274
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
E, xn
E. xn-i
E.x2
E.x,
En. Xo
n-1
R.y 3
2
R.y 2
1
R.y,
Figura 6.16: Esquema de un proceso de extraccin a contracorriente en etapas mltiples.
Extraccin en Etapas Mltiples

En la extraccin intermitente se usa una sola etapa para transferir el soluto de la fase acuosa a la fase ligera. Para transferir ms soluto puede repetirse el contacto mezclando la corriente de salida de refinado con disolvente nuevo. De esta manera se logra un mayor porcentaje de extraccin del soluto, sin embargo este procedimiento emplea una mayor cantidad de solvente y da lugar a la formacin de corrientes muy diluidas. Para emplear menos solvente y obtener una corriente de extracto de salida ms concentrada, generalmente se usa un contacto a contracorriente en etapas mltiples como el que se muestra en la Figura 6.16. En este esquema cada etapa est identificada por un nmero, iniciando con el nmero 1 a la derecha. La solucin pesada R0 (alimentacin) entra a la cascada por el lado izquierdo y el solvente puro o fase ligera E0 entra por la derecha. Las concentraciones con las que sale cada uno de los lquidos de cada etapa son las correspondientes al equilibrio. Por ejemplo, el lquido ligero que deja la primera etapa tiene una concentracin de equilibrio Xi. El lquido pesado que deja la segunda etapa tiene una concentracin de equilibrio y 2 Dos mtodos son comnmente utilizados para analizar este tipo de operaciones: - El mtodo Analtico
6.4. DISEO DE EQUIPO DE EXTRACCIN - El mtodo Grfico
275
Mtodo Analtico: Extractores Continuos Multietapas.El rendimiento alcanzado en una operacin de extraccin es un factor de diseo importante y puede ser obtenido mediante el clculo de la concentracin final del soluto de inters en las fases. Debido a que generalmente la extraccin se realiza de tal manera que las fases interactan hasta alcanzar el equilibrio, la concentracin final del soluto puede ser obtenida en algunos casos en forma analtica, mediante el empleo de dos ecuaciones: una relacin de equilibrio y un balance de masa. Cuando el equilibrio puede ser expresado por una relacin lineal para la etapa n se tiene: xn = Kyn (6.42)
El balance de masa para el soluto debe realizarse en cada etapa. De acuerdo a la Figura 6.16 dicho balance para la primera etapa es: Ry2 + E0x0 = Ryi + EXl (6.43)
Cuando las concentraciones de las corrientes de salida de cada etapa son las de equilibrio y el solvente est libre de soluto x0 = O, las ecuaciones (6.42) y (6.43) se combinan para obtener: 2/2 = (F + l)i/i (6.44)
como se mencion anteriormente F EK/ R es el factor de extraccin. Para la segunda etapa el balance de masa es: Ry3 + Exl = Ry2 + Ex (6.45)
y de acuerdo a la relacin de equilibrio, x\ = Ky\ y x 2 = K y< de tal manera que:
combinando la ecuacin anterior con la ecuacin (6.44) se obtiene:
276
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
2/3 = (1 -f F + F2)yi
(6.46)
mediante este procedimiento se puede obtener una expresin para el clculo de la concentracin de soluto en la fase pesada a la salida en funcin de la concentracin a la entrada, el factor de extraccin y el nmero de etapas, de la forma: j/n+i - (1 + F + F2 + ... -f F n ) yi que tambin puede escribirse como: (6.48) La ecuacin (6.48) puede ser utilizada de varias formas: - Si se conoce la concentracin de la alimentacin yn+i, el factor de extraccin F y el nmero de etapas n, entonces se puede calcular la concentracin del soluto a la salida t/i, y por lo tanto la fraccin extrada. - Si se conoce la concentracin de soluto a la entrada en la corriente de alimentacin y la concentracin deseada a la salida y el factor de extraccin F, entonces se puede calcular el nmero de etapas necesarias para el proceso de extraccin. - Si se conoce la fraccin que no es extrada yi/yn+i y el nmero de etapas, se puede conocer el factor de extraccin F; esto permite seleccionar flujos adecuados para E y R. El clculo de las concentraciones de salida permite estimar el rendimiento o la fraccin extrada p, que en este caso est dado por : (6.47)
Exn
Ryn+i
combinando la ecuacin anterior con las ecuaciones (6.42) y (6.48),
De la ecuacin (6.49) se desprende que cuando F es muy grande, p se aproxima a 1. Por otro lado, cuando F tiende a cero tambin p
EXTRACCIN
277
tiende a cero. En el caso particular cuando F es igual a la unidad, se cumple que p = n/(n + 1). Ejemplo 6.6.- Clculo de la fraccin extrada de un producto proveniente de un caldb de fermentacin en una extraccin por etapas. En una operacin de extraccin se ponen en contacto 10 l/rnin de un caldo de fermentacin acuoso que contiene 10 g/l del producto que se desea extraer, con un flujo de 1 l/min de un solvente orgnico. Si la constante de equilibrio es de 20 y se establece el equilibrio en el extractor, calcular la fraccin extrada de producto en un sistema de extraccin de tres etapas.
Solucin: De acuerdo a los datos yn+i = 10 g/l; K = 20; R = 10 l/min] E = 1 l/min y n = 3. La fraccin extrada puede ser obtenida mediante la ecuacin (6.49} y es necesario calcular primero el factor de extraccin, entonces:
F =
P
EK
v
(1 min -4-) (20) ' v /
10-4mtn
F = 2
la fraccin extrada o recuperada en el solvente de extraccin es:
F(Fn - 1)
P =
Fn+l
3
2(2 - 1) 24 - 1 0.93
Otro camino para resolver el problema no tan directamente, consist en utilizar la ecuacin (6.48) para calcular la concentracin de soluto
278
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
la salida en el refinado y\ . Conociendo este valor se puede encontrar la fraccin no extrada y la fraccin extrada. Se tiene entonces:
10
7-
la concentracin de salida de soluto en el refinado es:

10 9/1
15
9/1
/7
la fraccin no extrada es igual a la concentracn y\ dividida entre concentracin de soluto en la alimentacin, de tal manera que:
0.66 g/l -77- = 0.066 10 g/l
., , fraccin no extrada
y la fraccin extrada p es: p = 1 - 0.066 = 0.93 Ejemplo 6.7.- Extraccin continua de penicilina.Se extrae penicilina de un caldo de fermentacin utilizando isoamilacetato como solvente orgnico en un arreglo tipo cascada a contracorriente. Los flujos de la fase orgnica y de la fase acuosa son E 10 l/min y R = 100 l/min, respectivamente. El coeficiente de particin de la penicilina a pH=3 es K = 50. Si la concentracin de penicilina en la alimentacin es de 20 g/l, calcular el nmero de etapas necesarias para obtener una concentracin de 0.1 g/l de penicilina en la corriente de salida. Solucin: El nmero de etapas puede ser calculado mediante la ecuacin (6.48) y para lo cual primero es necesario calcular el factor de extraccin,
.4. DISEO DE EQUIPO DE EXTRACCIN
279
KE
(50)(10 l/m) 100 l/min F = 5

F
el nmero de etapas puede obtenerse mediante la expresin: /Fn+l
2/1
20 f
V F
5 n+l
0.1 f 5-1 n = 3.15 n = 4
Mtodo Grfico: Extraccin continua de Etapas Mltiples.Al igual que en la extraccin intermitente, los mtodos grficos son muy usados en ingeniera en la solucin de problemas de extraccin poi etapas. Se requieren dos tipos bsicos de relaciones: una relacin d( equilibrio y un balance de masa. La relacin de equilibrio se expresa como:
n
= f(yn)
(6.50;
El balance de masa global para el soluto, es decir en todo el equipo es de la forma:

f +i H = -j(y n
R
(6.51
las ecuaciones (6.50) y (6.51) pueden granearse sobre el mismo plan< coordenado para obtener las lneas de equilibrio y operacin, respecti vamente. En la Figura 6.17 se muestra una grfica de este tipo. Cuando interesa calcular del nmero de etapas n requeridas en un operacin de extraccin, el procedimiento es el siguiente (Figura 6.17"
280
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
Lnea de operacin Lnea de equilibrio
8 2
0)
X)
Alimentacin
II
o 5
<yA)
Concentracin de soluto en el refinado ( y )
Figura 6.17: Anlisis grfico de una extraccin a contracorriente en etapas mltiples.
281
- Se calcula la concentracin de soluto en la corriente de la alimentacin en la parte final de la cascada t/i, mediante la ecuacin (6.51). - Se localiza sobre la grfica el punto (y1? x = 0). Este punto representa la interseccin de la lnea de operacin con el eje de las abscisas. - Una vez localizado el punto (y\, x 0), se traza una lnea vertical en 7/1. - En la interseccin de la linea vertical con la curva de equilibrio se localiza el punto (yi, x\] de la lnea de equilibrio. - En x\ se traza una linea horizontal. - En la interseccin de la linea horizontal con la lnea de operacin s localiza el punto (1/2, x\]. - Se repite el procedimiento anterior hasta alcanzar el punto (y n +i, xn] En este punto la concentracin del soluto en el refinado iguala excede la concentracin en la alimentacin. El nmero de etapas se determina contando el nmero de escaln* trazados.
Ejemplo 6.8.- Extraccin por etapas de Actinomicina D.

Se desea extraer Actinomicina D de un caldo de fermentacin q contiene 260 mg/l de este antibitico, utilizando butil-acetato cor solvente. La constante de equilibrio K de este sistema tiene un val de 57 al pH 3.5 al que se realiza la extraccin. El flujo de la fase acuc R es de 450 l/h y el de la fase orgnica E es de 37 l/h. Calcular el nmero de etapas necesarias para lograr el 99% de cuperacin del antibitico.
Solucin:
Solucin grfica.- Para calcular grficamente el nmero de eta es necesario obtener una expresin para la curva de operacin media
282
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
\
la ecuacin (6.51), para lo cual es necesario calcular primero la concentracin de soluto a la salida en el refinado. Dado que se desea recuperar el 99% del soluto esta concentracin es:
; j J
yi = 0.01 x (260 mg/l) = 2.6 mg/l

la expresin para la curva de operacin es:
i
\
450 xn = (yn+i - y\) = 12.2 yn+l - 31.62
[mg/l]
la relacin de equilibrio para este caso est dada por:
Para realizar el clculo grfico se traza la curva de equilibrio utilizando el punto (O, 0) y la pendiente de 57. Se traza la lnea de operacin a partir del punto (2.6, 0) y la pendiente 12.2. Una vez obtenidas las curvas se puede estimar el nmero de etapas mediante el proceso de trazado de escalones sobre la curva. En este caso es necesario utilizar dos escalas debido al rango tan amplio de variacin de las concentraciones. Las curvas resultantes se muestran en la Figura 6.18. Se puede estimar que el proceso de extraccin se completa en tres etapas. Solucin analtica.- Dado que la relacin de equilibrio es lineal, el clculo tambin puede realizarse mediante el mtodo analtico por medio de la ecuacin (6.48), de tal manera que: 2/n+i = -= r- 0.01 y n+1
\ F - l J
y en este caso el factor de extraccin es:
_ (57)(37 l/h) _ ~ 450 l/h ~

de tal manera que:
yn+i ^ 0.01 yn+]
(4.69)" +1 - 1 4.69 - 1
283
a). lma de equilibrio b). linea de operacin
Figura 6.18: Etapas requeridas en la extraccin de actinomicina de Ejemplo 6.8.
284
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
rearreglando y tomando logaritmos se tiene: In370 = (n + l)ln4.69 por lo tanto
n = 2.8
se requieren tres etapas para esta extraccin lo que coincide con el resultado obtenido por el mtodo grfico. Extraccin Diferencial Cuando el contacto de la fase pesada y la fase ligera se efecta en forma continua, se dice que la extraccin se realiza en forma diferencial. El soluto se transfiere de una fase a otra a travs de un contacto ntimo entre stas, pero no se llega a alcanzar el equilibrio. Sin embargo, el resultado de este proceso es una extraccin significativa del soluto deseado. Este tipo de extraccin no es usado comunmente para el asilamiento de molculas biolgicas importantes, sin embargo se considera que en el futuro jugar un papel importante en bioseparaciones. El anlisis de la extraccin diferencial depende de tres relaciones bsicas. La primera de ellas es una relacin de equilibrio similar a las utilizadas en extraccin por etapas y est dada por: x = Ky* (6.52)
donde T/* es la concentracin hipottica de soluto en la fase pesada en equilibrio con la concentracin de soluto x en la fase ligera, en una altura dada de la columna. La segunda relacin es un balance de masa tomado en la base de la columna como se muestra en la Figura 6.19. En esta figura se puede observar que la concentracin de soluto a la entrada en la fase pesada R es y^, y a la salida es y0. La concentracin de soluto a la entrada en la fase ligera E es x0 = O y a la salida es XL. El balance de masa que resulta para este proceso a cualquier altura de la columna es: Ry + E(x0) = Ry0 4- Ex (6.53)
285
LT
" Xo
i r
Concentracin x, y en el volumen A A z
o "o
Figura 6.19: Esquema idealizado de una columna de extraccin diferencial.
286
que tambin puede ser escrito como:

/? x = (y - y0)
(6.54)
donde x y y son las concentraciones de soluto en la posicin z, las cuales no estn en equilibrio. La linea de operacin del proceso est dada por la expresin ( 6.54 ). La tercera relacin es un balance de masa del soluto que expresa la velocidad con que ste se transfiere de la fase pesada a la fase ligera. Este balance se realiza en un diferencial de volumen AV = AAz. En la Figura 6.19 se muestra el esquema para el balance de masa en este diferencial de volumen y que se expresa en palabras como: Acumulacin de soluto en fase R = Entrada de soluto Salida de soluto -^-Produccin Transferencia Este balance puede ser simplificado considerando que la acumulacin es nula. Debido a que no hay produccin de soluto el trmino correspondiente tambin es nulo. La velocidad de transferencia de soluto de la fase R a la fase E est dada por rA Az, donde r es la velocidad de transferencia volumtrica. El balance de masa en el diferencial de volumen se puede escribir entonces como:
O - R(y*+*z - yz) - rA&z
(6.55)
si se divide la ecuacin anterior entre AAz y se toma el lmite cuando Az * O, la ecuacin (6.55) se puede escribir como:
^-,
dz
(6.56)
En la extraccin diferencial una fase se dispersa en la otra en forma de gotas pequeas, y el rea de contacto es un factor muy importante para lograr una extraccin rpida y eficiente. La velocidad de transferencia r es proporcional al rea superficial de las gotas por unidad de volumen. La velocidad de transferencia / tambin es proporcional
EXTRACCIN
287
a que tan lejos est la concentracin y del equilibrio. De acuerdo a lo anterior r se puede escribir como: r = ka(y y*) (6.57)
donde a es el rea superficial de contacto por unidad de volumen, y* es la concentracin hipottica de soluto en la fase pesada en equilibrio con la concentracin de soluto en la fase ligera x, y k es una constante de velocidad llamada coeficiente de transferencia de masa. Esta depende de las propiedades fsicas de los fluidos en contacto tales como viscosidad, densidad y flujo. La constante k tiene dimensiones de velocidad. La tercera relacin requerida para el anlisis de la extraccin diferencial se obtiene combinando las ecuaciones (6.56) y (6.57),
dy
(y - *)
(6.58)
Una vez obtenidas estas tres relaciones se puede describir como se relacionan entre si para obtener una ecuacin de diseo. La ecuacin (6.58) est en funcin del diferencial dz. Esto permite calcular la longitud del extractor diferencial utilizando para ello la ecuaciones (6.52) y (6.54). La longitud del extractor est dada por:
rL
L = I
y de acuerdo a la ecuacin (6.58) :
dz
L=
yL f dy yL __dl
kaA
Jy0 y x ~K
mediante la ecuacin (6.52) se obtiene la expresin,
por lo tanto:
L=
dy
(y - f<
288
de la ecuacin (6.54) se obtiene,
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
R ( - y0} ^ x = -j;(y
entonces:
L=
fyL
dy
y - my - y0
fyL
dy
dado que F = EK/R, la ecuacin anterior se puede escribir como:
L=
R F kaA(F-l)
Jy0 y + JT
(6 59)
finalmente integrando se obtiene:
R ka A. *
* ~
"
'
Al trmino de la ecuacin (6.59) que aparece dentro de los parntesis cuadrados se le llama en ingeniera "altura de una unidad de transferencia" HTU (de sus siglas en ingls), tiene unidades de longitud y es una medida de la eficiencia del equipo. El trmino que aparece entre llaves es una cantidad adimensional llamado "nmero de unidades de transferencia" NTU ( de sus siglas en ingls) que permite medir el grado de dificultad de la extraccin. Valores grandes de NTU significan mayor dificultad en la extraccin que valores pequeos. La expresin (6.59) se puede escribir como:
L = (HTU}{NTU]
(6.60)
La ecuacin (6.60) es la base para el diseo de un proceso de extraccin diferencial lquido-lquido. Ejemplo 6.9.- Separacin de una mezcla racmica de leucina.
Los mdulos de fibras huecas constituyen una alternativa atractiva respecto aj uso de equipos de extraccin convencional debido su alta relacin rea/volumen (Ding et a/, 1992). Se utiliza una unidad de fibras huecas operando a contracorriente para separar 1-leucina de d-Ieucina bajo las siguientes condiciones:

Fase extractla ligera Fase acuosa Longitud de la unidad Dimetro de las fibras Nmero de fibras Flujo de la fase acuosa R Flujo de la fase orgnica E Coeficiente de particin K
EXTRACCIN
289
N-n-dodecil-1-hidroxiprolina en octanol Agua (conteniendo 1-leucina y d-leucina) 64 cm 240 /m 96
19.2 cm3/h 76.8 cm3/h
0.331 d-leucina
Los microporos de las fibras se rellenaron con gel de polivinil-alcoho de tal manera que los solutos difunden a travs de los poros sin que la fases se mezclen. Estimar el coeficiente de transferencia de masa volumtrico ka de sistema, si bajo las condiciones enunciadas la recuperacin de d-leucin; en la fase ligera fue del 99.97 %.
Solucin:
Se requiere utilizar la ecuacin (6.59) para estimar el parmetro k y expresarla en trminos de la recuperacin p que en este caso est dad, por la expresin:
Ex
P =
~Ryi
otra expresin necesaria es la del balance global del soluto que es:
ExL = R(yL - y0)
combinando las dos ecuaciones anteriores,
ExL
Ryi
290
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
en base a lo anterior la ecuacin (6.59) puede expresarse como:

L
L-
[kaA\{F-\
\VL(1-P)
o bien como:
L= ~ R ' kaA
La expresin anterior permite calcular fca, para lo cual es necesario obtener primero el rea de flujo A, que es la suma del rea transversal de las 96 fibras.
(96) TT x (240 x 10~6 m)' l A = 4 A = 4.34 x 10~2 cm2

tambin es necesario calcular el factor de extraccin F,
R 0.331 x 76.8 F _
19.2
2
F = 1.324
el coeficiente de transferencia de masa est dado por:
10 9 cm3 /i /i 3600 5
2 2
i or,, -' 3 ~^
/ i _ 0.9997 \ 1.324
(64 c7/?.)(4.43 x 10~ C77i ) 1.324 - 1

ka
\\ - 0.9997^
= 526 x 10
Un mtodo simplificado para el diseo de columnas considera a la columna formada por un conjunto de platos tericos o etapas ideales.
291
El nmero de platos tericos N de una columna de contacto diferencial se calcula mediante los mtodos empleados para la extraccin continua de etapas mltiples. Este tratamiento da origen al concepto de altura equivalente a un plato terico HETP (de sus siglas en ingls), de tal manera que: L = (HETP)(N) Ejemplo 6.10.- Extraccin diferencial de penicilina. La extraccin de penicilina a partir de una fase acuosa mediante una fase orgnica debe realizarse a pH cido. Es recomendable que esta extraccin se realice en un tiempo corto debido a que la penicilina es inestable a pH cido. Esto puede lograrse en un extractor diferencial centrfugo tipo Podbielniak. Este extractor funciona como una columna de platos perforados enrollada sobre un eje giratorio que favorece el flujo a contracorriente de las fases. Se cuenta con los siguientes datos de operacin de un extractor tipo Podbielniak: Coeficiente de particin
Conc. de penicilina a la entrada r
(6.61)
25 (fraccin libre soluto).

3.3 x 1(T4
moles de
, de P agua moles
enicilina
Conc. penicilina en el solvente Flujo de alimentacin Flujo de extracto Prdidas de penicilina
O 70 moles de agua/min 3.5 moles de solvente/min 10 %
Calcular: a).- La fraccin mol de penicilina en el extracto de salida. b).- El nmero de etapas tericas de la operacin. Solucin: a).- La fraccin de soluto en el extracto de salida puede ser obtenida mediante la ecuacin (6.54),
XL
TT
(y.L ~ yo)
292
70
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
[3.3xlO- 4 -(0.1)(3.3xlO- 4 )] gg
o c mol min
xL = 5.94 x 10
_3 moles de penicilina moles de solvente
b).- El nmero de etapas tericas puede ser calculado mediante la ecuacin (6.48) que en este caso se puede escribir como:
Vr,
F -I
se requiere calcular el factor de extraccin,
F =
KE R
mol
7fl
mo
min
F = 1.25
entonces el clculo del nmero de etapas mediante la ecuacin (6.48) modificada es:
1.25- 1
0.1 =
n = 4.6
6.4.3
Extraccin Fraccionaria
La extraccin fraccionaria es una tcnica de separacin en la cual una fase ligera E que contiene varios solutos, se pone en contacto con una serie de tubos que contienen originalmente, fase pesada R pura. El resultado de este proceso es la separacin de los distintos solutos contenidos en el solvente E. Este proceso de extraccin tambin es conocido como extraccin Craig (debido a que fue desarrollado inicialmente por L.C. Craig como
293
extraccin a contracorriente) o como extraccin fraccionaria con una fase estacionaria. La extraccin fraccionaria se fundamenta en la diferencia del coeficiente de particin de los solutos. Cuando se tiene un solvente conteniendo varios solutos que poseen diferentes coeficientes de particin, stos pueden separarse entre si por medio de la extraccin fraccionaria. La extraccin fraccionaria consiste de repartos repetidos de una mezcla de solutos entre dos disolventes inmiscibles. El fundamento se muestra en la Figura 6.20 (a), donde un soluto A que posee un coeficiente de particin entre los disolventes E y R dado por:
KP(A) = = 1
yA
es extrado por este proceso de la siguiente forma: - Inicialmente el soluto A (64 unidades) se encuentra disuelto en un volumen de fase ligera E y se localiza en el tubo 1 junto con un volumen de fase pesada R. - Inicialmente los tubos del 2 al 7 contienen volmenes iguales de disolvente puro R. - El tubo 1 se agita hasta alcanzar el equilibrio; el resultado es una distribucin del soluto A entre las fases E y R en cantidades iguales, es decir 32 unidades en cada una. - El solvente E de la capa superior del tubo 1, se transfiere al tubo 2. - Se aade al tubo 1 un volumen de solvente fresco E. - Se agitan los tubos 1 y 2 hasta alcanzar el equilibrio, donde cada fase en ambos tubos contiene 16 unidades de soluto A, puesto que el coeficiente de distribucin KP(] = 1.0. - Se separa la fase ligera de los tubos y se aade al siguiente de la derecha. - Se aade al tubo 1 un volumen de solvente fresco E. - Se repite el proceso las veces que sea necesario.
294
Disolvente E Tubo
Disolvente R 1 2 3 4
5 6
DDDnn
IlaaaaD DDnnHHE nnnn nnn mnnn nn 1 DD n ri no] fio n

2
5 [ M O l [10
H0Blll3
Total y Tubo
1 6 15 20 15 6 1
20 -
Nmero
de
tubo
Figura 6.20: Extraccin de Craig: a) Esquema del principio de extraccin fraccionaria con una fase mvil; b) Grfica para cada tubo y varios solutos.
EXTRACCIN
295
El esquema de la Figura 6.20 muestra los resultados de siete transferencias. Comunmente en la prctica real de laboratorio, se emplean 100 o ms etapas de distribucin para separar mezclas de aminocidos o de protenas. La cantidad total de soluto A, en cada uno de los siete tubos, se puede ver en la grfica de la Figura 6.20 (b). Con el fin de comparar la forma en que se distribuyen varios solutos con diferente coeficiente de particin, tambin se muestra en la Figura 6.20 (b) la distribucin de los solutos B y C en concentraciones arbitrarias de 64 unidades cada uno. El soluto B, posee un coeficiente de particin,
KP(B) = = 0.33
y el soluto C,
KP(C) = = 3.0
ye
La figura indica que a mayor coeficiente de particin Kp, mayor es 1< cantidad de soluto desplazada en cada transferencia. Debido a que cad< soluto se mueve independientemente del otro de acuerdo a su coeficient< de particin, la mezcla de solutos A, B y C se separar por complet< en tres picos despus de un nmero determinado de transferencias. La extraccin fraccionaria con una fase mvil es de aplicacin ge neral y puede emplearse como tcnica de bioseparacin para diferente tipos de solutos como: protenas, cidos nucleicos, lpidos y aminoci dos. Este principio tambin sirve de base para las operaciones croma togrficas que se revisan posteriormente. Perfil de Concentracin A diferencia de los procesos de extraccin vistos en las secciones an tenores, en la extraccin fraccionaria el soluto desarrolla un perfil d concentraciones distribuido a travs de todos los tubos, lo cual no s presenta en otro tipo de procesos de extraccin. Otra forma de repre sentar la extraccin fraccionaria es mediante el esquema que se muestr en la Figura 6.21.
296
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
Transferencia 0 Agitacin Equilibrio Transferencia 1 Agitacin Equilibrio Transferencia 2 Agitacin
100
Zm
q
::. P
-':
w:;
pq P2 P2
q2
pq pq pq
q2
Equilibrio Transferencia 3 Agitacin Equilibrio Transferencia
2pq
q3
P2q
q3
3pq3
pq3
P 3q
3pq3
J J J J J
4pq 3
Figura 6.21: Representacin esquemtica de la distribucin de la concentracin de un soluto en la extracin fraccionaria con una fase mvil.
4. DISEO DE EQUIPO DE EXTRACCIN
297
En la Figura 6.21 se muestra la distribucin de soluto en cada tubo despus que se realiza la transferencia y se alcanza el equilibrio, cuando la recuperacin en cada etapa es p. Se muestra que al final de la cuarta transferencia, la distribucin de la concentracin en los tubos sigue una forma binomial. Cuando la extraccin fraccionaria se realiza con n transferencias la fraccin / de soluto original que se encuentra en el tubo r, (en ambas fases) depus de las n transferencias est dado por:
r!(n r)!
pr+l(l-P)n-r
(6.62)
donde:
F=
EK
r= 1,2,3....n+1
Cuando el nmero de transferencias n es muy grande la ecuacir (6.62) se aproxima a una distribucin gausiana y se tiene que:
(r np)' exp : ' v > ' [2*np(l-p)]l~"f\ 2np(l- P ) Este perfil tiene un mximo cuando r = np.
1
(6.63
Ejemplo 6.11.- Aislamiento de cido quenodeoxicolico. El cido biliar quenodeoxicolico es aislado mediante una extracci de Craig usando 400 transferencias. La fase pesada es agua y la fas ligera es n-butanol; la proporcin de las fases se ajusta de tal maner que el factor de extraccin F sea igual a uno. Una vez que se realizan las 400 transferencias, determinar: a).- El nmero de tubo de mxima concentracin. b).- La concentracin de soluto en dicho tubo.
298 Solucin:
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
a).-De acuerdo a la ecuacin (6.63) la fraccin de soluto / tiene un mximo cuando r = np, ya que en este punto el valor de la exponencial es mximo e igual a uno. El tubo que tiene la concentracin mxima de soluto es:
r = np = 400 = 200
b).- La fraccin de soluto en el tubo 200 despus de 400 transferencias est dada de acuerdo a la ecuacin (6.47) por: /(r,n) = /(200,400)= [27r(400)(0.5)(0.5)] 1 /2 /(200,400)-0.04 esto significa que solamente el 4% de la concentracin de soluto original est presente en el tubo de mxima concentracin despus de 400 transferencias.
6.5
Sumario
La extraccin es una operacin que se emplea para concentrar solutos de inters a partir de caldos biolgicos. Se basa en la diferencia de solubilidad de los solutos entre dos fases: el caldo biolgico y el solvente de extraccin. En la extraccin se emplean diversos solventes que pueden ser seleccionados combinando criterios establecidos y la teora que se dispone. En el caso de productos como las protenas se utilizan sistemas de dos fases acuosas inmiscibles que permiten el manejo de estos productos en forma ms apropiada. Existe una gran variedad de equipos para realizar la operacin de extraccin y sta puede realizarse en forma intermitente o continua. Los mtodos d diseo de los extractores pueden ser grficos o analticos y estn basados en relaciones de equilibrio y balances de masa.
6.6.
PROBLEMAS
299
6.6
Problemas
6.1.- En la separacin de Ajmalicina de pKa = 6.3 y Serpentina de pKa = 10.8, dos alcaloides vegetales de estructura muy semejante; se dispone de un solvente en el cual el coeficiente de particin intrnseco es igual para ambas especies. a).- Calcular el valor de Kp/Ki para ambas especies a los pH de 2, 4, 6, 8, 10 y 12. b).- Calcular la selectividad de Ajmalicina a los pH de 2, 4, 6, 8, 10 y 12. c).- Qu sistema recominda a para realizar la extraccin.? b).- Resp.
pH 4 2 6 8 10 12 (3 31,621 31,465 21,065 620 7.3 1.1

6.2.- Una solucin de cido actico al 0.01 M presenta una disociacin del 4 % a 25 C. a).- Calcular su constante de disociacin, b).- Calcular su pKa b).- Resp. 4.77 6.3.- Un volumen V0 de solucin con una concentracin C0 del soluto de inters, se mezcla con un volumen V de una solucin que contiene dos polmeros dando origen a dos fases acuosas inmiscibles (E -f R) entre las cuales se reparte el soluto. En el caso que el soluto se distribuya preferentemente en la fase superior ", expresar el grado de concentracin (GC) y el rendimiento (p) en funcin de V0, E, R y Kp. 6.4.- Se desea separar una mezcla que contiene igual cantidad de masa de dos enzimas, en un sistema de dos fases acuosas inmiscibles en el cual las enzimas C y D presentan coeficientes de particin de KpC = 0.5 y KPD = 0.011, respectivamente. a).- Estimar la proporcin E/R para que la masa de C en la fase ligera E sea igual a la masa de D en la fase pesada/?.
300
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
b).- Estimar el rendimiento y la pureza de la extraccin de la enzima (7, si la relacin E/R es la determinada en a). b).- resp. 96.4 % y 87 % 6.5.- Una solucin que contiene 20 g/l de estreptomicina se procesa en un sistema continuo de etapas mltiples, en el cual el factor de extraccin empleado es igual a 3. a).- Calcular la concentracin de estreptomicina en el refinado a la salida en los casos que el sistema conste de 1, 2, 3 y 10 etapas. b).- Cuntas etapas se recomiendan para realizar esta extraccin.? a).- Resp. 1 etapa: 5 g/l. 6.6.- Demostrar que en una extraccin diferencial con yi, = O y con extraccin de soluto de la fase E a la fase /?, la longitud de la columna est dada por:
Ka A F - 1
1n i
x0- Ky0
6.7.- Se extrae estreptomicina de un caldo de cultivo utilizando un solvente orgnico, en un sistema de extraccin a contracorriente de 5 etapas. El coeficiente de particin de la estreptomicina en el sistema a un pH de 4 es de 40. El flujo de la fase pesada R es de 150 l/min. Estimar el flujo de fase ligera E para reducir la concentracin de estreptomicina en la solucin de 10 a 0.2 g/l. Resp. 7 l/min 6.8.- En el desarrollo de un proceso (Wisniak et al , 1990) para la eliminacin de mercurio(II) de corrientes industriales de desecho, se emplea como fase extractiva aceite de jojoba sulfurado (acomplejante de Hg II) disuelto en queroseno. El coeficiente de particin del Hg(I) en el sistema agua-aceite de jojoba (queroseno) vara directamente con la concentracin de jojoba en el queroceno e inversamente con la concentracin inicial de Hg(II) en la fase acuosa. Los datos obtenidos en cinco etapas de extraccin intermitente utilizando extractante fresco (20 g/l de aceite sulfurado de jojoba) en cada una de ellas, se muestran en la Tabla siguiente:
PROBLEMAS Fase acuosa ppm de Hg(II) Final Inicial 1091.00 146.400 146.40 19.600 19.60 2.000 0.090 2.00 0.005 0.09 Coeficiente de particin
301
Etapa
1 2 3
4 5
KP 6.4 54.6 555.0 12,499.0 100,000.0
a).- Calcular la eficiencia de recuperacin de cada etapa. b).- Calcular la eficiencia de recuperacin global al final de cada etapa. c).- Calcular la relacin de fase acuosa a fase orgnica empleada en cada etapa (R/E). d).- Calcular la cantidad de fase orgnica por litro de fase acuosa utilizada en cada etapa y la cantidad total para las cinco etapas. e).- Estimar la cantidad de fase orgnica necesaria para procesar un litro de solucin acuosa en una etapa y obtener la misma eficiencia que la alcanzada en las cinco etapas. f).- En base a los resultados anteriores que proceso se recomienda si el lmite tolerable de Hg(II) es de 0.005 ppm. Respuestas para etapa 3 a).- 89.8 % b).- 99.82 % c).- 63 6.9.- En una columna empacada con anillos rashing se utiliza ur sistema de dos fases inmiscibles PEG 4000 - Na^SO^ para extrae] amiloglucosidasa de la fase ligera dispersa (PEG 4000) hacia la fase continua (Na^SO^}. La enzima presenta un coeficiente de particin er el sistema de 0.0345 (Patil et a/, 1991). La viscosidad de la fase dispers es de 24 x 10~3 Kg/m - s. La resistencia a la transferencia de masa se localiza en la fase ligen dispersa y puede ser caracterizada mediante el coeficiente de transfe rencia de masa dado por:
ka = 6 x ID '
donde:
302
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
v: Velocidad superficial de la fase dispersa. [m/s]. ^: Viscosidad de la fase dispersa. [Kg/m s]. ka: Coeficiente de transferencia de masa. [s~1]. a).- Determinar la longitud necesaria de una columna de 56 mrr de dimetro interno, alimentada con un flujo de 985 mm3/s de fase dispersa y 68 mm3/s de fase pesada, para producir una disminucin del 20 % de la concentracin de enzima de la fase ligera. b).- Obtener una grfica de la longitud necesaria de la columna en funcin de R para las condiciones de extraccin anteriores. c).- Que flujo R recomienda a para esta operacin? a).- Resp. 1053 mm 6.10.- En un sistema de extraccin fraccionaria tipo Craig los componentes B y C de una mezcla presentan coeficientes de particin de KPB = 0.33 y KPC 3.0, respectivamente. Obtener el perfil de concentracin de cada uno de los solutos a lo largo de los tubos, en los siguientes casos: a).- E/R = 0.2 y nmero de transferencias 30, 60 y 90. b).- E/R = 1 y nmero de transferencias de 30, 60 y 90. c).- E/R = 5 y nmero de transferencias de 30, 60 y 90. d).- Cul de los 9 sistemas recomienda? 6.11.- Las protenas pueden ser extradas sin ser desnaturalizadas con soluciones de iso-octano que contengan el detergente aerosol OT. Las protenas se solubilizan dentro de las micelas que forma el detergente. Debido a que la cantidad de protena solubilizada depende fuertemente del pH, las protenas pueden ser extradas con el solvente orgnico a un pH dado cercano al punto isoelctrico, y posteriormente desorberse a un pH diferente. Se est estudiando una solucin acuosa que contiene 0.2% en volumen de protena, cuya relacin de equilibrio est dada por: x = 2.9?/*
donde x es la concentracin de protena en la fase orgnica y y* es la concentracin de equilibrio en la fase acuosa. La relacin volumtrica
6.6. PROBLEMAS
303
entre las fases es de 6.8 litros de solucin acuosa por cada 3.8 litros de solucin orgnica. Calcular la concentracin del refinado a la salida y la fraccin extrada cuando se utiliza una columna de extraccin diferencial de 2.0 m. en la cual el HTU (basado en la concentracin acuosa) es 0.85 m. Resp. y = 0.04 p = O.
304
CAPTULO 6.
EXTRACCIN
6.7
Bibliografa
Albertsson, R, Johansson, G. y Tjerneld, F. 1990. Aqueous two-phase separations. En: Separation Processes in Biotechnology. Asenjo J.A. (Ed.). Marcel Dekker Inc. New York. 287-319. Baskir, J. N., Hatton, T. A., Suter, U. W. 1989. Protein partitioning in two - phase aqueous polymer systems. Biotechnology and Bioengineering. 34, 541 - 558 Belter, P.A., Cussler, E. L. y Hu, W. 1988. Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology. John Wiley & Sons. New York. 5, 99-143. Clark, W.M. 1989. Thermodynamics of protein partitioning in aqueous two phase systems. En: Chemical Engineering Problems in Biotechnology. Shuler, M.L. (Ed.). New York. 147-181. Diamond, A. D., Hsu, J. T. 1990. Protein partitioning in PEG/Dextran aqueous two - phase systems. AIChE J. 36,7, 1017-1024. Ding, H.B., Carr, P.W. y Cussler E.L. 1992. Racemic leucine separation by hollow-fiber extraction. AIChE J. 38,10, 1493-1498. Huddleston, J., Veide, A., Kohler, K., Flanagan, J., Enfors, S. y Lyddiatt, A. 1991. The molecular basis of partitioning in aqueous two-phase systems. TibTech. 9, 381-388. Mattiasson, B. y Ling, T.G.I. 1987. Extraction in aqueous two-phase systems for biotechnology. En: Separations for Biotechnology. Verral, M.S. y Hudson, M.J. (Eds.). Ellis Horwood Limited. New York. 270-292. Mattiasson, B. y Rajni, K. 1991. Extractive bioconversions in aqueous two-phase systems. En: Extractive Bioconversions. Mattiasson, B. y Holst, O. (Eds.). Marcel Dekker Inc. New York. 173-188. Patil, T.A., Jafarabad, K.R., Sawant, S.B. y Joshi J.B. 1991. Enzime mass transfer coefficient in aqueos tvvo phase system using packed extraction column. The Canadian J. of Chem. Eng. 69, 548-556.
6.7.
BIBLIOGRAFA
305
Wisniak, J., Schorr, G., Zcovsky, D. y Belter S. 1990. Extraction of mercury(II) with sulfurized jojoba oil. Ind. Eng. Chem. Res. 29, 1907-1914. - -
Captulo 7 Adsorcin.
7.1 Introduccin
La adsorcin es una de las operaciones ms utilizadas en la etapa de concentracin de caldos acuosos diluidos. Mediante la adsorcin las molculas de un soluto se concentran en una superficie slida por la accin de fuerzas intermoleculares entre el soluto y el slido. Debidc a la naturaleza de estas fuerzas el fenmeno es fcilmente reversible La adsorcin es esencialmente un fenmeno de superficie y debe distinguirse de la absorcin la cual implica la penetracin de una sustancia en el cuerpo de otra. La concentracin de uno o varios solutos de un caldo por medio d( la operacin de adsorcin requiere cuatro pasos (Figura 7.1). Primen el adsorbente y la solucin se ponen en contacto. Al efectuarse la ad sorcin el soluto se une preferentemente a la superficie del adsorbent< respecto a otros solutos. Una vez concluida la adsorcin es necesari lavar la columna con una solucin que no provoque la desorcin de soluto de inters. Finalmente se efecta la recuperacin del soluto uti lizando un fluido que favorezca la desorcin, operacin conocida com elucin. Es importante resaltar que el anlisis de las etapas de adsorcin lavado y elucin, es anlogo. En este captulo slo se revisa lo referente la etapa de adsorcin por considerarse que los principios aqu expuesto pueden extenderse al anlisis de las otras etapas.
307
308
CAPTULO 7. ADSORCIN.
Adsorcin
e
Lavado de impurezas
Elucin de soluto
Figura 7.1: Etapas de la adsorcin. Fuente: Clonis, 1990.

7.2. FUNDAMENTOS
30
En el anlisis de la operacin de adsorcin, al igual que en otra operaciones de transferencia de masa, se utilizan modelos para el disee anlisis de alternativas (columnas en serie vs. columnas en paralelo) optimizacin, o simplemente para la obtencin de datos experimentale La formulacin de algunos de estos modelos requiere: - El establecimiento de las relaciones de equilibrio y de la capacida de adsorcin de los sistemas. - El establecimiento de la rapidez de la adsorcin con respecto a lo fenmenos difusivos y cinticos de superficie. - Los balances de masa y energa del sistema de adsorcin especfic (intermitente, continuo, serie, paralelo, etc.). - Las condiciones iniciales y de frontera del sistema. En la seccin 7.2 de este captulo se presentan los fundamentos d la operacin de adsorcin, como la qumica de la adsorcin, los tipo de adsorbentes, las curvas de equilibrio de los sistemas llamadas isotei mas de adsorcin y los aspectos bsicos de la cintica de la adsorcir En la seccin 7.3 se describen los principales equipos' utilizados en la operaciones de adsorcin y en la seccin 7.4 se presentan los principie para el diseo de tales equipos.
7.2
Fundamentos
Las operaciones de adsorcin son utilizadas en la obtencin de vari tipos de productos biotecnolgicos como aminocidos, antibiticos, v taminas y protenas. Debido a lo anterior, cada vez existe una maye necesidad de profundizar en los aspectos fundamentales de la operaci (principalmente en el contexto del procesamiento de caldos biolgicos de los cuales se pueden destacar cuatro: Los tipos de adsorcin segn el tipo de interaccin soluto-adso bente. Los tipos de adsorbentes.
310 Las relaciones de equilibrio. La cintica de la adsorcin.
CAPTULO 7.
ADSORCIN.
7.2.1
Tipos de Adsorcin Segn el Tipo de Interaccin Soluto-Adsorbente
De acuerdo al tipo de interaccin del soluto con el adsorbente, se pueden distinguir cuatro tipos bsicos de adsorcin (Figura 7.2): - Fsica - Inica - Hidrofbica - Por afinidad En la adsorcin fsica las fuerzas de atraccin entre el soluto y el adsorbente son de tipo London-van Der Waals. En la adsorcin inica la diferencia de cargas entre el adsorbente y el soluto genera atracciones electrostticas ms fuertes y selectivas. La adsorcin hidrofbica se produce por interacciones entre regiones hidrofbicas del soluto y el adsorbente. La adsorcin por afinidad est basada en interacciones altamente especficas entre el adsorbente y el soluto, lo que caracteriza a este tipo de adsorcin como altamente selectiva.
7.2.2
Tipos de Adsorbentes
En el establecimiento de un sistema de adsorcin es necesario seleccionar cuidadosamente el tipo de adsorbente que se va a utilizar. En este proceso de seleccin los principales parmetros a considerar son las propiedades fsicas del adsorbente, tales como: resistencia mecnica, rea por unidad de volumen, porosidad interna y del lecho, forma de la partcula y tamao. Asimismo, es de fundamental importancia la capacidad de adsorcin del slido, la cual est fuertemente influida por su carga y su relativa hidrofobicidad. Actualmente se utilizan:diferentes tipos de adsorbentes en la operacin de adsorcin. En el caso de la adsorcin fsica, el adsorbente
7,2.
FUNDAMENTOS
311
interacciones van der Waals
interacciones electrostticas
adsorbente /.
(a)
(b)
hidrofcibica adsorbente
Figura 7.2: Tipos de adsorcin, a) Fsica b) Inica c) Hidrofbica d) Afinidad.
312
CAPTULO 7.
ADSORCIN.
/?\ A /K /N
Carbn activado Slca gel
Figura 7.3: Adsorbentes fsicos. ms utilizado en bioseparaciones es el carbn activado (vegetal), y en menor grado la silica gel (Figura 7.3). Tambin son utilizadas como adsorbentes resinas sintticas. Las resinas no polares derivadas del estireno-divinilbenceno son utilizadas para la adsorcin de solutos no polares a partir de solventes polares. Las resinas basadas en esteres acrlicos tienden a ser ms efectivas para remover solutos polares de solventes no polares. Los adsorbentes utilizados en intercambio inico pueden ser inorgnicos o sintticos (Figura 7.4). Los inorgnicos como las zeolitas son poco utilizados. Los adsorbentes inicos sintticos estn formados por matrices de polmeros unidos lateralmente. A la matriz se le unen grupos funcionales que le dan la capacidad de intercambio inico. Las resinas de estireno-divinilbenceno catinicas se producen en un paso por accin de un cido sobre el grupo'benceno. Las amnicas se producen en dos pasos: Primeramente, se produce una cloro-metilacin del benceno. En el segundo paso, se efecta una animacin. Las matrices de celulosa activada tambin son muy utilizadas para adsorcin por intercambio inico. En la adsorcin por afinidad el adsorbente consta de dos partes, el soporte o matriz y el ligando. El ligando se une a la matriz por medio de un brazo que evita impedimentos estricos en un determinado arreglo (Figura 7.5). Las matrices utilizadas en la adsorcin por afinidad son fabricadas de: celulosa, celulosa modificada, poliacrilamida (o derivados), dextrano y agarosa (Figura 7.6). En la Tabla 7.1 se presentan algunas caractersticas de estas matrices.
7.2.
FUNDAMENTOS
313
A A I
Zeolitas
/\ /\
Figura 7.4: Tipos de adsorbentes de intercambio inico: a) Adsorbentes inorgnicos.
-CH-CH,-
CH-CH,
-CH-CH,-
i
H2S04 Clorometilacin
I
Resina catinica
SO;H*
I Aminacin N (CH3)3 N (CH3)2
Resina anin ica
CH3
CH2N - CH3Cr CHN - CHCr
CH,
Base dbil
Figura 7.4: Continuacin... b) Adsorbentes de intercambio inico derivados del estireno-divinil benceno.
314
CHjOH -O
OH
~VOH
OH OH
x^
O_
CHoOH
CH2OR
R = -PO 3 H 2 -SO2OCH2CH2NH2 - CH2COOH -CH2CH2NR2 -CH 2 CH 2 NR 3 *X' -C-CH 2 -CH 2 -COOH
Figura 7.4: Continuacin... derivados de celulosa
c) Adsorbentes de intercambio inico
A, CH, >, , x , ^, , ^, v x,NC, v Nc, N<,, v N;txc, Y NcHr^"LP
Figura 7.5: Adsorcin por afinidad, a) Soporte de slice b) ligando fijo c) ligando mvil parte hidrofbica d) ligando mvil parte hidroflica e) piridina f) protema Fuente: Torres et al, 1988.
Reproducida con el permiso de Academic Press. Copyright 1988. Todos los derechos reservados.
7.2.
FUNDAMENTOS
315
Soporte (marca)
Matrices comerciales Estructura qumica CH2OH O
Agarosa
OH
Materiales silceos (vidrio de poro controlado. Spherosil)
O Si OH
O Si OH I O
Poliacrilamida rv(CH2 CH ) Ofe CH C (CH2 CH
I C= 0 I
NH
NH
f NH
C= 0
Copolmero de Hidroximetil metacrilado
CH2 1 -C 1
-CHz
COOOH2CH2OH
CH CH3 1 1 C CH2 C CH2 C 1 1 1 OOOOHZCH2OH CO CO 1 1 0 o 1 CH2 OH2
CH2 1 O 1 CO
-C 1
-CHz
CCH3
COOOH2CH2OH
1 1
CH2 1 0 1 CO CH2 C CH2 1 COOOH2CH2OH
C CH21
CH3
CH2OH Celulosa
OH
Figura 7.6: Matrices de adsorcin por afinidad. Fuente: Yarmush Colton, 1985.
Reproducida con el permiso de Elsevier Science Inc. Copyright 1985. Todos los derechos res vados.
316
CAPTULO 7. Tabla 7.1: Propiedades de matrices. Propiedad Estabilidad Reactividad Permeabilidad Especificidad No. de ligandos Costo Slice buena alta buena baja bajo bajo Material Celulosa | Poliacrilamida buena buena alta alta buena baja baja baja bajo alto medio bajo
ADSORCIN.
Agarosa buena baja buena alta alto alto
Existen varios procedimientos para inmovilizar el ligando en la matriz, los cuales dependen del tipo de grupo funcional sobre la matriz, del ligando y de la estabilidad de stos. Generalmente los grupos funcionales utilizados son hidroxilos, aminos y carbonilos. En la Figura 7.7 se presenta uno de los procedimientos utilizados para activar una matriz de agarosa, lo cual se efecta mediante dos pasos qumicos. Inicialmente se activa la matriz con bromuro de ciangeno. Posteriormente se puede unir un radical por medio de un grupo amino para formar un derivado de la isourea. Los ligandos son molculas de alta afinidad por el soluto de inters y pueden ser de varios tipos (Figura 7.8): - Bioespecficos estrictos: Sustratos para adsorcin de enzimas. Antgenos para adsorcin de anticuerpos. Sondas para obtencin de cidos nucleicos. Protenas acarreadoras para obtencin de hormonas. - Bioespecficos amplios: Cofactores y lectinas. - Pseudoespecficos biolgicos: Aminocidos. - Pseudoespecficos no biolgicos: Colorantes y Metales.
7.2. FUNDAMENTOS
317
OH
BrCN.
- H _ =
Ester de aanato
24- c> C=NH ||_(X>
Amidocarbonato
o
^-o c NH Carbamato
b)
'/A
3CN + NHjR-
Figura 7.7: a) Activacin de matrices con bromuro de ciangeno. b) Reaccin del ster de cianato con un derivado amino para obtener un derivado de isourea. Fuente: Yarmush y Colton, 1985.
318
CAPTULO 7.
ADSORCIN.
ugandos Pseudobioespeficos
Figura 7.8: Tipos de ligandos en adsorbentes de afinidad. Adaptada de: Vijayalakshmi, 1989.
7.2. FUNDAMENTOS
319
7.2.3
Relaciones de Equilibrio
El anlisis de los procesos de adsorcin requiere de datos de equilibrio que se expresan normalmente como isotermas de adsorcin. Las isotermas son parte esencial para modelar la adsorcin y por lo tanto para el diseo, clculo de eficiencias y costos de la adsorcin. Las isotermas nos permiten estimar el grado de purificacin que puede ser alcanzado, la cantidad de adsorbente requerido, y la sensibilidad del proceso respecto a la concentracin del producto. En los procesos de adsorcin que se presentan en las bioseparaciones existen cuatro tipos bsicos de isotermas (Figura 7.9): la isoterma de Freundlich, la lineal, la de Langmuir y la irreversible (Hall et a/, 1966). Las isotermas tipo Freundlich normalmente se presentan en sistemas-' de adsorcin por intercambio inico; la adsorcin por afinidad generalmente presenta isotermas tipo Langmuir. La isoterma lineal es menos comn, pero puede ser utilizada para aproximar las otras isotermas en la regin de baja concentracin de soluto. Las isotermas irreversibles son caractersticas de sistemas altamente especficos. La isoterma de Freundlich se describe por medio de una ecuacin exponencial emprica de la siguiente forma:
q = Ky"
(7.1)
donde q es la cantidad de soluto adsorbida (incluyendo el soluto en el lquido de los poros del adsorbente) por cantidad de adsorbente, y es la concentracin de soluto en la solucin, n es una constante adimensional y K es una constante cuyas unidades dependen de n. Tanto K como n deben ser obtenidas experimentalmente. En este tipo de experimentos generalmente se pone en contacto cantidades iguales del adsorbente con soluciones de soluto de diferentes concentraciones y se mide las concentraciones una vez alcanzado el equilibrio. Las constantes de la isoterma de Freundlich pueden ser obtenidas por medio de una grfica log-log de los datos experimentales, determinndose K con la ordenada en el origen y n de la pendiente de la recta que se obtiene. Cuando las isotermas de adsorcin son cncavas hacia el eje de las abcisas o sea cuando n < 1, la isoterma se llama favorable, ya que se puede obtener una buena adsorcin an a concentraciones bajas de
320
CAPTULO 7. ADSORCIh
Freundlich (comn ^ emprica)
Figura 7.9: Isotermas de adsorcin ms comunes. Fuente: Belter et a 1988.

Reproducida con el permiso de John Wiley and Sons. Copyright 1988. Todos los derech reservados.
7.2. FUNDAMENTOS
321
soluto. Las isotermas concavas hacia el eje de las ordenadas o sea para n > 1, se llaman desfavorables. Las isotermas lineales pueden ser descritas por la ecuacin de una recta que pasa por el origen de la forma:
9 = Ky (7.2) en este caso los datos experimentales se grafican en coordenadas cartesianas para determinar K. Las isotermas tipo Langmuir estn dadas por expresiones de la siguiente forma:
q=
Vy
i-? 3) Q^ (7
donde q0 es la capacidad mxima del adsorbente y K es la constante de equilibrio de desorcin. Estas constantes deben ser obtenidas experimentalmente. En este caso es preferible manejar los datos experimentales con la forma reciproca de la ecuacin 7.3:
<io y
q0
de tal manera que en una grfica cartesiana de l/q vs 1/y, se puede obtener una recta de pendiente Kd/q0 y ordenada en el origen l/q0- La; unidades de q0 y K de esta isoterma son las mismas que las de q y y respectivamente. Un caso particular de la isoterma de Langmuir se presenta cuand< K es muy pequea y la adsorcin es irreversible. En este caso q = q para cualquier valor de y. La forma de las isotermas de Langmuir puede explicarse mediant un mecanismo terico bien fundamentado. Se propone que sobre la su perficie del adsorbente existen sitios especficos en los que las partcula de soluto se unen reversiblemente. En un momento dado durante 1 adsorcin, coexisten sitios ocupados por soluto y sitios vacos. La ac sorcin en el sentido directo es proporcional a la concentracin de solut y a la concentracin de sitios vacios. En el sentido inverso la adsorci es proporcional a la concentracin de sitios ocupados. De acuerdo a lo anterior, la adsorcin puede ser expresada en forrr de una ecuacin qumica de la siguiente forma:
322
soluto -f sitios vados ^ sitios ocupados
(7-5)
En el equilibrio se puede definir una constante de equilibrio de desorcin K de acuerdo con la siguiente expresin: k-2 [soluto][sitios vados] I<d - -j- = 7-rr. y; KI [sitios ocupados] (7.6)
El nmero total de sitios activos para la adsorcin es constante e igual al nmero de sitios vacos ms los sitios ocupados o sea: [sitios totales] [sitios vados] -j- [sitios ocupados] (7.7)
Combinando las ecuaciones (7.6) y (7.7) se puede llegar a la expresin: .... [sitios total es][soluto] [sitios ocupados] : 1 F J = Kd + [soluto]
v(7.8 l
debido a que q es proporcional a la concentracin de sitios ocupados y q0 a la concentracin de sitios totales, la ecuacin (7.3) puede ser obtenida a partir de la expresin (7.8), es decir este mecanismc fundamenta la expresin de Langmuir. Las isotermas de intercambio inico pueden ser racionalizadas er forma anloga. Sin embargo, en este caso los sitios de adsorcin en ur momento dado, o estn ocupados por el ion de soluto o estn ocupado; por el ion que normalmente est unido a la superficie del adsorbente La expresin final depende del nmero de iones de soluto que se nter cambian por ion de adsorbente. En el caso de un intercambio monovalente caracterstico de la resinas sintticas la adsorcin puede ser expresada como:
Na+ + HR ^ NaR + //+
(7.9
donde HR representa los sitios de intercambio inico en estado or mal del adsorbente, y NaR representa los sitios de intercambio una ve que ha sido intercambiado el ion de soluto. En equilibrio la constant de desorcin est dada por:
7.2. FUNDAMENTOS [Na+][HR] [NaR][H+]
32
(7.H
La concentracin de radicales R totales en la superficie del adso bente est dada por:
[R~] = [NaR] + [HR]
(7.1
Combinando las ecuaciones (7.10) y (7.11) se puede obtener la cuacin:

[NaR] =
[RT][Na +1 Kd[H+] + [Na-
(7.1:
como q es proporcional a [7Va.] y q0 es proporcional a [R ], adsorcin inica monovalente puede ser descrita por medio de una e presin tipo Langmuir, siempre y cuando la concentracin [H+] pe manezca constante; como en el caso de que se utilice una soluci< amortiguadora. En el caso de adsorciones inicas no monovalentes el anlisis anlo frecuentemente conduce a expresiones tipo Freundlich. Ejemplo 7.1.- Adsorcin de Albmina de Suero de Bovii (ASB) a pH = 7 en un adsorbente aninico Q-Sefarosa. Los datos de equilibrio de la adsorcin de ASB en Q-Sefarosa presentan en la Tabla 7.2. Encontrar la expresin matemtica de la isoterma que mejor aju los datos. Solucin: La solucin se presenta en forma grfica en la Figura 7.10. acuerdo con la Figura 7.10a los datos no se ajustan a una isoten lineal. La grfica log-log de los datos (Figura 7.10b) no produce u linea recta, entonces la isoterma no es del tipo Freundlich.
324
CAPTULO 7. Tabla 7.2: Datos de equilibrio. y mg/ml q mg/ml Log(y) 0.05 30.00 -1.30 43.70 0.10 -1.00 0.20 56.53 -0.70 1.00 73.85 0.00 2.00 76.81 0.30 4.00 78.37 0.60 Log(q) 1.477 1.640 1.752 1.868 1.885 1.894
ADSORCIN
i/y
20.00 10.00 5.00 1.00 0.50 0.25
i/q
0.0333 0.0229 0.0177 0.0135 0.0130 0.0128
Fuente: Draeger y Chase, 1990.

Reproducida con el permiso de Elsevier Science Inc. Copyright 1990. Todos los derechos rese vados.
Los datos ajustan la isoterma de Langmuir (Figura 7.10c). La o denada en el origen es 0.0125, por lo que q0 = 80 mg/ml. La pendient de la recta es igual a 1.0375 x 10~3, entonces K = 0.083 mg/ml.
7.2.4
Cintica de la Adsorcin
El estudio de las isotermas de adsorcin nos permite determinar par un sistema soluto-adsorbente dado, el grado de separacin que pued ser logrado y la sensibilidad del proceso con respecto a la concentraci del soluto. Sin embargo, para el desarrollo del modelo de la adsorci es necesario poder establecer, mediante el empleo de coeficientes d transferencia de masa, la velocidad de la adsorcin o el tiempo necesari para alcanzar una cierta separacin (Figura 7.11). En el caso que la adsorcin sea bastante rpida, el sistema pe manecer esencialmente en equilibrio y el modelo se simplifica. E la mayora de los casos las interacciones soluto-adsorbente no ocurre instantneamente. La velocidad efectiva de la adsorcin depende tanto de las cond cienes de operacin (flujo, temperatura, composicin y presin), con de la configuracin del sistema (intermitente, columna, etc.) y d tamao del equipo donde se realizar la operacin. El estudio de an
7.2.
FUNDAMENTOS
32
80
70
60 q (mg/ml)
50
40
30
20
10
0.00
1.00
2.00
y (mg/ml)
3.00
Figura 7.10: Ejemplo 7.1.- Ajuste de datos, a).- Isoterma lineal

2.0
1.8
log(q)
1.6 1.4 1.2
1.0
-1 50
-1.00
-0.50
log(y)
0.00
0.50
Figura 7.10: Continuacin... b).- isoterma de Freundlich.
326
0.030
0.025
0.020
1/q
0.015
0.010
0.005
0.000
I 10
I/y
I 15
Figura 7.10: Continuacin...c).- Isoterma de Langmuir.
7.2.
FUNDAMENTOS
327
Relaciones de Equilibrio Coeficientes de T. de Masa
Modelo del Adsorbedor
Simulacin
Perfiles de Concentracin Dinmicos
Mtodo de Operacin 'Concentracin Alimentacin Rujo Tamao Partcula Temperatura
Tiempo del Cido Productividad
Figura 7.11: Diseo de adsorbedores. Adaptada de: Wang, 1990.

Reproducida con el permiso de Marcel Dekker Inc. Copyright 1990. Todos los derechos rese vados.
328
CAPTULO 7. ADSORCIOh
bos efectos se divide en dos grandes conceptos : - Los mecanismos de transporte (fsicos y qumicos). - Los efectos de mezclado. Mecanismos de Transporte El estudio de los mecanismos de transporte consiste en establecer la expresiones de la rapidez de la adsorcin a nivel local, es decir con siderando el comportamiento de una partcula de adsorbente o un ele ment de volumen de un sistema. En los procesos de adsorcin se utilizan materiales porosos que ofre cen una gran rea por unidad de volumen con el propsito de recupera la mayor cantidad de soluto posible en un volumen dado. Para que un partcula de soluto pueda ser adsorbida en la superficie de un poro de adsorbente, el soluto tiene que pasar del seno de la fase lquida a 1 superficie del adsorbente (Figura 7.12). Varias resistencias al movimiento del soluto existen en este preces que pueden visualizarse principalmente como: - Resistencia de la pelcula del lquido que rodea el adsorbente.- Pr mero el soluto difunde desde el seno del lquido a travs de 1 pelcula de lquido que rodea a la partcula de adsorbente. - Resistencia a la difusin en el seno del adsorbente.- En algunos tipc de adsorbentes el soluto difunde a travs del seno del adsorbent< A este fenmeno se le conoce como difusin en la fase del adso bente. - Resistencia a la difusin dentro del poro.- Debido a que el rea de 1 superficie interior del poro es mucho mayor que la superficie ext< rior, generalmente la adsorcin se efecta principalmente denti del poro, por lo que el soluto debe difundir a travs del lquido i interior de los poros. - Resistencia a la reaccin en la superficie.- El soluto una vez situad en el sitio de adsorcin se une a ste por medio de una reaccic de superficie, la cual es un proceso finito pero generalmente m rpido que los procesos anteriores.
7.2.
FUNDAMENTOS
32
a)
Resistencia a la difusin al interior del poro
d)
Resistencias de la superficie Resistencia de la pelcula de lquido
Figura 7.12: Resistencias en la adsorcin. Adaptada de: Levensj 1962.

Reproducida con el permiso de John Wiley and Sons. Copyright 1962. Todos los den reservados.
330
CAPTULO 7. ADSORCIN
Control de la resistencia en la pelcula.- Las resistencias an teriores no actan slo en serie o en paralelo como puede apreciarse ei la Figura 7.12. Particularmente, la resistencia de la difusin en el por* no puede relacionarse directamente con las otras dos. Generalmente 1, resistencia de la pelcula o la del poro o una combinacin de ambas controla la velocidad de adsorcin local. Cuando la resistencia de la pelcula es mucho mayor que la de poro o la de la reaccin de superficie, la velocidad de adsorcin est; controlada a nivel local por el flujo del soluto a travs de la pelcul que rodea al adsorbente. En este caso la expresin de la velocidad d< adsorcin puede expresarse como: R=kLa(y-y*) donde: &,: Coeficiente de transferencia de masa. [M/(TL2M/L3 lquido)] (7.13
a: rea de adsorbente por unidad de volumen de lecho (adsorbente 3 lquido). [L2/L3]. y: Concentracin de soluto en el seno de la fase lquida. [M/L3].
y*: Concentracin hipottica de soluto en el lquido, en equilibrio cor la concentracin de soluto en el adsorbente. [M/L3]. R: Velocidad de adsorcin referida al volumen del lecho (adsorbente y solucin). [M/L3t]. (En la literatura tambin se utiliza R' = R/e velocidad de adsorcir. por volumen del lquido). El parmetro a puede ser correlacionado con la porosidad del leche 6 (volumen del lquido sin incluir el lquido de los poros/volumen de lecho) y el dimetro de la partcula de adsorbente dp de acuerdo a le expresin: (7.14)
p
7.2.
FUNDAMENTOS
La resistencia de la pelcula por si misma rara vez controla la rapidez de la transferencia de masa, excepto en los casos en que la partcula de adsorbente es pequea y la difusividad en el poro grande. Para sistemas de adsorcin en columnas, fc generalmente se puede correlacionar con una expresin de la forma: Sh = Cl-i- C2(Re)a(Sc)b (7.15;
donde Ci, ^2, a Y b son constantes, y Sh, Re y Se, son los nmero adimensionales de Sherwood, Reynolds y Schmidt dados por las siguien tes relaciones:
Sh =
kLdf
(7.16
(7.17
(AB En el caso de protenas se han utilizado las siguientes correlacione para estimar &,: Para tanques agitados:
-2/3
7 18
dp Para columnas:
'
\PLÂB
(7.19
S/i-2-f 1.45/?e1/2Sc1/3 estimndose la difusividad mediante la expresin:

= 9.4 x 1(T15
T
(7.2C
(7.21
donde: AB'- Difusividad. [m2/s]. : Viscosidad. [Kg/m s].
332 T: Temperatura. [K]. MA\ Peso molecular soluto.
CAPTULO 7. ADSORCIN
Control de la difusin del soluto en el seno del adsorbente.La difusin en la fase slida del soluto una vez que ha pasado del sene del lquido a la fase slida, se presenta en algunos slidos homogneos permeables como las resinas que se utilizan en intercambio inico o en adsorbentes con porosos cubiertos con pelculas mviles, o en lquidos utilizados para impregnar la partcula porosa. Considerando una geometra esfrica uniforme el balance de soluto en la partcula est dado por:
donde: Da: Difusividad efectiva del soluto en la fase slida. [(L2/t)]. r: La coordenada radial al interior de la partcula. [L]. q: Concentracin de soluto en la fase slida. [M/L3].
La velocidad de transferencia de masa entre las fases puede ser expresada por la ley de Fick como: R=-aDs^\r=Ra (7.23) or donde Ra es el radio externo de la partcula. La ecuacin (7.22) suele ser aproximada utilizando una fuerza impulsora lineal de la siguiente forma:
| ? = ^sksa(q* - q) (7.24)
q* es una concentracin hipottica de equilibrio con la concentracin de soluto en el seno de la fase lquida, ips es un factor de correccin
>2.
FUNDAMENTOS
333
Dimensional que se introduce al linearizar la expresin. ks es el coeficiente de transferencia de masa (L 3 (total)/rea-tiempo). Con la linearizacin anterior la expresin de la velocidad de transferencia de masa por unidad de volumen de lecho es: R= (1 - e)i>sksa(q* - q) k*a se correlaciona con la difusividad mediante la ecuacin: (7.25)
k<,a =
600,
(7.26)
Control de la difusin del soluto en la fase lquida al interior de los poros.- Cuando la velocidad de adsorcin est controlada por la difusin del soluto al interior de los poros de la partcula de adsorbente, hasta el sitio de adsorcin, el balance de soluto al interior de la partcula est dado por la expresin:
o, ot
\ dr2
r or
-d-.)f
(7.27)
yt-: Concentracin de soluto en la fase lquida al interior del poro. [M/L3]. qi\ Concentracin de soluto en la fase slida. [M/L3].
Dp: Difusividad efectiva del soluto al interior del poro. [ L 2 / t ] . e,-: Porosidad de la partcula al soluto de inters. [L3/Z/3]. Para el caso en que la acumulacin del soluto al interior del poro sea mucho menor que la velocidad de la adsorcin la ecuacin (7.27) puede ser escrita como:
|
dt
<9r2
2% r dr
(7.28)
La velocidad de transferencia de masa entre las fases puede ser expresada por la ley de Fick como: r=Ra
334
CAPTULO 7.
ADSORCIN.
para lquidos la difusividad Dp puede ser expresada como: Dp = ^^

*o
(7.30)
donde Y0 es la tortuosidad del adsorbente (una medida de la estructura de los poros) y DAB es la difusin molecular del soluto en un lquido libre de adsorbente. La ecuacin (7.28), puede aproximarse utilizando una fuerza impulsora lineal como la siguiente:
VA
de tal manera que,

r) H = ysp'vp ^*f *j) (<-! <tc\\ (7.32)
donde q* es una concentracin hipottica de equilibrio con la concentracin de soluto en el seno de lquido , q es la concentracin promedio de soluto en el adsorbente, qx es la concentracin de la fase slida en equilibrio con la concentracin y A de la solucin que se va a tratar y ifrp es un factor de correccin por linearizacin. kpa puede correlacionarse con la difusividad efectiva del poro mediante la siguiente expresin:
f^ (7.33)
Control de la reaccin de superficie.- Generalmente la reaccin de adsorcin en la superficie del adsorbente es mucho ms rpida que los otros mecanismos y rara vez es el mecanismo controlante. En las expresiones cinticas ms utilizadas la reaccin de superficie es tratada como una reaccin qumica, reversible o irreversible, de un cierto orden. Dos expresiones comunmente utilizadas principalmente para sistemas de intercambio inico, son: Cintica reversible de primer orden: R = e(kiy - k2q) (7.34)
7.2.
FUNDAMENTOS
Cintica reversible de segundo orden:

R -
(7.35;
donde k\ y k% son las constantes cinticas de adsorcin y desorcin respectivamente. q0 es la capacidad mxima de adsorcin del adsor bente. Efectos de Mezclado La velocidad de adsorcin efectiva tambin puede disminuir por efecto; de un mezclado imperfecto. Esta situacin es caracterstica de columna; largas donde se presentan irregularidades en el flujo (canalamiento) o ei el mezclado (espacios muertos, difusin molecular o dispersin axial). En la construccin de algunos modelos de adsorcin no se considerai los efectos de mezclado y de flujo no ideal. Sin embargo, debido . que en el proceso de escalamiento de columnas este efecto puede se importante, es necesario considerar algunos aspectos fundamentales d este fenmeno. Uno de los modelos ms utilizados para describir la desviacin de comportamiento ideal del flujo al interior de columnas, es el modelo d flujo tapn con dispersin (Figura 7.13), donde los efectos de la dis persin axial debida a remolinos y de la difusin molecular, se agrupa! en el concepto del coeficiente efectivo de dispersin axial, en funcin d( cual se puede definir un coeficiente aparente de transferencia de mas dado por:
(7.36
donde: E: Es el coeficiente de dispersin axial. [L2/t]. v: Es la velocidad superficial de flujo. [L/t]. Es conocido que para flujo laminar de lquidos en lechos empacadc (caso ms comn) el nmero de Reynolds basado en el dimetro de h partculas del lecho es menor a 10. Bajo esta consideracin el nmei
336
CAPTULO 7. ADSORCII
Perfil plano de velocidad
Fluctuaciones debidas a difusin molecular y turbulencia
Figura 7.13: Modelo de flujo tapn con dispersin. Adaptada de: L venspiel, 1962.
Pe:
0.1
1000
2000
Re =
Figura 7.14: Dispersin en lechos empacados. Adaptada de: Leven; piel, 1962.
7.2. FUNDAMENTOS
337
de Peclet (el cual es una medida del grado de dispersin en la columna) toma un valor constante de 2 (Figura 7.14) entonces, Pe = ^ = 2
hi
(7.37)
donde Pe es el nmero de Peclet (adimensional). Las ecuaciones (7.36) y (7.37) permiten obtener una expresin para el coeficiente aparente de transferencia de masa por dispersin, de tal manera que la expresin de la velocidad de adsorcin se puede aproximar a: R = kda(y - y*) (7.38)
Resistencias Combinadas En la elaboracin de un modelo cintico se puede suponer que una resistencia a la transferencia de masa es la controlante, lo cual simplifica la solucin matemtica del modelo de adsorcin. Sin embargo en algunos sistemas, la cintica de la adsorcin puede ser descrita en forma ms adecuada utilizando un modelo donde la combinacin de resistencias (por ejemplo pelcula y poro) describen en forma ms precisa la cintica. En estos casos, la combinacin de resistencias se presenta por medio de un coeficiente de transferencia de masa global que agrupa el efecto de las resistencias individuales. Para el establecimiento del coeficiente global de transferencia de masa es necesario fijar la forma en que las resistencias individuales estn relacionadas: en serie o en paralelo. Si se considera como ejemplo el caso de la resistencia de la pelcula y la del poro actuando en serie, para el clculo del coeficiente global se deben sumar los inversos de los coeficientes individuales (para equilibrios lineales).
~^ = r~ + r
( T ' 39 ^
donde K0 es el coeficiente global de transferencia de masa referido a la fase lquida.
338
CAPTULO 7.
ADSORCIN.
<^_ _^>
<=__
_-->
0
0
Q(~\
0*.
4-
Adsorbente
0
O
0
Oo
O4- Ad Adsorbente
0
o 0 0
bo
Solucin
0 o
4- So
cd"^ O
00
0 00 o O o
(a) Tanque agitado intermitente
0 O
o*"
(b) Tanque agitado continuo
Figura 7.15: Sistemas de adsorcin tipo tanque agitado.
Las operaciones de adsorcin pueden llevarse a cabo en tanques agitados, en forma intermitente o continua (Figura 7.15). Este tipo de sistemas son poco usados a nivel industrial por incosteables, pero resultan muy tiles en la experimentacin de laboratorio para la obtencin de datos de diseo. Los equipos industriales de adsorcin ms empleados son los tipo columna de lecho fijo. Estas columnas pueden ser operadas simulando un sistema a contracorriente mediante el sistema de carrusel (Figura 7.16). En este tipo de arreglo se cuenta con varias columnas operando en serie. Cuando se agota la columna que est siendo alimentada, se avanza la posicin de la alimentacin a la siguiente columna, simulndose una operacin a contracorriente. La columna agotada se descarga y posteriormente se convierte en la columna final de la serie. En los equipos de lecho fluidizado las partculas de adsorbente se suspenden mediante un flujo ascendente de la solucin de inters. Este tipo de arreglo se considera til para el tratamiento directo de caldos
7.3. EQUIPOS DE ADSORCIN

F
XA'
339
oooo oooo oooo oooo oooo oooo oooo oooo oooo
y(Ut)
a) Columna de lecho fijo Solucin Alimentacin
"1
A
~l
B
1 c L_
~l
r
E
de
lavado
Qdol
L_
L_
^^^
Se)lucn as otada
Alimentacin Solucin de lavado
Cido2
T Producto
Solucin agotada
;?dn0ae Alimentacin
Cido3
77
Solucin Producto agotada b) Sistema de Carrusel
Figura 7.16: Adsorcin en columnas.
340
con slidos en suspensin, suprimiendo la operacin slido-lquido previa a la adsorcin. Con esta misma intencin existen desarrollos donde se emplea una combinacin de un tanque adsorbedor y uno desorbedor operando en forma continua (Figura 7.17).
7.3. EQUIPOS DE ADSORCIN

Solucin agotada
341
y
Slidos celulares
Altura de lecho expandido Altura de lecho sedimentado -
Solucin de lavado
a) Adsorcin en lecho fluidizado
F
Alimen lactn
Solu ande lavUlO
Solu cin de e ucin
Etapa de adsorcin
0 o dbo oo
0 0 n
O o^cT O~o O 0^>

IX
F+
'
<PoOo~ J> OOoO "M f
XI
0 o d0 oV o
0 0 n
Etapa de desorcin
F Producto
b) Adsorcin continua con recirculacin de adsorbente
Figura 7.17: Adsorcin en caldos completos. Adaptada de: Gailliot et a/, 1990 y Pungor et a/, 1987.
Reproducida con el permiso de la American Chemical Society. Copyright 1990 y con el permiso de Nature Publishing Co. Copyright 1987. Todos los derechos reservados.
342
CAPTULO 7. ADSORCIN
7.4
Diseo de Adsorbedores
El diseo de adsorbedores mediante modelos (Figura 7.11) permite estimar algunos parmetros importantes como: - Concentracin de soluto al final de la adsorcin (prdidas o eficiencia). - Tiempo necesario para llevar a cabo el proceso. - Cantidad de adsorbente necesario. - Etapas necesarias o longitud de una columna. Como se estableci en la introduccin de este captulo la formulacin del modelo requiere de los datos de equilibrio de sistema, las expresiones de la velocidad de adsorcin, los balances y las condiciones de frontera. En las secciones 7.2 y 7.3 se han revisado los primeros dos aspectos. En esta seccin se revisa la integracin de estos cuatro aspectos en el diseo de arreglos especficos de sistemas de adsorcin, debido a que los balances y condiciones de frontera son caractersticos de cada tipo de arreglo. En general los arreglos ms comunmente empleados son: El tanque agitado intermitente. El tanque agitado con alimentacin continua. Las columnas empacadas de lecho fijo.
7.4.1
Adsorbedores Tipo Tanque Agitado Intermitentes
En una operacin de adsorcin tipo tanque agitado intermitente el adsorbente se agrega a la solucin dentro de un tanque, se agita la suspensin y posteriormente se separa la fase lquida y slida. Las operaciones de este tipo son utilizadas cuando la capacidad del adsorbente es muy alta. A escala industrial estas operaciones son poco utilizadas por incosteables. Sin embargo, gran parte de los datos de equilibrio o las
7.4. DISEO DE ABSORBEDORES
343
cinticas de adsorcin para otro tipo de diseos son obtenidos en este tipo de arreglos. Es importante mencionar que en algunos casos, las operaciones de lavado y elucin se realizan en tanques agitados en forma intermitente. Considrese una operacin tipo tanque agitado intermitente. Si se proporciona un tiempo de contacto adecuado se alcanza el equilibrio entre las fases. Por otro lado, si el tiempo de contacto es menor que el necesario para alcanzar el equilibrio la operacin no ser 100 % eficiente. En el caso de adsorciones lentas, una alternativa de diseo es utilizar curvas de equilibrio prcticas que tomen en cuenta directamente la eficiencia de etapa, considerando tiempos de contacto menores a los del equilibrio real. En el anlisis que sigue se considera que cada etapa es una etapa ideal, por lo tanto el adsorbente y la solucin estn en equilibrio al trmino de la operacin (o bien una etapa real si se utilizan curvas de equilibrio modificadas). Bajo esta consideracin el anlisis de este tipo de operacin se simplifica, y slo requiere de la combinacin de Jas expresiones de equilibrio y los balances de masa, ya sea en forma grfica o en forma analtica. La expresin de equilibrio es la isoterma que depende de cada tipo * de adsorcin, por ejemplo: q = Kyn (7.40)
El balance de masa del soluto de acuerdo a la Figura 7.18 puede ser expresado como: FyA + SqA = Fyi + Sq2 (7.41)
donde F es la cantidad de la fase lquida y S la cantidad de adsorbente (se suponen constantes como es el caso para soluciones diluidas de caldos biolgicos), y A y 2/2 son las concentraciones de soluto en el lquido al inicio y final del proceso, respectivamente. Asimismo, q y <?2 son las concentraciones de soluto en el adsorbente al inicio y final del proceso. La ecuacin (7.41) puede arreglarse para expresarse como la ecuacin de una lnea recta, llamada linea de operacin,
344
CAPTULO 7. ADSORCIN
ô o o 0 0'0 o db o O 0 0 OO
t=0 (a)
Sq.
'::.
t=t (b)
Sq
Curva equilibrio
y
(c)
Figura 7.18: Adsorcin intermitente.
92 = qA +
- 2/2)
(7.42)
La solucin grfica de las ecuaciones (7.40) y (7.42) se representa en la Figura 7.18c, donde la curva de equilibrio utilizada para la ilustracin refleja una adsorcin favorable (n < 1). La interseccin de la curva de equilibrio con la lnea de operacin permite calcular las concentraciones de equilibrio (7/2, #2) al final del proceso. Ejemplo 7.2.- Adsorcin de estreptomicina. La estreptomicina se recupera utilizando adsorcin por intercambio catinico. Se ha observado que 1.56 g de este antibitico pueden ser adsorbidos por cada gramo de resina. Debido a que la curva de equilibrio es muy favorable para este proceso; slo cuando la concentracin en la solucin es muy baja la concentracin del soluto en el adsorbente
7.4. DISEO DE ADSORBEDORES

es
345
menor de este valor. Estimar la cantidad de resina necesaria para procesar 100,000 / de un caldo de fermentacin que contiene 6 g/l de estreptomicina en una operacin intermitente.
Solucin:
El balance de masa para esta operacin es:
S(q-2 - QA) = F(yA - y2)
con los valores: <M = 0 q2 = 1.56 g/g

7/2 = 0
se puede calcular S:
s = s =
S
FyA
<12
100,000 1x6 g/l
1-560/0 384,615 0 de adsorbente.
Como puede observarse se requiere una gran cantidad de adsorbente. Esto implica que sera adecuada una operacin continua , sin embargo el problema que significa el movimiento continuo de los slidos, conlleva a utilizar con ms frecuencia operaciones semi-continuas. Ejemplo 7.3.- Adsorcin de fenilalanina. La adsorcin de fenilalanina en un adsorbente de poliestireno (amberlita XAD-2) puede ser descrita por la siguiente isoterma: q = 6.1 x 10~V'9 donde q tiene unidades de g/g y y de g/l. Si se ponen en contacto 300 g de adsorbente con 2 litros de solucin que contiene 15 g/l de fenilalanina, estimar:
346
CAPTULO 7. ADSORCIN
o.io
0.08
0.06
q (g/g)
0.04
0.02
(15.0)
o.oo
i
10
I 12
I 14
i
16
Figura 7.19: Solucin grfica del Ejemplo 7.3. a) Las composiciones en el equilibrio. b) El porcentaje de recuperacin. Solucin: Utilizando el mtodo grfico el balance de masa para esta operacin (ecuacin 7.42), permite encontrar la ecuacin de la lnea de operacin.
a) La curva de operacin y de equilibrio se grafican en la Figura 7.19, el punto donde intersectan representa las condiciones al final de la operacin, por lo tanto:
92
= 0.0420/0
= 8.6 g/l
2/2
7.4. DISEO DE ABSORBEDORES b) El porcentaje de recuperacin puede ser expresado como:

FyA -
347
FyA y A -y2
15-8.6 ~~l^~ RE = 43 %
RE =
Ejemplo 7.4.- Adsorcin de Desacetilcefalosporina C (DACC), utilizando amberlita XAD-2 modificada. La principal impureza en el proceso de obtencin de cefalosporina C es la DAC-C. La isoterma de adsorcin de esta impureza en amberlita XAD 2 CHi CH< Br, a un pH de 2.8, est dada por la siguiente expresin:
donde q est en g/g y y en g/l. Si se utiliza un proceso intermitente en equilibrio, qu cantidad de f h , adsorbente es necesario agregar a 2 litros de una solucin de DAC - C ; : con una concentracin de 2 g/l, para recuperar el 90 % de la impureza?. Solucin: Debido a que la isoterma es lineal se facilita una solucin analtica al problema. Del balance de masa se obtiene:
en el equilibrio:
92
- 0.0877/2
348 y de acuerdo a la recuperacin deseada,
CAPTULO 7. ADSORCIN
Combinando las dos expresiones anteriores se puede encontrar la interseccin de la curva de operacin con la de equilibrio, #2 = 0.0174 g de soluto g de adsorbente y-2 = 0.2 g de soluto/litro del balance de masa, S = 206.9 g En la adsorcin intermitente puede considerarse el proceso de transicin del sistema de su estado inicial hasta su estado final. Este proceso est descrito por el modelo en estado no estacionario del proceso, el cual como ya se ha mencionado depende del mecanismo controlante de la adsorcin. En el siguiente ejemplo se revisan algunos de los casos particulares de la adsorcin intermitente. Ejemplo 7.5.- Adsorcin de Inmunoglobulina G (ImG) en protema A inmovilizada en una matriz de agarosa en un sistema intermitente. Se desea predecir la variacin de la concentracin de ImG en un sistema experimental intermitente (Figura 7.20). La adsorcin se efecta utilizando protena A inmovilizada en una matriz de Sefarosa B en una solucin amortiguadora al 0.1 M de tris HC1 a pH=7 y a 25 C. El equilibrio del sistema es tipo Langmuir. Datos: Adsorbente: dp = 90 x 10'6 m G = 0.96 A/? = 28 Kg/m 3 Protena: MA = 150,000 daltons Kd = 0.019 mg/ml q0 = 40 mg/ml Dp = 6x 10~12 m2/s
,4. DISEO DE ADSORBEDORES
349
Adsorbente en suspensin
Filtro
Bao de agua agitado
Figura 7.20: Sistema experimental de adsorcin intermitente con agitacin.
350
CAPTULO 7. ADSORCIN
Solucin: p = 1000 Kg / m3 HL = 9.5 x 10~4 Kg/m - s e = 0.99 yA = 0.5 mg/ml El coeficiente de transferencia de masa de la pelcula puede ser estimado en este sistema intermitente utilizando la siguiente correlacin:
. Q1 1- n 0.31
/ 1*1
\PPD AB
donde pp es la densidad del adsorbente, A/9 es la diferencia de densidad entre el adsorbente y el lquido y m es la viscosidad del lquido. La difusividad de la protena puede ser estimada por medio de la siguiente correlacin emprica: .__ = 9.4 x 10 -15 donde: i: Difusividad molecular. [m2/s] T: Temperatura absoluta. [K] MA'- Masa molecular de la protena. [Daltons]. Solucin: Para mostrar el uso de modelos cinticos, en este ejemplo se desarrolla una solucin empleando tres modelos diferentes. Primero se pueden realizar los clculos comunes a las tres soluciones, a) Clculo de la difusividad:
1 T
DAB = 9.4 x 10~15 x
298 9.5 x
2
771
-4
DAB = 5.5 x 10~n -
JA. DISEO DE ABSORBEDORES b) Clculo del coeficiente de transferencia de masa:

2 x 5.5 x lT11 = kL = 2- + 90 x 10-6 m + 0.31
351
1028
x5.5 x 10-11 =
(1028 f)
kL = 4 x 1(T6 6
Solucin 1.- Equilibrio lineal y control de la pelcula. En esta solucin se supone un equilibrio lineal y que el coeficiente de transferencia de masa de la pelcula controla la rapidez de la adsorcin. ' La relacin de equilibrio est dada por una aproximacin lineal al equilibrio en el rango O < y < 0.5, de tal manera que: q = 80</* el balance de soluto en el lquido es: (A)
eV J = -RV
el balance de soluto en el adsorbente es:
(B)
(C)
la transferencia entre las fases:

R=kLa(y-y*) combinando las expresiones A, B y D, se tiene: (D)
352
CAPTULO 7. ADSORCIN \
combinando B y C e integrando con las condiciones:
y = yA ; q = o y =y ; q = q
se obtiene la linea de operacin,
j \
\
q = 7f~y(^ ~ y)
sustituyendo (F) en (E) y rearreglando: dy , AL a , kLa \ kLayA
(F)
integrando ( G ) con las condiciones:
t=O
y = yA
se puede obtener:
c (
donde: e
c _Bt
kLa K(l-e)
(H)
(>
La ecuacin (H) describe la variacin de la concentracin de soluto en la fase lquida conforme transcurre el tiempo de adsorcin t. Clculos Numricos:
=
6(1~
up
6(1 -0.99) 90 x 10~6 m a = 666 m"1

kLa kLa
=
4 x 10~ 6 x 666 m"1 s 2.66 x 10~ 3 5~ J
TTL
7.4. DISEO DE ABSORBEDORES Utilizando (I): 2.66 x lO"3^1 0.99 2.66 x 80x(l-.99)
353
B = 6.011 x 10~3 s~l

Utilizando (J): (2.66 x 10~3s~1)(0.5 mg/ml) 80(1 -0.99) C = 1.66 x 10~3 mg/s - mi _ y (H) queda expresada como: 0.276 + 0.224 ezp(-6.011 x 10~3 )
g k
b t*
y = '
= 0.553 + 0.447 ezp(-6.011 x 10'3 )
^ E r^r ^ p^
sas?-
En la Figura 7.21 se muestra la variacin de la concentracin de soluto en la fase lquida en funcin del tiempo de adsorcin, tal y como lo predice la expresin anterior con ki 4 x 10~6 m/s. Asimismo, se presentan los resultados para ki = 1 x 10 m/s para fines de comparacin. Solucin 2.- Equilibrio de Langmuir y pelcula controlante. En esta solucin se considera que el equilibrio es de tipo Langmuir y la resistencia controlante est localizada en la pelcula de lquido. La expresin de equilibrio est dada por:
q y =
El balance global de soluto:
354
CAPTULO 7. ADSORCIN
0.9
0.7
I
120.0
I 160.0
200.0
t (min)
Figura 7.21: Ejemplo 7.5.- Adsorcin intermitente de ImG. Equilibrio lineal y pelcula controlante, a) fc = 7 x 10~7 771/5 b) &L = 4 x 10~6 m/s La velocidad de transferencia de soluto por: R = kLa(y - y*) El balance de soluto entre las fases por:
dy
(C
-y
Las ecuaciones A, B y D, pueden ser resueltas utilizando un mtod de integracin numrico, para obtener la variacin de la concentracic con el tiempo. En la Figura 7.22 se muestra la curva obtenida utilizanc un valor de ki = 7 x 10~7 m/s, en lugar del valor obtenido median la correlacin, con el objeto de aproximar ms el modelo a los dat< experimentales. Solucin 3.- Equilibrio tipo Langmuir y resistencias cornt nadas poro y pelcula. En este modelo se supone que la velocidad de adsorcin est conti
355
0.8-
y/y*
0.4-
0.2-
0.0-
"T" 50
I ' ' ' ' I ' ' 100 150
M'
200
Tiempo (min)
Figura 7.22: Ejemplo 7.5.- Adsorcin intermitente de ImG. Equilibrio tipo Langmuir. Cintica lineal. Modelo y datos experimentales. Datos de: Horstman y Chase, 1989. lada por la transferencia de la protena a travs de la pelcula que rodea la partcula del adsorbente y por la difusin efectiva de la protena al interior de los poros del adsorbente. Asimismo, se supone que en la superficie del adsorbente la concentracin de protena en el lquido est en equilibrio con la concentracin de protena en el slido, relacionadas por una expresin tipo Langmuir. El balance de soluto al interior del poro es:
'-&
(A)
donde Ra es el radio de la partcula. El balance de soluto entre las fases en la superficie del adsorbente:
- \r-Ra = ki(y yi] \r= 3r El cambio de la concentracin en el seno del solvente :
P
(B)
dy -7T = -kia(y - yl dt La relacin de equilibrio:
(C)
356
CAPTULO 7. ADSORCIN
y las condiciones iniciales y de frontera,
7^ = 0 or de acuerdo a la regla de derivacin de la cadena,

r\ 7 r\
r =0
(F) v '
dt
dyi dt
(G)
derivando la ecuacin (D)

dqi Kdq0
dyt (Kd + y,-)2' combinando las ecuaciones (G) y (H),

dqj Kdq0
2
(H)
dyi
_
dt
e
(K + y i) dt
2
(I)
combinando el resultado anterior con la ecuacin (A),
y;
2 dyi
rdr
Las ecuaciones anteriores pueden expresarse en forma adimensiona utilizando el siguiente cambio de variables:
T =
Dpt
Efectuando el cambio de variables se obtiene el siguiente sistema d< ecuaciones:
357
Pelcula-Poro
0.6-
y/yA I
0.4-4
> I' ' ' '

100
1!
l' 200
Tiempo (min)
Figura 7.23: Ejemplo 7.5.- Adsorcin intermitente de ImG. Equilibrio Langmuir y resistencias combinadas pelcula y poro. Datos: Horstman y Chase, 1989.
2
dr
z dz
(K)
(L)
dw
dr
-3(l-e)NSH
e
(w Wi
(M)
donde NSH
es
un grupo adimensional dado por:
NSH =
(N)
Este sistema de ecuaciones puede ser resuelto por integracin con diferencias finitas. En la Figura 7.23 se presenta la curva obtenida mediante este mtodo.
358
CAPTULO 7.
ADSORCIN
Figura 7.24: Sistema de adsorcin tipo tanque agitado continuo.
7.4.2
Adsorbedores Tipo Tanque Agitado Continuo
Otro tipo de arreglo utilizado en procesos de adsorcin industriales es el adsorbedor tipo tanque agitado con alimentacin continua. Una aplicacin particular de este arreglo es en el procesamiento de caldos de fermentacin completos (con una filtracin gruesa previa en cribas vibradoras), ya que no presenta los problemas de taponamiento con la biomasa como cuando se trata de procesar estos caldos directamente en columnas de lecho fijo. La operacin se efecta (Figura 7.24) alimentando al tanque adsorbedor, donde inicialmente se coloca el adsorbente en solvente puro, un flujo F de solucin con una concentracin de soluto y A- Durante la operacin el adsorbente se mantiene en el interior del tanque y la corriente agotada se retira continuamente del tanque . Una vez que se alcanza cierta concentracin de soluto en la corriente de salida, se interrumpe la operacin y se recupera el soluto concentrado en el adsorbente. En una primera aproximacin para obtener el modelo del proceso del proceso, se puede considerar que el tanque est perfectamente agitado, de tal manera que la concentracin de soluto a la salida es igual a la
359
y(t)
Adsorcin rpida
Tiempo t
Figura 7.25: Concentracin en el lquido de salida de un adsorbedor continuo tipo tanque agitado. Fuente: Belter et a/, 1988.
concentracin de ste en la solucin dentro del tanque. En este sistema la cantidad de soluto adsorbido sobre la superficie de adsorbente vara con el tiempo, lo que se traduce en una operacin en estado no-estacionario. Por lo tanto, la concentracin de soluto en la superficie del adsorbente q y la concentracin de soluto en la solucin de salida t/, son ambas funciones del tiempo de operacin. El comportamiento cualitativo del sistema puede representarse de acuerdo a la Figura 7.25. De acuerdo con la figura an en ausencia de adsorcin, la concentracin de soluto en la corriente de salida vara con el tiempo. Por otro lado, si la adsorcin es muy rpida, la concentracin de soluto en la solucin ser baja por un cierto tiempo, hasta que se alcance la saturacin del adsorbente; una vez ocurrido lo anterior la concentracin aumentar siguiendo un patrn muy semejante al caso en que no existe adsorcin. En el caso general la velocidad de adsorcin es intermedia entre los dos casos descritos anteriormente.
Para un adsorbedor continuo tipo tanque agitado el modelo que
360
CAPTULO 7. ADSORCIN
describe la adsorcin, debe integrar la isoterma de adsorcin, el balance de masa, la expresin de la rapidez de la adsorcin y las condiciones de frontera. El balance de masa del soluto en la fase lquida se puede expresar en palabras como: velocidad de acumulacin velocidad de entrada velocidad de salida velocidad de adsorcin
V< = F(yA
dt
~y)-VR
(7-43)
(7.44)
el balance de soluto en el adsorbente: V(l-e) = VR
donde V es el volumen de la mezcla (solucin y adsorbente) en el adsorbedor, y A y y son las concentraciones de soluto a la entrada y la salida, respectivamente. La fraccin de volumen de lquido ( sin incluir el lquido en los poros) al volumen total de la mezcla es e. El flujo de alimentacin es F. La velocidad de adsorcin de soluto por unidad de volumen de la mezcla de adsorcin es R. Como se present en seccin 7.2, la velocidad de adsorcin depende de los mecanismos controlantes de la transferencia de masa. De tal manera que la expresin para R depende del sistema particular y debe ser determinada experimentalmente. El caso ms sencillo que permite obtener un modelo mediante integracin analtica, es el caso donde la velocidad de adsorcin puede ser aproximada mediante un modelo lineal y la isoterma de adsorcin es lineal. Para este caso la velocidad de transferencia de masa est dada por:
R = ka(y-y*) (7.45)
donde k es nuevamente el coeficiente de transferencia de masa, a es el rea de adsorbente por unidad de volumen de mezcla, y es la concentracin de soluto en el seno del lquido, y ?/* la concentracin
7.4.
DISEO DE ABSORBEDORES
361
hipottica de lquido en equilibrio con la concentracin de soluto en el adsorbente. La isoterma de adsorcin lineal se puede expresar como: q = Ky* (7.46)
La solucin de las ecuaciones (7.43), (7.44), (7.45 ) y (7.46) es:
y* -y
yA
r erii
r2 - rl
r T2t
r2 - rl
(7.47)
que es la la expresin de la variacin de la concentracin de soluto en la fase lquida con el tiempo de adsorcin. en la expresin anterior:
2A
-Br2 =
2A
A = 1 B = 4+ ^ d + (l-e)K = fcaF eA'(l-e)V

Ejemplo 7.6.- Recuperacin de antibiticos por adsorcin. Como alternativa a los procesos tradicionales de recuperacin de antibiticos, donde el primer paso consiste en una filtracin para la eliminacin de micelio y esporas, se desea analizar la posibilidad de una recuperacin directa del producto por medio de adsorcin inica en un arreglo tipo tanque agitado continuo. En un estudio piloto se desea estimar el tiempo para obtener el 90% de recuperacin de un antibitico de una corriente de alimentacin que fluye a razn de 3 l/h con una concentracin de 1 mg/l de antibitico. El adsorbente empleado inicialmente est libre de soluto y su constante de equilibrio lineal es 110. La relacin de volumen de lquido a
362
CAPTULO 7. ADSORCIC
volumen total que va a ser empleada es de 0.8. El volumen de reacci es de un litro. Como primera aproximacin se puede considerar que la resisten< controlante es la de la pelcula con un kia = 62.4 h~l. Solucin: Las constantes A, B y C estn dadas por:
A = 1
3 62.4 h~l (0.8)(l/) 0.8 2 B = 84.59 /T (62.4 ft-*)(3 {)
*-* /.-> / ~ V \ / 1 1\ I /-i /-, I ^ "I
0.8 (I -0.8)110
C = 10.63 h~2
Asimismo r\ y r2 estn dadas por:
l /i'1)2 - 4(1)(10.63 /i'2) Y . -==_ (-84.59 h~ ) v/(84.59 i 2 rj = -0.126 /T1 r2 = -84.46 /T1
Se puede definir el grado de recuperacin mediante la siguiente presin: ., /' Fyxdf - /' Fyof Recuperacin = ; Jo Fydt combinando la expresin anterior con la ecuacin (7.47),
JO
Recuperacin =
f'dt- JO f 'V f i - rrz-r! ^ + 115 r -r

2
/o*
efectuando la integracin,
f 7.4. DISEO DE ADSORBEDORES
363
n 2 (e r i t -1)4,(e r2t - 1)1 ) r , (r -r!)V /I Recuperacin = --. ,
_ t
T - 1 r 2 - r 1T )V
t/
U 7 - "~~~
7.95(1 - e"0-126*) + 1.8 x 1Q~ 5 (1 - e - 8 - 440f ) '~~ t
de donde:
t 1.75 h
7.4.3
Adsorcin en Lecho Fijo
La adsorcin en lecho fijo es la operacin ms empleada a escala industrial para la concentracin de caldos . Este tipo de operacin se efecta en columnas empacadas con adsorbente. Por la parte superior de la columna se alimenta la solucin que contiene el soluto de inters. Durante su paso por la columna el soluto es adsorbido en el lecho y la solucin agotada es obtenida en el fondo de la columna. Una vez que la concentracin de soluto a la salida alcanza una cierta concentracin, se interumpe la operacin y se recupera el soluto concentrado. A esta tcnica tambin se le conoce como Cromatografa Frontal. En la descripcin de la adsorcin en columna se utilizan grficas de la variacin de la concentracin de soluto la salida de la columna con el tiempo. Estas grficas son llamadas curvas de ruptura. Curva de Ruptura En la Figura 7.26 se presenta un esquema de adsorcin en una columna de longitud L (la columna se presenta acostada slo para efectos explicativos). La parte de la figura llamada "Lecho de Adsorbente" muestra como se va cargando de soluto el adsorbente del lecho conforme transcurre el tiempo. En tin tiempo intermedio (t -f di] cuando an no se agota la columna, se pueden distinguir tres zonas en el lecho de adsorcin:
364
CAPTULO 7. ADSORCIN
. XA
. X(L.t)
Tiempo
Lecho de Adsorbente
Solucin de Salida
t<t
(a)
(h)
(b)
ZE ZTM
ZNU
(c)
0)
(d)
(k)
(e)
(I)
= t
(m)
t>t,
(g)
(n)
Figura,7.26: Adsorcin de soluto y curva de ruptura en columnas.
14. DISEO DE ABSORBEDORES
365
La Zona de Equilibrio (ZE) donde el adsorbente se encuentra en equilibrio con la concentracin de soluto y A de la solucin de entrada. En esta zona la concentracin de soluto en el adsorbente es constante e igual a q = f(yA), donde la funcionalidad / depende del tipo de equilibrio. La Zona de Transferencia de Masa (ZTM) donde la concentracin de soluto en el adsorbente vara a lo largo de la zona. La Zona No Utilizada (ZNU) donde no se ha presentado adsorcin, de tal manera que la concentracin de soluto en el adsorbente es igual a la que tena inicialmente qx. Conforme transcurre la adsorcin la ZE va ocupando toda la columna, la ZTM se acerca a la salida de la columna y la ZNU tiende a desaparecer. En la misma Figura 7.26 la parte "Solucin de Salida" muestra como vara la concentracin de soluto en la solucin a la salida de la columna y(Z/,) , conforme transcurre el tiempo de adsorcin. Se pueden ditinguir tres eventos importantes en esta parte de la figura: Para tiempos menores a R cuando la Zona de Transferencia de Masa an no llega a la salida de la columna, la concentracin de soluto en la solucin a la salida de la columna y ( L , ), es muy baja e igual a la mnima detectada por el adsorbente yx (para fines prcticos esta concentracin puede tomarse como cero). En el tiempo de ruptura R la Zona de Transferencia de Masa ha alcanzado la salida de la columna, de tal manera que se ha incrementado la concentracin de soluto en la solucin de salida alcanzando el valor de diseo ya. Este valor es la mxima concentracn de soluto permitida en la solucin de salida y representa las prdidas de soluto tolerables en el proceso. El tiempo R marca la terminacin del ciclo de adsorcin. En caso de continuar la operacin la concentracin de soluto en la solucin de salida seguir incrementndose hasta igualar la concentracin de soluto y A-
366
CAPTULO 7.
ADSORCIN
La curva que describe la concentracin de soluto en la solucin de salida en el tiempo, y ( L , t ) vs , se llama Curva de Ruptura. La forma particular que toma la curva de ruptura depende tanto del tipo de equi* ^f^^,,^^,^,^^^^ ..-,,.>.,-,-^J;, ,,,.-,-.--=,*.*>**<.-."-; .v3-..,.'.---. ' - **- J -..,,,.-.-^v*--v --'-'*-'*'---.v-îJU,.^
librio del sistema que se trate, como de los mecanismos de transporte involucrados. ** Ejemplo 7.7.- Adsorcin en una columna ideal.
O Calcular la duracin del ciclo de una colun/na que opera con un flujo d^flO l/min de una solucin que contiene o g/l de estreptomicina. La columna est empacada con 10,000 <?jde una resina cationica cuya adsorcin mxima es: q0 = 1.56 g/g (Payne, 1989). <t:tr.i r 4 f- \ Suponer que en el rompimiento toda la columna est en equilibrio con la solucin de entrada.
Solucin:
El balance de masa global en la columna es: FyAAt = q0S despejando Ai y sustituyendo valores se tiene:
Ai = Ai =
Fy,
(10 //mtn)(6 g/l) Ai = 260 min Ai = 4.3 h En la Figura 7.27 se presenta un esquema de la columna y de la curva de ruptura para este ejemplo. Ejemplo 7.8.- Adsorcin de lisina. Se desean producir 8000 ton/ao de lisina a partir de un caldo que contiene 20 g/l de este aminocido, utilizando adsorcin por intercambio inico. Los datos de equilibrio muestran que q0 110 g/l.
367
y (i.t)
F=10l/min
y A -6g/i
Curva de ruptura ideal
o -4.3 Tiempo (h)
Figura 7.27: Columna y curva de ruptura para Ejemplo 7.7.
368
CAPTULO 7. ADSORCIN
Estimar las dimensiones volumtricas de un sistema de 3 adsorbedores en carrusel, en el cual cada lecho es lavado y eludo una vez que est completamente agotado. Se estima que el ciclo tiene una duracin de 4 horas (adsorcin, elucin y lavado). Solucin: a) Clculo del flujo total a procesar (3 turnos 310 das laborables). produccin
--
. . . . .
yA
171
_
9 S A. v 1 Ifl U
ano
3 -
A.
310 atas
or
ao J"
A.
o .
dia i
24 h
20 f 4 F = 5.37 x 10 l/h
b) Clculo de la cantidad de resina necesaria en proceso:
C*
__
5.37 x 104 { x 20? n_ /
~?
S = 9763 * de r**ina h c) Clculo del volumen del adsorbedor:
V = St
V = 9763 | x 4 h h V = 39, 000 / Se requieren 3 adsorbedores de 39 m3 cada uno.
JdLB^^
%Ja-3a-Jde^^
nlisis frontal), permite disear columnas para lograr ci recuperacin, estimar las prdidas y determinar el tiempo # de cada
369
ciclo, as como para estimar dimensiones y arreglos de los equipos para ia fase de adsorcin (Yang y Tsao, 1982). Existen diferentes mtodos para predecir la forma de la curva de ruptura entre los cuales se encuentran: - Los mtodos aproximados. - Los mtodos basados en la teora de platos. - Los mtodos basados en la teora cintica. - Los mtodos basados en la teora de equilibrio Los dos primeros mtodos no estn basados en la obtencin de modelos a partir de relaciones de equilibrio y balances de masa, mientras que los mtodos tercero y cuarto si lo estn. Esta variedad de mtodos se debe principalmente a que las expresiones matemticas de las curvas de ruptura son difciles de manejar en algunos casos.
Anlisis Aproximado
Este mtodo es especialmente til para isotermas de adsorcin favorables. Bajo estas condiciones, se supone que la adsorcin se desarrolla formndose una zona de transferencia de masa dentro de la columna con un perfil de concentracin constante que viaja a lo largo de la columna (Figura 7.28). Para caracterizar la curva de ruptura se seleccionan dos concentraciones. La concentracin yp, de ruptura que es la mxima concentracin que se puede tolerar a la salida, y la concentracin y3 que corresponde a la concentracin a la salida cuando el lecho se considera agotado. Una gua general es considerar: yR = Q.lyA ys = 0.9y donde y A es la concentracin de soluto en la solucin a la entrada. Si se supone que la zona de transferencia de masa (ZTM) se mueve a lo largo del lecho con una velocidad constante i?, en el tiempo IR
370
CAPTULO 7. ADSORCIN
Concentracin d la solucin de alimentacin =
(c)
Zona de adsorcin
Zona de adsorcin
Concentracin del efluente =
tiempo
Figura 7.28: Adsorcin con patrn constante.
371
existe una zona en la parte superior de la columna donde el adsorbente est saturado y una zona en el fondo de la columna donde se localiza la ZTM. El tiempo que tarda en salir la ZTM de la columna es A = t$ tp_. Por lo tanto se puede establecer que la longitud de la columna que est saturada Zs en el tiempo IR es : Zs = MR - i?A donde ti = IR y L la longitud de la columna. Combinando las expresiones anteriores se obtiene:
(7.48)
(7.49)
RJ
(7.50)
La longitud de la ZTM ZA est dada por: ZA = L^ (7.51) IR Se pueden utilizar estas relaciones para estimar la fraccin de lecho que est utilizado cuando termina la operacin o sea en el tiempo #, considerando simtrica la curva de ruptura, de tal manera que : En la zona de saturacin:
q = f(yA)
y en la ZTM :
donde la funcionalidad depender del tipo de isoterma. En base a lo anterior la fraccin de lecho utilizado O est dada por: f(yA)L
(y*)
372
CAPTULO 7. ADSORCIN
0=1
-2*
(7 52
' >
La fraccin de lecho utilizado dada por la ecuacin (7.52) debe ser obtenida experi mentalmente y puede ser utilizada para escalamiento. En este proceso, la longitud de la columna y la velocidad de alimentacin deben permanecer iguales en ambas escalas para mantener el mismo patrn de adsorcin. Esto conduce al diseo de columnas poco esbeltas con poca cada de presin en Jas cuales debe asegurarse una distribucin uniforme del lquido. Teora de Platos Cuando se utiliza la teora de platos la columna se modela mediante una serie de etapas en equilibrio como se muestra en la Figura 7.29. De acuerdo a dicha figura la cantidad de adsorbente est fija en cada etapa y el lquido fluye a travs de todas las etapas transportando al soluto. El empleo de esta teora permite disear columnas en forma muy sencilla. Una limitacin del empleo de la teora de platos es que slo puede ser utilizada para sistemas con isotermas lineales. Adems, en su forma original esta teora es de uso limitado por su incapacidad de predecir el nmero de etapas o la altura real de cada etapa y el efecto del cambio de las condiciones de operacin sobre el comportamiento de la columna. Considerando el arreglo que se muestra en la Figura 7.29, el balance de masa de soluto en la fase lquida en la etapa n, puede expresarse en palabras como: Velocidad de acumulacin de soluto en el lquido = Velocidad de entrada de soluto - Velocidad de salida de soluto - Velocidad de adsorcin de soluto y por medio de la ecuacin :
n.
di
dt
(7.53)
donde: n: Nmero de etapa.
373
Etapa
y,
Etapa 2
Figura 7.29: Teora de platos en adsorcin.
374
CAPTULO 7.
ADSORCIN
V: Volumen de la etapa (vol. del lquido + vol. adsorbente). e: Volumen de lquido por volumen de etapa. F: Flujo de alimentacin (constante entre etapas para soluciones diluidas). yn: Concentracin de soluto en la solucin en la etapa n (masa de soluto por volumen de solvente). qn: Concentracin de soluto en el adsorbente en la etapa n (masa de soluto por volumen de adsorbente). El modelo supone que cada etapa est en equilibrio de tal manera que para isotermas lineales: qn = Kyn combinando las ecuaciones (7.53) y (7.54) se obtiene: l(e + (I- c)K)V}$ = F(yn,1 - yn) (7.55) (7.54)
donde el trmino en el parntesis cuadrado de la izquierda de la expresin anterior representa un volumen hipottico.
La ecuacin (7.55) puede ser resuelta con las siguientes condiciones: - En el tiempo t = O, yn O para n = 1, 2,3,4, ...N t/( al i mentacin) = y A
- En cualquier tiempo t=t,
La solucin del anterior sistema de ecuaciones se facilita definiendo un tiempo adimensional mediante la siguiente expresin:
T =
Ft {(e + (1 - E)K)V]
o bien en trminos del volumen de lecho Vc = NV,
375
NFt
((e + (\ - e)K]Vc
donde N es el nmero de etapas. La ecuacin (7.55) queda expresada como:
dyn
La solucin de la ecuacin (7.56) est dada por:
(7.56)
yn =
(7.57)
La ecuacin anterior puede ser expresada de forma ms compacta manejando su forma diferencial:
dyn
dr (n-1)!
(7.58)
que representa una distribucin de Poisson. Puede observarse en la Figura 7.30 que conforme se incrementa el nmero de etapas, la distribucin de Poisson se aproxima a una distribucin normal, entonces se puede efectuar la siguiente aproximacin:
dyn _._ dr ~
VA
exp
1 - T T '
(7.59)
De acuerdo a la definicin de media y desviacin estndar, con ayuda de la ecuacin (7.58) se puede encontrar que la expresin (7.59) tiene una media r0 = N y una desviacin estndar a A = yN cuando n N (a la salida de la columna). La forma integrada de la ecuacin (7.59) para el caso de n = N, conduce a una expresin de la siguiente forma: (7.60) donde:
376
CAPTULO 7. ADSORCIN
0,5
N= 10
o.io-
0.05 -
= 100
0.00
\ 50
100
I 150
Figura 7.30: Aproximacin de la distribucin de Poisson a la distribucin Normal.

Tabla 7.3: Valores de la funcin error Erf(x).
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.0
377
0.000 0.112 0.223 0.329 0.428 0.521 0.604 0.678 0.742 0.797 0.843 0.880 0.910 0.934 0.952 0.966 0.976 0.984 0.989 0.993 0.995
0.011 0.124 0.234 0.340 0.438 0.529 0.611 0.685 0.748 0.802 0.847 0.884 0.913 0.936 0.954 0.967 0.977 0.984 0.990 0.993 0.997
0.023 0.135 0.244 0.349 0.447 0.538 0.619 0.691 0.754 0.807 0.851 0.887 0.916 0.938 0.955 0.968 0.978 0.985 0.990 0.993 0.998
0.034 0.146 0.255 0.359 0.457 0.546 0.627 0.698 0.759 0.812 0.855 0.890 0.918 0.940 0.957 0.970 0.979 0.986 0.990 0.994 0.999
0.045 0.157 0.266 0.369 0.446 0.555 0.634 0.705 0.765 0.816 0.859 0.893 0.921 0.942 0.958 0.971 0.980 0.986 0.991 0.994 0.999
0.056 0.168 0.276 0.379 0.475 0.563 0.642 0.711 0.771 0.821 0.862 0.896 0.923 0.944 0.960 0.972 0.980 0.987 0.991 0.994 1.000
0.068 0.179 0.287 0.389 0.485 0.572 0.649 0.717 0.776 0.825 0.866 0.899 0.925 0.946 0.961 0.973 0.981 0.987 0.991 0.994 1.000
0.079 0.190 0.297 0.399 0.494 0.580 0.657 0.724 0.781 0.830 0.870 0.902 0.928 0.947 0.962 0.974 0.982 0.988 0.992 0.995 1.000
0.090 0.201 0.308 0.409 0.503 0.588 0.664 0.730 0.787 0.834 0.873 0.905 0.930 0.949 0.964 0.975 0.982 0.988 0.992 0.995 1.000
0.101 0.212 0.318 0.419 0.512 0.596 0.671 0.736 0.792 0.839 0.877 0.908 0.932 0.951 0.965 0.975 0.983 0.989 0.992 0.995 1.000
y Erf es la funcin error dada por: -"*dri Los valores de esta funcin simtrica estn dados en la Tabla 7.3. En la Figura 7.31 se presenta la curva de y(L, r} vs r para el caso de N = 100. En la misma figura se presenta la curva para la derivada de la funcin: _1_ VA dy(L,r) dr
La ecuacin (7.60) puede ser expresada en funcin del tiempo real utilizando la definicin de T para obtener:
378
CAPTULO 7. ADSORCIN
Figura 7.31: Curva de ruptura por teora de platos con N=100.
379
(7.61) o bien como:

(T 4\ y(M) =y
1 + Erf
t-tt
22<0
(7.62)
\/
donde la desviacin estndar a est dada por 4=. La ecuacin (7.62) describe la curva de ruptura que predice la teora de platos. Esta permite caracterizar columnas mediante el ajuste de datos experimentales y la determinacin de los parmetros hipotticos N y HETP dados por la ecuacin :
HETP = -
(7.63)
donde HEPT es la altura equivalente de un plato terico (de sus siglas en ingls). La teora de platos no permite predecir la forma de la curva de ruptura cuando cambian las condiciones de operacin. Sin embargo, con este propsito suelen combinarse frecuentemente los resultados de la teora de platos con los de la teora cintica que se presenta en la siguiente seccin. Teora Cintica Los modelos de columnas de adsorcin que se enmarcan dentro de la teoras cintica se desarrollan mediante la combinacin de balances de masa, relaciones de equilibrio, relaciones de transferencia de masa entre las fases y las condiciones iniciales y de frontera del sistema. Considerando una seccin de una columna como la que se muestra en la Figura 7.32, el balance de soluto en la fase lquida en un elemento de volumen puede ser expresado en palabras como: Velocidad de acumulacin de soluto en la fase lquida = Velocidad de entrada de soluto por conveccin - Velocidad de salida de soluto por conveccin -f- Velocidad de entrada de soluto por dispersin - Velocidad
380
CAPTULO 7. ADSORCIN
Entrada de A por conveccin
Entrada de A por dispersin
Az
Adsorcin de A
Acumulacin de A Salida de A por conveccin Salida de A por dispersin
y(L.t)
Figura 7.32: Componentes del balance de soluto en un elemento d< volumen de una columna de adsorcin.
381
de salida de soluto por dispersin - Velocidad de adsorcin de soluto por el slido. En un sistema isotrmico y despreciando los efectos radiales este balance puede ser escrito como:
Ai dz Edy A dz
dividiendo entre AV = A&z y tomando lmites, se obtiene la ecuacin diferencial que describe el balance de soluto en una columna:
dy _ ft _ JET; d y _ v (7.64) 2 dt dz dz donde E es el coeficiente de dispersin axial basado en el rea transversal del lecho (este coeficiente debe distinguirse del coeficiente D el cual est basado en el rea transversal slo del lquido), v es h velocidad superficial del fluido (F/A), R es la velocidad de transieren ca de masa entre las fases por unidad de volumen del lecho (slido -\ lquido). La diversidad de modelos existentes para lechos empacados de a cuerdo a la teora cintica, se deriva por un lado de los diferente mecanismos que pueden controlar la velocidad de transferencia de mas entre las fases (pelcula, poro, resistencias combinadas, etc.), es dec de la forma que adopta el trmino R de la ecuacin (7.64), y por oti lado de la forma de la curva de equilibrio (lineal, Langmuir, etc.) qi tambin introduce variabilidad al modelo. Adems, el modelo puede no considerar los efectos de flujo no ideal contemplados en el trmii de dispersin axial (Tabla 7.4).
2
En los siguientes prrafos se presentan algunos modelos particular de la teora cintica. Modelo Cintico : Equilibrio no Lineal Favorable y Fuer Impulsora Lineal.- En algunos casos la acumulacin en la (ase lqui
382
CAPTULO 7. ADSORCIN
Tabla 7.4: Algunos factores a considerar en un modelo cintico de adsorcin. Tipo de Equilibrio Lineal Favorable Desfavorable Irreversible Resistencia Controlante Poro Superficie Pelcula Combinadas Efecto Mezclado Flujo ideal tipo tapn Flujo tapn con dispersin axial
es mucho menor que la acumulacin en la fase slida (equilibrios favorables) y la dispersin es despreciable. En estos casos el retardamiento de la curva de ruptura slo obedece a los mecanismos de transferencia de masa. Bajo estas condiciones la ecuacin (7.64) se puede escribir como:
r> -v = R oz
(7.65)
El balance de masa del soluto sobre el adsorbente se puede expresar como:
)TT- = -/t
r~>
(7.DO)
/i-r /?/>\
El trmino R de las ecuaciones (7.65) y (7.66) slo depende del mecanismo controlante de la transferencia de masa. A continuacin se presentan algunos casos particulares: Caso 1 : Control de la transferencia en la pelcula.- Si la velocidad de transferencia de masa est controlada slo por la pelcula de fluido que rodea la partcula de adsorbente entonces, R = kLa(y - y*) (7.67)
combinando las ecuaciones (7.65), (7.66) y (7.67) se obtiene el siguiente par de ecuaciones: - v = kLa(y -y*)
dy
(7.68)
383
(I - c)
= kLa(y - y ' )
(7.69)
Estas ecuaciones pueden expresarse en forma adimensional (solucin universal) utilizando el siguiente cambio de variables: zkLa v kLa (t - K
-y
VA
-
2M
y
=
J_ 9*
donde: : Distancia axial adimensional. T: Tiempo adimensional medido a partir de que la solucin alcanza el punto z. yA' Concentracin de soluto en el lquido a la entrada de la columna. <//?: Concentracin de referencia del soluto sobre el adsorbente. X' Concentracin adimensional de soluto en el lquido. Y: Concentracin adimensional de soluto en el adsorbente. Las ecuaciones (7.68) y (7.69) adimensionalizadas se expresan:
Caso 2 : Control de la difusin del soluto en el seno del slido del adsorbente.- En este caso la velocidad de transferencia de masa slo est controlada por la difusin del soluto en el seno del slido y de acuerdo a la ecuacin (7.25):
384
CAPTULO 7.
ADSORCIN
R= (l-e)VaX<7*-<?)
(7.71)
La combinacin de las ecuaciones (7.65), (7.66) y (7.71) conduce a: -v^- = (\-e}il>sksa(q*-q) (I - e)^t = (I - e)^sksa(q* - q) (7.72)
(7.73)
estas dos ecuaciones pueden ser expresadas en forma adimensional con:
ipsksa [t \
-v
x =
Y = q/qR
obtenindose la siguiente expresin :
-| = f = ( y *- r '
(7 74)
'
Caso 3 : Control de la difusin del soluto al interior del poro.- En este caso la velocidad de transferencia de masa slo est controlada por la difusin del soluto al interior del poro del adsorbente y de acuerdo a la ecuacin (7.32): R = ^*y q)
QR/yA
(7.75)
La combinacin de las ecuaciones (7.65), (7.66) y (7.75) conduce a: dy ^pkpa(q* - q) v- =

(7.76)
385
n-
(7.77)
Las dos ecuaciones anteriores pueden expresarse en forma adimensional con:

zijjpkpd
=
T
JM
X Y
= =

= (y* - Y) (7.78)
c/c;
C/T
Caso 4 : Control de la dispersin.- Si el mecanismo controlante de la transferencia de masa es slo la dispersin axial, la ecuacin (7.65) se puede aproximar a:
dy - v = kda(y - y*) uz y el balance de soluto sobre el adsorebente como:
(7.79)
Las ecuaciones anteriores pueden expresarse en forma adimensional utilizando el siguiente cambio de variables :
zka
=
T =
v
( V <-t
VA
386
CAPTULO 7. ADSORCIN \
y x =
i
'
_9x d '
El anlisis presentado para cada uno de los casos anteriores puede ser extendido para el caso en que el mecanismo controlante sea la reaccin de superficie. Sin embargo, como se ha planteado anteriormente este mecanismo generalmente no es el controlante. Asimismo el anlisis puede extenderse para el caso donde exista una combinacin de mecanismos controlantes, utilizando un coeficiente global de transferencia. Nmero de Unidades de Transferencia (NTU).- En las columnas de contacto diferencial no existen etapas reales de contacto y separacin, como en el caso de las operaciones que se realizan en tanques. Debido a lo anterior estas columnas se caracterizan utilizando el nmero de unidades de transferencia, que es una medida de la dificultad de la operacin. Las ecuaciones adimensionales de cada uno de los cuatro casos anteriores, permiten definir el concepto de nmero de unidades de transferencia de una columna de adsorcin de acuerdo al tipo de mecanismo controlante. Este nmero se define como la expresin que adimensionaliza la ecuacin de balance. De acuerdo a lo anterior:
NTUL
(7.82)
yA
N =
zâ v
4)
NTUd
= v
(7.85)
387
donde los subndices L,s,p y c/, especifican que el mecanismo controlante es la pelcula, la difusin en el seno del adsorbente, la difusin dentro del poro o la dispersin, respectivamente. Si se utilizan las correlaciones (7.26), (7.32) y (7.36), las ecuaciones anteriores pueden expresarse como:
NTUL = NTUS = NTUn = NTUd =
(7.86)
yA
p (l
Wzi/>,D,gR(l -e)
-e)
(7.87) (7.88) (7.89)
zv
Los valores de NTU pueden ser estimados con las ecuaciones anteriores y con correlaciones para clculo de parmetros de acuerdo a la geometra del sistema y a las condiciones de operacin. Por otro lado, estas mismas expresiones pueden ser utilizadas para el clculo de parmetros utilizando datos experimentales. El mecanismo controlante es aqul cuya NTU sea el menor. En trminos de los grupos adimensionales anteriores, las concentraciones adimensionales de la curva de ruptura son funcin de f y r, es decir:
r
(7-90)
No existe una solucin general para estas ecuaciones diferenciales. Sin embargo, estas ecuaciones han sido resueltas para algunos casos particulares. Dentro de stos se puede destacar el caso desarrollado en la literatura para equilibrios favorables llamado "Patrn constante" (Hall et a/, 1966). En este caso la curva de ruptura es caracterstica de cada mecanismo controlante. Asimismo se puede citar los resultados que se obtienen cuando la curva de equilibrio es lineal o cuando se usa el modelo de adsorcin a contracorriente.
388
CAPTULO 7. ADSORCIN
Estos dos ltimos casos se presentan en los siguientes prrafos, 10 cual permite precisar la metodologa del uso de los modelos cinticos. Modelo Cintico: Equilibrio Lineal y Fuerza Impulsora Lineal en el Lquido. Este modelo puede ser aplicado cuando se utilizan razonablemente las siguientes consideraciones: - El proceso es isotrmico. - La relacin de equilibrio es lineal. - La fuerza impulsora de la adsorcin es lineal. - No existe dispersin en la columna. - La acumulacin de soluto en la fase lquida es despreciable. - La distribucin y el tamao de las partculas del adsorbente son uniformes. Con las consideraciones anteriores el sistema de ecuaciones que describe el comportamiento de la columna, en el caso de que el control de la transferencia de masa est dado por una resistencia lineal es: Relacin de equilibrio.
9 = Ky'
Balance de soluto en fase lquida. O - -v^- - R
(7.91)
(7.92)
Velocidad de transferencia de masa.
R = ka(y-y*)
Balance de soluto en el adsorbente.
(7.93)
(l-e)ff = *
Condiciones iniciales y de frontera.
(7.94)
389
t = 0, V z, 9 = 0 > O, z = 0, y = JM
La combinacin de las ecuaciones (7.91)-(7.94) conduce a las siguientes dos expresiones:
dy_ _ dz
(7.95) (7.96)
Estas dos ecuaciones conjuntamente con las condiciones iniciales y de frontera, pueden adimensionalizarse con las siguientes variables:
zka v
T =
X =
y
fi KyA
K(l - e)
obtenindose el siguiente sistema de ecuaciones: (7.97) (7.98) con las condiciones:

r = 0, Y = 0, V
= O, x = O, V r
390
0.999 0.998 0.995 0.99 0.98
CAPTULO 7. ADSORCIN
:i
0.95 0.9 0.8 0.7 0 . 6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.05 0.02 0.01 0.005 0.002 0.001 10 20 50 200 500
1000
000
Figura 7.33: Solucin grfica de la ecuacin de la curva de ruptura. Modelo cintico: equilibrio lineal, resistencia lineal. Fuente: Vermeulen et al, 1973.
Las ecuaciones (7.97 ) y (7.98) han sido resueltas utilizando transformadas de Laplace (Bird et /, 1960), obtenindose la siguiente expresin para la curva de ruptura:
X = 1~
(7.99)
donde i = \/T, y J0 es una funcin Bessel de primera especie y orden 0. En la Figura 7.33 se presenta una solucin grfica de la ecuacin (7.99). Esta grfica puede ser usada para evaluar ka a partir de datos de laboratorio o predecir curvas de rompimiento utilizando correlaciones. Sin embargo, es importante recordar que las consideraciones del modelo deben ser aplicables al caso particular. Cuando el equilibrio es lineal estos resultados son anlogos para cada
391
uno de los casos donde un mecanismo es el controlante, de tal manera que o el nmero de unidades de transferencia que se puede utilizar en la ecuacin (7.99) es cualquiera de los establecidos en las ecuaciones (7.86)-(7.89), debido a que para un equilibrio lineal Y* Y = x~X*- La curva de ruptura tiene igual forma independientemente del mecanismo controlante (Hall et a/, 1966). Modelo de Adsorcin de Lecho a Contracorriente.- En una adsorcin de lecho fijo la zona de adsorcin se mueve hacia abajo de la columna. En el modelo de adsorcin de lecho a contracorriente, se supone que el adsorbente se mueve hacia arriba a contracorriente del fluido, de tal manera que la zona de adsorcin en la columna permanece estacionaria (Figura 7.34). El modelo supone que la longitud de la columna es infinita, de tal manera que en la parte superior de la columna el adsorbente est en equilibrio con la solucin de entrada y en la parte inferior la solucin est libre de soluto. El modelo supone adems: Adsorcin isotrmica. Dispersin despreciable. Volumen lquido en la columna mucho menor que el volumen procesado. Mecanismo de transferencia de masa lineal. El balance de soluto entre la salida de la columna y un punto z est dado por: F(y - 0) = S(g - 0) (7.100)
que es la curva de operacin del sistema. S es un flujo hipottico de adsorbente. De acuerdo a la ecuacin (7.64) y las suposiciones del modelo, el balance de soluto entre las fases est dado por: y*) (7.101)
dz
392
CAPTULO 7. ADSORCIN
q =0
Figura 7.34: Modelo de adsorcin de lecho a contracorriente.
393
La ecuacin anterior puede integrarse para encontrar la longitud necesaria de la columna para lograr un determinado grado de separacin, de tal manera que:
dz
= /" (y - y*)
JyA
dy
integrando se obtiene:
dy
y
o bien, L=
(y-y*)
(7.102)
[HTU][NTU]
La aplicacin de este mtodo requiere una integracin numrica de datos de laboratorio para evaluar fca, con el cual se pueden efectuar estudios de escalamiento. Combinacin Teora de Platos - Teora Cintica (Equilibrio lineal).- La combinacin de modelos obtenidos por medio de la teora de platos con modelos obtenidos por medio de la teora cintica, permite mantener la estructura sencilla de la teora de platos y poder correlacionar el efecto de los cambios en las variables de operacin sobre la forma de la curva de ruptura, lo cual es til para establecer las relaciones necesarias para mantener los mismos perfiles de concentracir (prdidas, tiempo de operacin, etc.) entre dos escalas de operacin d( inters. Una primera aproximacin a este enfoque es la combinacin de lo resultados de la teora de platos resumidos en la ecuacin (7.62), coi los resultados de la teora cintica con un mecanismo lineal controlant y equilibrio lineal, resumidos en la ecuacin (7.99), de tal manera qu
N = NTU
Esta aproximacin permite correlacionar la pendiente de la curva c rompimiento con variables de operacin, de tal manera que para cae uno de los casos estudiados se tiene lo siguiente:
394
CAPTULO 7. ADSORCIN
VA
y_ = l l + Erf\ -r\ _25_

2
v/JV
(7.103)
Cuando el mecanismo controlante de la adsorcin est localizado en la pelcula de lquido que rodea a la partcula de adsorbente, de acuerdo a la ecuacin (7.86),
v
por ecuacin (7.21),

1/2
por ecuacin (7.14),
entonces,
N
V
Cuando el mecanismo controlante es la difusin del soluto en el seno del adsorbente, de acuerdo con la ecuacin (7.87):
L
S el mecanismo de control es la difusin del soluto al interior del poro, de acuerdo con la ecuacin (7.88):
yv
En el caso que el mecanismo controlante sea la dispersin, de acuerdo con la ecuaciones (7.37) y (7.89):
395
Lv
~ TP
De tal manera que para el modelo combinado lineal se puede generalizar que: N -Kvnn+l
(7.104) V y
n n n n
donde K, es una constante de proporcionalidad. con = 1/2 para control de la pelcula. = 1 para control de la difusin en el slido. = 1 para control de la difusin al interior del poro. = O para control de la dispersin.
Ejemplo 7.9.- Adsorcin de Inmunoglobulina G en protena A inmovilizada en una matriz de agarosa, en una columna empacada. Se utiliza una columna de 1 cm de dimetro empacada con agarosa con protena A inmovilizada para adsorber ImG, a partir de una solucin que contiene 1.71 mg/ml de esta protena. El volumen del lecho es de 2.1 mi con una porosidad de 0.35. El equilibrio es tipo Langmuir. Datos del adsorbente:
6 \-G dp = 90 x- 10~ m IV. el = 0.96
A/9 = 28
Kd
f
rrr
mi
9
= 0.019
=
11 43 -
396 Datos solucin:

pL = 1000
CAPTULO 7. ADSORCIN
TU"
UL = 9.5 x 10~4
m s
Dp = 3.9 xlO- 1 2
F = 0.4
min
11
DAB = 5.5 x 1Q-
m2 s
Datos de la Columna:
Dc = 1 c m A = 0.785 cm2
Correlaciones: El coeficiente de transferencia de masa puede ser estimado utilizando la siguiente correlacin:
1/3
DAB
V PL )
\PLDAB
La curva de ruptura experimental se muestra en la Figura 7.35. Se pide: a) Estimar grficamente el porcentaje de prdidas si se deja correr la adsorcin hasta que y/yA = 0.1. b) Estimar a partir de la curva de ruptura la fraccin de lecho ocupado cuando y/yA = 0.1, suponiendo que el lecho se agota a los 200 min. c) Comparar los datos experimentales con la prediccin del modelo de platos. d) Comparar los resultados experimentales con la prediccin del modelo cintico: equilibrio lineal-resistencia lineal.
397
_y
VA
O ' " ' ' ' OO
150
200' ' 'V ' 300 ' ' ' '
t (min)
Figura 7.35: Curva de ruptura experimental ImG-Proteina A. Datos de: Hortsman y Chase, 1989. e) Comparar los resultados experimentales con los del modelo de lecho continuo. Solucin.a) Las prdidas se pueden calcular mediante la siguiente expresin:
L ydt Prdidas = -^
En forma aproximada la expresin anterior equivale a el rea del tringulo bajo la curva de ruptura en el punto de ruptura, la cual de acuerdo a la curva de ruptura experimental es : (0.1 - 0 ) ( 1 1 0 - 9 0 )
Prdidas Prdidas
= 0.9 %
b) La fraccin de lecho ocupado de acuerdo a !a ecuacin (7.52):
398
CAPTULO 7.
ADSORCIN
c) El Modelo platos est dado por la ecuacin (7.62):

+ ^-/f t
De la Figura 7.35 se pueden obtener dos pares de datos para calcular Para -^ = 0.5 yA t0 = 140 min
Para -^ = 0.1 tR = 110 min Con estos dos puntos sobre la curva de ruptura se puede estimar a
-i
110-140
con auxilio de la Tabla 7.3 se obtiene: <j = 23.33 min En la Figura 7.36 se muestra la curva de ruptura de acuerdo a este modelo. d) Modelo Cintico. La curva de ruptura en este caso est dada por la ecuacin (7.99) que puede aproximarse a (Vermeulen et -a/, 1973):
Clculos: rea de la seccin transversal de la columna:
399
0.8
0.6
0.4
0.2
200
t (min)
300
Figura 7.36: Curva de ruptura. Modelo de platos. Ejemplo 7.9 c.
400
CAPTULO 7. ADSORCIN
A =
A
Velocidad superficial:
=
0.785 cm2
F
4 TT x 1 cm2
A =
t? =
u =
0.4 mtn sa
0.785 cm2
8.3 x 10~5 s Coeficiente de Transferencia de Masa: Utilizando la correlacin proporcionada se puede calcular x 1Q-6 m) 5.5 x 10-11 sji 90 x 10~6 m x 8.3 x 10~5 ^ x 1000 *'"N
1/2
2 + 1.45"
9.5 x 10-4
lOOO^f x 5.5 x 10-11 ^
= 3xlO-6s rea por volumen de lecho: kL

a =
6(1 -
6(1 -0.35) 90 x 10~6 m a = 43,333 m"1

a =
7.4. DISEO DE ABSORBEDORES Coeficiente de transferencia de masa volumtrico: kLa = 3 x 10~6 x 43,333 m~l = 0.13 s~l s Variables adimensionales:
_
V
777
401
(2.67 cm)(0.13 s'1) (8.3 x 10-5 ^ = 41.8 (-f) - e)

=
Q 10 J
-1
/i V
2.67 cmxO.35 8.3X10-5 ?xigÊ
25(1 -0.35) r = 8 x 10~ (-112.6)

3
donde i est dado en segundos. En la Figura 7.37 se muestran los resultados en forma grfica. En la Figura 7.37a se observa que el ajuste del modelo a la curva real es muy pobre. Utilizando el mismo modelo con K = 33 y ki 1.5 x 10~5 m/s, se produce un ajuste ms adecuado (Figura 7.37b). e) Modelo Contracorriente. De acuerdo a la ecuacin (7.138) el empleo de este modelo implica una integracin como la que se muestra en la parte inferior de la Figura 7.38. La curva de operacin que se muestra en la parte superior de la Figura est comprendida entre los puntos (O, 0) y [ yA,<l(yA) } La curva de equilibrio se obtiene dando valores a y, en el rango de O a T/, en la ecuacin de equilibrio. Los valores de y* se obtienen con valores de q tomados de la curva de operacin y sustituidos la ecuacin de equilibrio. La Tabla 7.5 muestra algunos valores de estos clculos. El rea bajo la curva de la Figura 7.38b es de 1.346 y de acuerdo a la ecuacin (7.102),
= 'f . ka
402
CAPTULO 7. ADSORCIN
i.o-
y_
Xa
0.80.60.40.20
50
100 150 200
250
t (min)
Figura 7.37: Curva de ruptura. Modelo cintico lineal. Ejemplo 7.9d. K = 25 y kL = 3 x 10'6 m/s
i.o0.80.60.40.20
O 50
100
150
t (min)
200
250
Figura 7.37: Continuacin...Modelo cintico lineal. Ejemplo 7.9d. K = 33 y kL = 1.5 x 1CT5 m/s
403
Tabla 7.5: Clculos para el modelo contracorriente. Ejemplo 7.9 e.
y
1.7099 1.7095 1.7090 1.7050 0.5000 0.2000 0.1000 0.0500 0.0300 0.0100 0.0050
q
42.5250 42.5150 42.5026 42.4031 12.4349 04.9740 02.4870 01.2435 00.7461 00.2487 00.1243
y*
1.7009 1.6657 1.6236 1.3498 0.0077 0.0025 0.0012 0.0006 0.0003 0.0001 0.0001
q* 42.5274 42.5273 42.5272 42.5261 41.4258 39.2694 36.1345 31.1594 26.3265 14.8276 08.9583
i/(y-y*)
111.7 022.8 011.7 002.8 002.0 005.1 010.1 020.2 033.7 101.1 202.2
L =
x 10~5 ^ x
100 cni
2.675 cm 0.00417 s~l
(1.346)
Teora de Equilibrio
La forma cualitativa de la respuesta dinmica de una columna est determinada completamente por las relaciones de equilibrio. La forma de los perfiles de concentracin y por lo tanto de las curvas de ruptura puede ser modificada considerablemente por efectos cinticos, pero stos siempre son secundarios, en el sentido que no introducen nuevos patrones de comportamiento, sino que slo modifican el comportamiento pronosticado a partir de consideraciones de equilibrio. En la teora de equilibrio en la cual todos los efectos cinticos se ignoran, la respuesta dinmica se estima con la suposicin que existe
404
CAPTULO 7.
ADSORCIN
I 1.2
y (mg/ml)
I 1.4
I 1.6
Figura 7.38: Modelo lecho a contracorriente, a) Curvas de equilibrio y operacin, b) Integracin grfica. Ejemplo 7.9e.
405
i/y-y*
0.2
0.4
0.6
0.8
1
y (mg/ml)
l 1.2
i 1.4
l 1.6
i 1.8
406
CAPTULO 7. ADSORCIN
un equilibrio local a travs de la columna. Este enfoque ha sido til para el anlisis preliminar de columnas, as como para el anlisis del comportamineto de sistemas complejos. La utilidad del enfoque de la teora de equilibrio puede ser ilustrado considerando el caso simple de un sistema en el cual el flujo es ideal y se alcanza el equilibrio local. Bajo estas condiciones la ecuacin (7.64) se reduce a: e = v
con,
(7.105)
R = (l-)-J. Por regla de la cadena:
(7.106)
dq dq dy dt dy dt combinando las ecuaciones anteriores se obtiene:

dy^
=
_ dy__(l_
\^[dy_
_ .dq] dy _ dy ) V dy\ 8t ~ ~ dz
rearreglando,
flii
f)
7i
r\ii
f\
p- = O
(7.107)
A partir de la ecuacin anterior se puede definir W(y) como la velocidad del frente de concentracin de una onda.
dy.
dt
dy
dz
W(y)
= ----j-
(7.108)
7.5. SUMARIO
407
Cuando la isoterma es desfavorable el trmino dq/dy de la ecuacin anterior aumenta al aumentar la concentracin y la velocidad de onda disminuye. La zona de transferencia de masa se ensancha conforme avanza la onda a travs de la columna, formando un patrn llamado proporcional. Cuando la isoterma es favorable dq/dy disminuye al aumentar la concentracin y la velocidad de onda aumenta. La zona de transferencia de masa tiende a desaparecer debido a que se forman perfiles invertidos ilgicos. En tales situaciones la onda debe ser sustituida por el frente de choque. En el comportamiento llamado de patrn constante el efecto de compactacin de la onda cuando el equilibrio es favorable, se compensa con los efectos dispersivos y la onda no se altera a lo largo de la columna (Ruthven, 1987).
7.5
Sumario
La adsorcin permite procesar soluciones diluidas para concentrar solutos mediante su inmovilizacin reversible en slidos especializados llamados adsorbentes. En el estudio de la adsorcin son de fundamental importancia cuatro aspectos: Los mecanismos de adsorcin de acuerdo al tipo de interaccin soluto-adsorbente, los tipos de adsorbentes disponibles, las relaciones de equlibrio de los sistemas y la cintica de la adsorcin. La operacin de adsorcin puede realizarse en forma intermitente o continua en tanques agitados, pero se realiza ms frecuentemente en columnas de lecho fijo. La descripcin de la dinmica de la adsorcin es relativamente compleja y puede ser abordada mediante diferentes enfoques que conducen a diseos que varan desde los puramente empricos hasta los muy sofisticados.
408
CAPTULO 7.
ADSORCIN
120 110 100

090
oao
070
q (mg / mi)
060 050 040 030 020 010
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
y (mg / mi)
Figura 7.39: Curva de equilibrio para albmina. Fuente: Skidmore et al, 1990.
7.6
Problemas
7.1.- Calcular las constantes k y q0 para el sistema Albmina-S Sefarosa FF a pH=5 y T=25C a partir de la Figura 7.39. 7.2.- Un volumen de 2 litros de una solucin proteica con una concentracin de soluto de 0.5 mg/ml, se mezcla con 50 mi de adsorbente en una operacin intermitente y se obtiene un 90 % de recuperacin. Estimar la concentracin final de soluto en el adsorbente. 7.3.- Estimar el porcentaje de prdidas del Ejemplo 7.6 si la adsorcin se deja a correr 2.5 horas.
7.6. PROBLEMAS
409
7.4.- Encontrar la expresin matemtica para q(t) en el caso del adsorbedor tipo tanque agitado continuo. 7.5.- Simular el perfil adimensional de un adsorbedor utilizando el modelo de la teora de platos con 0=30 min y: a) N=50 b) N=100 c) N=300 7.6.- La curva de ruptura de una columna puede simularse adecuadamente mediante un modelo cintico lineal con K = 150, 6 = 0.35, kL = 10~4 m/5, F = 50 cm 3 /mm, A = 0.785 cm2 y L = 10 cm. Analizar el efecto sobre la curva de ruptura de 20 % de variacin en ki,a, K y F, considerando los parmetros restantes constantes. 7.7.- Obtener la ecuacin (7.99). (Ver Problema 22L4 de Bird, 1960) 7.8.- El procesamiento directo de caldos completos para la recuperacin de productos extracelulares, se ha estudiado como una alternativa para disminuir las prdidas asociadas a varios pasos de recuperacin, y por lo tanto incrementar la recuperacin. Sin embargo, el procesamiento de caldos completos en columnas puede originar problemas de taponamiento de stas, entonces una alternativa es el uso de adsorbedores continuos tipo tanque. Este sistema ha sido utilizado en la recuperacin de novobiocina (Payne, 1989). Obtener la variacin de la concentracin de novobiocina en la salida del tanque si el tiempo de residencia en el tanque VL/IF = 0.33 /i, la relacin de adsorbente a flujo es S/F = 98 g h/l y la concentracin de la solucin a la entrada y A 2 g/L Considere un tanque perfectamente agitado en el cual la solucin y el adsorbente siempre estn en equilibrio, y que el equilibrio es lineal con K = 0.015 l/g adsorbente. 7.9.- Se utiliza una columna de intercambio inico de lecho mvil para separar cefalosporina de un caldo de fermentacin que contiene 5 g/l del antibitico, utilizando una relacin de flujos de 10 a 1. Determinar la altura necesaria de la columna para recuperar el 96 % de cefalosporina, si la velocidad de flujo de lquido permisible es de 1.5 m/h y el coeficiente volumtrico de transferencia de masa toma un
410
CAPTULO 7. ADSORCIN
valor de 12 h~l. La relacin de equilibrio del sistema es: q = 25y'/2 donde q est en g/l de resina mientras que y en g/l de solucin. Resp. L = 0.6 ra 7.10.- Un nuevo antibitico se va a separar de un caldo de fermentacin mediante una operacin de adsorcin en lecho fijo, utilizando una columna de 5 era de dimetro y 50 cm de longitud. En esta columna el coeficiente de transferencia de masa volumtrico esperado es de 9 h~l. La alimentacin a la columna tiene una concentracin de 4 g/l y se desea que la corriente de salida contenga solamente 0.1 g/l. La relacin de equlbrio del sistema es: q = 20J/1/2 y la linea de operacin est dada por: 9 = 5(y-0.1) Estimar el flujo manejable por la columna. Resp. 150 l/h 7.11.- En la adsorcin intermitente de /3-galactosidasa la relacin de la actividad inicial de la enzima en la solucin a la actividad de la enzima en solucin a los 10 min es de 2.86; y a los 30 min de 5.755. Para tiempos muy grandes el valor es de 7.39 ( Pungor et a/, 1987). Considerando el modelo de adsorcin intermitente (equilibrio lineal y control de la pelcula) siguiente: ^- = P + (1 -P)exp(-Bt)
VA
estimar los parmetros P y B. Resp. P = 0.135 y B = 0.103 7.12.- En la adsorcin intermitente de albmina en un adsorbente de Sefarosa la curva de equilibrio se puede aproximar en forma lineal a:
7.6. PROBLEMAS
411
Los parmetros de la adsorcin son:
kL
= 5 x 10~6 m/5
e = 0.99 dp = 105 x 10-6 m y = 2 mg/ml

Representar grficamente la variacin de la concentracin de soluto en la fase lquida con el tiempo de adsorcin, suponiendo una sola resistencia controlante y equilibrio lineal. 7.13.- En una columna de lecho fijo empacada con S Sefarosa se realiza la adsorcin de albmina bajo las siguientes condiciones: q =
kL dp
l3Qy(aprox.)
= 5.6 x 10~6 m/s = 105 x 10~6 m
e = 0.35
y A = 1 mg/ml
Dc = 1 era
L = 2.3 era
F = 1 cra3/ran Mediante el modelo cintico de resistencia en la pelcula y equilibrio lineal, obtener una representacin grfica de la curva de rompimiento del sistema. 7.14.- En condiciones de adsorcin muy favorables (irreversible), la forma de la zona de transferencia de masa de la columna es independiente del tiempo (patrn constante). Bajo estas condiciones y con el control de la resistencia a la transferencia de masa al interior del poro
412
CAPTULO 7. ADSORCIN
(modelo adecuado para algunos procesos de afinidad), la curva de ruptura adimensional es nica, permite representar varias condiciones de operacin, y est dada por (Arnold et a/, 1985):
X =1 -
- 0.2737Vrt/p
- -1
Cuando se emplea una columna de Sefarosa 4B- Acido- Arsanlico para adsorber anticuerpos monoclonales bajo las siguientes condiciones:
dp
= 0.01 era
v L e ^ VA
= = = =
0.011 cm/s 16.5 era 0.6 18.1
el modelo se ajusta a los datos experimentales con NTUP = 8.

a).- Gra,ficar la curva de ruptura para el escalamiento del sistema con qn/yA = 18.1 y una columna de 15 x 60 era , en los siguientes tres casos: al.- v = 0.020 cm/s a2.- v = 0.015 cm/s a3.- v = 0.010 cm/s b).- Graficar x vs volumen alimentado (Ft eV) en el rango de 70 a 86 litros, para cada uno de los tres casos anteriores. c).- Que significa el punto de interseccin de las tres curvas?
7.7. BIBLIOGRAFA
413
7.7
Bibliografa
Arnold, F.H., Blanch, H.W., y Wilke, C.R. 1985. L- Predicting the performance of affinity adsorbers. II.- The characterization of affinity columns by pulse techniques. Chem. Eng. Journal. 30, B9-B36. Belter, P.A., Cussler, E.L. y Hu, W. 1988. Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology. John Wiley and Sons. 6, 145-179. Bird, R.B., Stewart, W.E. y Lightfoot, E.N. 1960. Fenmenos de Transporte. Ed. Reverte S.A. Mxico. 22, 22-27. Clonis, Y.D. 1990. Process affinity chromatography. En: Separations Processes in Biotechnology. Asenjo, J.A. (Ed.). Marcel, Dekker. New York. 13, 401-445. Draeger, N.M. y Chase, H.A. 1990. Modelling of protein adsorption in liquid fluidized beds. En: Separations for Biotehnology 2. Pyle, D.L.(Ed.). Elsevier Applied Science. London. 325-334. Gailliot, F.P., Gleason, C., Wilson, J.J. y Zwarik, J. 1990. Fluidized bed adsorption for whole broth extraction. Biotechnology Progress. 6, 5, 370-375. Hall, K.R., Eagleton, L.C., Acrivos, A. y Vermeulen, T. 1966. Pore and solid diffusion kinetics in fixed-bed adsorption under constant - pattern conditions. IEC Fundamentis. 5, 2, 212-223. Horstmann, B.J. y Chase, H.A. 1989. Modelling the affinity adsorption of immunoglobulin G to protein A inmobilised to agarosa matrices. Chem. Eng. Res. Des. 67, 243-254. Levenspiel, O. 1962. Chemical Reaction Engineering. John Wiley and Sons. New York. 14, 426-489. Payne. G.F. 1989. Bioseparations of traditional fermentations products. En: Chemical Engineering Problems in Biotechnology. Schuler, M.L. (Ed). AIChE. New York. 1, 183-207.
f.
"3*
?r
414
CAPTULO 7. ADSORCIN
Ptmgor, E., Afeyan, N.B., Cordn, N.F. y Cooney C.L. 1987. Continuous affinity-recycle extractions: A novel potein separation technique. Bio/Technology. 5, 604-608. Ruthven, D.M. 1987. Adsorption kinetics and adsorption column dynamics. En: Fundamental of Adsorption. Liapis, A.I. (Ed.). Skidmore, G.L., Horstmann, B.J. y Chase, H.A. 1990. Modelling single-component protein adsorption to the catin exchanger Sepharose FF. J. of Chromatography. 498, 113-128. Torres, J.L., Guzmn, R., Carbonell, R.G. y Kilpatrick, D.K. 1988. Affinity surfactants as reversibly bound ligands for high-performance affinity chromatography. Analytical Biochemistry. 171, 411-418. Vermeulen, T., Klein, G. y Hiester, N.K. 1973. Adsorption and ion exchange. En: Chemical Engineer's Handbook. Perry, H.R. y Chilton, C.H. (Eds.). Me Graw Hill. Fifth Edition. New York. 16, 1-50. Vijayalakshmi, M.A. 1989. Pseudobioespecific ligan affinity chromatography. TibTech. 7, 71-76. Wang, N.L. 1990. Ion exchange in purification. En: Separations Processes in Biotechnology. Asenjo, J.A. (Ed.). Marcel, Dekker. New York. 12, 359-400. Yang, C. y Tsao, G.T. 1982. Packed-bed adsorption theories and their applications to affinity chromatography. En: Advances of Biochemical Engennering. Flechter, A. (Ed.). Springer-Verlag. New York. 25, 1-18 Yarmush, M.L. y Cotton, C.K. 1985. Affinity chromatography. En: Comprenhensive Biotechnology. Murray, M.Y. (Ed.). Permagon Press. New York. 32, 507-521.
Parte IV Purificacin del Producto
417
Una vez que los caldos biolgicos han sido concentrados el paso siguiente dentro de un esquema general de separacin, es la purificacin del producto de inters. En esta parte se presentan los principios generales de las operaciones ms utilizadas para efectuar esta purificacin: la cromatografa por elucin, la precipitacin, la ultrafiltracin y la electroforesis. La cromatografa por elucin puede analizarse empleando gran parte de los conceptos utilizados para describir la adsorcin en lecho fijo, por lo que es la primera operacin tratada en esta parte. En el captulo 9 se presenta la operacin de precipitacin, que requiere un enfoque fuertemente fisicoqumico, muy caracterstico de esta operacin. En los captulos 10 y 11, se presentan las operaciones de ultrafiltracin y electroforesis dado que sus principios permiten una presentacin ms unificada.
Captulo 8 Cromatografa por Elucin.

8.1 Introduccin
La cromatografa por elucin es un mtodo para separar en sus componentes (resolver) una mezcla de solutos y es empleada con el propsito de puricar productos de inters. Esta se efecta en columnas empacadas con adsorbentes que pueden ser slidos, slidos porosos o geles. El adsorbente constituye la fase estacionaria de la columna. En la operacin de una columna cromatogrfica se aplica una pequena cantidad de muestra en la parte superior de la columna. Una vez colocada la mezcla se hace pasar un lquido que favorezca la desorcin llamado eluyente (fase mvil). Conforme avanzan los solutos sobre la columna stos se separan permitiendo su purificacin. En la cromatografa por elucin isocrtica la composicin del eluyente se mantiene constante durante el proceso. En la elucin por gradiente la composicin del eluyente se vara gradualmente. La operacin de una columna de cromatografa es similar a la de una columna de adsorcin. Sin embargo, en la cromatografa por elucin la columna no se satura completamente con soluto, sino que slo se carga en forma controlada una porcin de sta.. La decisin entre emplear adsorcin frontal o cromatografa por elucin en una separacin, radica principalmente en la dilucin del soluto. Por'ejemplo, si se desea remover dos compuestos orgnicos A y B muy similares que se encuentran diluidos en agua, la operacin
419
420
CAPTULO 8. CROMATOGRAFA POR ELUCIN.
apropiada es una adsorcin frontal. Por otro lado, si estos mismos compuestos se desean separar entre s con una alta pureza a partir de una muestra concentrada, la seleccin apropiada es la cromatografa por elucin. Entre estos dos casos extremos de separaciones en columna, se han desarrollado otros modos intermedios como la cromatografa por desplazamiento y la de recirculacin. En la Figura 8.1 se ilustra la separacin cromatogrfica de una mezcla de tres solutos. Cada soluto tiene diferente grado de retencin en la columna de tal manera que la velocidad de avance de cada uno es diferente, siendo el soluto A el ms lento y el soluto C el ms rpido. Un detector de solutos a la salida de la columna obtendra una grfica como la de la Figura 8.2, llamada cromatograma. En la cromatografa por elucin el soluto se purifica a expensas de cierto grado de dilucin, mientras que en la adsorcin el soluto se retiene en la columna y posteriormente se eluye concentrado. Para abordar el tema de cromatografa por elucin en la seccin 8.2 de este captulo se presentan los fundamentos de la cromatografa, describiendo las principales tcnicas cromatogrficas, tipos de adsorbentes, las relaciones de equilibrio y cinticas que son utilizadas en esta operacin. En la seccin 8.3 se revisan los principales equipos utilizados en las operaciones cromatogrficas. En la seccin 8.4 se presentan algunos de los modelos para el diseo de equipos cromatogrficos que nos permiten predecir y analizar los perfiles de concentracin o cromatogramas.
8.2
Fundamentos
Existen varias tcnicas cromatogrficas basadas en la interaccin de una fase mvil lquida y una fase estacionaria. Cinco aspectos fundamentales permiten distinguir las semejanzas y diferencias entre ellas: El tipo de principio de separacin que emplea cada una de ellas. Las caractersticas de las matrices que utilizan. La presin a la que se desarrollan. La relacin de equilibrio.
8.2.
FUNDAMENTOS
421
Eluyente
Columna empacada con adsorbente
Inyeccin de muestra (componentes O, A, O)
Eluyente
Eluyente
>
Tiempo
Eluyente
"A*M A " A AA A
>
F^
Eluyente
0TO D 0 0 D
0 0
Eluyente <
D aD'
11 D D OD -
000 O
o ooo
Figura 8.1: Esquema de una columna de cromatografa. Adaptada de: Belter et al, 1588.
422
CAPTULO 8. CROMATOGRAFA
POR ELUCIN.
Tiempo
Figura 8.2: Cromatograma tpico. Adaptada de: Belter et al, 1988.

La cintica de la adsorcin.
8.2.1
Tipos de Cromatografa Lquida segn el Principio de Separacin
De acuerdo al principio utilizado para la separacin se pueden distinguir < tres tipos bsicos de cromatografa por elucin: - Cromatografa lquido-lquido. - Cromatografa de filtracin en gel o cromatografa por exclusin. - Cromatografa por adsorcin. Cromatografa Lquido-Lquido En la cromatografa lquido-lquido se utiliza un adsorbente slido impregnado con un lquido que funciona como fase estacionaria. La separacin de los solutos es resultado de las diferencias en los coeficientes de particin de cada uno de los solutos de la mezcla entre las fases lquidas (estacionaria y mvil). Cromatografa por Filtracin en Gel La cromatografa por filtracin en gel utiliza partculas fabricadas de geles porosas que actan como mallas moleculares que permiten separar
8.2.
FUNDAMENTOS
423
molculas en funcin de su tamao. Este tipo de cromatografa es comunmente empleada en las ltimas etapas de los procesos de obtencin de protenas.
Cromatografa por Adsorcin

La cromatografa por adsorcin emplea adsorbentes en los que los solutos a separar presentan diferentes grados de retencin. Existen varias modalidades caracterizadas bsicamente por el tipo de adsorbente que emplea, llamadas cromatografa de adsorcin: - Fsica. - Por intercambio inico. - De interaccin hidrofbica. - De fase inversa. - De afinidad. Cromatografa de adsorcin simple.- Se caracteriza por la unin del soluto al adsorbente por fuerzas dbiles del tipo de van Der Waals. Este tipo de cromatografa es poco selectiva entonces se utiliza poco a nivel analtico, pero por su bajo costo es utilizada a nivel industrial. Cromatografa por intercambio inico.- La cromatografa por intercambio inico se basa en la interaccin electorosttica entre los grupos cargados del soluto y los grupos cargados de los adsorbentes utilizados en sta. Cromatografa de interaccin hidrofbica y cromatografa de fase inversa.- Tanto la cromatografa de interaccin hidrofbica como la de fase inversa, se basan en la interaccin entre las regiones hidrofbicas de molculas como las protenas y los grupos hidrofbicos de los adsorbentes empleados.
Cromatografa por afinidad.- La cromatografa por afinidad est basada en interacciones altamente especficas entre el soluto de inters y el adsorbente. Este tipo de cromatografa es muy empleada en la purificacin de protenas. Los adsorbentes utilizados en esta cromatografa
424
POR ELUCIN.
presentan grupos qumicos llamados ligandos que son altamente especficos para la unin con los solutos.
8.2.2
Matrices
Actualmente diversos tipos de materiales o matrices son utilizados para fabricar los soportes (empaques) de las columnas cromatogrficas. En algunos casos estos materiales se modifican qumicamente para incrementar su especificidad. Alrededor del 90 % de las matrices que se emplean actualmente estn hechas de materiales que forman geles de alto poder hidratante, los cuales se comercializan en forma de pequeas esferas cuyo dimetro vara entre 10 y 100 /ra. La Figura 8.3 muestra la estructura de algunas de las matrices empleadas en cromatografa. En general los materiales de las matrices pueden ser de cuatro tipos: Materiales inorgnicos. Slica porosa Vidrio de poro controlado (Marca Spherosill) Hidroxiapatita Polmeros orgnicos sintticos. Poliacrilamida (Marca Biogel P) Polimetacrilato (Marca Spheron) poliestireno Polisacridos Celulosa (Marcas Whatman, Cellulofine y Sephacel) Dextrano (Marca Sephadex) Agarosa (Marcas Sepharosa, Superosa, Ultrogel A y BoGel.) Compuestos: polmeros orgnicos-polisacridos. Poli-N,./V -bisacrilamida-dextrano (Marca Sephacryl)
S.2. FUNDAMENTOS
425
CH2OH
B
HO
OH
OH
NH2 C=O I CHaCH CHaCH CHzCH C=O I HN
C= O I NH2
HN I C=O I CH2 CH CH2 CH CH2 CH I I
I HN
c= o
c o
NH2
Figura 8.3: Estructuras de matrices, a) Celulosa (fi 1-4). b) Dextrano (di 1-6). c) Agarosa. d) Poliacrilamida entrecruzada. Fuente: Janson, 1989.
Reproducida con el permiso de VCH Publishers. Copyright 1995. Todos los derechos reservados.
426
CAPTULO 8. CROMATOGRAFA Agarosa-dextrano (Marca Superdex) Agarosa-poliacrilamida (Marca Ultrogel AcA)
POR ELUCIN.
Desde el punto de vista funcional se pueden distinguir dos tipos de geles: microporosas y macroporosas (Figura 8.4). Las geles microporosas se obtienen por entrecruzamiento puntual de polmeros lineales como el dextrano y la poliacrilamida. Este tipo de geles son utilizadas en cromatografa de filtracin en gel y tienen baja resistencia mecnica. Las geles macroporosas se obtienen por entrecruzamiento y agregacin de polmeros, como la agarosa y la poliacrilamida macroreticular. Este tipo de geles son empleadas en cromatografa de intercambio inico y de afinidad donde se requieren poros ms grandes. Las geles compuestas se forman al introducir geles de microporos en los poros de las geles de macroporos, para combinar las ventajas de ambos tipos de materiales. De acuerdo a su comportamiento con relacin al solvente, se pueden distinguir dos tipos de geles: xerogeles y aerogeles. Las xerogeles se caracterizan por arrugarse e hincharse en la ausencia y presencia del solvente, respectivamente. Por otro lado, el volumen de las aerogeles es independiente del solvente. Las geles de dextrano entrecruzadc (Sephadex) y las de poliacrilamida, pertenecen a las xerogeles; mientra* que las geles de vidrio poroso, slica, poliestireno y polimetacrilato sor aerogeles. Tipo de Cromatografa y Tipo de Matriz Existe una relacin directa entre el tipo de cromatografa y el tipo d< matriz empleada, a continuacin se presentan algunos ejemplos parti culares. Cromatografa Lquido-Lquido.- En la cromatografa lquido lquido se emplean partculas de tierras diatnicas impregnadas coi propilen-glicol. Esta tcnica es poco selectiva por lo que no es mu; utilizada en el laboratorio, pero debido a su bajo costo es utilizada escala industrial. Cromatografa de filtracin en gel.- En la cromatografa de fil tracin en gel se emplean bsicamente geles de microporos de dextran o poliacrilamida.
8.2.
FUNDAMENTOS
427
(b)
(c)
Figura 8.4: Matrices microporosas y macroporosas. a) Celulosa, b) Polmeros entrecruzados como poliacrilamida y dextrano. c) Agarosa. Fuente: Janson, 1989.
Reproducida con el permiso de VCH Publishers. Copyright 1995. Todos los derechos reservados.
428
CAPTULO 8. CROMATOGRAFA POR ELUCIN
/J-OCH2COO
Carboximetil
Fosfato
-OCH2CH2SO3
Sulfoetil
Sulfopropil
XCH2CH3 OCH2CH2N( I CH2CH3 n
Dietilamino-etil
' *"' Chfe Chb CH2 CH3
Trietilamino-etil
Figura 8.5: Grupos funcionales de adsorbentes inicos. Cromatografa por adsorcin.- Los procesos cromatogrficos basados en la adsorcin simple de solutos en un adsorbente slido poroso, utilizan adsorbentes como almina y slica-gel. Como ya se ha mencionado este tipo de adsorbentes son poco selectivos, pero debido a su bajo costo este tipo de cromatografa tambin se aplica slo en separaciones en procesos industriales. La cromatografa por intercambio inico es una de las ms utilizadas a nivel industrial para la purificacin de diferentes tipos de compuestos. Las resinas utilizadas son de dos tipos: catinicas y amnicas, dependiendo del grupo inico (Figura 8.5).
S.2.
FUNDAMENTOS
Fenil C6Hs-
429
Octadel Octil Butil Etil
Figura 8.6: Grupos funcionales comunes de la cromatografa de interaccin hidrofbica y de fase inversa. En las tcnicas cromatogrficas de interaccin hidrofbica y fase inversa, la fase estacionaria consiste de una matriz con ligandos no polares (Figura 8.6). La separacin se basa en el hecho de que algunas molculas como las protenas presentan residuos externos no polares, de tal manera que en soluciones no acuosas estos tienden a interaccionar con los ligandos no polares de los soportes. Las interacciones hidrofbicas entre la protena y el ligando del soporte, se fortalecen utilizando medios con altas concentraciones salinas, por ejemplo: sulfato de amonio a una concentracin cercana a la de precipitacin de la de la protena. Para elur las protenas se utiliza una solucin con concentracin salina baja o un solvente de baja polaridad. En la cromatografa de fase inversa no se utilizan solventes de baja polaridad para elur, para evitar la desnaturalizacin de las protenas, y ese es su rasgo distintivo respecto a la cromatografa de interaccin hidrofbica. En la cromatografa con iones metlicos, el adsorbente contiene iones metlicos inmovilizados sobre el soporte por medio de grupos quelantes como el cido iminodiactico. El tipo de iones ms utilizados son el Cu+2 y el Zn +2 . Estos iones interactan con los grupos cargados de las protenas como es el caso de los residuos de histidina. La cromatografa que utiliza colorantes como ligandos, se basa en el hecho que cierto tipo de estos colorantes interactan fuertemente con los grupos aninicos de las protenas. Los colorantes asemejan estructuras biolgicas como los cofactores
430
CAPTULO 8. CROMATOGRAFA POR ELUCIN,
,S03H
S03H SO3H(m/p)
H03S
SO3H
H03S
03H
H03S
03H
S03H
S03H
Figura 8.7: Colorantes utilizados como ligandos. a) Azul A. b) Rojo A. c) Naranja A.
$.2.
FUNDAMENTOS
431
Tabla 8.1: Tipos de cromatografas de acuerdo a su presin de operacin. Tipo Baja Moderada Alta Presin (atm) 1 2-50 51-350 Dimetro ((m) 90-100 30-50 5-10
NAD y ATP y permiten la interaccin con ciertas protenas. La ventaja es que son ms baratos que dichos cofactores, ms fciles de unir a las matrices y ms estables (Figura 8.7). Otro tipo de cromatografa utiliza ligandos biolgicos altamente especficos para ciertos sustratos. Las diferentes modalidades de la adsorcin por afinidad se presentan en la Figura 7.8.
8.2.3
Tipo de Cromatografa de Acuerdo a la Presin de Operacin
De acuerdo al tamao de partcula y a la presin de operacin que emplea, la cromatografa lquida se puede clasificar en cromatografa de presin baja, presin moderada y presin alta (la cromatografa lquida a presin alta es caracterstica de la tcnica llamada cromatografa lquida de alta resolucin, HPLC de sus siglas en ingls). En la Tabla 8.1 se presentan las presiones y el tamao de partcula caractersticas de cada una de ellas.
8.2.4
Relaciones de Equilibrio
En el anlisis de columnas cromatogrficas, las relaciones de equilibrio se expresan por medio de isotermas de adsorcin o curvas que relacionan la concentracin en el equilibrio del soluto en la fase estacionaria y de! soluto en la fase mvil. Dichas isotermas son generalmente no lineales mostrando comportamientos tipo Langmuir o Freundlich. Esta isotermas son iguales a las descritas en el captulo anterior.
432
POR ELUCIN.
8.2.5
Cintica de la Adsorcin
Algunos modelos utilizados para describir una operacin cromatogrfica toman en cuenta las resistencias a la transferencia de masa involucrada? en el proceso, las cuales pueden ser descritas mediante un mecanisrnc de cinco pasos: 1. Difusin del soluto del seno del lquido a travs de una pelcul; de lquido que rodea al adsorbente. 2. Difusin del soluto dentro del poro del adsorbente. 3. Reaccin reversible del soluto con el adsorbente (la reaccin pued involucrar adsorcin, reaccin y desorcin de superficie). 4. Contradifusin del soluto en el poro hacia la superficie del adso bente. 5. Contradifusin del soluto de la superficie del adsorbente hacia seno del lquido, a travs de la pelcula de lquido. Generalmente uno o dos de los pasos descritos anteriormente son 1< ms lentos, de tal manera que son los que controlan la velocidad glob de transporte del soluto.
8.3
Equipo Cromatogrfico
Los principales equipos cromatogrficos son columnas fabricadas plstico, vidrio o acero inoxidable. Las columnas para cromatogra en gel tienen relaciones LD muy bajas, en el rango de 0.3 a 3; c dimetros mximos de 1.5 rn. En el caso de geles blandas la longit necesaria de la columna se alcanza por medio de sistemas de varias columnas cortas. Las columnas empleadas en cromatografa HPLC tienen dimet de hasta 80 cm y altura de lecho de 120 era (Figura 8.8). Este t: de columnas deben ser empacadas utilizando sistemas hidrulicos ( permitan el manejo adecuado del empaque.
S.3. EQUIPO
CROMATOGRAFICO
433
Salida Distribuidor
Bomba
Figura 8.8: Columna cromatogrfica. Adaptada de: Nicoud y Perrut, 1991.

Reproducida con el permiso de Kluwer Acadeiic Publishers. Copyright 1991. Todos los derechos reservados.
434
POR ELUCIN.
8.4
Diseo de Columnas Cromatogrficas
La obtencin de productos biotecnolgicos con grados de pureza y mercados cada vez mayores, ha creado la necesidad de llevar a escala de proceso las tcnicas que tradicionalmente se utilizan slo a nivel laboratorio. Es en esta transicin donde los conocimientos ingenenles juegan un papel muy importante. Una de las tcnicas que ha recibido ms atencin en este sentido es la cromatografa, particularmente en el arreglo tipo columna de lecho fijo. Tres conceptos se combinan para lograr un diseo apropiado de estas columnas cromatogrficas: El modelo de la columna. Los criterios para la evaluacin tcnica del comportamiento de la columna: Resolucin, Pureza y Rendimiento. Los procedimientos de escalamiento y optimizacin de la columna.
8.4.1
Modelos Cromatogrficos
Varios modelos empleados para el anlisis y diseo de columnas cromatogrficas que operan bajo condiciones isocrticas, utilizan isotermas lineales para describir las relaciones de equilibrio que se presentan en stas, debido a que por su simplicidad dichos modelos pueden ser resueltos analticamente para obtener los perfiles de concentracin tipo campana de Gauss, que se observan experimentalmente en algunos cromatogramas. La suposicin de una isoterma lineal se puede justificar en funcin de que un gran nmero de sistemas cromatogrficos se trabajan con muestras pequeas, de tal manera que el rango de concentraciones en la columna es bajo, y puede ser situado en el rango lineal de cualquier tipo de isoterma (en la regin de baja concentracin). El trabajar con muestras pequeas permite tener una buena separacin de los solutos de la mezcla (resolucin) a expensas de un bajo rendimiento o cantidad de muestra que puede ser procesada. Sin embargo, es conveniente
8. DISEO DE COLUMNAS CROMATOGRFICAS
435
establecer que este enfoque tiene sus limitaciones , principalmente para los sistema cromatogrficos muy selectivos como los de afinidad. Cuando la elucin es por gradiente, las relaciones de equilibrio varan conforme cambia la composicin de los eluyentes y los modelos basados en isotermas lineales no son aplicables directamente. Actualmente se cuenta con algunas tcnicas cromatogrficas que emplean otros principios como es la cromatografa por desplazamiento y la de cambio cclico de la zona de adsorcin, donde tampoco son aplicables los modelos basados en isotermas lineales. A nivel preparativo la cromatografa por elucin se utiliza bajo condiciones de sobrecarga con el propsito de incrementar la productividad de la columna; esto puede lograrse incrementando el volumen o la concentracin de la muestra (Figura 8.9). Bajo estas condiciones la aplicacin de los modelos lineales tambin es limitada. Esta seccin slo se refiere a los principios bsicos de la cromatografa por elucin isocrtica en columna y principalmente a los modelos basados en isotermas lineales. Existen tres enfoques bsicos para la obtencin de estos modelos cromatogrficos de columnas: La teora de platos. La teora cintica. Teora de platos y Teora cintica combinadas. Modelo de Platos Tericos o Etapas El modelo de platos tericos es uno de los ms usados el anlisis de la cromatografa por elucin. Sin embargo, este modelo tiene sus limitaciones en lo que se refiere al diseo y escalamiento de columnas, por lo que su uso es cada vez ms limitado. En el desarrollo del modelo de platos tericos se supone que la columna se comporta como una serie de etapas en equilibrio. Cada etapa puede visualizarse como un adsorbedor tipo tanque de volumen constante. El solvente fluye de un tanque hacia el otro, mientras que el adsorbente permanece fijo en su tanque respectivo (Figura 8.10). El balance de masa del soluto para la etapa ?i puede ser escrito como:
436
POR ELUCIN
Figura 8.9: Cromatografa analtica y preparativa, a) Analtica, b Sobrecarga de volumen, c) Sobrecarga de concentracin. Fuente: Kno: y Pyper, 1986.
Reproducida con el permiso de Elsevier Science Inc. Copyright 1986. Todos los derechos rese vados.
8.4. DISEO DE COLUMNAS CROMATOGRAFICAS
437
y(L.t)
Etapa
y,
Etapa 2
Figura 8.10: Modelo por etapas.
438
Acumulacin en el liquido Entrada Salida Adsorcin lo cual pude ser expresado mediante la siguiente ecuacin: 7T - Fyn-i - Fyn - (1 - e)VE- \it cLt donde: VE'- Volumen de la etapa (lquido ms adsorbente). : Volumen del lquido por volumen de etapa. F: Flujo de alimentacin. yn: Concentracin de soluto en la solucin en la etapa n. qn: Concentracin de soluto en el adsorbente en la etapa n. El modelo supone que cada etapa est en equilibrio y que la relacin de equilibrio est dada por una isoterma lineal, de tal manera que en cada etapa la relacin de concentraciones puede ser expresada como:
qn = Kyn
(8.1)
(8-2)
Combinando las ecuaciones (8.1) y (8.2) se obtiene: {[e + (1 - e)K] VE] % - F(y n _, - yn) (8.3)
donde la cantidad entre corchetes es un volumen hipottico de lquido V* = [e + (1 E)K\VE que contiene al soluto de las fases lquida y slida (de tal manera que la expresin (8.3) es equivalente a un balance de masa de un tanque de volumen V* con entrada y salida). La ecuacin (8.3) puede ser resuelta con las siguientes condiciones: 1. Inicialmente ninguna etapa contiene soluto.
para t < O, yn = O para n = 1,2, ...N
8.4. DISEO DE COLUMNAS
CROMATOGRAFAS
439
donde N es el nmero total de etapas en la columna. 2. Al inicio de la operacin de la columna se inyecta un pulso muy corto de tal manera que: para t = O, yi = yA
(lo anterior corresponde a considerar que la masa de soluto que se alimenta a la primera etapa en el tiempo cero es M = V*y). La forma integrada es:
yn = y A
donde el tiempo adimensional r est dado por:
T =
(8.4)
Ft ( + (l-e)K]VE
(8.5)
o bien
como el volumen total del lecho Vc se puede expresar como: Vc = entonces la ecuacin (8.5) tambin puede ser expresada de la siguiente forma:
r =
NFt
(l-e)K]Vc
(8.6)
La ecuacin (8.4) es la expresin de una distribucin de Poisson. Para N grandes (mayores a 30) sta se aproxima a una distribucin de Gauss (Figura 8.11), caracterstica de los cromatogramas que se observan experimentalmente en comatografas de laboratorio donde la cantidad de muestra es pequea. En el modelo de platos tericos la variacin con el tiempo de la concentracin de soluto a la salida de la columna, puede aproximarse con la ecuacin de una distribucin de Gauss, de tal manera que:
440
N = 10
o.io-
o.os N=100
o.oo
50
I 100
150
Figura 8.11: Aproximacin de la distribucin de Poisson a la de Gauss.
CROMATOGRAFAS
441
(r y = yexP -Hr-5^
(8-7)
donde: y0: Concentracin mxima de soluto a la salida de la columna. T^: Desviacin estndar del perfil de concentracin de soluto. TO: Tiempo adimensional para el cual la concentracin de salida es mxima (tiempo adimensional de retencin). La ecuacin (8.7) relaciona la concentracin y con los parmetros yo ? oA Y TO] Y con la variable r. Para poder utilizar dicha ecuacin es necesario relacionar estos parmetros con el sistema fsico particular. El parmetro y0 puede ser relacionado con el sistema mediante un balance de masa en toda la columna. De este balance se obtiene la expresin de la masa M de soluto alimentada al sistema,
yoo
M= I Jo la cual puede ser aproximada a
Fydt
(8.8)
M=
Fydt
(8.9)
la ecuacin anterior se integra combinndola con la ecuacin (8.7), sustituyendo dt por V*dr/F, y multiplicando y dividiendo por (2 de tal manera que:
M=
exp
dr} (8.10)
puede encontrarse en cualquier texto de probabilidad y estadstica que la expresin entre corchetes de la ecuacin anterior vale uno, de tal manera que:
442
(8.11) como M = V*yA, entonces,
yo =
(8.12)
que es la expresin que se busca para el primer parmetro. Mediante las definiciones de media y desviacin estndar, y \it\- \ lizando la ecuacin (8.4), es posible relacionar a A y TO con el nmero de etapas de la columna, de tal manera que: (8.13)
(8.14) Mediante la ecuacin (8.5) se puede definir un t0, dado por:

7 * n ~~
NFt0
(l-e)K]Ve
(8.15)
como TO = N, entonces:
t0 =
(l-e)K]Ve
(8.16)
(El tiempo real de retencin de un soluto en la columna, es funcin del tiempo de residencia del fluido en la columna (V^/F), la porosidad e del lecho y la constante K.) Finalmente, la ecuacin (8.7) puede ser escrita en trminos de las caractersticas y condiciones de la columna como:
y = yoexp
(-0
2_ N
(8.17)

>
CROMATOGRAFICAS
443
La ecuacin (8.17) es una distribucin normal que tiene un mximo en t = t0 igual a:
yo =
y una desviacin estndar:
(27TJV)
a=
x/TV
La ecuacin (8.17) tambin puede expresarse en trminos del volumen V de solvente aadido a la columna, considerando un flujo constante, de tal manera que:
t=
V F
Vo
(8.18) (8.19)
F
y entonces,
y = yoexp
(*-') __
N
(8.20)
Aplicacin del Modelo de Platos.- Las ecuaciones (8.17) y (8.20) pueden ser utilizadas para estimar el nmero de etapas de una columna a partir de datos experimentales de concentracin contra tiempo. Una vez calculada N y contando con la longitud de la columna L, se puede obtener la altura equivalente de un plato terico (HETP de sus siglas en ingls) de la columna, la cual es una medida de la eficiencia de sta, mediante la siguiente ecuacin:
HETP= -
(8.21)
Asimismo, dichas ecuaciones han demostrado ser tiles en el anlisis de la dispersin y la resolucin de los picos de un cromatograma. Sin
444
POR ELUCll
embargo, no pueden ser utilizadas para predecir el nmero de etapj o la altura equivalente de un plato terico, ni para predecir en forma el cambio de las condiciones de operacin de la columna afect su comportamiento.
Ejemplo 8.1.- Clculo del nmero de etapas en la cro-1 matografa de Inmunoglobulina G.
La cromatografa de perfusin-afinidad de alta resolucin de Inmunoglobulina G (Fulton et a/, 1991) produce un cromatograma con un pico cuyo tiempo medio de retencin es de 32.5 s. El ancho del pico cuando la concentracin es la mitad de la mxima es de 1.60 s. Estimar el nmero de etapas tericas de esta columna.
Solucin:
Se puede utilizar la ecuacin (8.17) para determinar el nmero de etapas tericas de la columna. Sustituyendo valores,
0.5 = exp
2_
aplicando logaritmos en ambos lados de la expresin anterior se obtiene, N = 2287 Es importante hacer notar que entre ms ancho sea el pico del cromatograma, N ser ms pequea y por lo tanto HETP ms grande, y viceversa. Consecuentemente, la HETP es una medida de la amplitud de un pico cromatografa) (eficiencia de la columna). Entre menor sea HETP, mayor eficiencia de la columna. Mtodos grficos para determinar N.- Existen varias formas para calcular N a partir de un cromatograma gausiano. Una de las ms utilizadas emplea la siguiente expresin:
W2
(8.22)
CROMATO GRFICAS
445
1.2-
JL
Xo
0.8-
0.6-
0.4-
0.2-J
55
Tiempo (min)
Figura 8.12: Clculo del nmero de unidades de transferencia en forma grfica.
446
POR
donde W es el ancho de la base del cromatograma medido entre las rectas tangentes que pasan por los puntos de infleccin del cromatograma. La teora de platos es muy utilizada debido a que permite una rpida caracterizacin y una comparacin sencilla entre columnas Ejemplo 8.2.- Clculo grfico del nmero de etapas tericas. Estimar a partir del cromatograma que se muestra en la Figura 8.12 el numero de etapas tericas obtenidas en la cromatografa de transferrina. Solucin: Utilizando la ecuacin (8.22) se puede calcular N. Para realizar el clculo es necesario determinar el ancho del cromatograma, W = 49 min 33 min = 16 min y el tiempo de retencin, t0 = 41 min sustituyendo valores,
N =
N
16(41 min)'' (16 min)2
= 105
Modelos Basados en la Teora Cintica Los modelos basados en la teora cintica describen el comportamiento de una cromatografa mediante los perfiles de concentracin de los solutos obtenidos mediante balances de masa, relaciones de equilibrio y expresiones cinticas. Este enfoque resulta ms complejo que el de la teora de platos pero permite mejorar la descripcin y comprensin de estos sistemas. Para iniciar la revisin de algunos modelos cinticos es conveniente describir cuatro comportamientos generales de una columna cromatogrfica operando en modo elucin socrtica, descritos en la Figura 8.13. Caso 1.- Un pulso inyectado a una columna no sufrir ningn cambio a la salida de la columna, slo si:
CROMATOGRAFICAS
447
Casal
Caso 2
Caso 3
Caso 4
Figura 8.13: columna.
Descripcin cualitativa del comportamiento de una
448
- El flujo en la columna es idel o tipo tapn. - Los solutos no penetran al interior del adsorbente. - Los solutos no reaccionan (no se adsorben) con el adsorbente. Caso 2.- Un pulso inyectado a una columna donde exista un cierto grado de flujo no ideal debido a un empaque deficiente o a fenmenos de difusin axial, pero no exista adsorcin, presentar un tiempo de retencin promedio igual al del pulso del caso 1, pero con cierto grado de dispersin. Caso 3.- Un pulso que contenga un soluto que pueda ser adsorbido, sufrir un retardo y un cierto grado de dispersin al pasar por la columna. La dimensin de estos efectos depender de de la naturaleza de la adsorcin. La tcnica cromatogrfica se basa en el hecho de que diferentes solutos pueden sufrir diferentes retardos en un mismo adsorbente. Caso 4.- Un pulso inyectado a una columna donde exista adsorcin y efectos de flujo no ideal simultneamente, tendr un tiempo de retencin igual al del caso 3, pero una mayor dispersin. Se han desarrollado varios modelos para predecir los perfiles de concentracin de las colunas cromatogrficas desde el punto cintico, los cuales presentan diferentes grados de complejidad y difieren entre s en: - El tipo de equilibrio que consideran. - El nmero y tipo de resistencias a la transferencia de masa que toman en cuenta. - La cintica en la superficie del adsorbente. - Los efectos de mezclado que incorporan. La elaboracin del modelo de la columna se inicia con el balance de masa de; soluto en la fase lquida en una seccin de la misma.
dt
donde:
dz2
dz
8A. DISEO DE COLUMNAS CROMATOGRFICAS

e: Fraccin vaca del lecho. [L3/L3]. y: Concentracin de soluto en el lquido. [M/L3]. t: Tiempo, [t]. E: Coeficiente de dispersin axial. [L2/t]. z: Distancia axial. [L].
449
v: Velocidad superficial (flujo por rea de seccin transversal de columna). [L/i\. R: Velocidad de adsorcin de soluto en el adsorbente. [M/L3 t]. El balance de soluto sobre el adsorbente complementa al balance anterior y puede ser expresado como: /2 = (l_ e )|? (8.24)
A continuacin se revisan dos modelos cinticos de diferente grado de complejidad, el modelo cintico lineal y el modelo cintico general; ambos consideran relaciones de equilibrio lineales. En este punto es importante recordar que los balances de masa y las relaciones de equilibrio para columnas cromatogrficas son iguales que los de adsorcin en columna, mientras que las condiciones iniciales son diferentes. Modelo Cintico Lineal.- Este modelo supone que slo una resistencias controla la transferencia de masa. En el caso que la resistencia en la pelcula sea la controlante, la velocidad de transferencia de masa del lquido al adsorbente puede ser expresada como: R = kLa(y - y*) (8.25)
donde y* es una concentracin hipottica en el lquido en equilibrio con la concentracin de soluto en el adsorbente (en algunos casos la kâ se toma como un coeficiente que agrupa todas las resistencias, debido a la dificultad experimental de mediciones que puedan distinguir entre los diferentes mecanismos de control).
450
El modelo supone adems que la dispersin axial y la acumulacin en la fase lquida son despreciables, entonces la ecuacin (8.23) se transforma en: R = -v Combinando las ecuaciones (8.25) y (8.26) se obtiene: (8.26)
dv kLa(y-y*) = -v-^
(8.27)
Esta ecuacin puede ser integrada para obtener la longitud necesaria de la columna para un determinado grado de separacin,
L
L= dz =
dy
y -y")
(8.28)
al trmino entre parntesis cuadrados de la ecuacin anterior se le llama altura de una unidad de transferencia HTU (de sus siglas en ingls), y al trmino entre corchetes se le llama nmero de unidades de trasferencia NTU (de sus siglas en ingls); de tal manera que la ecuacin anterior puede ser expresada como:
L = HTU- NTU
(8.29)
La ecuacin anterior puede ser utilizada para calcular la longitud necesaria de una columna cuando se conoce kâ. Los modelos cuando la resistencia controlante es otra son anlogos. Modelo cintico general: Teora de momentos.- El modelo cintico general para describir una columna cromatogrfica es ms complejo e incluye los efectos de: - Resistencia a la transferencia de masa en la pelcula. - Resistencia a la difusin al interior de la partcula. - Adsorcin reversible de primer orden sobre la superficie de los poros (isoterma lineal). - Dispersin axial.
8.4. DISEO DE COLUMNAS CROMATOGRFICAS
451
Estos efectos se integran mediante un modelo pseudocontinuo descrito por el sistema de ecuaciones que se lista a continuacin. 1. Balance de soluto en el seno del lquido de la columna:
2 dy dy y = -T-T c1 d y " v" D (Q Qn\ 6 ri (0.60) ot oz oz En la expresin anterior, R es la velocidad de transferencia de masa de soluto entre el lquido y el adsorbente por unidad de volumen de lecho, dada por:
/"/1 \ O 6(1 e) oyi. Ri Dp-;r- \r=Ra dp or
(8.31)
donde: e: porosidad del lecho. dp: Dimetro de la partcula de adsorbente. Dp: Difusividad del soluto al interior del poro del adsorbente. r: Distancia radial del centro de la partcula a un punto dado en la partcula de adsorbente. Ra: Radio de la partcula. yt-: Concentracin de soluto en la fase lquida al interior del poro. 2. Balance de soluto al interior del poro:
>. l
~dt~
ip i __^_^_ + i _^_ Q
( "--"
~ ~ '"" (
_ i
/1
.j \ _^^^^_ t
( w <jy \
donde </, es la concentracin de soluto en el adsorbente y e, es la porosidad de la partcula de adsorbente al soluto de inters. 3. Balance de soluto interfacial en la superficie del adsorbente: Dp-^-\r=Ra = kL(y - yl)\r=Ra (8.33)
452
POR ELUCIN.
4. Adsorcin reversible de primer orden en la superficie del adsorbente:

(8.34)
donde &i es la constante cintica de la reaccin de superficie en el sentido directo y K es la constante de equilibrio de la reaccin de superficie. Las condiciones iniciales y de frontera del sistema de ecuaciones anterior son:
en: para:
>O t =0 = O O < < p
se tiene:
fr = O y =O yi - O y = yA
r 2 r 2
=0 >O >O = 0
2 = 0 t > tp
/ = O
donde p = Vp/F es la duracin de un pulso rectangular de volumen Vp inyectado a la columna. El sistema de ecuaciones (8.30)-(8.34) fue resuelto en el dominio de de las Transformadas de Laplace (Furusawa et a/, 1976), pero la | solucin no pudo ser invertida para obtener la expresin de la concentracin a la salida como una funcin del tiempo. La solucin en el dominio de Laplace fue utilizada para calcular los momentos del perfil de concentracin del soluto dados por las expresiones siguientes: La ecuacin para el momento u del perfil de concentracin del soluto en un lecho de longitud L es,
oo
mn=
y(t,L)tndt
Jo
(8.35)
de tal manera que el momento absoluto n es,

rnn m Jy(t,L)tndt
(8.36)
SA. DISEO DE COLUMNAS CROMATOGRAFAS y el momento central n,
453
.
rn
J?y(t,L)(t-
Jo 2/0
roo
Dos momentos tienen un significado fsico y son de particular inters en cromatografa: 1.- El primer momento absoluto o tiempo de retencin promedio dado por: ^y(t,L)tdt
/oy(*,)<ft
(8.39)
y de acuerdo al modelo est dado por,

L tp e + ( l - e W l + ^l + ' f v
De acuerdo a la ecuacin anterior, el tiempo de retencin de un soluto en la columna depende del tiempo de residencia del eluyente, el tipo de empaque y de la constante de equilibrio. Se puede utilizar la expresin del primer momento absoluto para estimar la porosidad de lechos cuando el soluto es tan grande que e, = O y no existe adsorcin, de tal manera que la ecuacin (8.39) se reduce a:
tp _ Le
2.- El segundo momento central es una medida de la dispersin del pico y est dado por:
8 4fn (8 40) '
'
J~y(t,L)dt
y de acuerdo al modelo general,
454
12
(8.41
La ecuacin anterior muestra que la dispersin del pico respecto al tiempo de elucin o segundo momento central, es funcin de varios parmetros como el coeficiente de transferencia de masa en la pelcula, el coeficiente de difusin efectiva al interior del poro, la constante cintica de adsorcin, la constante de equilibrio, el coeficiente de dispersin y los parmetros del empaque. El mtodo de momentos elimina la necesidad de una solucin numrica del sistema de ecuaciones de conservacin de la columna. Sin embargo, su uso est restringido a sistemas que presenten isotermas y expresiones de transferencia de masa lineales. Otra desventaja del mtodo de momentos es que la solucin no se obtiene en el tiempo real y no se puede predecir el efecto de los parmetros o variables de diseo sobre los perfiles de concentracin. Una de las principales aplicaciones del modelo es en la estimacin de parmetros para diseo, pero slo de aquellos que no varian con la escala, como la difusividad efectiva de partcula, las constantes cinticas de adsorcin y la porosidad de la partcula. Sin embargo, los coeficientes de dispersin que se determinen en una columna de laboratorio pueden ser muy diferentes a los de una columna industrial. Ejemplo 8.3 .- Estimacin de la porosidad de un adsorbente. Se determinaron (Arnold et a/, 1985) los tiempos de retencin promedio de mioglobulina y albmina de suero de bovino (ASB), utilizando pulsos de 1 -mi en una columna de 1.6 cm de dimetro, variando su longitud entre 26 y 31 cm. Los estudios se realizaron bajo condiciones
CROMATOGRAFAS
455
de no-adsorcin (columna equilibrada con solucin amortiguadora de elucin K = 0), utilizando Sefarosa CL-4B (100 /im). Los resultados se correlacionaron con L/v y se ajustaron a las rectas: Para Mioglobulina:
Mi -
2 = .
Para Albmina:
_ | = 0.692 v
La porosidad de la columna se estim utilizando datos de tiempo de residencia de azul de dextrano (molcula que no penetra en los poros del adsorbente ni se adsorbe) y fue de e = 0.35. A partir de estos resultados estimar la porosidad del empaque e. Solucin: En el caso que no existe adsorcin (K=0), la ecuacin (8.39) se puede expresar como:
entonces,
= [e
sustituyendo valores en la expresin anterior para el caso de la mioglobulina se tiene: 0.87 = 0.35 + (l-0.35)e = 0.8 sustituyendo valores para el caso de la albmina se tiene: 0.69 = 0.35+ (1 -0.35)e
e = 0.52
El adsorbente presenta diferente porosidad dependiendo del tamao del soluto: BSA (PM=67,000) y Mioglobulina (PM = 17,500)
456
POR ELUCIN.
Modelos Combinados: Teora de Platos y Teora Cintica Las teora de plato es sencilla en su desarrollo matemtico, pero no puede ser usada para predecir el comportamiento de columnas a partir de datos fundamentales. Se han efectuado diferentes intentos para superar esta limitacin de la teora de platos, todos los desarrollos efectuados han producido expresiones en las que la HETP (medida del grado de dispersin del pico) se relaciona con parmetros que permiten predecir el comportamiento de la columna. Sobre este tipo de enfoque dos tipos de modelos resultan de particular inters: - El modelo combinado lineal. - El modelo de van Deemter. Modelo Combinado Lineal.- Una primera aproximacin para la obtencin de expresiones de HETP en funcin de variables de operador de la columna, es igualar el nmero de platos tericos de la teor de platos (N) con el nmero de unidades de transferencia (NTU) de modelo cintico lineal, considerando que ambos modelos describen ui comportamiento gausiano similar, de tal manera que de acuerdo a la, ecuaciones (8.28) y (8.29):
J N = NTU=
!^L
v
(8.42
y combinando esta ecuacin con la ecuacin (8.17) se puede obtene el perfil de concentracin en funcin de las variables de operacin,
y = yoexp
2v
En la ecuacin (8.43) la desviacin estndar del pico est dada po
por otro lado se sabe que: HETP=
yv
(8.4
8A. DISEO DE COLUMNAS
CROMATOGRAFAS
457
y se puede expresar el HETP no slo en trminos de un parmetro hipottico TV, sino en funcin de caractersticas fsicas del sistema , HETP =
v
(8.46)
Ejemplo 8.4.- Cromatografa de aspartamo.

La cromatografa de d-aspartamo (Belter et al, 1988) en slica gel modificada, con silanos como brazos espaciadores y 1-prolina como ligando, produce un cromatograma en el cual el tiempo de elucin del d-aspartamo es t0 = 62 min y la desviacin estndar a = 3 razn, cuando se utiliza una columna de 25 cm de longitud y 0.41 era de dimetro, rellena de partculas esfricas de 0.0045 era de dimetro. La fraccin vaca de la columna se estim en 0.38 y el flujo utilizado fue de 2 cm3/min. La cintica de adsorcin puede suponerse que es controlada por el coeficiente de transferecia de masa de la pelcula, el cual puede ser estimado por medio de la siguiente correlacin:
-0.67
kL = l.llv La difusividad del d-aspartamo en estas condiciones es 0.7 x 10 -5 cm /s. La viscosidad y densidad pueden ser tomadas como las del agua. Se pide calcular: a) La constante de equilibrio del sistema. b) N y HETP de acuerdo al modelo de platos. c) N, cr2 y HETP de acuerdo al modelo lineal combinado. d) El efecto de variaciones de 20 % de la longitud de la columna, sobre N y t0.
2
Solucin:
a) Clculo de la constante de equilibrio. Se puede utilizar la ecuacin (8.16) para obtener A', para lo cual es necesario calcular primero el volumen del lecho Vc:
V, =
7r(0.41 era)'
x 25 cm
458

Vc Vc
= 0.132 cm2 x 25 cm = 3.30 cm3
rearreglando la ecuacin (8.16) y sustituyendo valores se tiene:

tnF
K = K =
1 - 0.38
62 min x 3.30 cm3
K = 60
b) Clculo de N y HETP con el modelo de platos. De acuerdo con las ecuaciones (8.45) y (8.46),
N
N
= -\
622 min2 = 15 ^ 6 min = 427
por la definicin de HETP dada en la ecuacin (8.45), HETP HETP HETP

L^ ~ 25 cm = 427 = 0.0585 cm
c) Clculo TV, cr2 y HETP con el modelo combinado lineal. Para calcular TV se utiliza la ecuacin (8.42). Para tal efecto primero se calcula la velocidad superficial v,
cm ., 2 min X v = 0.132 T7iin _ 60 s
= 0.25
cm
CROMATOGRAFICAS
459
El coeficiente de transferencia de masa se calcula utilizando la cor rrelacin dada de tal manera que: cm = 1.17 x 0.25 x 0.0045 cm x 0.25 22. x *
-0.42
kL
0.01 -f-
-0.67
0.01
JbL
x 0.7 x 10~5 sai cm = 5.67 x 10-J s
El clculo del rea interfacial es: 6(1-g) dp 6(1 - 0.38) a = 0.0045 cm

a =
826.67 cm'1 entonces,
N =
TV =
v (5.67 x 10~3 sa)(826.67 cm~1)(25 cm) 0.25 ss. s 468
De acuerdo a la ecuacin (8.46),
a i,
62 min \/468 2.86
460
CAPTULO 8. CROMATOGRAFA De la ecuacin (8.47),
POR ELUCIN.
HETP
HETp
= -^=
HETP
(2.86 min) 2 x 25 cm (63 min)2 = 0.052 cm
d) Para resolver este inciso necesariamente se tiene que hacer uso del modelo combinado lineal. Esta es la ventaja de este tipo de modelo; es decir, nos permite hacer predicciones con la variacin de ciertos parmetros. Una columna de 20 cm representa la reduccin de un 20 % en longitud de tal manera que:
1 (5.67 x 10~3 ^f)(826.67 _____ cm~ )(20 cm)
TV =
374
por otra parte: . = [0.38 + (1-0.38) 60] x "-"E cm^x 20 cm

rntn
t0 = 49.6 min
De la misma manera se pueden efectuar los clculos para L 30 era (+20%). Modelo de van Deemter.- El modelo de van Deemter (van Deemter ti a/, 1956) es uno de los ms conocidos para cromatografa por elucin. Estos autores combinaron los resultados de la teora de platos con los del modelo cintico de Lapidus y Amundson (Lapidus y Amundson, 1952). Este ltimo fue utilizado en forma simplificada para el caso de un sistema con isoterma de adsorcin lineal y una columna larga, de tal manera que el perfil de concentracin del soluto a la salida de la columna tambin sea gausiano como el de la teora de platos. El resultado fue obtener una expresin para HETP en funcin de los parmetros
CROMATOGRAFAS
461
considerados por Lapidus y Amundson para su modelo cintico. Dado que el modelo de Lapidus y Amundson incluye los efectos de dispersin axial (difusin molecular y mezclado), resistencia a la transferencia de masa en la pelcula y al interior del poro, la expresin de van Deemter considera todos estos efectos en tiempo real. Una versin reciente (Arnold et a/, 1985) de la expresin de van Deemter es:
12
HETP =
(8 47)
'
donde: t\ Longitud de mezclado. [L]. DAB'- Coeficiente de difusin del soluto. [L2/t]. ?/: Tortuosidad del lecho. En la expresin anterior el coeficiente de dispersin axial E se considera que est conformado por dos contribuciones: la difusin molecular en la direccin axial y un trmino de mezclado que es proporcional a la velocidad, esto es, E = rjDAB + iv (8.48)
En el caso de cromatografa lquida de molculas de tamao grande (por ejemplo protenas), el segundo trmino del lado derecho de la ecuacin (8.47) puede ser despreciado. Ejemplo 8.5.- Comparacin de los resultados de la teora de momentos con el modelo de van Deemter. Demostrar <que para el caso de perfiles de concentracin gausianos la teora de momentos y la de van Deemter producen resultados idnticos,
462
CAPTULO 8, CROMATOGRAFA
POR ELUCIN.
cuando se considera que existe equilibrio sobre la superficie del adsorbente (slo existen las resistencias de la pelcula y del poro) y que el pulso alimentado es de duracin corta. Solucin: En el caso de perfiles gausianos se cumple que:
de tal manera que: HETP = La expresin anterior conjuntamente con las ecuaciones (8.39), (8.41), (8.48) y las condiciones particulares:
tp
A
= O
g
conducen a:
\l Hj J. i )momentos \f* KJi i )van Deemter
La ecuacin de van Deemter (8.47) en su versin ms popular y simplificada se escribe como: HETP = A + - + Cv v donde: El trmino A es funcin del tamao y uniformidad del adsorbente de la columna, ya que esto determina la longitud y uniformidad del mezclado. Las partculas de dimetro pequeo, producen valores bajos de A. (8.49)
8.4. DISEO DE COLUMNAS CROMATOGRAFAS
463
El trmino B se relaciona con la difusin molecular axial. Este trmino puede ser despreciado en el caso de cromatografa lquida y particularmente cuando el soluto es una molcula grande como una protena. Si la velocidad superficial en una columna disminuye, el trmino B/v aumenta, esto significa que al ser mayor el tiempo de retencin hay ms tiempo para que el pulso se disperse por difusin molecular. Consecuentemente la contribucin de este trmino tiende a disminuir la eficiencia de la columna; es decir, a incrementar el HETP. El trmino C representa la dispersin del pulso debida a la resistencia a la transferencia de masa. Este trmino es funcin de la geometra de la fase estacionaria, del coeficiente de distribucin del soluto y de las velocidades de transferencia. Si la velocidad superficial se incrementa, el trmino Cv se incrementa. Esto significa que a mayor velocidad superficial en la columna, el tiempo para lograr el equilibrio es menor. Consecuentemente la contribucin de este trmino tiende a disminuir la eficiencia de la columna. En la Figura 8.14 se muestra el efecto de la velocidad superficial en la columna sobre el HETP, de acuerdo al modelo de van Deemter. Se observa que existe una velocidad ptima debido a los efectos opuestos de los trminos B/v y Cv. Para una columna particular es posible encontrar la ecuacin de van Deemter efectuando mediciones de HETP a tres velocidades diferentes.
8.4.2
Criterios de Evaluacin Tcnica del Comportamiento de las Columnas: Resolucin, Pureza y Rendimiento
El objetivo de un proceso cromatogrfico puede ser alguno o algunos de los siguientes: alta purificacin de un componente, anlisis rpido de un componente o una alta productividad. Cuando el rendimiento de una operacin disminuye conforme la pureza deseada aumenta, estos objetivos no pueden lograrse simultneamente.
464
POR ELUCIN.
no-equilibrio
Calidad de empaque
Difusin longitudinal
Figura 8.14: Efecto de la velocidad superficial sobre HETP. Fuente: Janson y Hedman, 1982.
Reproducida con el permiso de Springer-Verlag. Copyright 1982. Todos los derechos reservados.
La teora cromatogrfica permite evaluar el comportamiento de una operacin mediante el uso de tres criterios:
Resolucin.
Pureza. Rendimiento.
Resolucin
En la cromatografa por elucin un objetivo puede ser el separar los componentes de una muestra en forma satisfactoria. La medida del grado de separacin de dos componentes en una operacin cromatogrfica se conoce como resolucin o eficiencia de separacin. La resolucin de una columna depende de dos factores: La selectividad de la columna.- Este factor es una medida de la afinidad de los solutos por el adsorbente (Figura 8.15 a y b ).
CROMATOGRAFAS
465
Factor de separacin pobre. Numera de platos pequefio
Factor d separacin bueno Nmero de platos pequeo
Respuesta
c) d)
Factor de separacin pobr Nmero de platos grande

^ < | >X ^ ^ SS _j
Factor de separacin bueno Nmero de platos grande
\
*
/ / /
' ^ A
/ /
1*
$ ^ |
iÔ
t
' +/ y j/
^ o<N vo J
<.
v ^^ ^
i/s
Tiempo
Figura 8.15: Efecto de la selectividad y de la eficiencia sobre la resolucin. La eficiencia de la columna.- Este factor est relacionado con el grado de dispersin de los picos (Figura 8.15 c y 8.15 d). Si se considera la Figura 8.16 una separacin completa de dos picos puede lograrse cuando las rectas que definen la amplitud de la base de los picos W', se intersectan abajo del eje t. Puede ser demostrado que cuando esto sucede: Rs =
2(
* Q2 "* Ql) > 2
(8.50)
W = 4<r
(8.51)
donde ,Rs es la resolucin. Generalmente una Rs =1.5 es satisfactoria.
466
POR ELUCIN.
Respuesta
Tiempo
Figura 8.16: Medicin de la resolucin. Una resolucin adecuada puede ser difcil de obtener cuendo se trata de resolver una mezcla de componentes con propiedades similares, como en la separacin de mezclas de protenas. En este caso la mejor forma para mejorar la resolucin depende del tipo de cromatografa, pero existen algunas lineas generales como las siguientes: 1. Para incrementar A = t02 t0\. (a) Incrementar la longitud de la columna L. (b) Aumentar la cantidad de la fase estacionaria. (c) Mejorar la selectividad, selecionando otra fase estacionaria u otra fase mvil. 2. Para disminuir el ancho de los picos. (a) Empacar ms uniformemente la columna y/o disminuir el tamao de las partculas del empaque. (b) Optimizar el flujo. (c) Reducir el tamao de la muestra. La ecuacin (8.50) puede ser utilizada conjuntamente con los modelos cromatogrficos apropiados para analizar este tipo de acciones y generar las decisiones correspondientes. Por ejemplo, se puede estimar la longitud necesaria de una columna para alcanzar una determinada resolucin.
8.4. DISEO DE COLUMNAS CROMATO GRAFIO AS
467
Ejemplo 8.6.- Clculo de la resolucin de una columna.

Calcular la resolucin lograda en una columna de filtracin en gel en la que se separa un anticuerpo de una impureza y se obtienen los siguientes resultados:
Anticuerpo
Impureza 7.600 0.175 43
0(h)
<7(h)
y0
Solucin:
6.42 0.80 82
Se puede calcular el ancho de las bases de los picos W utilizando la ecuacin (8.51), Wl = 4<7! = (4)(0.80 h) = 3.2 h W2 = 4<r2 = (4)(0.175 h) = 0.7 h la resolucin se calcula con la ecuacin (8.50),
esta resolucin es demasiado baja.
Pureza
Cuando se tiene una resolucin muy baja debido a propiedades muy semejantes entre los solutos de una mezcla o por cuestiones de productividad, existe un compromiso entre el rendimiento alcanzable y la pureza deseada. Entre mayor sea la pureza requerida, menor rendimiento puede ser obtenido. Es posible efectuar un anlisis de pureza y rendimiento de columnas, empleando los modelos revisados. Considerando que en una operacin cromatogrfica la masa eluda del soluto j de una mezcla, en el intervalo de t a t est dada por:
468
SE3 = / Fyjdt jt
donde: j Masa del soluto j eluda en el intervalo de tiempo. F: Flujo de solvente en la columna. yji Concentracin del soluto j a la salida de la columna.
(8.52)
la pureza del soluto j, PRj, se define como la razn de la masa de soluto j obtenida en el intervalo de t a t, entre la masa total obtenida en ese mismo intervalo, es decir:
PRj =
Jt
^=JtlFy,dt
dt ti Fyj y -
8.53)]
donde n es el nmero de solutos presentes. Rendimiento El rendimiento de una operacin cromatogrfica puede ser definido como la cantidad de soluto recuperado en un cierto intervalo, respecto a la cantidad aplicada en la muestra original. La masa total de soluto j inyectada a la columna est dada por:
r
(8.54) = I Fyjdt Jo la proporcin de soluto j recuperada en el intervalo de t a, t o rendimiento REj puede entonces expresarse como: fi Fy3dt reo ,, Jo Fyjdt Las ecuaciones (8.53) y (8.55) combinadas con los modelos que describen los perfiles de concentracin en las columnas, nos permiten calcular y/o predecir (segn el tipo de modelo) rendimientos y pureza en columnas. SE,
8.4. DISEO DE COLUMNAS CROMATO GRFICAS
469
90-
Anticuerpo
80706050-
Impureza
40-^ 302010-
0
10
t(h)
Figura 8.17: Perfiles de concentracin del Ejemplo 8.7. Ejemplo 8.7.- Pureza y Rendimiento La Figura 8.17 muestra los prefiles de concentracin del anticuerpo y la impureza del Ejemplo 8.6. Puede observarse un traslape de los picos de estas sustancias debido a la baja resolucin de la operacin. Describir la variacin de la pureza y el rendimiento del anticuerpo con el tiempo de operacin, si la masa de anticuerpo y la masa de impureza alimentadas a la columna son 1.63 g y 0.45 g. respectivamente (se usa el subndice 1 para el anticuerpo y el subndice 2 para la impureza). Solucin: Combinando las ecuaciones (8.17) y (8.55) se obtiene una expresin para el rendimiento en funcin del tiempo,
470
REi =
"= 1 y iexp i (ôj,

t' -
La expresin anterior puede integrarse expresando la integral del numerador como una diferencia de integrales y utilizando la definicin de la funcin error, obtenindose:
= -\Erf J 2
-Erf
cuando i O la expresin anterior pued e aproximarse a:

1 + Erf
i o
La variacin de la pureza con el tiempo de operacin se obtiene combinando las ecuaciones (8.17) y (8.53),
PRr
'/' Fy0i exp [-^l^p-J di + Jt' Fyoi exp [-^l^~J dt
utilizando la definicin de funcin error la expresin anterior puede expresarse como:
sustituyendo valores en las expresiones desarrolladas se tiene:

fF 1 ILJ\
RE2
'-6.42V 1 + Erf [ ,>/2(0.8)JJ 1 ' -7.60 V = 1 + Erf ( 2 ,N/2(0.175)J.
pp.
82 REl
82 REl + 43
8.4. DISEO DE COLUMNAS CROMATO GRAFIO AS
471
o.o
Figura 8.18: Perfiles de pureza y rendimiento del Ejemplo 8.7. Los resultados sobre los clculos de los rendimientos y la pureza de anticuerpo se muestran en forma grfica en la Figura 8.18. Se puede constatar en la figura el hecho de que en una operacin de separacin generalmente se pueden obtener altas purezas o altos rendimientos, pero no ambos.
8.4.3
Escalamiento y Optimizacin
El escalamiento de una columna cromatogrfica consiste generalmente en determinar el diseo de la columna que permita cumplir con una productividad mayor a la de la columna empleada en la obtencin de los datos para el el diseo. En general las tcnicas de escalamiento surgen del reconocimiento de la imposibilidad del diseo de este tipo de equipo mediante modelos
472
POR ELUCIN.
estrictamente tericos (Gibbs y Lighfoot, 1986). Son varios los factores a considerar en el escalamiento de columnas cromatogrficas dentro de los cuales se pueden destacar los siguientes. 1. Objetivo del escalamiento: Generalmente el objetivo de un escalamiento es incrementar la productividad. En algunos casos slo se busca incrementar la produccin. 2. Criterio de escalamiento: Existen varias alternativas no excluyentes que pueden servir de base para realizar el estudio de escalamiento como: - Incrementar el flujo volumtrico a procesar. - Incrementar la concentracin de la muestra. - Incrementar el volumen de la muestra. El incrementar slo el flujo volumtrico, manteniendo la concentracin y el tamao relativo de la muestra, permite conservar la linearidad del proceso. Cuando se incrementa la concentracin y/o el volumen de la muestra se produce una condicin de sobrecarga, que produce un perfil de concentracin no gausiano a la salida de la columna (Figura 8.9). En el caso de muestras ms concentradas generalmente se producen isotermas no lineales y efectos de interferencia de los solutos en la adsorcin, que se traducen en una disminucin del grado de purificacin obtenible. En estos casos no puede ser aplicado el concepto de HETP desarrollado para sistemas lineales. 3. Restricciones: El escalamiento adems de cumplir con el objetivo fundamental de incrementar la productividad (o al menos la produccin), debe tambin cumplir con las restricciones del proceso en cuanto a pureza, rendimiento, concentracin del producto y duracin de cada ciclo. 4. Caractersticas de flujo: El escalamiento de columnas presenta varios problemas asociados al flujo dentro del lecho:
473
- El incremento de la longitud de la columna es imposible sin reducir la velocidad de percolacin debido a que generalmente las cadas de presin de las columnas de laboratorio estn en el lmite del colapso de los adsorbentes empleados. - El incremento del dimetro produce problemas de distribuccin del flujo y de incremento del gradiante de presin por disminucin de soporte por la pared. La caida de presin en una columna empacada en rgimen laminar est dada por la ecuacin de Blake-Kozeny (Bird et a/, 1960),
donde v es la velocidad superficial y est dada por la relacin:
4F
donde D es el dimetro de la columna.
(8 57)
'
5, Geometra: Los parmetros bsicos que define la geometra de una columna y que pueden ser modificados son: c/p, Dc y L. 6. Dinmica de la columna. En el proceso de escalamiento es fundamental tomar en cuenta los grupos adimensionales que se derivan de la expresiones diferenciales que describen los perfiles de concentracin en la columna; de particular importancia son el tiempo t/t0 y el nmero de unidades de transferencia NTU o de etapas tericas N. En el proceso de escalamiento generalmente tambin se busca optimizar la columna fijando criterios de mxima productividad o mnimo costo. Es importante distinguir dos mtodos de escalamiento comunmente empleados en cromatografa: Mtodo de escalamiento directo. Mtodo de escalamiento mediante modelos.
474
Escalamiento Directo La mayora de los procesos cromatogrficos han sido escalados directamente de los sistemas analticos de laboratorio (Wang, 1990). el mtodo de escalamiento directo se parte de un diseo ptimo desarrollado generalmente a nivel laboratorio (puede ser terico) y se supone que los fenmenos difusionales no varan dentro del rango de escalas que se estudia. Este mtodo permite determinar el tamao y las condiciones de operacin de la escala nueva en forma rpida. Una limitacin de este mtodo es la escasa informacin que genera sobre los mecanismos cinticos controlantes. A continuacin se presenta caso particular de escalamiento directo con el proposito de ilustrar este mtodo. Caso de escalamiento directo de un sistema lineal.- Uno de los enfoques ms utilizados en el escalamiento de columnas cromatogrficas, consiste en seleccionar como parmetro de escalamiento un incremento del flujo de la columna, lo que permite mantener la linearidad del proceso. Generalmente las restricciones son de igual pureza y rendimiento en ambas escalas (Cowan ti a/, 1987). Estas restricciones requieren que la dinmica de la columna no cambie. El perfil de concentracin de los solutos a la salida de la columna debe mantenerse igual en ambas escalas. En este caso lineal los perfiles gausianos estn dados por la relacin ya conocida,
21
(""O
= y0 exp
mantener los perfiles iguales durante el escalamiento, requiere mantener iguales ?/0, TV y t/t0, para cada uno de los solutos en ambas escalas (escalas 1 y 2). Si el escalamiento es slo a travs del incremento de flujo, la concentraccin mxima de soluto, la cual es funcin de la concentracin de entrada principalmente, puede considerarse igual en ambas escalas, o sea y0l = y0in donde los subndices I y II se refieren a cada una de las escalas. El nmero de etapas cuando slo un mecanismo controla la rapidez de la adsorcin puede ser expresado como:
475
N =
(8.58)
Asimismo, el tiempo de retencin est dado por: t0 = [e + (l-e)K](8.59) v Como primer alternativa se puede considerar incrementar Z)c, dp y L; sin embargo, no es posible hacer este cambio sin alterar el perfil de concentracin dado que el valor de N cambia con todos estos parmetros, independientemente del valor que tome n en la ecuacin (8.58) o mecanismo controlante de la cintica. Tambin se puede considerar incrementar Dc y dp, de tal manera que su razn se mantenga constante; sin embargo esto tambin conduce a un cambio en el valor de N. Como tercera alternativa se puede considerar mantener dp igual para ambas escalas e incrementar v y L, de tal manera que la relacin L/v sea igual en ambas escalas, lo que permite mantener t0 y N constantes entre las escalas, en casi todos los casos de un slo mecanismo controlante. Sin embargo, incrementar simultneamente L y v produce un efecto dramtico sobre la cada de presin, de acuerdo a lo que establece la ecuacin (8.56). La solucin comnmente empleada consiste en usar columnas poco esbeltas (gordas) con dp , L y v iguales a las de la columna de escala laboratorio. Esto permite aumentar la produccin (no la productividad), al aumentar el rea de flujo o dimetro de columna. En el caso de que en el proceso de escalamiento pudiera disminuirse el dimetro del empaque utilizado a nivel laboratorio d p , es posible realizar el escalamiento y obtener una mejor resolucin, con una columna de menor volumen y conservando la misma cada de presin (Wankat y Koo, 1988). Para reducir los costos asociados a la inversin inicial en las columnas, es preferible utilizar cada columna en varios ciclos procesando alcuotas del material inicial, entonces el problema de optimizacin de la columna escalada se traduce en encontrar el dimetro de columna que produce el menor costo del producto. De tal manera que el proceso
476
de escalamiento y el de optimizacin, se desarrollan simultneamente (Janson y Hedman, 1987).
Ejemplo 8.8.- Optimizacin de una columna.

Con el propsito de separar una protena de sus sales acompaantes, se utiliza una columna cromatogrfica de 5 cm de dimetro y 15 cm de longitud, empacada con sefacril S-200 superfino (dextrano). La alimentacin consiste en una solucin diluida que contiene una mezcla de solutos, 80 % de la cual es transferrina y 20 % sales (como NaCl). Guarido la columna se opera a 10 cm/h se produce una separacin caracterizada de la siguiente manera (Janson y Hedman, 1982): Transferrina t0 (min) 41 <j (min) 4 Sales 88 4
Se pide: a) Calcular el tiempo necesario para obtener el 90% de rendimient< de transferrina. b) Si se desea incrementar la productividad de la columna mante niendo la misma geometra y suponiendo que la etapa controlante es te que la desviacin estndar es proporcional a v~, calcular la velocida de alimentacin mxima y el tiempo del ciclo necesario para obtener u rendimiento de 99% de transferrina con 98% de pureza (transferrina^ y sales=2; escalas I y II).
Solucin:
a) De acuerdo a la ecuacin desarrollada en el Ejemplo 8.7,

1 + Erf
( t-t
0\
0.90 = - 1 + Erf
i -41 2x4
8.4. DISEO DE COLUMNAS CROMATOGRAFICAS de tal manera que,
477
90% =46.1 min

b) De acuerdo a las expresiones tambin desarrolladas en el Ejemplo 8.7, la pureza de la transferrina en la masa total colectada en un intervalo de tiempo est dada por: masa de transferrina masa 7T~j total (masa de transferrina)(RE\) (masa de transferrina](RE\] -f (masa de sal^RE?)
PR\ -
Por otro lado, como a oc t>~2 ? se pueden desarrollar la siguientes relaciones:
= (-)* \viij
utilizando la ecuacin (8.59), se obtiene:
ton
Sustituyendo valores se puede establecer el siguiente sistema de ecuaciones:
(0.8) (REu),
478

!_ 2 1 2 12.65
12.65
410 880
VJ1
Erf
| LJf "\
El sistema anterior puede ser resuelto mediante el mtodo de clculo siguiente: . Suponer una t?//. . Calcular cr// y ton para ambos solutos. . Calcular t de la ecuacin de rendimiento de transferrina. . Calcular el rendimiento de sal. . Con los datos anteriores calcular la pureza de la transferrina. La suposicin de v ser correcta cuando sta sea del 98 %. De acuerdo a lo anterior el resultados es: vtl = 93
cm
t = 7.4 min
Esto representa aumentar 9.3 veces la velocidad en la columna. La Figura 8.19 muestra los perfiles de los solutos para el caso base y la situacin nueva. Los resultados sugieren que a nivel laboratorio la optimizacin consiste en incrementar la velocidad manteniendo una resolucin o pureza adecuada. El anlisis anterior es vlido, siempre y cuando el mecanismo controlante se mantenga en ambas situaciones. Tambin es importante hacer notar que para otro tipo de cromatografa la expresin de la desviacin estndar utilizada en este ejemplo, puede ser diferente.
479
4.000-
3.500 3.000-
1>
2.5002.0001.5001.0000.5000.000 Escala I Escala I
10
20
30
40
50 t (min)
80
90
100
Figura 8.19: Perfiles de concentracin del Ejemplo 8.8.
480
POR ELUCIN.
Los casos de escalamiento directo no lineal escapan al alcance de este trabajo pero existen varias publicaciones especializadas que pueden ser consultadas (Wankat y Koo, 1988).
Escalamiento Mediante Modelos

La mayora de los sistemas cromatogrficos han sido escalados directamente de los sistemas analticos de laboratorio. Este enfoque conduce a utilizar partculas muy pequeas (5-100 //m) que incrementan el costo del proceso; an cuando producen buena resolucin, poca dispersin y tiempos cortos de ciclo . Esto se debe a que las resistencias por difusin dentro de la partcula y los fenmenos de dispersin son menores con partculas pequeas. Estas partculas pequeas no siempre son las ms adecuadas en un proceso industrial, dado que el objetivo en stos es incrementar la productividad y no la resolucin de todos los componentes. Por otro lado, el escalamiento directo conduce a la utilizacin de una fraccin muy pequea del lecho cromatogrfico, aspecto que tambin impacta el costo. Las limitaciones del escalamiento directo han conducido a tratar de incorporar metodologas ingenenles al diseo de las columnas. En la Figura 8.20 se presenta la metodologa para el escalamiento mediante el uso de modleos de columnas. Cuando se utiliza este enfoque, los experimentos que se realizan ms que tener como objetivo desarrollar una optimizacin de la columna, estn orientados a la validacin del modelo y a la obtencin de los parmetros del mismo. Los modelos desarrollados son utilizados para predecir los perfiles de concentracin a la salida de la columna, por medio de una simulacin por computadora, , as como el impacto que sobre los perfiles producen los cambios en: - La geometra del sistema: Dc, L y dp. - La operacin del sistema: Flujo, concentracin, volumen y tamao de muestra. - Qumica del sistema: Tipo de eluyente, tipo de adsorbente y tipo de isoterma.
CROMATOGRAFAS
481
Relaciones de Equilibrio Coeficientes de T. de Masa
Modelo Cromatografa)
Simulacin
Perfiles de Concentracin Dinmicos
Mtodo de Operacin 'Concentracin Alimentacin Rujo Tamao Partcula Temperatura
Tiempo del Cido Productividad
Figura 8.20: Metodologa para escalamiento y optimizacin de columnas. Adaptada de: Wang, 1990.
482
- Modo de operacin. de tal manera que sea posible obtener un diseo ptimo bajo restricciones de costos, tiempo de ciclo, productividad, pureza y concentracin. Los modelos cromatogrficos presentados en este captulo son particularmente tiles cuando se trata de seguir este enfoque de escalamiento.
8.5
Sumario
La cromatografa por elucin se utiliza para obtener productos biotecnolgicos con un alto grado de pureza. Existen varias formas para llevar a cabo una operacin cromatogrfica que dependen del tipo de adsorbente empleado y las condiciones en las que se realiza. Las operaciones cromatogrficas se desarrollan generalmente en columnas empacadas fabricadas en diversos tipos de materiales y operadas tanto a presiones moderadas como a altas presiones. Las columnas cromatogrficas han sido escaladas principalmente a partir de columnas de laboratorio, pero existe creciente necesidad de apoyar el diseo de las columnas mediante el empleo de modelos.
8.6. PROBLEMAS
483
8.6
Problemas
8.1.- El ancho W de un pico es de 50 s y el tiempo de retencin es de 50 min. Calcular el nmero de platos tericos de la columna bajo estas condiciones. R: 57,600 8.2.- Los tiempos de retencin de los compuestos A y B, son de 800 y 815 5, respectivamente. La columna se puede considerar que tiene 8,100 etapas tericas para ambos compuestos. (a) Calcular la resolucin para estos compuestos en la columna. R: 0.42 (b) Suponiendo que los tiempos de retencin son iguales, estimar el nmero de etapas para obtener una resolucin de 1.
R: 45,500
8.3.- Obtener una expresin para la v ptima y la altura equivalente de un plato terico (HETP) mnima, a partir de la ecuacin (8.49). 8.4.- Utilizando el modelo de platos tericos y considerando iguales la altura equivalente de un plato terico para dos solutos que se desea separar, demostrar que:
a-1 F ..i Rs - -- -N*

esta ecuacin se conoce como la ecuacin fundamental de la cromatografa lineal, donde:
u -fi K!
AI
1: Soluto 1
484 2: Soluto 2
POR ELUCIN.
a: Selectividad k{: Factor de capacidad del soluto 1. k'2: Factor de capacidad del soluto 2. k'\ Factor de capacidad promedio. K\: Constante de equilibrio del soluto 1. K-2'- Constante de equilibrio del soluto 2. e: Porosidad del lecho. 1
I i |
8.5.- En el caso de la cromatografa lquida de alta resolucin puede considerarse que el ancho de los picos es igual, entonces: W\ W-. Demostrar que bajo estas condiciones,
donde el subndice 2 corresponde al soluto ms lento. 8.6.- En la separacin de albmina de suero de bovino (ASB) y mioglobulina (Mg), mediante una columna de laboratorio de cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), se determin que los factores de capacidad de los solutos son: kASB 0.8 y kMg = 1.1. La altura equivalente de un plato terico para la mioglobulina est dada por: 6.2 x l(T 5 -M.13u donde HETP est en metros y v en m/s. Estimar la resolucin esperada si la columna tiene un dimetro de 7.5 x 10~3 m y una longitud de 0.6 ni. El volumen de la muestra es de 10~7 m3 y la velocidad superficial en la columna es de 2.17 x 10~4 m/s Resp. Rs = 1.58 8.7.- Utilizando la expresin del problema 8.4, estimar la resolucin que se obtiene en una columna de 50 c??i, si en una columna de 20 era la
8.6. PROBLEMAS
485
resolucin obtenida es de 0.8 (considere como nica variable la longitud de la columna). R: 1.27 8.8.- Una mezcla contiene 70% de una droga y 30% de una impureza. Cuando esta mezcla se corre en una columna de laboratorio, los tiempos de retencin son de 9.7 y 8.7 h y la desviacin estndar de 0.5 y 0.2 /i, respectivamente. a).- Calcular el rendimiento de la droga si desea separarse mediante cromatografa y obtener una pureza del 99%. b).- Simular los perfiles de concentracin, pureza y rendimiento dados por las condiciones del problema utilizando la computadora. c).- Simular el efecto de variar la proporcin de soluto a 50:50% sobre los perfiles de concentracin, rendimiento y pureza. d).- Repita la simulacin para una proporcin 90:10% 8.9.- Cuando se procesa una mezcla de Lincomicina A y B, en una columna de partculas de celulosa, se colecta el 2.2%, 15.8% y 50% de lincomicina A a 600, 650 y 700 litros de elucin, respectivamente. Calcular el volumen para obtener un rendimiento del 95% de lincomicina A. R: 780 1 8.10.- Una columna de laboratorio ( Ghose, 1990) de 0.02 m de dimetro, se empaca con 0.065 Kg de Sephadex G-100 cuyo poder hidratante es de 0.003 m3/Kg de gel seca, producindose un lecho empacado de 100 cm de altura. La columna se utiliza para separar una mezcla de albmina de suero de bovino (ASB) de glucosa. El volumen utilizado de muestra es de 2 x 10~6 ra3, el cual tiene una concentracin de ASB de 5 Kg/m3 y 10 Kg/m3 de glucosa. La cromatografa se desarrolla utilizando agua como eluyente. El volumen de elucin (V0) de la ASB es de 1.05 x 10~4 m3 y el de glucosa de 2.95 x 10~4 m3. El volumen vaco de la columna (e V] se midi utilizando el polmero de alto peso molecular dextrano y fue de 1.05 x 10~4 m3 (en cromatografa en gel donde la cantidad de lquido en los poros de la matriz es considerable, esta medicin con dextrano no incluye el volumen de
486
dicho lquido V). El coeficiente de particin de los solutos A (ASB) y B (glucosa) est dado por:
donde Vc es el volumen total del lecho de la columna y Kp y K son los coeficientes de particin. El volumen de los poros V puede ser calculado con la expresin:
K = aWr
donde a es la masa seca de gel y WT la capacidad hidratanten de la
gel.
Se desea escalar la operacin de esta columna a una columna de 0.06 m de dimetro y 3 m de lecho manteniendo la relacin de volumen vaco a volumen total constante (K/K) = ce? y 1a realcin de volumen de los poros a volumen total constante. a). Determinar los volmenes de elucin de la ASB y de la glucosa en la nueva columna. b). La masa del adsorbente a emplear en la segunda columna. c). Demostrar que en cromatografa en gel el modelo de van Deemter conduce a: _ Vc(l-e)ep ~ V, Cul es el significado fsico de A'p?. d). Comparar la ecuacin (8.16) con la (8.39) para su uso en cromatografa en gel. a). Resp. (V0)A = 2.834 x 10~3 m3 b). Resp. 1.76 Kg 8.11.- Se desea efectuar un anlisis econmico de una operacin cromatogrfica, considerando los siguientes parmetros: S: Costo del adsorbente. \j Ky de. adsorbente}.
8.6. PROBLEMAS
487
p: Productividad promedio. [Kg de producto/Kg de adsorbente ciclo]. n: Duracin del ciclo, [ciclo/h]. t: Tiempo de vida del adsorbente, [h]. CA: Impacto del costo del adsorbente sobre el producto. a). Obtener una expresin del impacto del costo del adsorbente sobre el costo del producto. b). Graficar CA vs P para valores de S/nt de 0.1, 0.5 y 1.0, en el rango de O < P < 0.05 c). En una operacin cromatogrfica el adsorbente tiene un costo de $10.00//f<7 y tiene una vida de 2,000 h. La operacin se efecta de tal forma que se inyecta una muestra cada 2.5 h y la productividad promedio P es de 0.02 Kg deproducto/Kg de adsorbente ciclo. Estimar el impacto del costo del adsorbente sobre el producto. c). Resp. CA = $0.625//f <jr de producto 8.12.- Se desea efectuar un anlisis econmico de una operacin cromatogrfica, considerando los siguientes parmetros: S: Costo del adsorbente. [$/Kg de adsorbente]. P: Productividad promedio. [Kg de producto/Kg de adsorbente ciclo]. n: Duracin del ciclo, [cicloh]. t: Tiempo de vida del adsorbente, [h]. L = nt: Nmero de ciclos en la vida del adsorbente. CT'. Impacto del costo del adsorbente, regenerante y eluyente sobre el producto. [/Kg]. CA: Impacto del costo del adsorbente sobre el producto. [$/Kg]. CR: Impacto del costo del regenerante sobre el producto. [/Kg]. CE'. Impacto del costo del eluyente sobre el producto. [/Kg].
488
POR
R: Costo del regenerante. [/Kg de adsorbente ciclo de regeneracin]. Lft'. Ciclos por ciclo de regeneracin. M: Costo de eluyente. [$/ Kg de adsorbente ciclo]. Demostrar que:
8.13.- En la cromatografa de ASB se obtienen los siguientes datos:
v^f
0.005 0.010 0.015
HETP (cm)
0.12 0.19 0.26
Estimar los parmetros A, B, y C de la ecuacin de van Deemter para la columan empleada. Resp. A = 0.05 cm, B = O, C = 14 s 8.14.- En una separacin cromatogrfica se obtiene un pico de hemoglobina con una concentracin mxima de 0.22 g/l a los 820 s y una concentracin de 0.10 g/l a los 670 s. Estimar el nmero de etapas tericas y la altura equivalente de una etapa terica, si la columna utilizada tiene una longitud de 16.5 cm Resp. TV = 47 y HETP = 0.35 cm 8.15.- En una separacin cromatogrfica de albmina y hemoglobina se aplica una muestra que contiene un gramo de cada una de estas protenas, la cual se eluye con un flujo de 5 cra 3 /ram, obtenindose dos picos con las siguientes caractersticas:
8.6. PROBLEMAS Albmina Hemoglobina Conc. mxima Tiempo de elucin Conc. en un tiempo t Tiempo t 0.25 g/l 680 s 0.11 g/l 600 s 0.22 g/l 820 3 0.10 g/l 670 s
489
Calcular el rendimiento y la pureza de la albmina a los: a). 500 s b). 600 5 c). 1,200 s b). Resp. Para albmina RE = 0.1 y PR = 0.775 8.16.- La porosidad de un lecho medida con azul de dextrano es de 0.4. Cuando se corre albmina en una columna de 16.5 cm de altura y 2.5 cm de dimetro con un flujo de 5 cm3/mw su tiempo de retencin es de 680 s. Calcular la porosidad interna del empaque de la columna para esta protena. Resp. i = 0.5 8.17.- El valor experimental para la difusin en el poro en una matriz de agarosa es de 3.9 x 10~7 cm2/s. Comparar este valor con el que se obtiene mediante la correlacin para este tipo de geles (Boyer y Hsu, 1992):
/2 Dp = 8.34 x 10'10 (-7777^ 1 exp [-0.1307v (M1/3 + 1245) C 1 V uM1/3 / L ' J J
donde: Ai: Peso molecular de la mioglobina= 16890 Da. T: Temperatura=293 K. //: Viscosidad del solvente=0.01 g/cm s Cf. Concentracin de polmero en la partcula de adsorbente^ 0.04 *g/cm?
490
POR ELUCIN.
8.7
Bibliografa
Arnold, F.H., Blanch, H.W. y Wilke, C.R. 1985. Analysis of affinity separations. Chem. Eng. J. 30, B9-B23. Belter, P.A., Cussler, E.L. y Hu, W. 1988. Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology. John Wiley and Sons. New York. 7, 183-219. Bird, R.B., Stewart, W.E., y Lightfoot E.N. 1964. Fenmenos de transporte. Ed. Reverte. Mxico. Boyer, P.M. y Hsu, J.T. 1992. Experimental studies of restricted protein difusion in agarose matriz. AlChE, J. 38, 2, 259-272. Cowan, G.H., Gosling, J.F. y Sweetenham, W.P. 1987. Modeling for scale-up and optimisation of packed-bed columns in adsoption and chromatography. En: Separations for biotechnology. Verral, M.S. y Hudson, M.S. (Eds.). Ellis Horwood. England. 10, 152175. Fulton, S.P., Meys, M., Vrady, L., Jansen, R. y Afeyan, M.B.. 1991. Antibody quantification in seconds using amnity perfusin chromatography. Biotechecniques. 11, 2, 226-231. Furusawa, T., Suzuki, M. y Smith, J.M. 1976. Catal. Rev. Sci. Eng. 13, 1, 43-76. Ghose, T.K. 1990. Bioprocess Computations in Biotechnology. Vol. 1. Ellis Horwood. New York. 9, 229-264. Gibbs S.J. y Lighfoot E.N. 1986. Scaling up gradient elution chromatography. IEC Funcl. 25, 490-498. Janson J. C. y Hedman, P. 1982. Large scale chromatography of proteins. En: Adv. Biochem. Eng. Fiechner, A. (Ed.). SpringerVerlag. New York. 25, 43-99. Janson J. C. y Hedman, P. 1987. On the optimization of process chromatography of proteins. Biotechnology Progress. 3, 1, 9-13.
8.7. BIBLIOGRAFA
491
Knox J. y Pyper, H.M. 1986. Framework for maximizing throughput in preparative liquid chromatography. J. of chromatography. 363, 1-56. Ladisch, M.R. 1987. Separation by sorption. En: Advanced Biochemical Enginnering. Bungay, H.R. y Belfort, G. (Eds.). John Wiley and Sons. New York. 9, 219-237. Lapidus, L. y Amundson, N.R.. 1952. The effect of longitudinal diffusion in ion exchange and chromatographic columns. Mathematics of adsorption in beds VI. J. Phys. Chem. 56, 984-988. Nicoud, R.M. y Perrut, M. 1991. Operating modes, scale-up and optimization of chromatographic processes. En: Chromatographic and Membrane Processes in Biotechnology. Costa, C.A: y Cabral, J.S. (Eds.). Kluwer Academic Publishers. Netherlands. 381-413. van Deemter, J.J., Zuiderweg, F.J. y Klinkenberg, A. 1956. Longitudinal diffusion and resistance to mass transfer as causes of nonideality in chromatography. Chem. Eng. Sci. 5, 271-289. Wang, N.L. 1990. Ion exchange in purification. En: Separation Processes in Biotechnology. Asenjo, J.A. (Ed.). Marcel Dekker. New York. 12, 359-400. Wankat, P.C y Koo, Y. 1988. Scaling rules for isocratic elution chromatography. AIChE Journal. 34, 6, 1006-1019.
Captulo 9 Precipitacin
9.1 Introduccin
Algunos productos biotecnolgicos presentan solubilidades que varan con la temperatura, el pH, la fuerza inica y con la constante dielctrica del medio. Esta propiedad puede ser utilizada para concentrar y purificar estos productos mediante la operacin de precipitacin. En la precipitacin se concentra el soluto de una solucin convirtiendolo en slido mediante la accin del agente precipitante. Tericamente la precipitacin debe producir un soluto concentrado y puro, por lo que es una operacin que se usa con frecuencia al inicio de un proceso de bioseparacin. Los agentes precipitantes seleccionados no deben producir desnaturalizacin del soluto y deben proveer una mayor estabilidad del soluto en el precipitado que en la solucin. La precipitacin de protenas y la subsecuente recuperacin del precipitado, son de las operaciones ms importantes para la recuperacin y purificacin de protenas tanto a nivel laboratorio como a escala industrial. Las ventajas de usar la precipitacin para la concentracin y purificacin de solutos SOD. entre otras, las siguientes: 1. Es una operacicn que se adapta fcilmente a gran escala. 2. Puede realizars- en forma continua. 3. El equipo que ; - utiliza es sencillo.
493
494
CAPTULO 9. PRECIPITACIN Tabla 9.1: Pincipios de la precipitacin de protenas. Principio Agente Precipitante
Disminucin de la solubilidad Sales (Sulfato de Amonio) pH (Precipitacin isoelctrica) Solventes (etanol) Polmeros no inicos Desnaturalizacin selectiva.
Afinidad
Ligandos
4. Se dispone de diversos agentes precipitantes y en muchos casos stos son baratos. Este captulo se enfoca a la precipitacin de protenas debido a su gran inters biotecnolgico. En la seccin 9.2 se revisan los fundamentos de la precipitacin incluyendo algunos mtodos para la precipitacin de protenas. En la Seccin 9.3 se hace mencin de los equipos utilizados en esta operacin y en la Seccin 9.4 se presentan algunos aspectos del diseo de dichos equipos.
9.2
Fundamentos
La precipitacin de protenas puede realizarse empleando diferentes principios (Tabla 9.1). La precipitacin por disminucin de la solubilidad de la protena de inters se efecta por medio de un agente precipitante. Este puede ser una sal neutra como el sulfato de amonio; un agente que altere el pH de la solucin"; un solvente orgnico como etanol, acetona o ter; o algn polmero como el polietilenglicol.
9.2. FUNDAMENTOS
495
En la desnaturalizacin selectiva se producen cambios en la conformacin de las protenas contaminantes con el propsito de aislar en la solucin la protena de inters, utilizando como agentes precipitantes temperatura, pH y algunos solventes orgnicos. Un tipo reciente de precipitacin lo conforman los mtodos que se basan en la capacidad que tienen las protenas de formar complejos mediante la interaccin de los sitios activos de stas con ligandos especficos. En esta seccin se revisan los tres mtodos bsicos de precipitacin: Precipitacin por Disminucin de la Solubilidad. Precipitacin por Desnaturalizacin Selectiva. Precipitacin por Afinidad.
9.2.1
Precipitacin por Disminucin de la Solubilidad
El hecho de que las protenas sean molculas anfotricas se debe a que sus superficies (Figura 9.1) presentan regiones hidrofbicas, y regiones hidroflicas cargadas ya sea positiva o negativamente. Debido a su naturaleza anfotrica cuando una protena se encuentra en solucin acuosa produce complejas interacciones con la solucin que la rodea. Particularmente, cuando se agrega un agente precipitante a la solucin, las protenas que presentan mayor hidrofobocidad (por contar con mayor cantidad de aminocidos hidrofbicos en su superficie) precipitan ms fcilmente que las de menor hidrofobocidad. En el primer caso las protenas tienen una baja solubilidad y en el segundo caso una alta solubilidad. De lo anterior se desprende que la estructura de la protena determina su solubilidad. La protena permanece en solucin cuando termodinmicamente es ms favorable estar rodeada por el solvente que estar en un agregado con otra protena formando una fase slida. La protema puede insolubilizarse ya sea cambiando las caractersticas de su superficie, o cambiando el solvente que la rodea. Como el cambiar las caractersticas de la superficie de la molcula puede implicar cambiar la protena misma,
496
CAPTULO 9.
PRECIPITACIN
wm Regiones hidrofbicas
Figura 9.1: Esquema de la distribucin de carga y de zonas hidrofbicas en una molcula de protena tpica. generalmente se opta hacer cambios en el solvente que alteren la solubilidad de la protena. Los mtodos utilizados para la precipitacin de protenas que se revisan en esta seccin y que estn basados en la disminucin de la solubilidad por alteracin del solvente son: - Precipitacin con sales. - Precipitacin isoelctrica. - Precipitacin con solventes. - Precipitacin con polmeros no inicos. Precipitacin con Sales Una de las tcnicas ms ampliamente utilizadas para la purificacin de enzimas es la llamada precipitacin por insolubilizacin por salado o "salting out". Se realiza agregando altas concentraciones de sales a la solucin en le que se encuentra la protena para producir su precipitacin.
2,
FUNDAMENTOS
497
Insolubilizacin por salado
[Sal]
Figura 9.2: Efecto de la concentracin de sal en la solubilidad de protenas: Regiones de solubilizacin por salado e insolubilizacin por salado. La Figura 9.2 muestra una curva caracterstica de la solubilidad de una protena como una funcin de la concentracin de la sal en el medio. En esta figura se pueden apreciar dos regiones, la primera del lado izquierdo de la figura, donde la solubilidad de la protena se incrementa con la concentracin de la sal, llamada regin de solubilizacin por salado o "salting-in", y la otra donde la solubilidad de la protena disminuye a medida que la concentracin de sal aumenta llamada regin de insolubilizacin por salado o "salting out". El punto mximo de esta curva es caracterstico de cada tipo de protena. Mecanismo: Una descripcin simplificada del mecanismo de insolubilizacin por salado est basada en el hecho de que la adicin de las sales elimina el agua de la protema hidratada, dejando las regiones hidrofbicas en libertad de combinarse intennolecularmente (Glatz, 1990). Aquellas protenas que presentan mayor nmero de regiones hidrofbicas sobre su superficie, forman agregados y precipitan ms
498
CAPTULO 9.
PRECIPITACIN
Figura 9.3: Ordenamiento de las molculas de agua frente a las regiones hidrofbicas de la molcula de protena.
rpidamente que aquellas que presenten pocas regiones hidrofbicas. Debido a esta propiedad hay protenas que pueden permanecer en solucin a altas concentraciones de sal. Una descripcin ms detallada de la precipitacin con sales es la siguiente (Scopes, 1994): Cuando las molculas de protena estn en solucin las molculas de agua presentan un ordenamiento como el que se muestra en la Figura 9.3. Este ordenamiento lo produce el contacto entre regiones hidrofbicas de la protena con la solucin acuosa. Este ordenamiento es inestable termodinmicamente comparado con el que presentan las protenas sin solvatar conjuntamente con las molculas de agua libre. Si la precipitacin de protenas utilizando sales se presenta como una serie de tres procesos, de tal forma que en el primer proceso se considere la disolucin de la protena en agua, esta disolucin puede ser representa por:
9.2. FUNDAMENTOS
499
P + nH2O -> P nH2O
(9.1)
donde nH2O representa el agua ordenada alrededor de los residuos hidrofbicos de la protena P (el proceso tiene una AS y una AG negativas y por lo tanto una A// tambin negativa). En el segundo proceso que es hipottico, se considera a dos molculas de protena en disolucin que podran unirse al interactuar a travs de sus residuos hidrofbicos. De esta unin se liberara agua por medio de la siguiente reaccin: P niH20 + P' n2H2O -+(P- P') + (ri! + n2)H2O (9.2)
donde (P P') representa el agregado de protena que puede ser formado. En este segundo proceso se tiene que A5 es grande y positiva, el cambio en la entalpia se espera que sea aproximadamente el inverso del que presenta el proceso de la ecuacin (9.1). A (7 puede ser pequeo y su signo depende de la magnitudes de AS0 y A//. AG a bajas concentraciones de sal ser positiva para una protena soluble en agua. Puesto que la protena es soluble no ocurre el agregado dado por la ecuacin (9.2). En el tercer proceso se agrega una sal a la solucin, las molculas de agua liberadas de acuerdo al proceso hipottico de la ecuacin (9.2) son atrapadas por la sal, se producen agregados de protena y stos precipitan. Esto es:
(AB)ml + (ri! + n2)H2O -> A+ - niH2O + B' n2H2O
(9.3)
para esta reaccin A// es positiva. El proceso completo puede describirse de la siguiente manera: P-P' + (ni + ni)H20 + (AB)aai-* P - P' + A+ niH2O 4- B~ n2H2O (9.4) (9.5)
La Figura 9.4 muestra un esquema del efecto de una sal en la precipitacin de protenas (insolubilizacin por salado) basado en el proceso descrito anteriormente.
500
CAPTULO 9.
PRECIPITACIN
+ Sal
Solucin salina
(Agregado que Precipita)
Figura 9.4: Esquema de la precipitacin de protenas por insolubilizacin por salado. Ecuacin de la Precipitacin con Sales: El mecanismo de precipitacin descrito anteriormente proporciona una explicacin para la precipitacin de protenas por insolubilizacin por salado, sin embargo la teora de este fenmeno an est en desarrollo. Debido a lo anterior los modelos de precipitacin son de carcter emprico. Uno de los ms ampliamente utilizados es el de Cohn. En este modelo la solubilidad de la protena est dada por: log S = A m[conc. de sal] (9.6'
la ecuacin (9.5) es la ecuacin de una recta con pendiente m y ordenada al origen A. En esta ecuacin: S: Solubilidad de la protena a un valor dado de concentracin salina A: Constante que depende fuertemente del pH y la temperatura Esta constante usualmente toma un valor mnimo en el punt( isoelctrico, es caracterstica de cada protena e independient< del tipo de sal. m: Pendiente de la curva de insolubilizacin por salado. Esta e; independiente del pH y de la temperatura, pero vara con el tip< de sal y de protena. Las sales que contienen aniones polivalente tales como sulfates y fosfatos tienen valores de ra mayores qui las sales univalentes. Los cationes polivalentes como el calcio o e magnesio disminuyen los valores de m.
9.2.
FUNDAMENTOS
501
o-
TJ
-H
-2-
50 2.0
60 2.4
70 % Sat. 2.8 M
Figura 9.5: Solubilidad de aldolasa de msculo de conejo a pH 7.0 en solucin de sulfato de amonio: (o), solubilidad de la enzima pura; (-f) solubilidad en una mezcla de enzimas de msculo de conejo: aldolasa, piruvato kinasa, gliceraldehido fosfatasa deshidrogenasa y lactato deshidogenasa en proporciones 3:3:3:1. Fuente: Scopes, 1994.
Los datos experimentales que se presentan en la Figura 9.5 permiten apreciar el grado de ajuste del modelo dado por la ecuacin (9.5) para dos casos, el de una enzima pura y el de una mezcla de enzimas. Se observa para este ltimo caso una ligera desviacin respecto al comportamiento terico. En la Figura 9.6 se muestra otro ejemplo experimental de precipitacin de protena que obedece la ecuacin (9.5) (la escala de las ordenadas es logartmica). En esta figura se observa que el comportamiento lineal depende de la concentracin inicial de la enzima.
Naturaleza'de la Sal: La naturaleza de la sal que se utiliza en el proceso descrito por la ecuacin (9.3) es un aspecto muy importante
502
CAPTULO 9.
PRECIPITACIN
10
T3 'E D
'
1
1-1
0.5-
Fuerza inica ( moles/1)

0.1 4 5 6
30
40
50
60
% de saturacin
Figura 9.6: Efecto de la concentracin de enzima en la insolubilizacin por salado de fumarasa por sulfato de amonio a 6C. Concentraciones iniciales de enzima (unidades/mi): (A) 5.4; (o) 15.2; ( + ) 25.2. Adaptada de: Bell etal, 1983
9.2. FUNDAMENTOS
503
que debe considerarse. Las sales que producen enlaces e interactan directamente con la protena tienen efectos desestabilizadores. Las sales que producen mejores resultados, esto es, una mayor precipitacin de la protena, son aquellas que producen deshidratacin de las regiones hidrofbicas y fomentan la hidratacin de las regiones polares de la protena, sin interaccionar directamente con sta. Existen reglas heursticas para seleccionar la sal ms adecuada para un proceso de precipitacin, algunas de ellas son las siguientes: 1. Los aniones son ms efectivos en el siguiente orden (Series de Hofmeister):
citrato'3 > tartato'2 > SO'2 > F~ > IO^ > H2PO~ >
CH3COO- > Cl~ > C/03 > Br~ > N0~ > CIO~ > I~
2. Los cationes son efectivos en el siguiente orden:
NH+ > K+ > Na+
3. Seleccionar una sal que sea barata debido a las altas concentraciones que requiere el mtodo. 4. Seleccionar una sal que produzca un precipitado cuya densidad sea diferente a la de la solucin para facilitar su separacin. 5. Aadir la sal en forma slida y no como solucin, para minimizar la dilucin. Ejemplo 9.1.- Determinacin de la solubilidad de piruvato quinasa de msculo de conejo. En un experimento de precipitacin de la enzima piruvato quinasa con sulfato de amonio a pH 7, se obtuvieron los siguientes resultados (Scopes, 1994):
04
CAPTULO 9.
Dato No. 1
PRECIPITACIN
S
(mg/ml) 0.079 0.316 1.258 3.162
2 3 4
Concentracin sulfato de amonio (M) 2.60 2.50 2.37 2.24
a). Determinar los parmetros de la ecuacin de solubilidad A y m. b). Calcular la solubilidad de la enzima para una concentracin !.34 M de sulfato de amonio.
Solucin:
a). De acuerdo a la ecuacin (9.5) la solubilidad de la enzima est lada por: log S = A m[conc.salina] donde A es la ordenada al origen y m es la pendiente de la curva. Para determinar los valores de los parmetros de la ecuacin anterior, los valores experimentales se ajustan por mnimos cuadrados y se abtiene que A = 10.540 y m = 4.43. La Figura 9.7 muestra la grfica correspondiente. La ecuacin de solubilidad para la enzima piruvato quinasa est dada por: logS" = 10.540 4.43 x [conc.salina] b). Sustituyendo el valor de la concentracin salina en la expresin anterior, se tiene que la solubilidad de la enzima a una concentracin 2.34 M de sulfato de amonio es: S = 1.4918 mg/ml Precipitacin Isoelctrica Otra tcnica para precipitar protenas se basa en la disminucin de su solubilidad en el punto isoelctrico.
9.2.
FUNDAMENTOS
505
-2 -
2.0
2.4
70 % saturacin 2.8 M
Figura 9.7: Variacin de la solubilidad de la enzima piruvato quinasa en funcin de la concentracin de sulfato de amonio. Fuente: Scopes, 1994.
Mecanismo: Las protenas por su naturaleza anfotrica presentan una carga neta negativa a pH altos y una carga neta positiva a pH bajos. Existe un pH llamado pH isoelctrico al cual la carga neta de la protena es cero. A este pH la molcula es incapaz de desplazarse en un campo elctrico. En la Figura 9.8 se muestra el tipo de interacciones que se presentan entre molculas cargadas: - Cuando la protena se encuentra a un pH diferente de su pH isoelctrico, las molculas proteicas poseen una carga elctrica neta del mismo signo. Debido a esto existe una repulsin electrosttica entre las molculas ocasionando que su solubilidad se incremente. - Las atracciones electrostticas son bloqueadas por pequeos agregados de molculas. - En punto isoelctrico el efecto de las fuerzas electrostticas entre las protenas es casi nulo. En estas condiciones la solubilidad de la protena es mnima, y en consecuencia las molculas de protena tienden 'a unirse y a precipitarse. A este tipo de precipitacin se le llama precipitacin isoelctrica.
506
CAPTULO 9.
PRECIPITACIN
f \
Baja interaccin * + en el punto isoelctrico
Figura 9.8: Representacin esquemtica del efecto de las fuerzas electrosttica sobre la protena: a), atraccin, b). repulsin, c). atraccin nnima a pH isoelctrico. La Figura 9.9 muestra una curva tpica de la variacin de la can;idad de protena no precipitada con respecto al pH. En esta figura Duede observarse que existe un pH al cual la fraccin de protena no precipitada es mnima, ste es el pH isoelctrico. Cada protena tiene un pH isoelctrico caracterstico por lo que la precipitacin isoelctrica puede utilizarse como una operacin de puificacin de protenas. Sin embargo, cabe hacer notar que hay algunas )rotenas como las globulinas, que presentan una solubilidad consideable an cuando se encuentren en su pH isoelctrico. En la Tabla 9.2 e muestran pH's isoelctricos de algunas protenas.
Seleccin del agente precipitante. La precipitacin isoelctrica :omunmente se realiza a pH's cidos, debido a que los cidos son baratos r varios de ellos como el fosfrico, clorhdrico y sulfrico son aceptables :n productos alimenticios. La principal desventaja de usar cidos es su >otencial de producir daos irreversibles a la protena.
.2.
FUNDAMENTOS
507
0.8
0.6
0.4
0.2
pH
igura 9.9: Efecto del pH sobre la concentracin de .protena de soya jue permanece en solucin, expresada como una fraccin de la concen.racin inicial del extracto acuoso. Fuente: Bell et al, 1983.
leproducida con el permiso de Springer-Verlag. Copyright 1983. Todos los derechos reservados.
508
CAPTULO 9.
PRECIPITACIN
Tabla 9.2: pH's isoelctricos de algunas protenas. Protena Pepsina Ovoalbmina Seroalbmina Ureasa (3 -Lactoglobulina 71 - Globulina Hemoglobina Mioglobina Ribonucleasa Lisozima
pH ~ 1.0 4.6 4.0 5.0 5.2 6.6 6.8 7.0 9.6 11.0
Precipitacin con Solventes

La precipitacin de las protenas de una solucin tambin puede realizarse mediante la adicin de un solvente orgnico ligeramente polar. Mecanismo: El agua se caracteriza por su alta constante dielctrica (Tabla 9.3), lo cual significa que los iones en solucin acuosa presentan interacciones ms dbiles que en otros medios. Cuando se agrega un solvente orgnico como etanol o acetona, a una solucin acuosa de protenas (a un pH y temperatura dados), se producen agregados de molculas proteicas que tienden a precipitar. Este efecto se debe principalmente a que el solvente presenta una constante dielctrica menor que la del agua, lo cual produce un incremento en las fuerzas de atraccin entre cargas opuestas y una disminucin en el grado de ionizacin de los radicales de la protena, y en consecuencia una disminucin de la solubilidad de sta. Otra forma de explicar la precipitacin por solventes (Figura 9.10) consiste en considerar un desplazamiento global del agua por el solvente, conjuntamente con una inmovilizacin parcial de las molculas
2.
FUNDAMENTOS Tabla 9.3: Constantes dielctricas de algunos lquidos a 20(7. Lquido Agua Metanol Etanol Acetona Benceno Hexano
509
D
80.0 33.0 24.0 21.4
2.3 1.9
; agua por la hidratacin del solvente. El solvente puede desplazar las olculas ordenadas de agua de las regiones hidrofbicas estimulando precipitacin de la protena. Debido a que la influencia de la constante dielctrica es muy sensible la temperatura, este tipo de precipitacin debe trabajarse a tempe,turas bajas. Por ejemplo, la precipitacin de protenas de plasma imano utilizando etanol, se lleva a cabo a temperaturas tan bajas uno 100(7. Trabajar con temperaturas por arriba de 10C provoca jsnaturalizacin de la protena. cuacin de la precipitacin con Solventes: La expresin que tlaciona el cambio en la solubilidad de una protena en su punto oelctrico con un cambio en la constante dielctrica del medio es una cpresin emprica (Bell et a/, 1983) que est dada por:
log S = log S0 -f
(9.7)
donde Ds es la constante dielctrica de la mezcla solvente-agua, lisma que vara dependiendo de la cantidad de solvente agregada; K > una constante que toma en cuenta la constante dielctrica original el medio acuoso. S0 es la solubilidad extrapolada. eleccin del solvente: La mayor desventaja de la precipitacin con )lventes es la desnaturalizacin que puede sufrir la protena por accin
510
CAPTULO 9.
PRECIPITACIN
Solvente orgnico Regin hidrofbica
Figura 9.10: Representacin esquemtica de las interacciones electrostticas de agregacin entre las protenas en presencia de un solvente orgnico. Fuente: Scopes, 1994.
Reproducida con el penniso de Springer-Verlag. Copyright 1994. Todos los derechos reservados.
9.2. FUNDAMENTOS
511
del solvente, de tal manera que es importante seleccionar adecuadamente ste. Debe tenerse muy en cuenta la flamabilidad del solvente principalmente cuando se trabaja a gran escala, ya que algunos de ellos como los alcoholes son altamente inflamables y el uso seguro de los mismos ocasiona incrementos en los costos. Algunos factores que deben considerarse en la seleccin del solvente son: El solvente debe ser completamente miscible en agua. No debe reaccionar con las protenas. Debe ser un buen agente precipitante. Debe ser seguro. Precipitacin con Polmeros no Inicos La precipitacin de protenas tambin puede realizarse utilizando polmeros neutros como el polietilenglicol (PEG) en lugar de sales o solventes. Dichos polmeros de elevado peso molecular son solubles en agua y sus soluciones presentan viscosidades moderadas. Mecanismo: El mecanismo por el cual ocurre la precipitacin cuando se utilizan estos polmeros no est claramente establecido, sin embargo existen dos modelos que permiten una buena comprensin de este fenmeno. Los modelos desarrollados por Ogston y Laurent (Clark, 1989) conducen a una ecuacin de solubilidad de la misma forma que la ecuacin (9.5), y sugieren que los polmeros excluyen a las protenas de parte de la solucin y reducen la cantidad efectiva de agua disponible para su solvatacin. El modelo de Ogston se basa en la teora termodinmica y concluye que los sistemas (protena en solucin acuosa-polmero) pueden ser explicados en trminos de los coeficientes de interaccin protenapolmero, y protena-protena de las especies presentes. El modelo propuesto por Laurent se basa en un mecanismo de exclusin geomtrica de regiones hidratadas de la protena por el polmero. El modelo de Laurent (Juckes, 1971) considera, a la protena como una
512
CAPTULO 9.
PRECIPITACIN
esfera y al polmero como un cilindro, supone que la protena es incapaz de distribuirse dentro del polmero y, por lo tanto, que la solubilidad (S) de la protena es proporcional slo al volumen disponible (V) dado por: Vd = exp [-7r/(ra + r p ) 2 ] donde: rs: Radio de la molcula de protena. [//]. rp: Radio del cilindro del polimero. [L]. 1: Longitud total de la molcula de polmero por unidad de volumen (9.8)
[i].
Considerando que el volumen total (Vt) es igual al volumen disponible (Vd) ms el volumen excluido (K), el volumen excluido por peso del polmero (W) est dado por:
| = 1(1 - 10-KC)
donde: C es la concentracin del polmero y
/
(9.9)
\ 3
2.303 V rp
donde v es el volumen parcial especfico del polmero, la fraccin de volumen excluido Ve> y la fraccin de volumen disponible Vd> estn dadas por las siguientes expresiones:
VO = 1 - 10 -KC
como la solubilidad de la protena es proporcional a la fraccin de volumen disponible:
= x
FUNDAMENTOS
513
donde k es una constante de proporcionalidad. La ecuacin anterior de ser escrita en forma ms conveniente como: logS^logk-KC o bien como: logS^X-KC
jen X.
(9.10)
que es la ecuacin de una recta con pendiente K y ordenada en el
El uso de la ecuacin (9.9) proporciona un resultado similar (Juckes, 1) al que se obtiene utilizando el volumen disponible expresado en :cuacin (9.7). La ecuacin (9.9) es equivalente a la ecuacin corresidiente a la precipitacin por insolubilizacin por salado. El modelo de Ogston que se deriva de una simplificacin termodinica establece que la protena permanece en solucin siempre que potencial qumico en solucin sea menor que su potencial en la fase icipitada. Considera que el potencial qumico de la protena //t en enca de un polmero, est dado por: pi = f0. + R!T(lnm + ct-m + c,-mj) donde: Protena Polmero : Es el potencial qumico de la protena en el estado estndar : Es la constante de los gases ideales ': Es la temperatura absoluta til Es la molalidad de la protena ij\ Es la molalidad del polmero : Es el coeficiente de interaccin protena-protena (9.11)
514
CAPTULO 9.
PRECIPITACI1
Ciji Es el coeficiente de interaccin protena-polmero Cuando la molalidad del polmero rrij se incrementa, el potencia qumico se eleva y el sistema reacciona insolubilizando protena inician dose la precipitacin. Despus de sto el potencial permanece constan te. En un sistema polietilenglicol y protena en solucin acuosa, en e que solamente las interacciones polietilenglicol-protena y protena protena son significativas, la ecuacin (9.10) puede ser escrita corn (Foster et al, 1973):
(9.12
donde S es la solubilidad de la protena, C la concentracin d polietilenglicol, / el coeficiente de interaccin protena-protena y a c coeficiente de interaccin protena-polietilenglicol. La ecuacin (9.11 puede ser rearreglada en forma ms conveniente como:
(9.13
donde:
RT
En este sistema puede suponerse que el trmino fS es mucho m pequeo que In5 entonces la ecuacin (9.12) puede ser escrita como: \nS = X-aC
(9.14
que resulta ser anloga a la ecuacin de insolubilizacin por saladc La ecuacin (9.13) puede ser utilizada para calcular la solubilidad d la protena a diferentes concentraciones del polmero. La Figura 9.11 muestra el comportamiento de la solubilidad de 1 alcohol deshidrogenasa en funcin de la concentracin de PEG, a de niveles de concentracin de la enzima. Se puede apreciar que la cor centracin de PEG requerido para reducir la solubilidad depende de 1 concentracin de enzima. El grado de ajuste del modelo depende de 1 concentracin de la enzima, de tal manera que cuando la concentrado de la enzima es alta es necesario considerar en la ecuacin el trmin de interaccin protena-protena fS para un mejor ajuste.
p.2.
FUNDAMENTOS
515
1.5-
1.5-
1.0-
1.0-
0.5-
0.5-
10 14 6 10 Concentracin de polietilenglicol ( % w/v)
14
Figura 9.11: Relacin entre la solubilidad S de la alcohol deshidrogenasa y la concentracin C de PEG a dos concentraciones de la enzima: () 8 mg/ml; (o) 75 mg/ml. a) log (S) vs C, b) log (S) + fS vs C. Fuente: Foster, et al, 1973.
Reproducida con el permiso de Elsevier Science Lie. Copyright 1973. Todos los derechos reservados.
516
CAPTULO 9.
PRECIPITACIN
Seleccin del Polmero: Es importante seleccionar adecuadamente el polmero que se utilice como agente precipitante. Varios tipos de polmeros pueden ser efectivos en la precipitacin de las protenas el incoveniente es que algunos pueden generar una alta viscosidad que 5 dificulta su manejo. El polietilenglicol es un polmero disponible en varios grados de ' polimerizacin y presenta una viscosidad moderada. El polietilenglicol de peso molecular 4000 o mayor es ms efectivo en la precipitacin de protenas que el de bajo peso molecular. Se ha observado tambin (Bell et a/, 1983) que se requieren bajas concentraciones de polietilenglicol para precipitar protenas de alto peso molecular, mientras que para precipitar protenas de bajo peso molecular las concentraciones deben ser mayores. Una ventaja adicional de la precipitacin con polmeros no inicos es que stos estabilizan la protena y permiten realizar la precipitacin a temperatura ambiente. Adems, a diferencia de la precipitacin por ; salado en la cual debe eliminarse la sal antes de seguir con cualquier i operacin de fraccionamiento por intercambio inico, los polmeros no ] inicos generalmente pueden ser eludos durante el paso de la protena I por un intercambiador inico.
9.2.2
Precipitacin de Protenas por Desnaturalizacin Selectiva
Los mtodos de precipitacin por disminucin de la solubilidad son efectuados a condiciones moderadas de tal manera que la protena de inters no se desnaturalice. Si la protena que se desea purificar presenta estabilidad en condiciones extremas de temperatura, pH, o en solventes orgnicos, puede utilizarse esta propiedad en las primeras etapas del proceso de purificacin sujetando a la solucin de protenas a estas condiciones extremas, de tal manera que se eliminen por desnaturalizacin las protenas contaminantes y se obtenga una buena recuperacin de la protena deseada. El objetivo de la desnaturalizacin selectiva es crear las condiciones en las cuales la protena de inters no se desnaturaliza o su desnaturalizacin es mnima.
g.2. FUNDAMENTOS Desnaturalizacin por Temperatura
517
En general las protenas son muy sensibles a la temperatura. Sin embargo, hay protenas que se mantienen estables a temperaturas altas. Cuando esto sucede, puede usarse la temperatura para desnaturalizar y precipitar protenas contaminantes y aislar la protena de inters. El proceso de desnaturalizacin de la protena por efecto de la temperatura puede ser descrito como un proceso de primer orden de acuerdo a la siguiente expresin:
= -k[P]
donde: [P]: Concentracin de protena disuelta. [M/L3]. t: Tiempo, [t]. k: Velocidad especfica de desnaturalizacin. [t~1].
(9.15)
La dependencia del proceso de desnaturalizacin con la temperatura est dada por: (9-16) de tal manera que la influencia de la concentracin de protena y la temperatura sobre el cambio en la concentracin est dado por: P] donde: k0: Constante caracterstica. [t~l], E: Energa de activacin de la desnaturalizacin. [KJ /mol}. R: Constante de los gases ideales. [KJ /mol K}. T: Temperatura. [K]. (9.17)
518
CAPTULO 9.
PRECIPITACIN
1-s
45
50
55
Temperatura (C )
Figura 9.12: Diagrama terico de protena que permanece estable despus de 10 min de incubacin, con E 400 kj rao/"1. Fuente: Scopes, 1994.
Reproducida con el permiso de Springer-Verlag. Copyright 1994. Todos los derechos reservados
Las protenas tienen energas de activacin relativamente altas de ta manera que presentan una variacin muy significativa de la velocidac de desnaturalizacin con la temperatura. El mecanismo de desnatu ralizacin puede involucrar varios pasos, lo importante es determina; cual es la energa de activacin del paso ms lento o controlante. Po; regla general el primer paso es el ms lento e involucra el rompirnient< de los enlaces que le dan la conformacin a la protena. La Figura 9.1^ muestra un diagrama terico del porcentaje de protena que permanec estable despus de 10 minutos de incubacin, cuando la energa d< activacin es de E 400 kj mol~l. La Figura 9.13 muestra un esquema terico de las posibles curva de desnaturalizacin para diferentes enzimas. Cuando la enzima d> inters es la P5, siendo sta estable a temperaturas de hasta 58, si L solucin se calienta a 57, se desnaturalizan completamente las enzima Pl y P1- y en grado substancial la P3 y la P4. Esto significa qu es posible seleccionar una temperatura, que produzca por un lado 1
2.
FUNDAMENTOS
519
100-
1-s
50-
25-
40
45
50
55
60
Temperatura (C )
'igura 9.13: Esquema terico de las posibles curvas de desnaturalizain por temperatura de diferentes protenas. Fuente: scopes, 1994.
lesnaturalizacin completa de una enzima y por otro permita que otra >ermanezca estable. La precipitacin con temperatura puede ser riesgosa debido a que os daos que se ocasionen a la enzima de inters son irreversibles. La elucin se calienta hasta una temperatura dada, se mantiene por un )erodo de tiempo a dicha temperatura y enseguida se enfria rpidanente. Por lo tanto, se requiere contar con sistemas de enfriamiento idecuados, sobre todo en tanques agitados, para lograr bajar adecuadanente la temperatura y evitar as que sta pueda daar a la protena de nters. Es conveniente realizar el calentamiento en presencia de sulfato le amonio en la solucin, debido a que ste estabiliza las protenas e nhibe la actividad de las proteasas, que como es sabido se incrementa :on la temperatura.
520
CAPTULO 9.
PRECIPITACIN
Ejemplo 9.2.- Cintica de desnaturalizacin . La desnaturalizacin de una protema tiene una energa de activacin de 400,000 J/mol. Cuando esta protena se mantiene a 50 C por u n lapso de lOmin se desnaturaliza en un 50 %. a).- Calcular la constante de la velocidad especfica de desnaturalizacin. b).- Calcular la temperaratura a la cual la protena slo se desnaturaliza el 10 % en lOmin. Solucin: a).- La forma integrada de la ecuacin (9.14) es:
P / , x = exp(-kt)
In
cuando la desnaturalizacin es del 50 % la constante k est dada por:

k =
-ln(0.5) lOmin k = 0.0693 min~l k = 1.155 x 10~3 s~l
b).- De acuerdo a la forma integrada de la ecuacin (9.14),

^323 K
kT
^323 K
ln(0.5) ln(0.9)
= 6.58
kr
combinando el resultado anterior con la ecuacin (9.15) se obtiene:

^323 K
kT
'E /323 -T\l R V 323T )\
6.58 -
400000 -^-7 /323 - T\\ mol 1

oqi O. O
mol-\
r-
1 \ x
O<JJ
^^1T
x/
j/
FUNDAMENTOS
521
H,0
ura 9.14: Esquema de la desnaturalizacin de una protena por :to del pH. Las fuerzas internas obligan a la molcula a abrirse provodo su desnaturalizacin. Fuente: Scopes, 1994.
oducida con el permiso de Springer-Verlag. Copyright 1994. Todos los derechos reservados.
la temperatura es: T = 46C' snaturalizacin por pH 3do a que ciertas protenas de inters son estables a pH's extremos, la utilizado esta propiedad para purificarlas mediante la precipitai por desnaturalizacin selectiva de sus protenas contaminantes. La desnaturalizacin por pH ocurre tanto por la formacin en la lcula de protena de regiones con cargas iguales que tienden a resrse, como por el rompimiento de las fuerzas de atraccin que le dan :onformacin a la protena (Figura 9.14). La velocidad de desnaturalizacin a pH's extremos ya sea cidos o icos depende del tiempo que tarde la protena en abrirse y perder conformacin. Este proceso es esencialmente similar al que ocurre la desnaturalizacin por temperatura.
522
CAPTULO 9.
PRECIPITACIN
Desnaturalizacin por Solventes Orgnicos La estabilidad que presentan algunas protenas en una solucin con solventes orgnicos es una propiedad que ha sido utilizada en procesos de purificacin, mediante la precipitacin de protenas contaminantes con estos solventes. Cuando se utilizan solventes orgnicos como etanol, acetona o cloroformo para desnaturalizar protenas, la temperatura de la solucin se mantiene entre 20 y 30C con el fin de acelerar el proceso. Despus de un tiempo de incubacin a esta temperatura la solucin se enfra. El aumento de temperatura permite que la cantidad de solvente utilizada sea menor que la empleada en la precipitacin convencional de protenas. El pH y la temperatura de la solucin deben definirse y manejarse cuidadosamente (pues tambin actan sobre la protena de inters) con el fin de maximizar el rendimiento y la pureza de la protena de inters, y de lograr la mxima precipitacin de las protenas contaminantes. Una protena estable en solventes orgnicos es la alcohol deshidrogenasa de levadura. Esta enzima puede ser purificada mediante un tratamiento con 33% vol/vol de etanol.a 25C. Este tratamiento permite desnaturalizar las protenas contaminantes y obtener la deshidrogenasa. En la Figura 9.15 se muestra la desnaturalizacin de la enzima gliceraldehido fosfato deshidrogenasa con varios alcoholes a una temperatura de 30(7 y un tiempo de incubacin de 30 minutos (Scopes, 1994).
9.2.3
Precipitacin por Afinidad
La precipitacin de protenas por afinidad es un mtodo de precipitacin selectivo que se basa en la capacidad que tienen las protenas para unirse con ligandos por medio de sus sitios activos. En el caso de la afinidad bioespecfica el ligando puede ser un sustrato, un inhibidor, o un anticuerpo. En el caso de pseudoafinidad los ligandos utilizados son colorantes o metales. La simple adicin de ligandos a una solucin proteica generalmente no es suficiente para que ocurra la precipitacin. Es necesario que el ligando propicie un estado de agregacin de los complejos ligando-
9.2.
FUNDAMENTOS
523
10
Figura 9.15: Desnaturalizacin de gliceraldehido fosfato deshidrogenasa: (o), metanol; (), etanol; (O), 1-propanol; (), 1-butanol; (<), 1-pentanol; (+), 2-propanol. Scopes, 1994.
524
CAPTULO 9.
PRECIPITACIN1
a)
b)
Figura 9.16: Representacin esquemtica de la formacin de agregados por inmunoafinidad y por afinidad, a). Agregado en forma de cadena constituido por un anticuerpo policlonal y una protena monomrica. b) Agregado en forma de red producido por un anticuerpo policlonal y una protena tetramrica o por ligandos bis-NAD y una protena tetramrica. Fuente: Scopes, 1994.
Reproducida con el permiso de Spriiiger-Verlag. Copyright 1994. Todos los derechos reservados.
protena. La precipitacin por afinidad bioespecfica ocurre slo cuando se agrega un ligando especfico a la solucin de protenas. Este ligando se une con las protenas o enzimas y forma agregados. El tipo de agregados que se forman depende del tipo de ligando y de la protena. En la Figura 9.16 se presentan dos sistemas de precipitacin por afinidad. La Figura 9.16a presenta un agregado producido por la unin de un anticuerpo policlonal y una protema monomrica, llamado inmunoprecipitado. Este tipo de agregados se producen en forma natural en el caso de los sistemas antgeno-anticuerpo. En el caso de que las protenas sean oligomricas se originan redes como la que se muestra en la Figura 9.18b. El principio de precipitacin por inmunoafinidad se ha generalizado
. EQUIPO DE PRECIPITACIN
525
ra el uso de otro tipo de ligandos que no son anticuerpos y que se >ducen de manera artificial, dando origen a un nuevo enfoque en la jcipitacin por afinidad al utilizar ligandos bifuncionales bis-NAD. tos ligandos se enlazan covalentemente a los sitios activos de las )tenas oligomricas y forman redes semejantes a la que se muestra la Figura 9.16b. Esta tcnica de precipitacin por afinidad ha tenido m xito en la precipitacin de deshidrogenasas utilizando como pretitante el ligando Bis-NAD . Se ha reportado un rendimiento del 85% la recuperacin de la enzima lactato deshidrogenasa (Luong et a/, 37). La limitacin de este enfoque de la precipitacin radica en que se lica nicamente a protenas oligomricas, y es necesario llevar a cabo rias pruebas experimentales para determinar cul es la concentracin tima de bis-ligando a la que ocurre la precipitacin de la totalidad la protena. En la Figura 9.17 se muestra un esquema de otro enfoque de la ?cipitacin por afinidad, el cual ya ha sido aplicado a escala industrial, insiste en sujetar el ligando a un polmero obtenindose as agentes iltifuncionales (macroligandos) que se unen con la protena de inters forman agregados. Posteriormente se produce la precipitacin del nplejo ligando-protena al agregar sal a la solucin o al cambiar el [ de la misma (Janson, 1984).
Equipo de Precipitacin
operacin de precipitacin puede realizarse en diferentes tipos de ictores entre los que se encuentran los reactores intermitentes, tubues y continuos tipo tanque agitado (Figura 9.18).
Diseo de Precipitadores
el diseo de un proceso de precipitacin debe tomarse como base el nportamiento cintico de las partculas en solucin. El conocimiento este comportamiento permite hacer la seleccin adecuada de la geo>tra en que se realizar el proceso. En base a lo anterior, esta seccin enfoca a dos aspectos:
526
CAPTULO 9.
PRECIPITACIN
A//
Extracto crudo
p.-.
o 0 0
o a
Formaoibod agregado* maoofigafldo - produca
Cambia tn I pH d* U solucin
Precipitado maerotiga'ido producto
S*pvcin Ipredudo
o
0
o o
o O
9.17: Representacin esquemtica, de la precipitacin del comgando-protena al agregar una sal o cambiar el pH de Ja solucin, icin del macroligando a la solucin proteica; b). formacin del |o ligando-protena; c). precipitacin del complejo, d). disode la protema del macroligando.
DISEO DE PRECIPITADORES
527
Alimentacin
^
C2
Alimentacin
to
(b) (a)
P
/->--v:-.?.:
(c)
^S
V^^
V
Producto
a 9.18: Tipos de reactores utilizados en la precipitacin de nas. a) Intermitente b) Tubular c) Continuo tipo tanque agitado. Cintica de la Precipitacin. Diseo del Precipitador.
Cintica de la Precipitacin
ecipitacin de protenas puede efectuarse ya sea desnaturalizando desnaturalizar stas. En este apartado se revisan los aspectos ;cos relacionados con la precipitacin sin que ocurra desnaturalin de la protena. a una solucin proteica las molculas presentan por efecto de su a cintica un movimiento al azar que produce choques entre s. que las molculas de protena queden asociadas al chocar se ree eliminar tanto las barreras producidas por las molculas de agua is rodean, como las que originan sus cargas elctricas, ira facilitar su estudio la cintica de la precipitacin se divide en fruientes fases: Mezclado inicial: La solucin proteica se mezcla con el agente precipitante para eliminar las barreras. Nucleacin: Al disminuir la solubilidad de la protena se inicia la precipitacin al formarse en el seno de la solucin pequeas partculas (ncleos).
528
CAPTULO 9.
PRECIPITACIN
3. Crecimiento limitado por difusin: En esta fase los ncleos van creciendo conforme la protena difunde del seno de la solucin hasta los ncleos. La frecuncia de las colisiones est limitada por la velocidad de difusin de las molculas y no por el mezclado. Se forman las partculas primarias de tamao entre 0.1 y 10 4. Crecimiento influenciado por el flujo: El mezclado favorece el crecimiento del agregado formndose partculas en el rango de 1 a 100 5. Floculacin: Los agregados se juntan formando los grandes flculos. En la descripcin anterior las fases de crecimiento 3 y 4 son llamadas tambin crecimiento pericintico y agregacin ortocintica, respectivamente. Mezclado Inicial Una vez que se agrega el agente precipitante (sal, solvente o polmero no inico) a la solucin de protenas, se requiere que : ste se difunda rpidamente para obtener una mezcla homognea. El f tiempo requerido para obtener una mezcla homognea esta dado por:
donde: D: Coeficiente de difusin. [cm2/s]. 1: Dimetro promedio de los remolinos ocasionados por la agitacin. [cmj. De acuerdo a la teora de difusin de remolinos el dimetro de stos est dado por:
donde:
-.4. DISEO DE PRECIPITAD ORES p: Densidad de la solucin, [g/cm3]. i/: Viscosidad cinemtica. [cm2/s].
529
P/V: Razn de potencia por unidad de volumen del sistema de agitacin. [HP/cm3]. Combinando las ecuaciones (9.17) y (9.18) se pueden estimar tiernas de mezclado mediante parmetros del sistema. Este tiempo es una ledida del tiempo necesario para tener una mezcla homognea. ucleacin. En esta fase del proceso se inicia la formacin de las equeas partculas de precipitado (ncleos) que aparecen despus de gregar el agente precipitante. En algunos casos como en los sistemas oloidales esta etapa es instantnea, por lo que el tiempo en que esto curre puede despreciarse. En esta etapa las partculas de precipitado e encuentran dispersas en el lquido.
Crecimiento Limitado por Difusin o Crecimiento Pericinico. En esta fase la velocidad con que disminuye la concentracin e partculas de soluto suspendidas en el seno del lquido, puede ser escrita de acuerdo a la teora de Smoluchowski por un proceso de egundo orden:
- =ks/-2
donde: t: Tiempo, [s] k: Constante del proceso. [I/mol s].
(9 20)
yi\ Concentracin de partculas de soluto en el tiempo t. [mol/I].
Considerando un tiempo de nucleacin instantneo la integracin e la ecuacin (9.19) conduce a: -- = k*
y^
yio
(9.21)
530
CAPTULO 9.
PRECIPITACIN
donde y to es la concentracin inicial del soluto i. La ecuacin (9.20) describe una recta con ordenada al origen \/yi y pendiente k. Debido a que es difcil medir la concentracin y, la ecuacin (9.20) puede escribirse en trminos del peso molecular promedio del precipitado utilizando un balance de masa. Esto es: yM = yloM0 (9.22)
combinando las ecuaciones (9.20) y (9.21), se puede obtener la siguiente expresin:
M = M0 + M 0 y io k
donde: M0: Peso molecular del soluto. M: Peso molecular promedio de las partculas de precipitado.
(9.23)
La ecuacin (9.22) se representa grficamente en la Figura 9.19. La ordenada al origen es M0 y el valor de la pendiente est dada por M0/,-0k. Si se conocen 7/to y M0 puede estimarse k. La constante k del crecimiento pericintico, de acuerdo con la teora de Smoluchowski, slo depende de la difusividad y el dimetro de la partcula de soluto. De aqu que esta etapa est limitada por la velocidad de difusin. De acuerdo a esta teora k est dada por:
k = SnDdN
(9.24)
donde: , es el dimetro de la partcula; D, es el coeficiente de difusin; y TV, es el nmero de Avogadro. El valor del coeficiente de difusin de la ecuacin anterior es un valor promedio de todas las partculas en el sistema, de tal forma que a medida que la partcula crece el valor del coeficiente de difusin disminuye. De acuerdo a la ecuacin (9.23) an cuando esto suceda, el valor de la constante no se altera pues la disminucin en D tiene como causa un incremento en la misma proporcin del dimetro de la partcula d, de
9.4. DISEO DE PRECIPITAD O RES
531
m = pendiente
Figura 9.19: Representacin esquemtica de M vs t para determinar experimentalmente el valor de la constante k. tal manera que el producto Dd permanece constante, y en consecuencia k permanece constante. Es decir, la determinacin experimental de k puede ser aplicada a diversos sistemas. Generalmente el tiempo de formacin de las partculas primarias es mucho menor que el tiempo global del proceso de precipitacin.
Crecimiento Limitado por el Flujo o Agregacin Ortocintica.

La difusin puede limitar el crecimiento de partculas pequeas, pero es menos importante en el crecimiento de partculas grandes. En el proceso de precipitacin cuando se agita una suspensin de partculas cuyo dimetro es mayor que una fj,m aproximadamente, el movimiento del fluido provocar que las partculas choquen y formen agregados. Estos choques tambin pueden ocasionar rompimiento de los agregados. El crecimiento de las partculas estar limitado tanto por el movimiento del fluido como por la concentracin de partculas. En una suspensin agitada de partculas esfricas de tamao uniforme de dimetro e?, la velocidad con que disminuye la concentracin inicial de esas partculas debido a los choques que forman agregados, est dada por:
532
CAPTULO 9.
PRECIPITACIN
Ii
= k V?
>1
(9 2^
\&-\J)
idealmente la ecuacin anterior debera incluir un trmino para tomar en cuenta el crecimiento pericintico. Sin embargo, dicho trmino se hace menos importante conforme aumenta el tamao de las partculas. La constante k de la ecuacin (9.24) est dada por:
1/2
[ pv
(9.26)
en esta ecuacin a representa un coeficiente que indica la eficiencia del choque, indica la frecuencia con que un choque da lugar a un agregado. Este coeficiente puede ser estimado estudiando la velocidad con que decrece el nmero de partculas durante el crecimiento pericintico. Se ha encontrado que en ausencia de fuerzas repulsivas entre las partculas, la eficiencia de la colisin es proporcional a la (velocidad de corte)~'18 y aproximadamente proporcional a d~-73. Si se sustituye la expresin de k en la ecuacin (9.24) se obtiene:
v,3 = -aNd dt 3
P"
(9.27)
En la ecuacin (9.26) el dimetro d de las partculas depende del tiempo, por lo que para su integracin se considera una fraccin constante f de volumen de partculas del soluto a volumen de la solucin. Esta fraccin esta dada por:
7TC?2
(9.28)
si ce esta ecuacin se despeja d3 y se sustituye en la ecuacin (9.26) se obtiene una ecuacin en la cual no esta involucrado el dimetro de las partculas y es
dt
fP/V\ ~
1/2
(9.29)
DISEO DE PRECIPITADORES malmente, integrando la ecuacin (9.28) se tiene:
533
(~~J *}
/p/vY'2] }
(9 30)
londe j/io es la concentracin inicial de soluto en la solucin bajo consideraciones del modelo. l)n un proceso de precipitacin en el cual el crecimiento de las culas est limitado por el flujo, el cambio en la concentracin de s tiene un decaimiento exponencial. D ara determinar el coeficiente de eficiencia de colisin a, debe conrarse que ste depende no slo del tamao de las partculas sino bien de la velocidad de corte del fluido. Lo anterior se debe a que partculas que aparentemente pueden ir directo a una colisin, tiena seguir las lneas de corriente del fluido con lo que disminuye la >abilidad de la colisin. culacin. La aglomeracin o floculacin de las partculas de pretado es la ltima fase del proceso de precipitacin. Durante la agregacin ortocintica el crecimiento es funcin directa mezclado. Sin embargo, este mismo mezclado puede causar el pimiento de los flocules formados. Debido a lo anterior la fase loculacin generalmente se realiza a bajas velocidades de agitacin L ocasiones sin agitacin, proceso conocido como envejecimiento del ipitado. La floculacin espontanea de la suspensin puede ser estimulada por licin de agentes floculantes, en este caso la velocidad de floculacin ender del mezclado del agente con la solucin de protenas, de la 'Cidad de difusin y de la unin del agente floculante a la superficie a molcula de protena. Todas estas etapas determinan el tiempo ;spera antes de que la floculacin comience. Estos aspectos deben arse en consideracin en el diseo del precipitador.
: .2
Diseo de Precipitadores
)roceso de crecimiento de las partculas en la precipitacin puede T limitado por varios mecanismos. An cuando hay pocos datos
534
CAPTULO 9.
PRECIPITACIN
para definir la relacin que existe entre las condiciones de mezclado inicial y el tamao de partcula, puede suponerse que para protenas que precipitan rpidamente, la velocidad de mezclado de los reactantes afectar el tamao inicial de la partcula y las caractersticas de su crecimiento posterior. De tal manera que en el diseo del precipitador deben tenerse muy en cuenta las condiciones de mezclado en las que se realizar la precipitacin, existiendo dos arreglos bsicos: - Precipitador intermitente. - Precipitador Continuo.
Precipitador Intermitente
En un precipitador intermitente la protena est expuesta a un rango de condiciones creadas por el agente precipitante durante el tiempo en que ste se agrega a la solucin, entonces las condiciones inicales de precipitacin del material son diferentes a las condiciones finales. Para disminuir este efecto el agente precipitante debe agregarse lentamente y bien dispersado. En un precipitador intermitente todas las partculas son sometidas a fuerzas de corte similares, y cuando stas son controladas, se producen partculas primarias ms grandes que las obtenidas en los precipitadores tubulares. A nivel laboratorio es muy usado el precipitador intermitente que consiste en un tubo de ensayo que se agita en vortex por un corto tiempo inmediatamente despus de agregar el agente precipitante. Posteriormente se deja en reposo toda la noche. Otro arreglo bsico es el vaso de precipitados agitado magnticamente (Chan et a/, 1986). En el escalamiento de un proceso de precipitacin lo que interesa es que la cintica que se observa a nivel laboratorio sea la misma que la que se presente a gran escala. Cuando la velocidad de crecimiento pericintico es alta con respecto a la velocidad del proceso global de precipitacin, como generalmente es el caso de la precipitacin de protenas, las ecuaciones (9.18) y (9.29) establecen que la cintica de precipitadra a nivel laboratorio y a gran escala ser la misma siempre que la razn P/V permanezca constante entre ambas escalas, dado que
. DISEO DE PRECIPITADORES
535
densidad de la solucin /o, la viscosidad cinemtica /, a y t/> no ibian con la escala. Ejemplo 9.3. Precipitacin de Casena. La casena a de bovino es una protena que precipita en presencia de -uro de calcio a concentraciones 0.008 M. Se va a precipitar casena artir de una solucin que presenta una densidad ps de 1.032 g/cm3 y i viscosidad cinemtica v de 0.01 era 2 /s. El proceso se va a realizar un tanque agitado con una potencia P de 1.0 HP y un volumen V 1000 /. La concentracin de la casena en la solucin alimentada ?/,0 es de g/l. El peso molecular M de la caseina-a es de 27,000, la densidad precipitado pp medida a nivel laboratorio es de 1.367 g/cm3, el metro, d es de 0.002 x 10~4 cm y el coeficiente de difusin, D es de x 10~7 cm2/s. Se estima que el coeficiente de aglomeracin a tiene un valor de 0.08 ue el tiempo en que se realiza la nucleacin es instantneo. A partir ia informacin anterior estimar: a). El tiempo en que el crecimiento est limitado por la difusin y oncentracin de partculas al final de este tiempo, b). El tiempo para alcanzar un tamao de partcula de 50 //m. Solucin: Se tienen los siguientes datos: = 1.032 g/cm3 = 1.367 g/cm3 = 0.01 cm2/s = 1 HP = 746 x 107 g - cm2/s3
= 1000 /
-0.1 g/l
= 27,000
536
CAPTULO 9.
PRECIPITACIN
d = 0.002 x 10~4 cm D = 8.5 x 10~7 cm2/s

a = 0.08
a).- El tiempo requerido para un mezclado homogneo est dadc por la ecuacin (9.17). El tiempo t corresponde al tiempo en el cual e crecimiento est limitado por la difusin. combinando las ecuaciones (9.17) y (9.18) y sustituyendo valores s< tiene:
3 \ 1/2
4D \P/VJ
-,1/2
1.032 -^ (o.Ol sai)

746xlo r^2 6 3
4(8.5
lQ-7 cffil)
10 cm
t = 3.46 s
La concentracin de partculas T/ al final de este tiempo se determin; combinando las ecuaciones (9.20) y (9.23) para obtener: - = + (SxDdN)t de tal manera que:
27000
7 cm , w ~7 8(7r)(8.5 x 10
0.1
103 cm3
(0.002 x 10~4cm) x 6.02 x 10J

1
3.7 x 10- ^ mol
8.9 x 101
-(3.46 s) mol ,3 cm" mol
entonces,
i = 1.12 x 10 -13
mol
0.4. DISEO DE PRECIPITADORES
537
la concentracin final es mucho menor que la inicial. b).- El tiempo necesario para obtener partculas de 50 //m de dimetro est dado por la ecuacin (9.29):
In
de acuerdo al balance expresado en la ecuacin (9.21),
y el peso molecular promedio M de las partculas de 50 fim es:
M = M =
M = 5.39 x 10 l6
9
1Q23
rnolec
4 TT (50 x 10 4 )
mol
entonces, 27,000
yio
5.39 x 1016
13
WMI
= 5 x 10~
yio
la fraccin de volumen de soluto en la solucin es:
w ^
: 103
1.367
o ^r cm3 0.10 g
i) =
7.31 x 1CT5
sustituyendo estos valores se tiene:
538
CAPTULO 9.
PRECIPITACIN
ln(5 x 1Q-13)
1/2
_ /4xO.Q8x7.31xlQ-5\ / ^ * /4bxiu ' I 106 cm 3 x 1.032
t -
4474 5
el paso controlante en esta precipitacin es el crecimiento ortocintico. Precipitadores Continuos En un reactor tubular cuando se tiene un buen mezclado en el punte donde se agrega el agente precipitante, la protena se ubica rpidament< a las condiciones finales en que ocurre la precipitacin. Las fuerzas d( corte a las que estn sujetas las partculas pueden ser las que produc< el flujo laminar, an cuando la velocidad media de corte puede excede a la de un tanque agitado. En un reactor continuo tipo tanque agitado la protena es puesta ei contacto instantneamente con el agente precipitante, alcanzndose a mismo tiempo las condiciones finales de precipitacin. Las condicione de corte son muy parecidas a las de un precipitador intermitente, y la partculas estarn sujetas a las fuerzas de corte durante el tiempo d residencia en el reactor (Glatz, 1990) . La Figura 9.20 muestra la influencia del tipo de reactor sobre 1 curva de insolubilizacin por salado de la fumarasa (Bell et a/, 1983] Puede observarse que existe un desplazamiento en la curvas, que pued ser debido a diferencias locales en el pH, provocadas por la forma com se agrega el sulfato de amonio. El mismo corrimiento se observa cuand hay variacin en el grado de mezclado en un tanque agitado. Los resultados anteriores sugieren que un factor importante a cor siderar en el diseo del reactor, es la agitacin que se proporciona a 1 solucin en la que se encuentra la protena de inters. Esto es part cularmente importante cuando se desea escalar el proceso debido a 1 relacin que hay entre potencia y agitacin. Para'visualizar el diseo de precipitadores continuos, se puede part de un sistema sencillo donde se cuenta con una suspensin diluida (
. DISEO DE
PRECIPITADORES
539
15.0 10.0
1.0
Fuerza inica ( mol" 1 )
7
SO
8
70
9
80
60
% de saturacin
$ura 9.20: Influencia del tipo de contacto sobre la curva de insolubiicin por salado de fumarasa. V Contacto intermitente con sulfato amonio slido, o Contacto intermitente con solucin saturada de fato de amonio, Contacto continuo r = 96 s , V=0.38 1 y solucin rUrada de sulfato de amonio. < Contacto continuo r = 918 s V=1.87 solucin saturada de sulfato de amonio. Bell et a/, 1983.
reducida con el permiso de Springer-Verlag. Copyright 1983. Todos los derechos reservados.
540
CAPTULO 9.
PRECIPITACIN
20 g/l) y velocidades de agitacin moderadas, de tal manera que e rompimiento de los agregados pueda ser despreciado (Rohani y Chen 1993). Bajo estas condiciones es posible utilizar balances poblacionale para derivar expresiones de las velocidades de nucleacin, crecimienti y agregacin a partir de datos experimentales. Las correlaciones emp ricas que se obtienen son de la siguiente forma:
til
= kG exp veIu9T
(9.31
(9.32
V J^ /
(9.33
donde: B: Velocidad de nucleacin. [nmero de ncleos// h]. G: Velocidad de crecimiento pericintico. [fj,m/h]. Iagg- ndice de agregacin. Medida del crecimiento ortocintico. [adim.]. ks, ko y k: Constantes cinticas. [Unidades consistentes.]. EB, EG y E A- Energas de activacin. [KJ/mol]. cr: Sobresaturacin aparente. /: Fuerza inica. [mol/I]. u: Velocidad de agitacin, [rpra]. r: Tiempo de residencia promedio, [h]. a, b, c, d, e, f, g, h, p, q, r, s: Constantes empricas.
DISEO DE PRECIPITADORES A su vez el ndice de agregacin est dado por:

TT
541
(9.34)
donde:
0:
Nmero de partculas por unidad de volumen en el precipitado. [nm/3].
^: Nmero de partculas formadas por nucleacin en un tiempo de residencia. [nm/L3]. Cuando la agregacin es total el ndice toma el valor de uno, cuando existe agregacin el ndice toma el valor de cero. La definicin de sobresaturacin en un proceso de precipitacin es ipleja. En el caso de una precipitacin continua la sobresaturacin ;de definirse como:
/n o c \ (9'35)
donde Ce y Ca son las concentraciones proteicas a la entrada y salida precipitador. Ejemplo 9.4.- Precipitacin isoelctrica de protenas de una aginosa. En el estudio cintico de la precipitacin de protena a partir de una tcin obtenida de una pasta de una semilla oleaginosa, se obtuvieron correlaciones empricas siguientes:
B = 4.;
G = 0.
lagg =
1.2exp
RT J
542
CAPTULO 9.
PRECIPITACIN
a).- Estimar la velocidad de nucleacin, la velocidad de crecimiento y el ndice de agregacin cundo la precipitacin se efecta a las condiciones siguientes: a =0.6246, r = 0.048 /, u= 270 rpm, 7=0.027 rnol/ y T=295K. b).- Estimar el nmero de partculas por unidad de volumen en el precipitado. Solucin: a).- Aplicando las correlaciones correspondientes se tiene:
B"
= 4 . 8 x 1 0 " exp
1654 8.314 mcp/-/\ ** x 295/T
((0.6246)5'723(0.027)--1 (270)-905(0.048)--215)
? =
1.67 x 1015 ^^ / h
G = 0.7 exp'
8.314 F x 295K molh
-2860 ^ m l
((0.6246)-67(0.027)--091(270)0-625(0.048)-0-833)
X-Y G = no o ^m 93.0
Iagg
1.2 exp 8.314
-470
mo 7_ 0 ^ x 295 A
'
((0.6746) 0 - 007 (0.027)-- 003 (270) 0 - 004 (0.048) 0 - 008 )
/a55 - 0.99
b).- De acuerdo a la ecuacin que define al ndice de agregacin,
9.5. SUMARIO
543
Np Np
Np
Br(l-Iag3)
= fl.67 x 1015 ^^\ (0.048 h) (1 - 0.99)

= 8.oi6
xlO 1 1 ^
9.5
Sumario
La precipitacin es una operacin empleada tanto para la concentracin como para la purificacin de soluciones proteicas. Existen varias formas de realizar una operacin de precipitacin, dependiendo del tipo de agente precipitante que se utilice y el principio que se emplee. De tal manera que la precipitacin puede realizarse por disminucin de la solubilidad, por desnaturalizacin selectiva y por afinidad. Los equipos empleados en la precipitacin pueden ser intermitentes o continuos en diseos convencionales. El diseo de estos equipos se realiza mediante una combinacin de experimentos y modelos cinticos de cierto grado de complejidad.
544
CAPTULO 9.
PRECIPITACIN
9.6
Problemas
9.1.- En la precipitacin de alcohol deshidrogenasa con sulfato de amonio utilizando un volumen de 30 mi, en determinaciones realizadas en el sobrenadante se obtuvieron los resultados siguientes: % de Saturacin (NH4)2S04
50 45 40 35
25
Actividad Especfica 180,000 200,000 650,000 440,000 430,000
Protena total (mg)
29.80 21.28 17.87 8.65 23.87
Obtener los parmetros A y m de la curva de precipitacin para la actividad de la enzima en U/ml. Resp A=5.7 y m=-0.244 9.2.- Una protena se desnaturaliza el 50 % cuando se calienta a 50C por lOmin. Estimar el tiempo de calentamiento para que la desnaturalizacin sea slo del 10 %. Resp. 1.51 min
9.7. BIBLIOGRAFA
545
9.7
Bibliografa
Bell, D. J., Hoare, M. and Dunnill, P. 1983. The Formation of Protein Preciptales and their Centrifugal Recovery. En: Downstream Processing. Advances in Biochemical Engineering. SpringerVerlag. New York. 26, 1-72. Chan, M.Y.Y., Hoare, M. y Dunnill, P. 1986. The kinetics of protein precipitation by different reagents. Biotechnology and Bioenginnering. 27, 387-393. Clark, W. M. 1989. Thermodynamics of protein partitioning in aqueous two phase system. En: Chemical Engineering Problems in Biotechnology. Shuler, M. L. (Ed.). AIChE. New York. 147-179. Foster, P.R., Dunnill, P. y Lilly, M.D. 1973. The precipitation of enzimes from cell extracts of Saccharomyces cerevisiae by polyethylene glycol. Biochemica et Biophysica Acta. 317, 505-516. Glatz, C.E. 1990. Precipitation. En: Separation Processes in Biotechnology. Asenjo, J.A. (Ed.). Marcel Dekker. New York. 329-356. Janson, J. 1984. Large-scale affinity purification. State of the art and future prospects. Trends in Biotechnology. 2, 31-38. Juckes, I. R. M. 1971. Fractionation of proteins and viruses with polyethylene glycol. Biochemica et Biophysica Acta. 229, 535546. Luong, J. H. T, Nguyen, A. L y Male, K. B. 1987. Recent developments in downstream processing based on affinity interactions. Tibtech. 5, 281-286. Rohani, S. y Chen, M. 1993. Aggregation and precipitation kinetics of cala protein by isoelectric precipitation. The Canadian Journal of Chem. Eng. 71, 689-698. Scopes, R. 1994. Protein Purification: Principies and Practice. Springer-Verlag. New York. 3, 41-71.
Jltrafiltracin
D.l Introduccin
, ultrafiltracin (UF) es una operacin que emplea membranas espejes en diferentes tipos de arreglos para separar macromolculas en ucin de contaminantes ms pequeos, por medio de un gradiente presin. La ultrafiltracin es utilizada en la etapa de purificacin de caldos )lgicos. En esta etapa los caldos sujetos a purificacin contienen al uto de inters en forma ms concentrada y pura que el caldo original, bido a sto los volmenes a tratar son menores que los correspondites a las primeras etapas del proceso. Para describir un proceso de membrana es necesario poder estable el movimiento relativo de los componentes de la mezcla a travs de membrana, debido a la fuerza originada por el gradiente de presin, neralmente se realiza una descripcin fenomenolgica donde la memina se considera como una caja negra, es decir, el mecanismo mi>scpico de flujo (y rechazo) no es explicado en este enfoque. Este amiento es caracterstico del enfoque de los fenmenos de transrte. La ultrafiltracin forma parte de un conjunto de "operaciones de mbrana" empleadas en diferentes etapas de los procesos de biosepa;in. Es importante hacer notar que los principios bsicos de estas oraciones son comunes.
547
548
CAPTULO 10.
ULTRAFILTRACIN
En la seccin 10.2 de este captulo se efecta una descripcin general de los diferentes procesos de membrana existentes con el propsito de establecer las principales similitudes y diferencias de stos con respecto a la ultrafiltracin. Se resalta la importancia que tiene la operacin en flujo tangencial para este tipo de sistemas. Se presenta tambin en esta seccin la teora de la ultrafiltracin que permite analizar el efecto de los diversos parmetros sobre el comportamiento de esta operacin. En la seccin 10.3 se se describen las caractersticas ms importantes de los principales equipos utilizados en los procesos de membrana. La seccin 10.4 presenta los fundamentos del diseo de equipos de UF haciendo nfasis en el clculo de reas y tiempo de UF de dichos sistemas. Se presenta una discusin sobre las condiciones ptimas de operacin de un sistema en el marco de la mecnica de fluidos y los esquemas de operacin ms frecuentes en los sistemas de UF.
10.2
Fundamentos
Para el tratamiento de la operacin de UF es conveniente establecer primero el marco donde se desarrolla. Asimismo, es conveniente revisar los fundamentos tericos de la operacin que facilitan su uso y correcta aplicacin. En este sentido, esta seccin hace nfasis en tres aspectos: Los procesos de membrana. Flujo cruzado o tangencial La teora de UF.
10.2.1
Procesos de Membrana
Actualmente existen varios procesos que emplean una membrana par lograr una separacin dada (Me Gregor, 1986). Estos procesos s< pueden caracterizar en forma general en base a: - La fuerza impulsora del proceso. - El tipo de membrana que emplean.
12.
FUNDAMENTOS
549
Cabla 10.1: Principales caractersticas de los procesos de membrana.

MF
Fuerza impulsora Presin de operacin (KPa) fipo de membrana Flux Ifm2 h flango de retencin Especie Peso molecular D Hongos Levaduras Bacterias Coloides Virus Protenas 10* - 10b Polisacrido 10* - 106 Enzimas 10* - 106 Antibiticos 300 - 10J Azcar 200 - 400 Ac. Orgnico 100- 500 [on inorgnico 10 - 100
AP
UF
AP 100-500 Microporosa Asimtrica 10-200
o
AP 700-20,000 Semipermeable Asimtrica 1-20
D
ACDilisis
Simtrica
-
100-500 Microporosa Simtrica 50-1000 Tamao
mn
10J - 10* 10J - 10* 300- 104 300- 10-5 30 - 300 2-10 2-10
2-5 X
X X X
X X X X
X X
X X X X X X X X
0.6- 1.2 0.8- 1 0.4 - 0.8 0.2 - 0.4
Adaptada de: Fane y Radovich, 1990. producida con el permiso de Marcel Dekker Inc. Copyright 1990. Todos los derechos reserdos.
El rango de tamao de partcula que retienen sus membranas. De acuerdo al tipo de fuerza impulsora los principales procesos de embrana (Tabla 10.1) se pueden clasificar de la siguiente forma: Gradiente de presin. Ultrafiltracin (UF). Microfiltracin (MF). Osmosis Inversa (01). Gradiente de concentracin Dilisis (D).
550
CAPTULO 10.
ULTRAFILTRAC1N
O Partculas Macromolculas o Microsolutos
AP
Alimentacin_jo u-o Ao 0ô ^ u 0 ao<oA ^[_Retenido

0 0
A O^. ^ A n
o ^ o o ^ o w o w 00 o w o o p
^ <^^ ^^ ^^ A
>
Permeado
\
4
Membrana
Figura 10.1: Esquema de ultrafiltracin. - Gradiente de Voltaje Electrodilisis (ED).
\
j \
Ultrafiltracin
La ultrafiltracin utiliza membranas microporosas generalmente asimtricas o anisotrpicas para separar macromolculas y partculas, de ; molculas pequeas y solventes (Figura 10.1). Las membranas anisotrpicas son las ms utilizadas en UF debido a que las membranas microporosas convencionales poseen una estructura tortuosa que provoca retencin irreversible de partculas dentro de la matriz lo que dificulta su limpieza y reuso. Las membranas anisotrpicas tiene dos capas caractersticas: una pelcula delgada y densa de 0.1 a 1.5 fj,m de espesor y bajo la pelcula una subestructura microporosa de 0.1 - 1 mm que presenta aberturas progresivamente mayores, que facilitan el paso del solvente y los solutos que logran pasar la pelcula (Figura 10.2). Las membranas utilizadas en UF se caracterizan por su Peso Molecular de Corte (PMC), el cual es el peso molecular del soluto globular
FUNDAMENTOS
551
Membrana Anisotrpica
Filtro Microporoso
ira 10.2: Comparacin de membranas Dtrpicas. Fuente: Santos, et el, 1991.

eservados.
convencionales con
'ducida con el permiso de Kluwer Academic Publishers. Copyright 1991. Todos los dere-
552
CAPTULO 10.
ULTRAFILTRAd
<O Partculas Macromolculas o Microsolutos
Alimentacin_ro-oomo
omo
û ô0 A 0 ^ [_Retenid
Permea< Membrana Figura 10.3: Esquema de microfiltracin. que es retenido en un 90 % por la membrana. El PMC vara entre 5i 1,000,000 para la mayora de las membranas de UF, lo cual repres< la retencin de partculas de 1 a 10,000 nanometros de tamao. presiones caractersticas de la ultrafiltracin son moderadas en el re de 100 a 500 KPa. Las capacidades caractersticas son del ordei 10 200 //m 2 h (al flujo volumtrico por unidad de rea de memb se le conoce como flux y se utiliza para especificar equipos de UF) Microfiltracin La microfiltracin emplea membranas con poros ms grandes qu( utilizados en UF, ya sean de tipo convencional o asimtricas. La mi filtracin (Figura 10.3) se emplea generalmente para separar de ca biolgicos partculas mayores de 1 /zm como coloides y clulas, tualmente tiende a desplazar a la filtracin convencional y a la trifugacin como tcnica de recuperacin celular. El rango de pre de operacin tambin es restringido debido a las caractersticas d< equipos que se emplean, y es del orden de 160 - 500 KPa. Un r caracterstico de la MF es que puede manejar flujos mucho mayores la UF del orden de 50 - 1000 l/m2 - h.
10.2. FUNDAMENTOS
553
Partculas
Macromolculas Microsolutos
Alimentacin ro-o5
0
0 0
u 0 00
0 0
0
o
O
0
0 0
0 0 0
0 o o
^Permeado Membrana Figura 10.4: Esquema de osmosis inversa.
Osmosis Inversa
La osmosis inversa (Figura 10.4) utiliza membranas semipermeables que permiten el paso slo del solvente (generalmente agua), para separar ste de solutos de bajo peso molecular. La fuerza impulsora es un gradiente de presin que debe vencer la presin osmtica normal de las soluciones, es decir, invertir el flujo espontneo. Las presiones utilizadas en esta operacin son relativamente altas del orden de 700 a 20,000 KPa. Las membranas utilizadas en O son pelculas no porosas que permiten el paso del solvente a travs de espacios entre los polmeros que conforman la membrana. Los iones no pueden estar solvatados en estos pequeos espacios y por lo tanto no son transportados. Los flujos caractersticos en la O son del orden de 1 20 l/m2 h.
Dili ISIS
La dilisis (Figura 10.5) emplea membranas de poro muy pequeo (menor que las membranas de UF). Esta operacin se utiliza para separar solutos de sus soluciones, en base a su peso molecular y posiblemente a su conformacin y carga. El o los solutos a separar de la solucin de
554
CAPTULO 10.
ULTRAFILTRACIN
Partculas Macromolculas Microsolutos
AC
Al i mentado n_j-
CZ>
Corriente Purificada
o
0 O 0
o o 0 o o o o0
00
0 O 0 0
oo 0
'
r Dializado
Membrana Figura 10.5: Esquema de dilisis. alimentacin fluyen hacia la solucin de lavado o dializado a travs de la membrana, slo por la accin de un gradiente de concentracin. El papel fundamental de la membrana es impedir el paso de macromolculas o partculas de la alimentacin al dializado permitiendo e! paso del solvente y de solutos ms pequeos. En los procesos de electrodilisis la operacin de dilisis se efecte bajo la accin de un campo elctrico.
10.2.2
Flujo Cruzado o Tangencial
En los procesos de separacin por membrana se producen gradientes d< concentracin de los solutos en la proximidad de la membrana, causado por las diferentes velocidades de transporte de cada uno de ellos. Est efecto es conocido como "Polarizacin de la Concentracin" . Esta polarizacin acta de dos formas: - En los procesos de dilisis disminuye el gradiente de concentraci efectivo, disminuyendo por lo tanto el flux de impurezas. - En los'procesos de MF, UF y 01, produce un Incremento de la concei tracin de solutos en la proximidad de la membrana (Figura 10.6
,2.
FUNDAMENTOS
555
Rux de Agua
Ce
Membrana
10.6: Gradiente de concentracin durante la UF. Fenmeno de larizacin. Fuente: Tutunjian, 1985b.
>roducida con el permiso de Elsevier Science Inc. Copyright 1985. Todos los derechos reser-
lo cual por un lado puede incrementar el flux de soluto, y por otro disminuir el flux del solvente debido a un aumento de la resistencia al flujo producida por esta barrera de concentracin. Asimismo, puede ocasionar una resistencia adicional debido a que puede estimular la interaccin del soluto con la membrana ocasionando que esta se incruste con soluto. El flux de solvente a travs de la membrana puede ser incrementado ;nificativamente utilizando flujo cruzado o tangencial en lugar del jo de extremo-cerrado convencional (Figura 10.7). En los sistemas flujo cruzado la alimentacin fluye en forma paralela a la membrana nimizando el efecto de la polarizacin de la concentracin, ya que el uerzo cortante del fluido estimula el desplazamiento de las partculas la superficie de la membrana.
K2.3
Teora de la Ultrafiltracin
teora de la ultrafiltracin est orientada a tratar de predecir el flux un sistema dado en ^funcin de los parmetros de operacin como i: presin, temperatura, concentracin de la solucin y velocidad igencial. Es importante sealar que la teora de la ultrafiltracin es
556
CAPTULO 10.
ULTRAFILTRACINI
Filtracin Convencional
Filtracin de Flujo Cruzado
Figura 10.7: UF convencional y de flujo cruzado. de aplicacin limitada, pero es til en la interpretacin y extrapolacin de los datos experimentales, as como de gua para la operacin de los equipos. El principal parmetro de diseo de un sistema de UF para concentrar una solucin es el rea necesaria para lograr una concentracin determinada en un tiempo dado, bajo limitaciones de rangos de presin y temperatura tolerados por los equipos. La prediccin del flux o la interpretacin y extrapolacin correcta de las mediciones experimentales de ste, se enfocan a resolver este problema de diseo. Prediccin del Flux La fuerza impulsora de un proceso de UF es el gradiente de presin transmembrana (APTM), el cual puede ser definido en referencia a la Figura 10.8 como:
P 4- P
(10.1)
o bien, APTM =
P0 - P
,2.
FUNDAMENTOS
Pi
** ^r1 v
557
Po
~~TK
Permeado
Retenido
Vlvula de Contrapresin Retenido Mdulo deUF
P
Alimentacin Bomba
Filtrado
gura 10.8: Relacin de presiones en UF. Fuente: Tutunjian, 1985b.

roducida con el permiso de Elsevier Science Inc. Copyright 1985. Todos los derechos reser-
donde: PTM: Gradiente de presin transmembrana. : Presin de entrada de la alimentacin. ,: Presin de salida del retenido. : Presin de salida del permeado o filtrado. P = P P0'- Gradiente de presin del flujo tangencial. En este arreglo la bomba debe ser dimensionada para proveer la )cidad de flujo cruzado necesaria a.s como la APTM. Esta ltima ontrolada restringiendo la vlvula ;e contrapresin a la salida de la dad de UF. Le. Figura 10.8 muestre, el hecho de que las presiones de
558
CAPTULO 10.
ULTRAFILTRACIN
entrada y salida a la unidad, pueden ser moni toreadas con el empleo de manmetros. Ejemplo 10.1.- Clculo de APTM La presin de alimentacin a una unidad de UF es de 1.70 Kg/crri2 La vlvula de salida de la unidad se ajusta de tal manera que la cada de presin del flujo tangencial es de 0.68 Kg/cm2 y la presin del permeado despreciable. Estimar APTM. Solucin: Se puede utilizar la ecuacin (10.1) para calcular APTM. Primero es necesario calcular P0. Conociendo que
AP - P - P0
entonces P0 = (1.70 - 0.68) Kg/cm2 = 1.02 Kg/cm2
1 7 4- 1 02 APTM = ' ' Kg/cm2 = 1.36 Kg/cm2

t
Un comportamiento tpico de un proceso de ultrafiltracin de una macromolcula se muestra en la Figura 10.9, la cual muestra la variacin de flux del permeado J (L3/L2 ) con el gradiente de presin transmembrana (APTM) para soluciones de concentracin en el rango de O a 65 % en celdas de ultrafiltracin agitadas (sin flujo cruzado). Se obtienen resultados anlogos a los anteriores cuando se utilizan equipos operando con flujo cruzado constante (Figura 10.10). Sin embargo, al aumentar la velocidad de flujo cruzado U se produce un incremento en el flux J. En UF se utiliza la variable J para describir el flux de permeado c velocidad del permeado a travs del lecho filtrante, mientras que en la filtracin convencional se utiliza la variable v para el mismo efecto, es decir, Q Gasto volumtrico J =v = = : A rea
2.
FUNDAMENTOS
559
'0.8 % Solucin Salina

r
0.66 % Proteica (1830 RPM )
3.0 % Protelna (1830 RPM ) 6.5 % Protelna (1830 RPM ) 6 5 % Protelna ( 880 RPM )
APTM (Atm )
'igura 10.9: UF de albmina en una celda. Fuente: Belfort, 1987.

oducida con el permiso de John Wiley and Sons. Copyright 1987. Todos los derechos vados.
T = 60
Linea A
1.5
1.0
J cm/h
0.5
0.0
0 1 2 APTM (Kg/crn) 3
ura 10.10: Efecto de la presin, de la velocidad de recirculacin y a concentracin sobre el flux. Fuente: Le y Howell, 1985.
oducida con el permiso de Elsevier Science Inc. Copyright 1985. Todos los derechos reser-
560
CAPTULO 10. ULTRA FILTRACIN
La prediccin del flux a que hace referencia el ttulo de esta seccin consiste en encontrar relaciones que permitan describir y predecir el comportamiento experimental al que se hace referencia. Para analizar los resultados experimentales (Figura 10.10) para una solucin de una concentracin dada, es conveniente dividirlos en dos regiones separadas por un gradiente de referencia APTM ++ : - Regin I.- Localizada a la izquierda de APTM ++ , donde J es funcin de APTM y U. - Regin II.- Localizada a la derecha de APTM ++ , donde J slo es funcin de U (independiente de APTM).
Modelo General del Flux

La descripcin fenomenolgica del flux en un proceso de ultrafiltracin, se ha efectuado por varios caminos con resultados anlogos. Por medio de la termodinmica de los procesos irreversibles, la ecuacin del flux de solvente que se obtiene es: J = L P (APTM - crATr) donde: Lp: Coeficiente de permeabilidad. cr: Coeficiente de rechazo del soluto por la membrana. ATT: Contrapresin osmtica. J: Flux de permeado. Por otro lado, cuando se utiliza la ecuacin de D'arcy como se hiz< en el caso de la filtracin convencional (Captulo 3) se obtiene la si guente expresin: (10.2)
donde:
,2. FUNDAMENTOS ^: Resistencia de la membrana. ;5: Resistencia de la capa de soluto de polarizacin.
561
El coeficiente de rechazo en un instante dado durante el proceso de est dado por:

1
(10.4)
B
donde: 'p: Concentracin de soluto en el permeado. 'B. Concentracin de soluto en el seno de la solucin. : Coeficiente de retencin del soluto por la membrana. = 1: Retencin completa del soluto por la membrana. = 0: Retencin nula del soluto por la membrana. De acuerdo a las ecuaciones (10.2) y (10.3),
Dado que la presin osmtica para macromolculas en solucin y ra dispersiones coloidales es muy baja, en dicho caso el modelo ge:al de flux en la forma de la ecuacin (10.3) se transforma en:
Se puede utilizar la ecuacin (10.6) para efectuar una descripcin ilitativa de las observaciones experimentales (Figura 10.10) que se lizan en un proceso de UF: En soluciones diluidas la resistencia Rs puede considerarse nula. Si adems se considera Rm constante, entonces J vara linealmente con APTM (lnea A).
562
CAPTULO 10.
ULTRAFILTRACIN
- Para la regin I donde APTM < APTM ++ , se puede considerar que Rm > Rs, es decir la resistencia de la membrana es controlante Es una zona donde J depende de APTM; los incrementos en APTM producen un aumento en Rs, de tal manera que J tiende a un valor mximo conforme aumenta APTM. - En la regin II donde APTM > APTM ++ , se puede considerar que Rs > Rm. Los slidos retenidos representan la resistencia controlante, de tal manera que J es independiente de APTA/. Los incrementos en APTM producen incrementos en Rs tales, que no se produce un incremento en J. Esta regin es ms sensible a la velocidad del flujo cruzado por actuar sta directamente sobre RsEl uso del modelo general para la prediccin del flux requiere poder expresar Rs en trminos de parmetros medibles como se hizo en el caso de la resistencia de la torta RT, en el captulo de filtracin convencional. Los intentos que se han efectuado en este sentido son de uso limitado para el caso de UF de protenas y coloides. Modelo de polarizacin con pelcula (Regin I).- Otro enfoque para obtener el modelo del flux propone que el fenmeno de polarizacin de la concentracin slo se presenta en una pelcula delgada del fluido en la proximidades de la membrana (Teora de la capa lmite). En esta pelcula el perfil de concentracin es funcin de APTM. Considerando como nica variable la APTA/, los perfiles de concentracin en estado estacionario se irn incrementando conforme se incremente APTM (Figura 10.11). Un balance de soluto en estado estacionario (UF continua) en una pelcula diferencial en la interfase fluido-membrana puede ser expresado como:
Movimiento Movimiento convectivo de difusivo del soluto hacia la = soluto de la interfase interfase al seno del fluido
-f
Movimiento convectivo de soluto fuera de la interfase
\0.2.
FUNDAMENTOS
563
Flujo de Permeado
Flujo Alimentacin
x=o
APTMi
Cw
Incremento de
APTM y del
x=6
Flux
APTM
APTM3
Figura 10.11: Variacin del perfil de concentracin en estado estacionario con el gradiente de presin transmembrana. CB ' Concentracin de soluto alimentacin. Cw Concentracin de soluto en la 3ared de la membrana. Cp : Concentracin de soluto en el permeado. ): Espesor de la capa lmite de concentracin.
564
CAPTULO 10.
ULTRAFILTRACIN
(10.7)
donde: * : Constantes en estado estacionario. APTM: Constante. DAB'- Difusividad del soluto en la solucin. x: Coordenada espacial. Separando variables e integrando a lo largo de la capa lmite con:
x = O;
r V A , L
C = CB
C l-'M' C^r O
La ecuacin (10.7) se transforma en:
J* =
AD
In yy
/1 n o \ (10.8)
Si la membrana presenta un coeficiente de rechazo total Cp = O, entonces la ecuacin (10.8) se simplifica a:

J> =
^B,
(1()_9)
dado que el espesor de la pelcula 8 generalmente es desconocido, el coeficiente DAB/& se sustituye por un coeficiente de transferencia de masa ks, de tal manera que: J* = k,\n^(10.10)
.2. FUNDAMENTOS
565
El modelo de pelcula permite analizar la dependencia del flux J* a los parmetros fsicos y geomtricos que afectan 8. El coeficiente de insferencia de masa ks puede ser estimado por medio de correlaciones perimentles de la literatura, donde los parmetros que afectan el Desor de la capa lmite de la transferencia de masa, se agrupan en ipos adimensionales como el Reynolds, el Schmidt y el Sherwood. Para flujo en tubos circulares las siguientes ecuaciones son aplica;s: Flujo laminar:
Y * ~V/3
o bien en trminos de nmeros adimensionales,
i \ ^/^ ^-ReSc] 2L/ J
(
Flujo turbulento: donde: ;: Dimetro del tubo. [L].
(10.11)
Sh = 0.023#e-83Sc-33
(10.12)
UB: Difusividad del soluto. [L/t2]. : Longitud del tubo. [L]. : Velocidad promedio del fluido en el tubo. [L/t]. : Viscosidad. [M/L t]. Densidad. [M/L3]. .e: Nmero de Reynolds, c: Nmero de Schmidt.
566 Sh: Nmero de Sherwood.
Es importante hacer notar que de acuerdo a las ecuaciones (10.11) y (10.12): Para flujo laminar:
t/V /3
o bien cuando se usa el esfuerzo cortante definido como:
(10.13)
(10.14)
L,
entonces,
J'ocfy) (10.15)
\ljj
donde 7 es el esfuerzo cortante del fluido sobre la membrana. Para Flujo Turbulento: r oc U0'83 (10.16)
El modelo de polarizacin de pelcula conjuntamente con las ecuaciones (10.11) y (10.12) permiten interpretar los resultados experimentales de los procesos de UF: En la regin I: - El flux J* considerando U constante, es proporcional a In l/Cs- El flux J* aumenta al aumentar U . - El flux J* vara con /3 en flujo laminar y con U0'83 en flujo turbulento. - El flux J* aumenta al aumentar C^ la cual a su vez aumenta con
APTM.
En la regin II:
.2. FUNDAMENTOS
567
J* es proporcional a Inl/C^ cuando la velocidad de recirculacin constante. J* aumenta al aumentar U. Vara con U* en flujo laminar y con U0'83 en flujo turbulento. Estos resultados se muestran en forma grfica en la Figura 10.12. Modelo de polarizacin en pelcula y capa de gel (Regin ).- De acuerdo con el modelo de polarizacin en pelcula (ecuacin .10) el flux J puede ser incrementado aumentando la concentracin soluto en la membrana C\v (aumentando APTM). Sin embargo, se serva que en la regin II (Figura 10.10), existe un lmite para este >o de correlacin. Uno de los modelos ms empleados para la regin II propone que en i soluciones macromoleculares, el aumento de Cw con APTM tiene lmite CG, donde la solucin forma una "capa de gel" (Figura 10.13). te gel acta en serie con las otras resistencias. Este modelo llamado lodelo de capa de gel", implica que en la regin II de la UF los incre;ntos en APTM se contrarrestan con incrementos en la resistencia de capa de gel, de tal manera que J se mantiene constante. De acuerdo o anterior, la ecuacin (10.10) se transforma en:
donde CG es la concentracin lmite que es una constante para un tema dado. ks es el coeficiente de transferencia de masa dado por las relaciones ya presentadas (ecuaciones (10.11) y (10.12)). Ejemplo 10.2: Clculo de CG y ks. Los datos de flux en //m 2 h de la UF de una solucin proteica se estran en la Tabla 10.2. Estos datos se presentan en forma grfica en la Figura 10.14. Estiir ks y CG para esta operacin. Solucin: En la Figura 10.15 se presentan los datos graneados en la forma de ecuacin 10.17. Se puede observar que conforme se incrementa la
568
CAPTULO 10.
ULTRAFILTRACIN
(b)
U2
lnC t
(c)
A
0.83
In J
Laminar
Turbulento
l n ( R e o U o Y)
Figura 10.12: Efecto de la presin, concentracin y velocidad de recir culacin sobre el flux. Fuente: Belfort, 1987.
Reproducida con el permiso de John Wiley and Sons. Copyright 1987. Todos los derecho reservados.
.2.
FUNDAMENTOS
569
Flujo de agua J.
Membrana Capa Lmite de Fluido

Pelcula deGel
gura 10.13: Gradiente de concentracin durante la polarizacin con 1. Fuente: Tutunjian, 1985a.
producida con el permiso de Nature Publishing Co. Copyright 1985. Todos los derechos er vados.
Tabla 10.2: Datos de UF para Ejemplo 10.2.
APTM Kg/cm
0.00 0.33 0.66 1.00 1.33 1.66 2.00
Concentracin % peso 1 10 20 5 00.00 00.00 00.00 0.00 18.00 17.50 17.00 7.00 33.00 30.00 21.80 7.33 47.00 36.00 22.20 7.66 50.00 36.50 22.60 8.00 52.00 37.00 23.00 8.33 54.00 37.50 23.40 8.66
570
CAPTULO 10.
ULTRAFILTRACI;
1%PROTEINA
5% PROTEINA
10%PROTEINA
A PTM
(Kg/cm2)
Figura 10.14: Variacin del flux con el gradiente de presin transmer brana y con la concentracin. Datos Ejemplo 10.2. Fuente: Tutunjia 1985b.
Reproducida con el permiso de Elsevier Science Inc. Copyright 1985. Todos los derechos res vados.
2.
FUNDAMENTOS
571
10
o
O
Figura 10.15: Flux vs \nCB. Datos Ejemplo 10.2. entracin C# y la APTM, se llega a una regin donde la variacin ux se comporta de acuerdo al modelo de pelcula de gel, en la cual x J vara slo con CB y es independiente de APTM. ) Clculo de CG>'G puede ser obtenido grficamente de la interseccin de las curvas Figura 10.15 con el eje de las abscisas de tal manera que,
CG = 30 %
Clculo de ks.es igual a la pendiente de las curvas en la zona de formacin del puede ser estimada con dos puntos sobre la recta. , o j )
L
_
ft
<;
28-8 3-2 m2-h
CAPTULO 10.
ULTRAFILTRACIN
60 50
Flux i m'-h
40 30 20 10 O
1 2 3
Tiempo (h)
Figura 10.J6: Variacin del flux con el tiempo. Fuente: Brocklebank, 1990.
La expresin del flux en la regin II es por lo tanto:

30
= 201n
Se puede resumir en base a la discusin de los dos modelos anteriores, que en la ultrafiltracin el flux J se puede controlar por medio de la. APTM y la velocidad de flujo cruzado. El flux aumenta linealmente con APTM en su fase inicial, posteriormente empieza a disminuir la rapidez de aumento, y finalmente cuando ocurre la polarizacin J se hace independiente de APTM y permanece constante . El flux puede mejorarse incrementado la velocidad del flujo cruzado, lo cual implica un incremento en el esfuerzo cortante sobre la superficie do la membrana. El anlisis anterior tambin permite describir el comportamiento tpico de los procesos de UF intermitentes (Figura 10.16).
EQUIPOS ustacin de la Membrana
573
de los problemas que se observa durante la operacin de un sisL de UF es la reduccin progresiva en el flux manejable conforme snta el tiempo de uso de las membranas. Este fenmeno llamado rustacin de la Membrana" debe distinguirse del fenmeno de posicin de la membrana. 11 fenmeno de incrustacin se refiere a la interaccin de algunos so; con la membrana que afectan la porosidad de la misma. Existen Amiento fsicos (retrolavado) y qumicos para desincrustar memas, sin embargo estos incrementan los costos de operacin y dislyen la vida til de los equipos.
Equipos
equipos utilizados en los procesos de membrana generalmente on con flujo cruzado o tangencial y presentan dos caractersticas ntivas: Utilizan una membrana apropiada para el tipo de proceso. Presentan diferentes geometras en arreglos tipo modular. ]\ equipo modular conjuntamente con el equipo perifrico constila unidad de ultrafiltracin. Parte importante del equipo perifrico bomba de alimentacin y el tanque de almacenamiento. Un arreglo o de un sistema de UF se muestra en la Figura 10.17.
3.1
Membranas
arte central de los procesos de membrana es la membrana misma. general la membrana debe reunir algunas caractersticas impor-
na alta permeabilidad hidrulica, es decir, permitir altos flujos de permeado bajo gradientes de presin razonables.
574
CAPTULO 10.
ULTRAFILTRAClfi
Retenido Recirculacin OO
Permeado AJ mentacin =*
Figura 10.17: Sistema de UF tpico (intermitente). Fuente: Belter e al, 1988.

R educida <.<>ii <:l permiso de John Wiley and Sons. Copyright 1988. Todos los derech< reservados.
Un peso molecular de corte preciso, es decir, retener especies d determinado peso molecular, pero permitir el paso de las de menc peso molecular. _ Buena resistencia mecnica, qumica y trmica. - Baja tendencia a incrustamiento. - Facilidad de limpieza. - Capacidad de esterilizacin. - Larga vida activa. Los materiales que se utilizan en la fabricacin de membranas g neralmcrite son derivados de polmeros naturales como la celulosa o < polmeros sintticos. Recientemente se han desarrollado membranas < materiales cermicos y metlicos. El la Tabla 10.3 se presenta una lista de algunos materiales y cara tersticas <!< las membranas.
10.3.2
Mdulos
Los mdulos utilizados en los equipos de separacin con membrana p sentan diferentes geometras que se pueden dividir en dos tipos bsio
1.3. EQUIPOS
Tabla 10.3: Caractersticas tpicas de las membranas.
MF
Rateriales: Acetato de celulosa Poli amida Polisulfona Politetrafluro Etileno Polipropileno Cermica Poliester Sstructura: $ de Porosidad uperficial: Tamao de poro:
575
UF
X X X
o
X X X
D X
X X X X X X X
Asimtrica Simtrica 30-70 0.1 - 1 nm
3-10 2-12 1-14 1-14 1-14 1-13
75 . 130 140 130 140 150
X
Asimtrica Asimtrica
-
Simtrica
1-10 1-20 nm
10-20 0.3 - 3 nm
Adaptada de: Brocklebank, 1990. Droducida con el permiso de Marcel Dekker Inc. Copyriglit 1990. Todos los derechos reserlos.
Mdulos de tubos y carcaza. Mdulos de hojas. Los mdulos de tubos y carcaza pueden presentar dos tipos de tubos: Tubos de fibras huecas. Tubos normales. Los arreglos de hojas pueden ser de: Hoja plana. Hoja enrollada en espiral. Hoja plegada.
576
CAPTULO 10.
ULTRAFILTRACIN
. . A
y Membrana Macrosolutos Retenidos
* Malla Separadora
Solvente y Microsolutos
Figura 10.18: Mdulo de UF de hoja plana. Fuente: Tutunjian, 1985b.

Mdulos de Hoja Plana Los filtros de hoja plana (Figura 10.18), son muy similares a los filtros convencionales de marcos y placas. Su principal ventaja es su versatilidad. Este tipo de mdulos pueden trabajar a presiones mayores que los otros tipos, por lo que son empleados para manejar soluciones viscosas. Los mdulos de hoja plana pueden ser utilizados tanto en MF como en UF. Los filtros de hoja plana pueden ser desmontados para su limpieza y permiten restituir hojas defectuosas. Una desventaja es que su rea por unidad de volumen es menor en relacin a los otros tipos de mdulos y producen un flux moderado. Mdulos de Hoja Enrollada en Espiral Los mdulos de hojas enrolladas en espiral (Figura 10.19) utilizan un diseo de membranas con espaciadores tipo malla separando la membrana. Este tipo de arreglos producen un flux mayor que los de hoja plana debido a que presentan una mayor rea por unidad de volumen. Son ms difciles de limpiar y frecuentemente debe descartarse toda la unidad an cuando slo parte del mdulo est daado. Como consecuencia este tipo de mdulo se recomienda para caldos relativamente limpios o en combinacin con un prefiltro.
10.3. EQUIPOS
* *. Macrosolutos Retenidos
577
Membrana Solvente y Microsolutos Malla Separadora
Cubierta Externa
Espaciadores
Flujo de permeado Flechas que indican el flujo de permeado
Figura 10.19: Mdulo de UF de hoja enrollada en espiral. Fuente: Hanisch, 1986.

Reproducida con el permiso de Marcel Dekker Inc. Copyright 1986. Todos los deredios reservados.
578
CAPTULO 10. Flujo de Permeado Alimentacin
ULTRAFILTRACIN
Material de Soporte Membrana
Figura 10.20: Mdulo de UF de hoja plegada. Fuente: Dziezak, 1990.

Reproducida con el permiso del Institua of Food Teclmologiests. Copyright 1990. Todos los derechos reservados.
Mdulos de Hoja Plegada Los mdulos con membranas en forma de hoja plegada (Figura 10.20) permiten un arreglo tubular con rea ampliada, y presentan propiedades similares a los de hoja enrollada en espiral. Mdulos de Tubos y Carcaza Este tipo de mdulos presenta una geometra similar a los intercambiadores de calor de tubos, con varios tubos unidos en sus extremos a un cabezal comn (Figura 10.21). Normalmente la alimentacin fluye a presin a travs del cabezal de entrada por el interior de los tubos , de tal manera que el permeado se colecta en la parte externa de los tubos a travs de la carcaza y el retenido sale por el extremo opuesto de los tubos a travs del cabezal de salida. El dimetro de los tubos vara entre 0.6 y 2.5 cm. Los tubos son fabricados utilizando polmeros o cermica, lo que les confiere una alta resistencia mecnica y trmica. Han sido recomendados para procesar materiales viscosos y para la obtencin de concentraciones celulares elevadas.
10.4. DISEO DE PROCESOS DE UF
579
Alimentacin
Salida de Retenido
Salida de Permeado
Figura 10.21: Mdulo de UF de tubo y carcaza.
Mdulos de Tubos de Fibra Hueca

Los mdulos de tubos de fibra hueca (Figura 10.22) son muy parecidos a los de tubos y carcaza convencionales, sin embargo los dimetros de los tubos son muy pequeos: de 0.02 a 0.11 cm. Entre ms pequeo sea el dimetro interno, menor es su capacidad de manejo de slidos. Las fibras grandes (0.11 cm de dimetro) son especialmente tiles para separar clulas as como para el manejo de materiales viscosos. Este tipo de mdulos es probablemente el ms empleado tanto en MF como en UF, sin embargo presentan algunas limitaciones en cuanto a su rango de operacin (presin y temperatura), as como en su facilidad a la esterilizacin. En la Tabla 10.4 se presenta un resumen de las principales caractersticas de los mdulos empleados en las operaciones de membrana.
10.4
Diseo de Procesos de UF
Para el diseo de un proceso de UF se deben considerar cuatro aspectos principales: El objetivo de la UF. La mecnica de fluidos del sistema. El mtodo de operacin apropiado. El diseo de la unidad de UF.
580
CAPTULO 10.
ULTRAFILTRACIK
Alimentacin
Cilindro
Cabezal
Permeado m
Figura 10.22: a) Mdulo de UF de fibra hueca, b) Fibra individu; Fuente: Dziezak, 1990.
Reproducida con el permiso del Institute of Food Technologiests. Copyright 1990. Todos 1 derechos reservados.
10A. DISEO DE PROCESOS DE UF Tabla 10.4: Caractersticas de los mdulos de UF.

Hoja plana Moderada 200-400 Moderada Regular Hojas o mdulo Tipo de mdulo Hoja Tubo y carcaza enrollada Moderada Baja 150-300 300-900 Baja Regular Mdulo Buena Buena Tubos Fibra hueca Alta 9000-30,000 Baja Retrolavado Mdulo
581
Caracterstica Densidad de empaque rea (m^/m 3 ) Tolerancia a solidos suspendidos Facilidad de limpieza Remplazo
Adaptada de: Fane y Radovich, 1990. Reproducida con el permiso de Marcel Dekker Inc. Copyright 1990. Todos los derechos reservados.
10.4.1
Objetivo de la UF
Un sistema de UF puede ser empleado con distintos propsitos entre los cuales se pueden mencionar los siguientes: - Concentracin de una solucin diluida. - Diafiltracin de una solucin con solutos indeseables pequeos. - Purificacin de una solucin que contiene solutos indeseables grandes.
Concentracin
En la UF donde el objetivo es la concentracin de una solucin, la solucin retenida es el producto deseado (Figura 10.23).
Diafiltracin
Cuando se desea separar macromolculas de molculas pequeas como sales, azucares o alcoholes por medio de la UF de una solucin, el permeado que sale del sistema es reemplazado con agua desionizada o bufer. Esta operacin es conocida como diafiltracin (Figura 10.24).
582
CAPTULO 10.
ULTRAFILTRACf
1
UF
r_r
Figura 10.23: Concentracn por UF. Fuente: Tutunjian, 1985b.

Reproducida con el permiso de Elsevier Science Inc. Copyright 1985. Todos los derechos res< vados.
Figura 10.24: Diafiltracin por UF. Adaptada de: Tutunjian, 19851

Reproducida con el permiso de Elsevier Science Inc. Copyright 1985. Todos los derechos re; vados.
583
Figura 10.25: Purificacin por UF. Fuente: Tutunjian, 1985b.

Purificacin
La UF donde el objetivo es recuperar el permeado que contiene un solvente de inters o una solucin con solutos de bajo peso molecular se conoce como purificacin (Figura 10.25). Algunos procesos combinan las operaciones descritas anteriormente, como es el caso de la operacin de concentracin con diafiltracin.
10.4.2
Mecnica de Fluidos
En un sistema de UF el flux es funcin de APTM y de la velocidad del flujo cruzado. Tericamente el flux puede incrementarse tanto como sean incrementados estos parmetros. Sin embargo, existen limitantes en cuanto a la operacin de los equipos. La mayora de los equipos de UF deben operar abajo de 7 Kg/cm2 de presin, mientras que los equipos de fibras huecas slo toleran presiones de hasta 2.7 Kg/cm2. De acuerdo a la ecuacin (10.1),
APTM = i +
-Pt
Si se supone que la presin de salida del permeado es O, entonces la ecuacin anterior puede rearreglarse de la siguiente forma:
584
U'
CAPTULO 10.
ULTRAFILTRACI*
AP APTAf = />-
(io.i 8 ;
donde: AP = Pt - P0 La ecuacin (10.18) permite optimizar la relacin de APTM coi AP, cuando la P, se fija como la presin mxima de operacin de equipo. Bajo esta condicin, al aumentar APTM, AP disminuye y p0 lo tanto la velocidad del flujo cruzado del fluido. Por el contrario, a disminuir APTM, AP aumenta y por lo tanto aumenta U la velocida< del flujo cruzado. El flux ser ptimo para una cierta combinacin d< AP y APTM ; visto de otra manera, para una combinacin de P,- y P0 Esto ocurre generalmente donde se inicia la formacin de la pelcula d< gel. Ejemplo 10.3.-Mecnica de fluidos en UF. Se desea optimizar el flux de un sistema de UF a partir de los dato de la Figura 10.26. La presin de entrada al sistema es fija e igual 1.7 Kg/cm2. El flujo cruzado se correlaciona con la cada presin d acuerdo a la siguiente expresin; -_
Q = 29.41 AP
. ,**
donde AP tiene unidade^de~J^/êm'^y Q de l/min (rea fija). Se pide: a) Encontrar la regin de operacin factible. b) La combinacin APTM y AP que permita el mximo flux.
Solucin:
a) Regin de operacin factible. Al fijar la presin de entrada Pt a un valor mximo de 1.7 Kg/cm tanto la AP como la APTM se restringen a un rango posible de valore: en funcin de la presin de salida P0 la cual puede ser regulada median! la vlvula de salida. En la Tabla 10.5 se presentan algunos valores de este rango. L figura 10.27 muestra la regin de operacin factible en base a este datos. b) Flux mximo.
585
4j
AP =1.70Kg/cm2 AP = 1.37 Kg/cm2 AP = 1.02 Kg/cm2 AP=0.68Kg/cm 2
JA l/min
3 2
AP =0.34Kg/cm 2
1-1
APTM (Kg/cm2)
Figura 10.26: Variacin del flux con APTM. Presin de entrada fija y la velocidad de recirculacin variable. Datos Ejemplo 10.3. Adaptada de: Tutunjian, 1985b.
4j
AP = 170 Kg/cm2 AP = 1.37 Kg/cm2 AP = 1.02 Kg/cm2 AP = 0.68 Kg/cm2
JA l/rnn
2
1-1
A P = 0.34 Kg/cm2
APTM (Kg/cm2)
Figura 10.27: Regin de operacin factible. Ejemplo 10.3. Adaptada de: Tutunjian, 1985b.
Reproducida con el permiso de Elsevier Science Inc . Copyright 1985. Todos los derechos reservados.
586
CAPTULO 10.
ULTRAFILTRACIN
Tabla 10.5: Clculo de la regin de operacin factible. Datos del Ejemplo 10.3. Kg/cm2
Pi
1.70 1.70 1.70 1.70 1.70 1.70
Po
0.00 0.34 0.68 1.02 1.36 1.70
1/min AP APTM Q JA 50 2.30 1.70 0.85 40 2.80 1.37 1.02 1.02 30 2.901.19 20 2.40 0.68 1.36 0.34 10 1.70 1.53 0.00 00 0.00 1.70
En la Figura 10.27 se puede observar que para cada combinacin de P con P0 o AP con APTM, existe un flux factible alcanzndose un mximo cuando:
AP = 1.02 Kg/cm2 APTM = 1.19 Kg/m2 JA = 2.9 l/min
En un sistema de UF tanto la regin factible de operacin como la combinacin P, y P0 que optimiza el flux, son funciones de la concentracin de la solucin de alimentacin.
10.4.3
Mtodos de Operacin
Los sistemas de UF pueden ser diseados para operar en forma intermitente o en forma continua. Operacin Intermitente Las operaciones intermitentes se pueden efectuar con y sin recirculacin interna. En una operacin intermitente sin recirculacin (Figura 10.28), la solucin que inicialmente est contenida en un tanque de proceso, es bombeada a la unidad de UF y regresada al tanque hasta alcanzar la concentracin final deseada. De esta manera la concentracin del
J0.4. DISEO DE PROCESOS DE UF
587
UF
Tanque de' Proceso
Permeado Bomba
Figura 10.28: UF intermitente sin recirculacin. Fuente: Tutunjian, 1985b.

producto en el tanque aumenta gradualmente durante el proceso, a la vez que el flux decrece proporcionalmente a sta. La operacin intermitente con recirculacin interna (Figura 10.29) emplea dos bombas. Una de recirculacin para proveer la velocidad de flujo cruzado ptima y la bomba de alimentacin. La velocidad de alimentacin debe mantenerse alta, de tal manera que la concentracn en el circuito de recirculacin sea cercana a la concentracin del tanque alimentador. Esto generalmente se logra manteniendo una relacin de 20 veces la velocidad de alimentacin a la de permeacin. Cuando al tanque de proceso se le alimenta solvente para lavar la solucin la operacin intermitente respectiva, se convierte en una operacin intermitente de diafiltracin. La desventaja principal de los sistemas intermitente es que generalmente requieren ms tiempo de residencia (lo cual puede afectar al producto) y tanques de proceso ms grandes. Operacin Continua La diferencia entre una operacin intermitente y una continua es que en esta ltima, el retenido es retirado continuamente del sistema a la concentracin final deseada. En estado estacionario el flux es cons-
588
CAPTULO 10.
ULTRAFILTRACIN
Agua de Diafiltracion
Permeado Bomba de Alimentacio'n Bomba de Recirculacion
Figura 10.29: UF intermitente con recirculacin. Fuente: Gravatt y Molnar, 1986.

Reproducida con el permiso de Marcel Dekker Inc. Copyright 1986. Todos los derechos reser vados.
589
0 1 0
UF
Retenido
Alimentacin
a-*
Bomba Etapa 1
Bomba de Permeado Recirculacin
0^1
Etapa 2
Etapa 3 Retenido
Bomba
Permeado
Permeado
Permeado
Figura 10.30: UF continua de una y varias etapas. Adaptada de: Tutunjian, 1985b.
tante y mnimo. Para contrarrestar esta limitacin de la operacin continua generalmente los sistemas utilizados son de etapas mltiples (Figura 10.30).
10.4.4
Diseo de la Unidad de UF
El problema del diseo de la unidad de UF consiste en determinar el rea de UF necesaria para procesar una cantidad de una solucin de concentracin conocida en un tiempo dado, hasta una concentracin final determinada. Generalmente para situaciones de inters prctico, la prediccin de coeficientes de transferencia de masa y del flux es limitada, por lo que el diseo requiere de datos experimentales especficos del sistema.
590
En el caso de los sistemas de diafiltracin otro parmetro importante es la cantidad de solvente de lavado que es necesario agregar. A continuacin se presentan las ecuaciones de diseo de algunos arreglos tpicos de los sistemas de UF. Concentracin Intermitente En un sistema de concentracin intermitente el volumen inicial de solucin V0 con una concentracin inicial CBO, se procesa hasta alcanzar un volumen final Vj con una concentracin final CBJ, obtenindose un volumen de permeado Vp. Un balance de soluto en el sistema, considerando la concentracin de soluto en el permeado Cp constante, se puede expresar como:
(10.19)
La ecuacin anterior integrada entre los lmites
y v y vQ
r* \-j B
/~i ^*Bo
V =V
conduce a:
CB
V = V0 exp
'CB
dC B
(10.20)
La ecuacin (10.19) combinada con la expresin del flux dada por:
donde A es el rea de UF, puede ser integrada entre O y , y expresada con ayuda de la ecuacin (10.20) de la siguiente forma:
CBJ exp - Jc CB c s r - dC B _ Bo B-cPJ
'--1%
J(CB-CP)
591
Cuando el rechazo es total Cp^Ô, entonces la equacin (10.22) simplifica a: (10.23) La ecuacin (10.23) puede ser utilizada para calcular el rea necesaria para realizar una concentracin de CBO a CBJ en un tiempo / o para calcular dicho tiempo dada el rea de UF disponible. Este clculo requiere la evaluacin de la parte derecha de la ecuacin (10.23), lo cual puede realizarse calculando el rea bajo la curva de los datos experimentales graneados como:
VS ~J J
1
Para realizar estudios de escalamiento tambin puede utilizarse la | expresin experimental de la variacin delfluxcon CB obtenida en equipos de laboratorio, conjuntamente con la ecuacin 10.23. Ejemplo 10.4.- UF intermitente. Se desea concentrar de 2 a 10 % en peso 10 m3/dia de una solucin de un polisacrido. Como el tiempo muerto (descarga, limpieza, etc.) de la unidad es de 4 h, el tiempo de operacin es de 20 h. Se realizan pruebas de laboratorio utilizando una unidad tubular de 0.012 x 1.2 ra, por considerarse ms conveniente este tipo de arreglo para el flux proyectado, y por las ventajas que ofrece para su limpieza por retrelavado. Los datos de laboratorio muestran que para una AP =1.5 Kg/cm2 el gasto volumtrico en la recirculacin es de 8 l/min y el flux en //m 2 h est dado por la expresin:
= 81n
'B
a) Calcular el rea de UF necesaria. b) Calcular el nmero de tubos necesarios (diseo modular). c) El flux promedio.
592
0.40 0.35 0.30 1/J 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 0.10 0.20
CAPTULO 10.
ULTRAFILTRAC)
0.30
I/Ce
0.40
Figura 10.31: Curva de 1/J vs l/CB. Datos de Ejemplo 10.4 Solucin: a) Clculo de rea: Con los datos y la ecuacin (10.23) se obtiene la expresin:
.1/2
A = 1000
> i l n15 n /I > ^ \\C B
En la Figura 10.31 se muestra la curva que se obtiene al gr 1/J vs \CB- La integral de la expresin anterior es igual al re< esa curva, de tal manera que:
A = 1000 x 0.04 m 2 A = 40 m2

b) Clculo del nmero de tubos N: rea total rea por tubo 40 m2 = TT x 0.012 m x 1.2 m = 884 tubos
=
593
N
N
c) Clculo del flux promedio: Mediante un balance de soluto se obtiene primero el volumen final de la solucin: V0C0 = VjCf de tal manera que, 10,000x2/
lo vf = 2000 /
con estos datos se puede calcular el flux promedio: (10,000-2000) I 40m2x20/i
1U
V =
prom
Jprom
m*
Concentracin Continua
Los sistemas de UF continuos se utilizan para procesar volmenes considerables o cuando se tiene una alimentacin continua. Debido a que un sistema continuo opera todo el tiempo a la concentracin de salida deseada, si el sistema consta de una sola etapa, el rea de UF necesaria es mucho mayor que si se opera en varias etapas en cascada. Debido a esto los sistemas de multietapas continuas son los ms utilizados.
594
CAPTULO 10.
ULTRAFILTRACIN
F r
ir
C0
Av . i ir
/i\
fc
1r
"
e.
r)
* *
f. ^ t, V
r r
,\
i
r
_ .n
c,
\r
C2
Figura 10.32: UF continua de etapas mltiples. Si un sistema de UF presenta varias etapas de igual rea, conforme la concentracin de soluto aumenta en cada etapa el flux de permeado disminuye. Entre ms etapas presenta la cascada mayor es el flux promedio de sta. Sin embargo, este efecto disminuye conforme aumenta el nmero de etapas, tendiendo a alcanzar el flux promedio de un sistema intermitente. Generalmente es ms econmico utilizar de tres a cinco etapas (Tutunjian, 1985b). Algunos cascadas de UF operan con reas diferentes en arreglos tipo pirmide, donde el rea por etapa disminuye conforme la concentracin de soluto aumenta, es decir el volumen de solucin disminuye. En el sistema de UF continua que se muestra en la Figura 10.32, cada etapa est constituida por una o varias unidades de UF en serie o paralelo. El problema de diseo consiste en determinar el rea de UF de cada etapa, para un flujo de entrada F0, con una concentracin de la solucin de entrada C0 y una concentracin de salida deseada Cn. Si se supone un coeficiente de rechazo a = 1 para todas las etapas, el rea de cada etapa puede calcularse utilizando balances de masa solamente. El flujo Fn puede calcularse efectuando un balance de masa de soluto en toda la cascada, de tal manera que, Fn = ^ (10.24)
El flux en la etapa n est dado por una expresin de la forma:
595
(10.25)
n
El flujo de permeado Pn en la etapa n se puede calcular para un rea A de diseo con,

Pn = AJn (10.26)
Efectuando un balance global en la etapa n se puede calcular el flujo de la etapa previa, Fn_1 = JPn + Fn (10.27)
Por medio de un balance de soluto en la etapa n se calcula la conI centracin de soluto en la etapa previa, (10.28) Con el sistema de ecuaciones (10.24)-(10.28), en forma iterativa descendente se calcula el nmero de etapas necesarias hasta alcanzar el valor de la concentracin de soluto de la solucin de entrada, cuando se conoce el rea de cada etapa; o bien el rea necesaria para un nmero de etapas prefijado. Ejemplo 10.5.- Comparacin de UF intermitente y continua. Se desea procesar 5000 l/h de una solucin proteica para concentrarla de 2 a 20% en peso. Las pruebas experimentales muestran que el flux puede estimarse con la expresin
Calcular: a) El rea necesaria para un procesamiento intermitente y el flux promedio. b) El rea necesaria para un procesamiento continuo de 5 etapas y el flux promedio.
596
CAPTULO 10.
ULTRAFILTRACIN
c) La variacin del rea total de la UF con el nmero de etapas. Solucin: a) rea UF intermitente. Utilizando la ecuacin (10.23) se puede llegar a la siguiente expresin:
*1/2
Aintermitente 10,000 X
A>ntermitente
întermitente
10,000 x 0.0134 m
134 772.
El flux promedio est dado por:

c nnn DU Jprom
~ 5000x2 1
n 134 m2
20
'==-
OO.O
m2 h
b) En la Tabla 10.6 se presentan los clculos utilizando las ecuaciones (10.24)-(10.28), donde la relacin rea/etapa = 32.875 m2 satisface la condicin de diseo. El rea total es : = (5)(32.875) m2 = 164.375 m2
Acont
El flux promedio es:

r
_ 4500 l/h _ "" ~ 164.375 m 2

n
I m -h
2
c) Utilizando el procedimiento del inciso b) se realizan los clculo para obtejier la Tabla 10.7. La Figura 10.33 muestra estos resultados en forma grfica.
flO.4- DISEO DE PROCESOS DE UF
597
Tabla 10.6: rea para procesamiento continuo en 5 etapas. Datos del Ejemplo 10.5
Fn
n 5 4 3 2 1 0
(1/h) 500.00 766.59 1314.17 2216.14 3461.69 5000.00
Cn (% en peso) 20.00 13.04 7.61 4.51 2.89 2.00
(//m 2 - h) 8.11 16.66 27.44 37.89 46.81

Total
Jn
(l/h)
Pn
266.59 547.57 901.97 1245.55 1538.79 4,500.00
Tabla 10.7: Clculos para diferentes nmero de etapas. Datos ejemplo 10.5 Nmero de rea por etapas totales etapa (ra 2 ) 1 555.00 2 119.22 3 63.98 5 32.88 10 14.77 rea total (m 2 ) 555.00 238.44 191.94 164.37 147.74 Flux promedio (//m 2 - h) 8.11 18.87 23.44 27.38 30.45
598
CAPTULO 10.
ULTRAFILTRACIN
6 N (Etapas)
10
Figura 10.33: Variacin del rea de UF con el nmero de etapas. Datos del Ejemplo 10.5.
10A. DISEO DE PROCESOS DE UF Diafiltracin Intermitente: Volumen Constante
599
En la diafiltracin intermitente a volumen constante (Figura 10.24) se alimenta continuamente solvente de lavado al tanque de alimentacin y se mantiene el volumen del retenido constante, de tal manera que el flujo de alimentacin es igual al flujo de permeado. Considerando que el soluto de inters es totalmente rechazado por la membrana y la impureza totalmente permeable, el balance en el sistema del soluto que se desea eliminar, est dado por:
al
= -PC
(10.29)
donde: VR: Volumen retenido en el tanque. [L3]. Ci\ Concentracin de impureza en el tanque. [M/L3]. P: Flujo de permeado. [L3/t]. dado que VR es constante el flujo de permeado puede igualarse al flujo de solvente, obtenindose la siguiente expresin: (10.30) donde VD es el volumen de solvente de diafiltracin. La ecuacin 10.30 puede integrarse con los lmites,
C = C0
C, = Ci
VD O
VD = VD
obtenindose la siguiente expresin: (10.31)
La ecuacin* anterior puede ser rearreglada expresando el flux de permeado como:
600
CAPTULO 10.
ULTRAFILTRACIN
= -T7
(10.32)
y combinando las ecuaciones (10.31) y (10.32) para obtener: -JAt\ C/ = C/0exp -TT (10.33) V VR ) dado que el flux de permeado tambin puede expresarse de la siguiente forma: J = ks\n-~ al combinar las ecuaciones (10.33) y (10.34) se obtiene: Ci = C /0 exp -*
VR
(10.34)
(10.35)
V J La ecuacin (10.35) puede ser utilizada para calcular el rea de diafiltracin necesaria para lograr un determinado grado de eliminacin de impurezas.
Ejemplo 10.6.- Diafiltracin intermitente a volumen constante. Se desea purificar por diafiltracin intermitente a volumen constante 5000 / de una solucin que contiene 15% en peso de protenas y 3% de sal (O'Sullivan et a/, 1984). El flux del sistema est dado por:
CB
[? - h
a) Calcular el efecto sobre la pureza de la solucin de la razn del volumen de diafiltracin a volumen de retenido o ndice de lavado. b) Calcular el rea de diafiltracin necesaria para lograr una pureza del 99% en un tiempo de 10 h. I c) El volumen de solvente de diafiltracin para el inciso b). Solucin:
601
Tabla 10.8: Efecto del volumen de diafiltracin sobre la concentracin de impurezas. Datos del Ejemplo 10.6
VD/VR 0 1 2 3
4
c,
3.00 1.10 0.41 0.15 0.05
CB C + CB
15 15 15 15 15
Pureza
18.00 16.10 15.41 15.15 15.05
= c7+fe 0.833 0.932 0.973 0.990 0.996
a) Utilizando la ecuacin (10.31) se pueden obtener los resultados que se presentan en la Tabla 10.8. b) Utilizando la ecuacin (10.35) y los datos se tiene:
0.05 = exp
de donde se obtiene:
5000 /
A = 108 m2
c) La ecuacin (10.32) puede ser usada para calcular V>, de tal manera que:
VD
VD VD
= JAt
= (201n^)(108m 2 )(10/i) 15 = 15,000 /
QH
Diafiltracin Intermitente Repetida Una forma alternativa de diafiltracin intermitente consiste en adicionar un volumen de lquido de lavado al tanque de proceso que contiene un volumen VR de solucin, y lavar hasta alcanzar nuevamente el volumen VR. Esta operacin se repite hasta alcanzar la pureza deseada.
602
CAPTULO 10. ULTRA FILTRACIN El balance de masa para esta operacin puede ser expresado cornol C ^ 7T= , , VDT C ' l +
rf%
(10.36) }
donde: Cin\ Concentracin de impurezas despus de n lavados. (7/0: Concentracin inicial de impurezas. VDT'- Volumen total de lquido de lavado empleado. n: nmero de lavados. VR: Volumen de retenido. Diafiltracin Continua en Cascada En la diafiltracin continua en cascada el lquido de lavado se adiciona continuamente en cada etapa (Figura 10.34). Este tipo de arreglo es til para procesar volmenes considerables o cuando por inestabilidad del producto se requieren tiempos de operacin cortos. Cuando la concentracin de la especie retenida es constante, existe un flux constante en cada etapa (flujo de lquido de lavado igual al flujo de permeado). Adems, si la membrana no retiene la impureza, la concentracin de sta a la salida de cada etapa y en el permeado es la misma, de tal manera que el balance de masa para la primera etapa puede ser expresado (con Q = P) como: (10.37) La concentracin de soluto a la salida de la etapa n puede ser expresada como:
donde: Cn: Concentracin de impureza en la etapa n.
603
FCk,
F Cu
\\-
FC'n
Figura 10.34: Diafiltracin continua en cascada. Q: Flujo de lquido de lavado. F: Flujo de alimentacin (retenido). P: Flujo de permeado. La ecuacin (10.38) tambin puede expresarse como:
^
Co
(10.39)
donde VD es el volumen de lavado alimentado a una etapa y VR el volumen de retenido alimentado al sistema en un tiempo dado. Como el flux de permeado en cada etapa est dado por:
J
VD J~ ~Tt
la ecuacin (10.39) se puede rearreglar de la siguiente forma:
At =
(10.40)
604
CAPTULO 10.
ULTRAFILTRACli
donde A es el rea de UF por etapa. El producto At es mnimo cuando el lado derecho de la ecuaci (10.40) es mnimo. De acuerdo a la ecuacin (10.39) al aumentar el ndice de lavad VD/VR se incrementa la purificacin. De acuerdo a la ecuacin (10.4( el rea necesaria para efectuar una determinada purificacin disminu^ al incrementar el nmero de etapas, o bien el incremento del nmei de etapas reduce la cantidad de lquido de lavado y el rea necesar por etapa. Ejemplo 10.7.- Comparacin entre la diafiltracin interm tente y la continua. Se desea efectuar un anlisis comparativo entre la diafiltracin i termitente y la continua para determinar que operacin requiere men volumen de lavado (menor rea) para alcanzar un mismo porcentaje ( eliminacin de impurezas.
Solucin:
Se pueden utilizar las ecuaciones (10.31) y (10.39) para efectuar es anlisis, definiendo las siguientes expresiones del grado de eliminad de impurezas: Para la operacin intermitente:
CIo-CIn
Para la operacin continua:
Co Cn Co
De acuerdo a lo anterior si VDT/VR 2 el % de eliminacin impurezas es: Operacin intermitente:

(1 - e'2) x 100 = 86.5 %
605
100
Figura 10.35: Comparacin de diafiltracin intermitente y continua. Datos Ejemplo 10.7. 1:Intermitente 2: continua 1 etapa 3: continua 2 etapas 4: continua 3 etapas. Operacin continua 1 etapa:
1-
x 100 = 66.7%
Operacin continua 2 etapas:

1x 100 = 75.0%
Operacin continua 3 etapas:

1f) 3 .
x 100 = 78.4%
En la Tabla 10.9 se presentan los clculos para otras relaciones de ls cuales se muestran en forma grfica en la Figura 10.35. Es necesario hacer notar que VDT es gl volumen total de lquido de lavado, por lo que en el caso de la operacin continua dicho volumen se reparte equitativamente entre las etapas.
606
CAPTULO 10.
ULTRAFILTRACI
Tabla 10.9: Comparacin de diafiltracin intermitente y continu Datos Ejemplo 10.7. % de eliminacin de impurezas Continua intermitente 1 2 3 0.0 0.0 0.0 0.0 86.5 66.7 75.0 78.4 98.2 80.0 88.9 92.1 99.8 85.7 93.8 96.3 100.0 88.9 96.0 98.0 100.0 90.9 97.2 98.8
VDT/VR
0 2 4 6 8 10
La operacin intermitente es la que requiere menor volumen c lavado (rea), entonces cuando sto sea el objetivo de la operacic debe seleccionarse este tipo de operacin. Diafiltracin a Contracorriente En la diafiltracin a contracorriente (Figura 10.36) es posible lograr ur mayor purificacin con menos lquido de lavado, sin embargo, esto d pende de la concentracin alcanzable de la especie no permeable (Fai y Radovich, 1990). Operaciones Combinadas: Concentracin-Diafiltracin /
Algunos caldos requieren tanto ser concentrados como lavados, en e tos casos se requiere decidir cuando efectuar la diafiltracin. Si es ise inicia con el caldo inicial, el flux se maximiza, sin embargo la cant dad de lquido de lavado tambin es la mxima bajo estas condicin (ecuaciones 10.31 o 10.39). Por otro lado, si el caldo se concentra valor deseado y posteriormente se lava, la cantidad de lquido de lavac disminuye, sin embargo el flux tambin disminuir dado que ste var inversamente a la concentracin del soluto impermeable CB (ecuacic 10.34). Estos hechos conducen a un problema de optimizacin, don<
QA. DISEO DE PROCESOS DE UF
607
Agua de Lavado 20
1
Alimentacin
100
t i
1
50
ni mi w ti
1
50
7 J
+
Retenido Libre de Producto
10
Perneado (Producto) 110
Recuperacin de Producto 97% Dilucin del Producto 868
Figura 10.36: Diafiltracin a contracorriente. Fuente: Fane y Radovich, 1990.

la diafiltracin deber efectuarse en un punto intermedio entre la concentracin inicial y final de retenido.
Ejemplo 10.8.- Operaciones combinadas de UF.

Se desea concentrar 10 veces 1000 / de un caldo que contiene 2% en peso de protena y 5% en peso de sales, de tal manera que se obtenga una concentracin final de 20% en peso de protena. Se desea tambin reducir la concentracin de sales al 0.05%. El flux para el sistema est dado por la relacin experimental.
[l/h]
Encontrar el tiempo de diafiltracin ptimo. Solucin: Emplendola ecuacin (10.31) se puede calcular la relacin del volumen de lquido de diafiltracin a volumen del caldo.
608
VR
VR
= In =
Ci
0.05
VD
. 5 In
Esta relacin debe ser utilizada independientemente del volumen de caldo VR. Por otro lado, VR depende del grado de concentracin previa a la diafiltracin. Utilizando la expresin de flux se puede calcular el tiempo de diafiltracin de acuerdo a la siguiente expresin:
JA
o bien,
t =
500 l n ^
La ecuacin anterior puede expresarse en trminos de "X" o veces que se concentra la solucin original de 1000 / y 2% de protena.
t =
4.6-
En la Tabla 10.10 se muestra el efecto del factor de concentracin sobre los diferentes parmetros, y la Figura 10.37 muestra la variacin del tiempo de filtracin en el factor de concentracin, observndose un mnimo en X = 5 con t = 1.85 h. / Los resultados anteriores conducen a proponer el siguiente esquema de Concentracin - Diafiltracin: 1. Concentrar 5 veces hasta 10% de protena y 5% de sales. 2. Diafiltrar hasta 0.05% de sales. 3. Concentrar 2 veces hasta 20% de protena. Se supone que el tiempo total de concentracin no se afecta por el esquema de diafiltracin que se adopte.
DISEO DE PROCESOS DE UF
609
Figura 10.37: Operacin de UF combinada. Datos del Ejemplo 10.8.
Tabla 10.10: Operaciones combinadas. Datos del Ejemplo 10.8.
% ) JA (l/h) t(h) VR(') M/) CB ( 1 1000.00 4600.00 2.00 1301.34 3.53 2.41 2 500.00 2300.00 954.77 4.00 2.04 752.04 3 333.33 1533.33 6.00 4 250.00 1150.00 1.89 608.20 8.00 496.63 1.85 5 200.00 920.00 10.00 1.89 405.47 6 166.67 766.67 12.00 2.00 328.39 7 142.86 657.14 14.00 261.62 2.20 8 125.00 575.00 16.00 2.52 202.73 9 111.11 511.11 18.00 3.07 10 100.00 460.00 150.05 20.00 4.08 11 90.91 102.40 418.18 22.00
610
CAPTULO 10.
ULTRAFILTRACII
10.5
Sumario
La ultrafiltracin se utiliza para concentrar y purificar caldos biolgico; mediante el uso de membranas especializadas para lograr la separado deseada. Los equipos de ultrafiltracin presentan caractersticas distintiva en arreglos modulares de varios tipos que operan bajo la modalidad c flujo cruzado de la alimentacin. Las operaciones pueden ser efectuado en forma intermitente o continua ya sea para concentrar, purificar diafiltrar una solucin. El diseo de los equipos de ultrafiltracin est basado en una con binacin de la teora y la experimentacin, para estimar reas de 1< equipos, las etapas necesarias o el tiempo requerido de un proceso.
J. PROBLEMAS
611
0.6
ik-
Problemas
fo.l.- En la concentracin de una solucin de factor VIII antihemoflico itilizando mdulos de fibra hueca (Mitra y Ng, 1986) se obtuvieron los siguientes datos: Cs(m<7/m/) J(ml/cm2 - s) x 105 5 15.1 10 12.0 20 11.0 30 8.5 40 7.0 50 6.5
Estimar ks y CG10.2.- Demostrar que la concentracin de un soluto impermeable a la cual el tiempo de diafiltracin es mnimo en un proceso combinado, est dada por:
C=
-sG
donde e es la base de los logaritmos naturales. 10.3.- Se desea concentrar 75,000 / de una solucin proteica del 2 al 15% en peso y reducir su contenido de sales 5 veces. El tiempo de proceso es de 12 horas y la expresin experimental del flux es:
40^ J = 12 In ~C~B
I
m
a) Calcular el rea mnima para una operacin intermitente a volumen constante. b) Calcular el rea total para una operacin continua en cascada con 3 etapas de igual rea. a) Resp. 321 m 2 b) Resp. 410 m 2
612
CAPTULO 10.
ULTRAFILTRACIN
10.4.- Al procesar en forma intermitente 2.9 / de un caldo que contiene 23.77 g/l de B. megatherium en una unidad de fibra hueca de 0.0316 m2 de rea, la solucin se concentra 5.3 veces en 14mm. a) Calcular la concentracin final del caldo. b) Calcular el flux promedio de la operacin, a) Resp. 0.547 / b) Resp. 319 //m 2 - h 10.5.- Una planta produce Cefamicina C mediante una fermentacin a un ritmo de 28 lotes de 57,00 / cada semana. El caldo que contiene slidos en suspensin se procesa en un sistema que consta de cuatro unidades de UF de 268 m2 cada una. El flujo de permeado promedio que produce cada unidad es de 76 l/min. El coeficiente de retencin de la Cefamicina C en la unidad puede considerarse igual a cero. Para obtener una recuperacin del 98 % de Cefamicina la operacin se efecta en dos pasos: i) Primero se reduce el volumen del caldo a la tercera parte. ii) Posteriormente se diafiltra a la velocidad final de permeacin del primer paso. Determinar: a) El tiempo requerido para procesar cada lote considerando un tiempo muerto de cuatro horas por dia. b) El flujo que es procesado por unidad. c) El tiempo necesario para el primer paso del proceso. d) El porcentaje de recuperacin de Cefamicina C en el primer paso. e) El volumen de diafiltracin. f).- El flujo de permeado por unidad en la di afilt racin. a) Resp. 5 h/lote b) Resp. 47.5 l/min c) Resp. 125 min d) Resp. 66% e) Resp. VD = 53,455 / f) Resp. JA = 74.24 l/min 10.6.- En una unidad tubular de UF donde se concentra a razn de 2 l/min una solucin que contiene 30 mg/l de una protena de peso molecular de 300,000 Da, el flux est dado por: J = 5 x 10~ 4 In
100 cm 3 cm s
.6. PROBLEMAS
613
La presin de entrada a la unidad es de 2 atm. El tubo presenta un fclimetro interno de 2 cm y una longitud de 50 cm. La cada de presin a lo largo del tubo est dada por:
o.ooiLcy
donde: AP: Cada de presin en atmsferas. L: Longitud del tubo en cm. Q: Flujo cruzado en cm3/s. d: Dimetro del tubo en cm Determinar: a) La presin a la salida del tubo. b) La cada de presin transmembrana. c) El flux de permeado. a) Resp. 0.264 atm b) Resp. 1.132 atm 146 //m 2 - h
c) Resp.
10.7.- Se desea comparar dos tipos de membranas para desalar y concentrar una solucin de proteasas (Ghose, 1990). Los coeficientes de retencin de las membranas son los siguientes: Membrana Soluto Proteasas PM-10 Sales Proteasa PM-30 Sales Coeficiente 0.99 0.00 0.80 0.00
El volumen a procesar es de 10 2 m3 con una concentracin de 0.1 Kg/m3 de proteasas y 4 x 102 mol/m3 de NaCO?,. Determinar para cada tipo de membrana: a) El volumen necesario de agua destilada para eliminar el 99 % de sales por diafiltracin a volumen constante.
614
CAPTULO 10.
ULTRAFILTRACIN
b) Las prdidas de proteasas durante la diafiltracin. c) La concentracin de proteasas al final de la diafiltracin. d) Las prdidas de proteasas al concentrar 10 veces la solucin diafiltrada. e) El porcentaje de prdidas totales de proteasas. Respuestas para la membrana PM-10. a) Resp. 4.6 x 1(T2 m3 b) Resp. 4.5 x 10~5 m3 c) Resp. 3 0.0955 Kg/m e) Resp. 6.69 %
10,7. BIBLIOGRAFA
615
10.7
Bibliografa
Belfort, G. 1987. Membrane separations technology: An overview. Advanced Biochemical Enginnering. Bungay, H.R. y Belfort, G. (Eds.)- John Wiley and Sons. New York. 10, 239-297. Belter, P.A., Cussler, E.L. y Hu, W. 1988. Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology. John Wiley and Sons. 9, 237-270. Brocklebank, M.P. 1990. Downstream processing plant and equipment. En: Separation Processes in Biotechnology. Asenjo, J.A. (Ed.) New York. Marcel Dekker. 19, 617-740. Dziezak, J.D. 1990. Membrane separation technology offers processors unlimited potential. Food Technology. Sep. 108-113. Fane, A.G y Radovich, J.M. 1990. Membrane Systems. En: Separation Processes in Biotechnology. Asenjo, J.A. (Ed.). New York. Marcel Dekker. 8, 209-262 Ghose, T.K. 1990. Bioprocess Computations in Biotechnology. Vol. 1. Ellis Horwood. New York. 9, 229-264. Gravatt, D.P. y Molnar, T.E. 1986. Recovery of an extracellular antibiotic by ultrafiltracin. En: Membrane Separations in Biotechnology. Me Gregor, W.C. (Ed.). Marcel Dekker. New York. 4, 89-97. Hanisch, W. 1986. Cell harvesting. En: Membrane Separations in Biotechnology. Me Gregor, W.C. (Ed.). Marcel Dekker. New York. 3, 61-88. Le M.S. y Howell, J.A. 1985 . Ultrafiltration. En: Comprehensive Biotechnology. Murray M.Y. (Ed.). Permagon Press. New York. 25, 383-409. Me Gregor, W.C. 1986. Selection and use of ultrafiltration membranes. En: Membrane Separations in Biotechnology. Me Gregor, W.C. (Ed.). Marcel Dekker. New York. 1, 1-35.
616
CAPTULO 10.
ULTRAFILTRACIN
Mitra, G. y Ng, R.K. 1986. Practice of ultrafiltration-diafiltration in the plasma frationation industry. En: Membrane Separations in Biotechnology. Me Gregor, W.C. (Ed.). Marcel Dekker. New York. 6, 115-134. O'Sullivan T.J., Epstein, A.C., Korchin S.R. y Beatn, N.C. 1984. Applications of ultrafiltration in biotechnology. Ch. Eng. Prog. Enero, 68-75. Santos, J.A.L., Mateus, M. y Cabral, J.M.S. 1991. Pressure driven membrane processes. En: Chromatographic and Membrane Processes in Biotechnology. Costa, C.A. y Cabral, J.M.S. (Eds). Kluwer Academic Publishers. Netherlands. 177-205. Tutunjian, R.S. 1985a. Scale-up considerations for membrane processes. Bio/Technology. 3, 615-626. Tutunjian, R.S. 1985b. Ultrafiltration processes in biotechnology. En: Comprehensive Biotechnology. Murray M.Y. (Ed.). Permagon Press. New York. 26, 411 - 437.
Captulo 11 Electroforesis
11.1 Introduccin
Electroforesis es el movimiento de las partculas cargadas contenidas en un medio debido a la influencia de un campo elctrico. La electroforesis constituye una de las tcnicas ms poderosas para la purificacin de molculas biolgicas. Gran parte de la teora y de los equipos de electroforesis han sido desarrollados para la separacin de protenas globulares, sin embargo pueden ser aplicados igualmente a otro tipo de protenas, as como a cidos nucleicos, clulas o partculas coloidales. En la separacin de protenas por medio de un campo elctrico, la carga y la naturaleza anfotrica de stas juega un papel fundamental. Sin embargo, existen otros factores tanto microscpicos como macroscpicos que afectan el movimiento de una partcula en un campo elctrico, que han conducido al desarrollo de diferentes formas y tcnicas para el desarrollo de las separaciones electroforticas. Estos aspectos fundamentales de la electroforesis se revisan en la seccin 11.2 de este captulo. La electroforesis no est limitada a la escala analtica. Actualmente existen varios tipos de equipo en diversos arreglos que permiten el uso de esta tcnica a escala preparativa. En la seccin 11.3 se presenta una descripcin general de este tipo de equipos.
La seccin 11.4 presenta una discusin sobre los principios bsicos
617
618
CAPTULO 11.
ELECTROFORES1S
Inicio
15 minutos
(i]
30 minutos
gQ Soluto Aninico
Soluto Catinico
Figura 11.1: Electroforesis de zona en una gel anticonvectiva. Fuente: Ivory, 1990.
del diseo de equipos de electroforesis.
11.2
Fundamentos
La forma mas sencilla de realizar una operacin de electroforesis es el mtodo de electroforesis de zona (Figura 11.1). En este mtodo se coloca una pequea banda de muestra de la solucin que contiene el soluto de inters, sobre una matriz generalmente rectangular, de celulosa, almidn, agar o poliacrilamida, la cual se encuentra inmersa en un electrolito que sirve como bufer. Dichas matrices tienen la propiedac de constituir medios porosos altamente hidratados que proporcionar resistencia mecnica, y disminuyen los efectos del calor generado por e paso de corriente al aplicar el gradiente de potencial a la celda. En la electroforesis de zona cada componente de la mezcla se muev< a diferente velocidad, separndose los componentes de la mezcla sobn la matriz. Cuando esta tcnica se utiliza con fines cualitativos, despu de un tiempo apropiado para desarrollar la electroforesis, las matrice son teidas para observar los componentes de la muestra. En la discusin de la operacin de electroforesis es importante con siderar cuatro aspectos fundamentales:
1.2. FUNDAMENTOS
619
La naturaleza de la carga de la partcula que se mueve en el campo elctrico. En esta seccin se hace uso del caso de las cargas que se presentan en las protenas globulares. El segundo aspecto lo constituye el estudio de los parmetros ms importantes para describir la velocidad de migracin de la partcula, que es el campo de estudio de la teora electrocintica. Los fenmenos de dispersin de la muestra que se observan en las operaciones electroforticas, constituyen el tercer aspecto. El cuarto aspecto se refiere a las tcnicas y diversas formas en que es posible realizar una operacin electrofortica.
L 1.2.1
Carga y Punto Isoelctrico de las Protenas
3n las protenas su carga se origina principalmente de la ionizacin de ms numerosos grupos amino y carboxilo. Los grupos amino 7V//2 sn medio ambientes cidos son protonados produciendo grupos amoaio TV.///. Los grupos carboxlicos COOH en medios ambientales bsicos son ionizados para formar grupos carboxilatos COO~. Tal como se muestra en la Figura 11.2, la carga neta de una protema depende entre otros factores del pH al que sta se encuentre. A un pH relativamente bajo existen ms grupos NH^ y COOH y la protena tiene una carga neta positiva; a un pH relativamente alto la protena tiene ms grupos NH< y COO~ y se encuentra cargada negativamente. Existe un pH particular para cada protena donde la carga neta de sta es cero, a este pH se le conoce como punto isoelctrico. La carga que adquiere una protena en determinado pH, as como el punto isoelctrico de sta, son dos propiedades que se utilizan para la correcta separacin electrofortica de protenas.
11.2.2
Teora Electrocintica
La velocidad de migracin de un soluto a travs de un lquido conductor por la accin de un campo elctrico, despreciando efectos gravitacionales y difusivos, est influenciada por algunos fenmenos fsicos mi-
620
CAPTULO 11.
ELECTROFORESIS
+ 10
8. 1
-10
4
PH
Figura 11.2: Cambio de la carga neta de un protena con el pH. croscpicos como: la carga de la partcula, la fuerza de arrastre que se opone al movimiento de la partcula, y las fuerzas de relajacin y de retardamiento que se producen en el ambiente inico que rodea al soluto. La teora electrocintica que ha sido desarrollada para el tratamiento de estos aspectos ha conducido a la elaboracin de varios modelos, los cuales varan en su grado de complejidad. Dos modelos bsicos de gran utilidad son: I - El modelo de una esfera cargada sumergida en un medio continuo. - El modelo de la doble capa. Modelo de una Esfera Cargada Sumergida en un Medio Continuo Un modelo sencillo para el tratamiento de la electroforesis consiste en considerar a la partcula de soluto, como si se tratara de una esfera sumergida en un medio continuo de solvente. Un balance de las fuerzas que actan sobre la partcula cuando sta se mueve a una velocidad constante (en equilibrio), despreciando los efectos difusivos y gravitacionales, establece que la fuerza que acta
11.2. FUNDAMENTOS
621
sobre la partcula debida al campo elctrico, es igual a la fuerza de arrastre de la partcula, es decir: FK = -FE (11.1)
La fuerza de arrastre FK en el caso de un flujo viscoso lento alrededor de una esfera (flujo reptante) est dada por (Bird et a/, 1964): (11.2) donde: v : Velocidad de la partcula. [L/t]. i: Viscosidad lquido. [M/L t]. d: Dimetro de la esfera. [L]. La fuerza elctrica FE es proporcional tanto al campo que acta sobre la partcula as como a su carga, de tal manera que: (11.3)
/' o
donde: z\\ Valencia de la partcula o carga puntual. F\ Constante de Faraday. [96,500 Coulombio/Mol-equiv].
oneJ ~" [,/V' - ]. 0\ Nmero de Avogadro. iMo equiv*
E: Campo elctrico. [Voltio /cm]. Si la partcula est en equilibrio es posible combinar las ecuaciones (11.1), (11.2) y (11.3) para obtener:
En la expresin anterior N0 puede ser expresada en funcin de la constante de Boltzman ks y la constante de los gases ideales R para obtener:
622
CAPTULO 11.
1
ELECTROFORESIS
De acuerdo a la ecuacin de Stokes-Eistein para un flujo reptante alrededor de una esfera, la difusividad DAB est dada por:
Combinando las ecuaciones (11.5) y (11 .6) se tiene:
La movilidad m de una partcula en un campo elctrico se defin como la velocidad de la partcula por unidad de campo elctrico, m=~
(11.8
En este caso particular del modelo de esfera, la movilidad est dad, por:
Se ha observado experimentalmente que la movilidad de una part cula no depende slo de su carga intrnseca, como predice modelo d esfera en la forma de la ecuacin (1 1.9). El ambiente inico que s^ form alrededor de la partcula en solucin tiene una influencia importan! sobre la movilidad y las propiedades electrostticas de la partcula. I modelo de la doble capa para interfases slido-lquido electrolito, h sido empleado para explicar estos efectos. Modelo de la Doble Capa El modelo de la capa doble desarrollado en base a la teora de los ele trolitos fuertes de Debye y Hckel, permite visualizar las interaccin de una partcula slida cargada, con su microambiente inico. Las partculas como las protenas cuando se encuentran present en soluciones de electrolitos desarrollan cargas. Estos grupos cargad' atraen especies de la solucin que presenten cargas contrarias (coione
11.2. FUNDAMENTOS
623
contraiones, molculas polares o molculas con dipolos inducidos, coiones solvatados o contraiones solvatados). El modelo de la doble capa propone que este conjunto de cargas genera dos regiones o capas con diferente grado de movilidad (Figura 11.3). En la primera regin (capa de Sterm) la atraccin que ejerce la partcula sobre las especies es ms fuerte, formando una capa altamente hidratada, relativamente fija, de un espesor aproximado de 10 A Esta capa que envuelve a la partcula misma constituye la superficie de corte del complejo formado. Se considera a esta capa la responsable de la disminucin del campo elctrico intrnseco de la partcula. Dependiendo de la carga neta que se genere dentro de la superficie de corte por accin del rearreglo de cargas, en las proximidades de la superficie de corte se genera una segunda capa de carga contraria (cuya naturaleza no es rgida), constituida por molculas del solvente ligeramente ligadas y iones totalmente hidratados. A esta segunda capa se le conoce como capa difusa o capa de Gody-Chapman. El modelo de la doble capa permite interpretar el hecho que la velocidad de migracin de una partcula cargada en un campo elctrico, es proporcional al potencial Z de la partcula y no a su carga intrnseca. El potencial Z es el potencial elctrico medido en la superficie de corte de la partcula. Actualmente no existen suficientes bases tericas que permitan calcular el potencial Z en funcin de la carga de la partcula y su determinacin es de carcter emprico. El radio de la capa difusa tambin tiene una influencia importante sobre la movilidad de la partcula. Utilizando la teora de Debye-Hckel ha sido calculado el radio medio de la capa difusa o la longitud de Debye A. Esta longitud vara inversamente con la raz cuadrada de la fuerza inica / (Castellan, 1971), es decir, A o c 4= (11.10) \/7 donde la fuerza inica es una medida de la concentracin y valencia de los iones que rodean la partcula, y est dada por:
= * E c--?
624
CAPTULO 11.
ELECTROFORESIS
Superficie cargada \ >>
Cap* interna de Helmholtz
c*p* externa de Helmholtz
Superficie de corte Agua de Hidratacin
Capa difusa de Gouy-Chapman
Capa de Stern
Distancia
Figura 11.3: Esquema de la doble capa cerca de una superficie cargada. Adaptada de: Ivory, 1990.
11.2. FUNDAMENTOS donde: d'. Concentracin de la especie i. Z{\ Valencia de la especie i.
625
En la mayora de los casos prcticos A es menor a 1000A. Para analizar los efectos del espesor de la capa difusa sobre la movilidad de la partcula, es conveniente considerar tres casos particulares: - Para fuerzas inicas bajas, es decir a concentraciones salinas bajas, la capa difusa es grande pero muy diluida en contra iones, de tal manera que su presencia puede ser ignorada. - En ambientes de fuerzas inicas altas, como los caractersticos de los lquidos fisiolgicos (0.15M), el espesor de la capa difusa es muy bajo (~ 2 A) y su presencia tambin puede ser ignorada. - Entre los dos extremos anteriores, se puede considerar la situacin en la cual el espesor de la capa difusa es intermedio. Modelo de la doble capa: Movilidad en soluciones diluidas.Para soluciones diluidas la movilidad en funcin del potencial Z puede calcularse por medio de un balance de fuerzas sencillo, tal como el desarrollado para obtener la ecuacin (11.9), de tal manera que en equilibrio FK = -FE (11.12)
siendo FK la fuerza de arrastre sobre la partcula esfrica formada por la superficie de corte, de tal manera que: FK = 3TTfdcv (11.13)
La fuerza elctrica FE que acta sobre la partcula es proporcional al campo que acta sobre sta, y al potencial Z que es una medida de la carga aparente de la misma. De acuerdo con la Ley de Coulomb la fuerza entre dos cargas est dada por:
626
CAPTULO 11.
ELECTROFORESIS
rA
(11.14)
en este caso: q\: Carga aparente de la partcula, [coulombio]. qi: Carga correspondiente al campo, [coulombio]. r: Distancia entre las cargas, [m]. e: Constante dielctrica del medio. [Coulombio2/new m 2 ]. El potencial Z est dado por:
(11.15)
donde rc es el radio de corte de la partcula y q\ es la carga neta de la partcula en la superficie de corte. El campo aplicado a la partcula puede ser expresado como: (11.16) - e r2 combinando las ecuaciones (11.14), (11.15) y (11.16) se obtiene: FE = etrcE y las ecuaciones (11.12), (11.13) y (11.17) conducen a: 6?r/t; = 6Ê (11.18) (11.17)
de tal manera que la movilidad m = v/E est dada por la ecuacin conocida como de Hckel,
m = _.
67T/
(11.19)
Esta movilidad es menor a la esperada si slo se considera la carga real de la partcula, y es aplicable cuando la relacin de radio de corte a longitud Debye es muy pequea (rc/X 1).
1.2.
FUNDAMENTOS
627
Ejemplo 11.1.- Clculo del campo que genera un protn. Estimar el campo sobre la superficie de un protn utilizando los siguientes datos:
1.6 x 10
I9
coulombio
r = 31 x 1(T 1
6
10
m
new m coul2
= 9 x 10
Solucin:
El campo est dado por la ecuacin siguiente:
E=
sustituyendo los datos se tiene:
' '
E =
9 x 10
- m'
coul2
1.6 x 10~19 (31 x 10-10)2 m 2
7 = =
1.5 x 10*
V_ m e V_ 1.5 x 10 cm
El campo que produce el protn debido a la relacin de la carga con la distancia es muy grande. Una batera de 100 V produce un campo de slo 10 V/cm. Modelo de doble capa: Movilidad en soluciones de concentracin intermedia y alta.- Cuando la capa difusa presenta una longitud intermedia en el rango,
0.01 < -f < 1000
628
CAPTULO 11.
ELECTROFORESIS
1.5
Fuerza Inica
0.5
.01
10
100
1000
Figura 11.4: Variacin de la movilidad con el radio de la capa difusa, se observa experimentalmente una variacin en la movilidad predi cha por la ecuacin (11.19), tal y como se representa en la Figura IIA Esta variacin ha sido correlacionada utilizando modelos basados e la ecuacin de Henry, la cual establece que la movilidad de la partcul adems de ser funcin del potencial Z y de la fuerza de arrastre, tambi es funcin de la relacin del radio de corte a la longitud de Debye. E decir,
m=
(11.2
67T/I
Algunos modelos predicen reducciones en la movilidad de Hckel c hasta 60% en el rango aproximado de
0.6 < Y < 6 A
Para relaciones de rc/X 1, los modelos predicen una soluci< asinttica donde:
(i) = 3/2
de tal manera que:
11.2. FUNDAMENTOS
629
m=
ef
D7T// *
2
m = -^47T/X
(11.21)
que es una movilidad 50% mayor que la predicha por la ecuacin de Hckel. A nivel microscpico esta variacin de la movilidad ha sido explicada utilizando el modelo de doble capa para proponer otros efectos conocidos como: - Fuerza de relajacin. - Fuerza de retardamiento. Cuando la partcula emigra en direccin opuesta a su carga neta, se presenta una distorsin de la capa difusa (Figura 11.5). Los contraiones de la capa difusa tienden a emigrar en direccin opuesta creando un campo que se opone al movimiento de la partcula. La fuerza opuesta al movimiento de la partcula que se genera, se conoce como fuerza de relajacin. La fuerza de retardamiento se origina por el movimiento de solvente provocado por el movimiento de contraiones de la capa difusa, generndose un esfuerzo viscoso adicional sobre la superficie de corte de la partcula. Los modelos electrocinticos en general han presentado dificultades para predecir con exactitud los resultados de las separaciones electroforticas. Sin embargo, han servido de base para generar diversos modelos empricos de amplio uso.
11.2.3
Fenmenos de Dispersin
Cuando se realiza una operacin de electroforesis se requiere que los solutos presentes en la solucin de inters se separen formando bandas bien definidas, es decir se obtenga una resolucin apropiada. Sin embargo, existen varios fenmenos que provocan la dispersin de la
630
CAPTULO 11. ELECTROFORESIS
Carga neta +
O
Ctodo (-)
t
nodo (+)
R
E Campo
Fuerza de Relajacin
Figura 11.5: Representacin esquemtica del efecto de relajacin. Adaptada de: Rudge y Ladisch, 1986.
Reproducida con el permiso de la American Chemical Society. Copyright 1986. Todos los derechos reservados.
11.2. FUNDAMENTOS
631
muestra, trmino que engloba tanto los efectos de difusin molecular, como los efectos microscpicos de mezclado que se agrupan en la llamada difusividad de remolino. Algunos de estos efectos se describen a continuacin. Difusin En una electroforesis generalmente existe algo de dispersin de la mezcla debida a la difusin molecular, sin embargo este fenmeno normalmente no es la causa principal de la dispersin. De acuerdo a Jorgenson y Lukacs (Rudge y Ladisch, 1986), la desviacin estndar de una muestra dispersada slo por difusin est dada por: a = T/WABt (11.22)
En el caso de protenas la difusin puede ser estimada empleando la ecuacin de Polson (Horstmann y Chase, 1989).
D =9Axl
"
~nm&r>
(1L23)
donde: T: Temperatura. [K]. MA> Peso molecular del soluto. //: Viscosidad de la solucin. [Kg/m s]. Ejemplo 11.2.- Dispersin de protenas. Para la electroforesis a 25C de ovalbimina (PM= 45,000), ImG (PM=150,000) y colgeno (PM= 345,000), en un medio cuya viscosidad es de 0.001 Kg/m s, se desea estimar: a).- La variacin de la dispersin por difusin con el tiempo. b).- El tiempo de doblado del ancho original de la banda de muestra que es de 0.08 era. Solucin:
632
CAPTULO 11. ELECTROFORE
Tabla 11.1: Clculo de difusividades de protenas. Ejemplo 11.2. Protena Ovalbmina ImG Colgeno
PM 45,000 150,000 345,000
Difusividad (cm 2 /s) 7.88 x 10-7 5.27 x 10~7 3.99 x 1Q-7
Tabla 11.2: Clculos de dispersin. Ejemplo 11.2.
i(h)
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00
Dispersin (cm) Ovalblmina ImG Colgeno 0.000 0.000 0.000 0.027 0.038 0.031 0.044 0.038 0.053 0.046 0.053 0.065 0.054 0.062 0.075 0.087 0.076 0.106 0.107 0.093 0.130 0.107 0.123 0.151 0.138 0.120 0.168
a).- Mediante las ecuaciones (11.22) y (11.23) se puede calcul dispersin. En la Tabla 11.1 se presentan los resultados de los cl< de difusividades de acuerdo a la ecuacin (11.23). En la Tabla 11.2 se presentan los resultados de los clculos < dispersin en funcin del tiempo. Estos resultados se muestran en f< grfica en la Figura 11.6. Se puede puntualizar que conforme aurr el tamao de la protena, el coeficiente de dispersin disminuye dispersin es menor. b).- De acuerdo a los resultados anteriores, si la muestra con ImG, sta tardar alrededor de 1.8 h para doblar el ancho inicial, muestra contiene ovalblmina el doblado de la longitud de la ban
11.2.
FUNDAMENTOS
633
0.160.140.12-
0.100.080.060.040.02-
0
0.5
1.5 2
2.5
3.5
4 4.5
Tiempo (h)
Figura 11.6: Dispersin de protenas por difusin en electroforesis. 1) Ovalbmina 2) ImG 3) Colgeno.
634
CAPTULO 11.
ELECTROFORESlS
efecta en una hora aproximadamente. Una forma de disminuir el grado de dispersin en una operacin intermitente consiste en disminuir el tiempo de operacin. Electrosmosis Otra causa de dispersin en una operacin electroforetica es la electrosmosis. Esta es el resultado del movimiento de la capa difusa de iones en la proximidad de la superficie cargada fija de la celda por accin del campo elctrico, lo que se traduce en el desplazamiento neto de solvente hacia uno de los polos (en direccin opuesta al movimiento electrofortico). Este efecto microscpico puede alterar el patrn de flujo macroscpico dependiendo de la configuracin de la celda electrofortica, alterando el desplazamiento de la muestra. Efectos Inicos Regulatorios La diferencia de movilidad entre el soluto de inters y los iones del bufer donde se efecta la electroforesis, puede generar dispersin durante la electroforesis. Para atenuar este efecto en la interfase delantera la muestra debe presentar una menor movilidad que el bufer, mientras que en la posterior es conveniente que la movilidad de la muestra sea mayor. Gradientes de Conductividad Si la conductividad de la muestra es mayor que la del bufer, cuando el campo se incrementa arriba de un valor crtico, puede provocarse una distorsin en "forma de puntas" de la interfase. El bufer puede presentar una menor conductividad que la muestra por efecto de los iones que contiene. Sobrecalentamiento: Efectos Trmicos Cuando una, corriente elctrica se hace pasar a travs de un medio con una determinada resistencia parte de la energa se convierte en calor,
11.2. FUNDAMENTOS
635
fenmeno conocido como efecto de Joule. En una operacin electrofortica el calor generado es proporcional al cuadrado del campo aplicado y al cuadrado del espesor del gel, de tal manera que la cantidad de muestra est limitada por este espesor. La existencia de gradientes trmicos puede desnaturalizar solutos lbiles, daar el gel o estimular la evaporacin de solvente. Sobrecalentamiento: Efecto de Conveccin Libre Si la electroforesis se desarrolla en un medio lquido en ausencia del gel de soporte, los gradientes de temperatura pueden originar movimientos convectivos libres debido a la accin de la gravedad sobre los gradientes de densidad que se originan. Esta es la principal causa de mezclado en electroforesis. El grado de conveccin se caracteriza por el nmero adimensional de Rayleigh Ra el cual est dado por:
fa \z
donde: /: Longitud caracterstica de la geometra del aparato de electroforesis (en una celda es el espesor del gel). [L]. g: Aceleracin de la gravedad. [L/t2]. j,: Viscosidad del medio. [M/L t]. a: Difusividad trmica del medio. [L2/t]. : Gradiente de densidad en la direccin z. [M/L4]. Entre menor sea el valor Ra menor es el efecto de la conveccin natural. De acuerdo con la ecuacin (11.24) sto se puede lograr de varias formas. La ms empleada a nivel laboratorio es el incremento de la viscosidad mediante el uso de geles de soporte. En equipos industriales que operan en forma continua se utilizan membranas porosas para separar regiones de electroforesis de diferente pH. Esto tiende a disminuir la conveccin al disminuir la longitud caracterstica /.
636
CAPTULO 11.
ELECTROFORESIS
11.2.4
Medios y Modos de la Electroforesis
La electroforesis ha evolucionado en forma considerable a partir de los trabajos pioneros de Ame Tiselius en 1937 y el desarrollo de la teora de los electrolitos fuertes de Debye y Hckel en 1923. Actualmente existen diferentes medios y formas para efectuar una separacin electrofortica (Ivory, 1990). Medios Anticonvectivos Se han utilizado diferentes medios para realizar las operaciones electroforticas. Inicialmente stas se realizaban en medio lquido en celdas especiales (Lehninger, 1989). En 1939 fueron introducidos los primeros materiales anticonvectivos como: papel filtro, fibra de vidrio y almidn granulado. A mediados de los cuarenta fue introducido el uso de geles cuyo comportamiento es superior a los materiales anteriores por su menor tamao de poro y menor carga superficial. A partir de 1959 fueron introducidos los geles de poliacrilamida (PAG de sus siglas en ingls) y de agarosa. Los geles de agarosa tienen una estructura porosa altamente hidratada con poca carga que asemeja un medio lquido. Este tipo de gel es muy utilizado en anlisis de cidos nucleicos. Los geles de poliacrilamida estn formados de polmeros ms entrecruzados que producen poros ms pequeos. Este gel es muy empleado en el anlisis electrofortico de protenas, tcnica conocida como PAGE (de las siglas en ingls de electroforesis en gel de poliacrilamida). Una variante de la tcnica PAGE es la PAGE-SDS. En sta se agrega sulfato de dodecil sodio a la solucin amortiguadora que provoca la desnaturalizacin de las protenas. Las cadenas desnaturalizadas migran a una velocidad proporcional al logaritmo de su peso molecular PM, log(PM) = A- Bm donde A y B son constantes y m es la movilidad.
[1.2. FUNDAMENTOS Modos de la Electroforesis
637
En un proceso electrofortico la velocidad de migracin de las especies, depende de su carga, tamao y forma, y de las propiedades del medio. La resolucin que se puede lograr considerando slo estos parmetros ha sido mejorada imponiendo a los sistemas restricciones adicionales como el uso de geles porosos que incrementan la separacin por filtracin o la utilizacin de gradientes de pH que orientan a las especies de acuerdo a su punto isoelctrico. Este tipo de modificaciones ha dado origen a una amplia gama de tcnicas electroforticas analticas y preparativas, cuya clasificacin es difcil, pero que en trminos generales se pueden dividir en (Bier et al, 1983): - Electroforesis de interfase mvil (MBE). - Electroforesis de zona (ZE). - Isotacoforesis (ITP). - Enfoque isoelctrico (IEF). Electroforesis de interfase mvil.- La electroforesis de interfase mvil o electroforesis libre fue desarrollada por Ame Tiselius en 1937, logrando por primera vez resolver las globulinas sanguneas en los tipos a, 3 y 7. Esta tcnica utiliza una celda en forma de tubo en U (Figura 11.7). Inicialmente se coloca dentro de la celda la solucin que contiene la mezcla proteica en el bufer adecuado, posteriormente se aade una columna de solucin con bufer. Al aplicarse el campo elctrico cada protena migra, de la muestra a la zona de bufer, formando una interfase. Cada banda se detecta en funcin de la velocidad de migracin de la protena particular, utilizando el ndice de refraccin. La protena ms rpida se coloca al inicio del patrn de migracin en el brazo ascendente y la ms lenta al final del brazo descendente de la celda. La separacin completa de los componentes de la mezcla no puede ser alcanzada mediante este tipo de electroforesis, slo el soluto ms rpido puede obtenerse en forma pura.
638
Buffer
\
Frontera Ascendente
Frontera Inicial
Frontera Descendente
Figura 11.7: Representacin esquemtica de la celda de Tieselius. Electroforesis de interfase mvil.
11.2.
FUNDAMENTOS
Compartimiento .X del nodo
639
Electrolito de Alta Movilidad Frontera de Fase No. Electrolito de Alta Movilidad

1-5
1-4
1-3
1-2\
No. de Componentes
Fase No.
Figura 11.8: Electroforesis de interfase mvil de cinco componentes inicos, (antes y despus). Tomada de: Ivory, 1990.
En los desarrollos recientes la electroforesis de interfase mvil acta como una celda donde la banda de muestra aplicada es semi-infinita, de tal manera que slo pueden separarse solutos de igual carga. La colocacin de la muestra depende del polo hacia al que va migrar. Para solutos con carga positiva deber colocarse en el nodo. El resto de la celda se carga con electrolito rpido que permanezca siempre al frente de la migracin y permita disminuir la dispersin de la muestra (Figura 11.8). Electroforesis de zona.- En la electroforesis de zona descrita al inicio de la seccin 11.2, la muestra es pequea y diluida, entonces es posible lograr la su resolucin completa. Este tipo de electroforesis puede ser empleada para resolver mezclas de cargas diferentes. Isotacoforesis.- En una separacin por isotacoforesis la muestra se inserta entre un electrolito rpido y uno lento (Figura 11.9), formando una banda finita. En estado estacionario todos los constituyentes se mueven a la misma velocidad, en un orden impuesto por sus mov-
640
CAPTULO 11.
ELECTROFORESIS
Electrolito de Baja Movilidad
Electrolito de Alta Movilidad
Frontera de Fase No. Electrolito de Baja |II 5 Movilidad Componente No. 5
5 4l '' 4
4 HFl '' 3
2 Un '' 2 \ / m 1
1 Electrolito de Alta Movilidad
Fase No.
Figura 11.9: Isotacoforesis de cinco especies inicas(antes y despus). Tomada de: Ivory, 1990.
lidades, con la ventaja de que cada banda contiene slo un tipo de electrolito (el ancho de la banda es una medida de la concentracin de la especie en la muestra original). Enfoque isoelctrico.- Cuando la separacin electrofortica es por medio de enfoque isoelctrico (IEF) se requiere un gradiente de priven el medio donde se realiza la electroforesis (Figura 11.10). En el medio continuo de pH las molculas como las protenas se ordenan conforme a su punto isoelctrico, es decir al migrar llegan a un punto donde su carga neta es cero y por lo tanto su movilidad es nula. El enfoque isoelctrico es una operacin gobernada por el equilibrio, mientras que las otras operaciones son controladas por la velocidad de transporte.
11.3
Equipos
Actualmente existe un buen nmero de equipos para realizar electroforesis a escala preparativa, en la Tabla 11.3 se presentan las principales
11.3.
EQUIPOS
641
nodo
/"p\
f\
\-S
Ctodo
nodo pl: Punto Isoelctrico
Ctodo
Figura 11.10: Enfoque isoelctrico de solutos polianfolticos (antes y despus). Tomada de: Ivory, 1990.
caractersticas de algunos de ellos. A nivel laboratorio y en algunos equipos a escala preparativa, la forma que se ha empleado para minimizar el problema de la dispersin de la muestra por conveccin, ha sido el uso de geles como medios de soporte. Estas tcnicas han sido caracterizadas como tediosas y costosas, debido que al finalizar la operacin se requiere recortar las regiones de gel donde se localizan las bandas y extraer por electroelucin o algn otro mtodo los solutos de inters. Para evitar el uso de geles se han diseado equipos donde la electroforesis se realiza en medios lquidos, y donde la longitud caracterstica / del nmero de Rayleigh se reduce empleando pelculas delgadas o mediante el uso de membranas. Otro tipo de equipos combina la electroforesis con la cromatografa para eficientar las separaciones. De manera general los diversos equipos de electroforesis existentes se pueden dividir en tres tipos: Equipos de flujo libre. Equipos de flujo libre con recirculacin.
Equipos electrocronialogricos.
642
CAPTULO 11.
ELECTROFORESIS
Tabla 11.3: Caractersticas de algunos equipos de electroforesis.

Tipo 1. Compaa 2. Nombre 3. Introduccin 4. Precio dU. 5. Tcnicas Electroenfoque SDS-PAGE PAGE A garosa Celes Isotacoforesis Zona Escaln de campo 6. Operacin 7. Estabilizacin del flujo Rotacin Membranas Pelcula Gel 8. Dimensin de U celda Geometra Seccin transversal Longitud de separacin 9. Campo Tpico 10. Tiempo de operacin tpico 11. Tamao tpico de la muestra 12. Produccin tpica 13. Enfriamiento 14. Detector 15. Colector de fracciones Nmero de fracciones Proceso de coleccin
Adaptada de: Eby, 1991.
Pelcula con flujo libre Bender y Hobein Elphor VaP 22 1987 80,000
Si No No No No Si Si Si Continua No No Si No
Pelcula con flujo libre Hirschmann AGE 710 1986 140,000

No No No No No No Si No Continua No No Si No
Tipo tambor Bio-Rad Rotofor Prep IEF 1987 7,000

Si No No No No Si No No Intermitente Si Si No No
Pelcula con recirc. P r o t e i n Techs

RF3
1990 30,000
Si No No No No Si No No Intermitente No Si Si No
Rectangular
250 mm
2
Rectangular
60 mm 4 cm 100-150 V/cm
Anular
627 mm
2
Rectangular
150 mm 2 4 cm 250-375 V/cm
2h \ \ mg-g protena 5-500 mg/corr. Si No
SI
10 cm 100-300 V/cm
12.5 cm 50-100 V/cm

3-5 h 100 pg - 1 g 0.2-500 mg/da
Continuo 25 X 10 ce/m 500 X 106 ce///

Si
6
Continuo 5 X 10 ce/m 100 x 106 ce///i

Si
6
Si
No
U V / V i s , Variable Si 90 Lento
U V / V i s Var. Si 35 Rpido
Si 20 Rpido
30 Rpido
Reproducida con el permiso de Nature Publishing Co. Copyright 1991. Todos los derecho: reservados.
11.3. EQUIPOS
643
11.3.1
Equipos de Flujo Libre
En los equipos de flujo libre a diferencia de los equipos que presentan recirculacin, el medio no se recircula. La estabilizacin de los flujos se logra empleando distancias pequeas de migracin o estabilizacin rotacional. Existen dos arreglos bsicos de este tipo de equipo: - Tipo pelcula delgada. - Tipo anular. Pelcula Delgada Los equipos de electroforesis de pelcula delgada han sido estudiados desde los aos cincuenta (Hamel y Hunter, 1990). En tales sistemas se inyecta una corriente continua y puntual de muestra sobre una pelcula de bufer que se mueve verticalmente en flujo laminar entre dos placas (Figura 11.11). En las partes laterales de este arreglo se sitan los electrodos en forma de placas. La muestra emigra horizontalmente conforme pasa por la cmara. Los solutos forman bandas discretas de acuerdo a sus movilidades electroforticas, y son eludos continuamente por el fondo de la cmara y colectados por medio de una bomba de canal mltiple. El calor generado es removido por medio de refrigerantes que enfran las paredes laterales. Uno de los usos principales de este tipo de equipos es en la separacin de clulas y virus, partculas sub-celulares y componentes de membrana. Electroforesis Anular La electroforesis de flujo libre tambin se ha conducido en arreglos anulares basados en el diseo de Philpot-Harwell (Figura 11.12). En estos sistemas el cilindro interno es fijo y funciona como ctodo, mientras que el exterior gira a velocidades hasta de 150 rpm. Este movimiento permite neutralizar los efectos convectivos radiales. La muestra y el bufer son inyectados en la base del anillo y se mueven axialmente hacia el colector mltiple situado en la parte superior.
644
CAPTULO 11.
ELECTROFORESIS
z (lateral) ' y (transversal) x (axial)
Alimentacin Buffer
Electrodos
Figura 11.11: Esquema de un equipo de electroforesis de flujo continuo en una celda de electroforesis. Tomada de: Gobie y Ivory, 1986.
11.3. EQUIPOS
645
Fracciones Recuperadas
Anillos colectores de fracciones
Campo elctrico transverso
Anillo de carga de muestras Entrada del Buffer
Figura 11.12: Esquema de un equipo de flujo libre en un arreglo anular. Tomada de: Hamel y Hunter, 1990.
646
CAPTULO 11.
ELECTROFORESIS
Figura 11.13: Celda de electroforesis tipo tambor rotatorio. A) Entrada y salida de refrigerante B) nodo C) Cmara de electroenfoque D) Ctodo E) Brazo de enfriamiento F) Venteo G) Cubierta. BioRad
11.3.2
Equipos de Flujo Libre con Recirculacin
En los equipos de flujo libre con recirculacin el medio lquido donde se efecta la electroforesis se recircula continuamente. Existen diferentes tipos de arreglos para estos equipos como: - La celda tipo tambor. - Los equipos de pelcula delgada con recirculacin. - Los equipos de pelcula delgada con recirculacin desplazada.
Celda Tipo Tambor
La celda tipo tambor (Figura 11.13) consta de una cmara cilndric dividida en 20 compartimientos por medio de 19 discos de membrana de polister, con poros de 10 /i, y gira a 1 j-pni. Este tipo de equipo es operado con gradientes de pH, de tal maner que la operacin es conocida como enfoque isoelctrico con recirc lacin (RIEF de sus siglas en ingls). La rotacin de la cmara y la membranas permiten enfocar apropiadamente las zonas. Cada cmar posee un'a posicin para alimentar la muestra y una para descargar!; lo cual se efecta por medio de vaco.
11.3. EQUIPOS
647
El campo elctrico se provee por medio de dos electrodos situados en los extremos de la cmara. El enfriamiento se realiza por medio de un tubo de cermica por el cual fluye el lquido de enfriamiento por el interior del tambor. Pelcula Delgada con Recirculacin Una variante de los equipos de enfoque isoelctrico con recirculacin separa fsicamente las funciones de enfriamiento y estabilizacin del fluido (Figura 11.14). En este arreglo la solucin que va a fraccionarse es recirculada continuamente entre la celda de canales mltiples donde se realiza la electroforesis y un intercambiador de calor de canales mltiples. El flujo en la celda es laminar ya que est dividida por membranas formando canales de flujo muy delgados. La operacin se efecta utilizando un gradiente de pH sobre la cmara y slo el 6% de la muestra permanece en la cmara en un tiempo dado. Tpicamente una separacin se realiza despus de cientos de ciclos en aproximadamente dos horas. Pelcula Delgada con Recirculacin Desplazada Una variante del arreglo fsico anterior empleado en electroforesis de zona (Figura 11.15), es la electroforesis en pelcula delgada con recirculacin desplazada. En este sistema la muestra es inyectada continuamente en un canal de la celda y reinyectada en forma desplazada, de tal manera que su migracin neta es alterada. Los solutos ms lentos tendern a migrar en el sentido del desplazamiento de la alimentacin, cuando este desplazamiento sea lo suficientemente grande; y en direccin contraria cuando el soluto tenga una movilidad tal que logre tener un desplazamiento mayor que el provocado por el movimiento de la recirculacin.
11.3.3
Equipos Electrocromatogrficos
Otra alternativa para disminuir los problemas convectivos en la electroforesis son los sistemas que utilizan medios con partculas como las
648
CAPTULO U.
ELECTROFORESIS
Figura 11.14: Esquema de un equipo electrofortico con recirculacin. 1) Bomba 2) Celda de enfoque 3) Intercambiado! 1 4) Monitor de pH 5) Monitor UV 6) Control de la bomba 7) Interfase de datos 8) Centro de carga 9) Control UV Adaptado de: Bier, 1986.
11.3.
EQUIPOS
649
Alimentacin
uuuuuu
Purga
Componente de Baja Movilidad
Seccin de cambio
Componente de Alta Movilidad
Figura 11.15: Esquema de un equipo electrofortico de pelcula delgada con recirculacin desplazada. Tomada de: Ivory, 1990.
usadas en cromatografa. Su desarrollo actual es a nivel de prototipos y se pueden mencionar dos tipos: - Los equipos de Electrocromatografa anular rotativa continua. - Los equipos de electrocromatografa de efectos opuestos.
Electrocromatografa Anular Rotativa Continua

En los equipos de electrocromatografa anular rotativa continua (CRAE de sus siglas en ingls) (Figura 11.16), la muestra se alimenta en forma continua en un punto de un lecho anular, y se eluye mientras el lecho rota. El campo es aplicado axialmente.
Electrocromatografa de Efectos Opuestos

En la electroforesis cromatogrfica de efectos opuestos (CACE de sus siglas en ingls), el campo elctrico es antiparalelo al movimiento convectivo forzado, y se desarrolla en una columna empacada de cromatografa por pxclusin, que presenta dos secciones de diferente resolucin (Figura 11.17). La parte superior de la columna se empaca
650
CA PTVLO 11.
ELECTROFORESIS
Alimentacin Multicomponente
V= reo
Figura 11.16: Esquema de un equipo de electrocromatografa anular rotativa continua. Tomada de: Hamel y Hunter, 1990.
1L3. EQUIPOS
651
Compartimiento del Buffer Anin ico
Tapn de Poliacrilamida
Entrada del Bufler acarreador
Lecho de Gel de Exclusin
Zona de Acumulacin del producto
Flujo del Buffer
Migracin Electrofortica
Movimiento
Lecho de Gel de Inclusin
Tapn de Poliacrilamida
WW -
^ Salida del Buffer acarreador
Compartimiento del Buffer Catinico
Figura 11.17: Electrocromatografa de efectos opuestos. Tomada de: Hamel y Hunter, 1990.
con gel excluyente del soluto de inters y la parte inferior con gel incluyente, de tal manera que ste se mueva ms rpidamente en la parte superior. Con un manejo adecuado de la intensidad del campo, el soluto de inters puede tener un movimiento neto siempre hacia el centro de la columna y acumularse en esa regin, mientras que los contaminantes salen por alguno de los extremos. Este arreglo produce separaciones de alta pureza y concentracin, pero su productividad est limitada por el calentamiento y la cada de presin.
652
CAPTULO U.
ELECTROFORESiS
11.4
Diseo
El tratamiento de la electroforesis al igual que las columnas cromatogrficas puede ser abordado empleando: La teora de platos. La teora cintica.
11.4.1
Teora de Platos
La teora de platos es til para comparar el comportamiento de un mismo equipo para diferentes aplicaciones, y entre la misma aplicacin en equipos diferentes. Como se estableci anteriormente la desviacin estndar en equipos electroforticos cuya principal causa de dispersin es la difusin molecular est dada por: (11.25) donde: D: Dispersin axial. [L2/t]. t: Tiempo. [i\. a: Desviacin estndar. [L]. La ecuacin (11.25) se puede expresar en trminos de parmetros electroforticos introduciendo la expresin: u = rnE = m donde: v: Velocidad del soluto. [L/t]. m: movilidad. [L2/ Voltio t}. E: Campo. [Voltio/ L}. (11.26)
11.4. DISEO V: Voltaje. [Voltio]. L: Longitud de la celda. [L] dimensionalmente: t=-
653
(11.27)
entonces se combinan las ecuaciones (11.25), (11.26) y (11.27) para obtener:
De acuerdo a la teora de platos, la eficiencia de la separacin puede definirse como la dispersin por unidad de longitud,
2
~ LJ Las ecuaciones (11.28) y (11.29) conducen a:
(11.29)
1DL HETP= mV
como:
(11.30)
L = (HETP)(N)
entonces
(11.31)
(11-32) De estos resultados es importante notar que TV es independiente de L. Asimismo, /V puede incrementarse aumentando V. Por otro lado, HETP aumenta al aumentar L. Esto implica que las distancias cortas de migracin son las ms eficientes para la separacin. La resolucin de dos componentes del sistema cuando su coeficiente de dispersin es el mismo est dado por (Rudge y Ladisch, 1986):
R=4 V 2D
654

donde mi y m< son las movilidades del soluto 1 y 2, respectivamente
y:'
771 =
mi + m 2 2
De acuerdo a la expresin (11.33) el voltaje incrementa la resolucin. Ejemplo 11.3.- Resolucin de una mezcla de protenas. Se desea separar dos enzimas mediante una electroforesis en gel a 4C. El coeficiente de dispersin axial es de 2 x 10~7 cm2/s. La movilidad es de 3.38 x 1(T5 cm?/V - s y 1.33 x 10~5 crn2/V - s, respectivamente. Para realizar la separacin se utiliza una celda de 2 cm donde se aplica un campo de 1.8 V/cm por un lapso de 7.5 h. Se pide estimar: a) La distancia que viaja cada soluto. b) La eficiencia de la separacin de cada soluto. c) La resolucin de la separacin. Solucin: a).- La distancia puede ser calculada mediante la expresin
L = vt mEt
de tal manera que:
= 3.38 x 10~5 -f^ x 1.8 x 7.5 h x V s cm

=
1.64 cm
cm
3600 s
y,
2 =
1.33 x 10-* .,cm' x 1.8 - x 7.5 h x V cm cm
L2
= 0.64 cm
11.4. DISEO La separacin entre los solutos es:

LI Z/2 = 1 era
655
b).- De acuerdo a la ecuacin (11.30),
HETP = (HETPh
(HETP)i
mE
2 (2 x 10~7 22!)
3.38 x 10-5 gal x U
= 6.57 x 1(T3 era

2 (2 x 10-7 ss\ 2 i/ 1.33 x io-5 ^ x 1.8
(HETP)2 (HETP)2
= =
1.67 x 10~2 era
c) Utilizando la ecuacin (11.33) se puede calcular la resolucin. Primero es necesario calcular la movilidad promedio,
I | I j
fe,
ra
_ _
m
mi + = 2 (3.38 + 1.33) x 10-5 &.

J
ra = 2.334 x 1(T5 ^~V s de tal manera que, 1 /2.334 x 10~5 ^ x 1.8 ^7 x 2cra
4 \ 2 x 2 x 10-7 '
(3.38- 1.33) x 10-5 f^-2
2.334 x 10-5
R = 3.18
656
CAPTULO 11.
ELECTROFORESIS
11.4.2
Teora Cintica
En un proceso electrofortico la velocidad de migracin depende de la carga, tamao y forma de la partcula de inters, as como de las propiedades del medio. La resolucin puede ser incrementada mediante gradientes de pH, filtracin molecular, o modificaciones del flujo. Esto a dado origen a una diversidad de procedimientos para optimizar las separaciones electroforticas. Actualmente se cuenta con un teora unificada para tratar los diversos modos electroforticos (ZE, MB, ITF e IEF) (Bier ti a/, 1983), lo cual demuestra que las ecuaciones que rigen estos procesos son idnticas. Las diferencias aparentes surgen de las diferentes condiciones iniciales y de frontera de cada caso. A continuacin se presentan algunos modelos particulares.
Pelcula Delgada con Alimentacin Continua
En el caso de la electroforesis en pelcula delgada con alimentacin continua, el soluto est sujeto a fuerzas difusivas, convectivas y electroosmticas, que determinan su patrn de elucin. En estado estacionario y para E constante, el balance de masa de soluto en este tipo de arreglos es:
de de de
d^c
donde vx es la velocidad parablica axial y vz es la velocidad osmtica lateral. S0(x) es un trmino que describe la distribucin del flujo de soluto inyectado. La ecuacin (11.34) es una ecuacin difusiva, convectiva tridimensional, cuya forma ms sencilla es su solucin asinttica (Gobie y Ivory, 1986).
Electrocromatografa
En el caso de electrocromatografa en columna si se supone que mE es independiente de la concentracin, en ausencia de electrosmosis el modelo empleado es:
11.5. SUMARIO
657
rearreglando,
01.36)
donde R es la acumulacin de soluto en la fase slida y vx es la velocidad del flujo convectivo. Este resultado indica que las soluciones a la ecuacin de diseo de las columnas cromatogrficas, pueden ser aplicadas a la electrocromatografa, sustituyendo vx por vx -f mE.
11.5
Sumario
La electroforesis es una operacin que permite la purificacin de solutos por la accin de un campo elctrico. Uno de los problemas que se presenta normalmente en las operaciones electrofcrticas es la dispersin que sufre la muestra conforme la operacin se desarrolla. Para abordar esta dificultad se han desarrollado diversas formas y medios para efectuar la operacin, lo cual se ha traducido en una variedad de equipos disponibles a escala preparativa. El diseo de los equipos de electroforesis se realiza mediante enfoques similares a los utilizados en cromatografa de columna, y actualmente su desarrollo es incipiente y basado fuertemente en las pruebas de laboratorio.
658
CAPTULO 11.
ELECTROFORES1S
11.6
Problemas
11.1.- La movilidad relativa de /2-galactosidasa respecto a la de citocromo c en un gel de PAGE-SDS es de 0.2, mientras que la de actina es de 0.6. Los pesos moleculares de estas protenas son de 130,000 para la /3-galactosidasa y de 45,000 para la actina (Condeelis, 1977). Estimar la movilidad relativa de ASB (albmina de suero de bovino) en el mismo gel si su peso molecular es de 68,000. Resp. 0.42 11.2 La electroforesis capilar de alta resolucin (HPCE) es una poderosa tcnica analtica que maneja muestras menores de 1 j,g (Frenz y Hancok, 1991). Estimar el nmero de platos de una columna de HPCE donde la movilidad del soluto es de 10~8 m 2 /V s, el voltaje aplicado es de 30 KV y el coeficiente de dispersin de 10~10 m2/s. Resp. 1.5 x 106 platos. 11.3.- Se desea separar dos protenas en una celda electrofortica aplicando un gradiente de potencial de 1.2 V/cm. Bajo las condiciones de la electroforesis la movilidad de las protenas es de 1.2 x 10~4 y 2.1 x 10~4 cm2/V 5, respectivamente. Estimar el tiempo de separacin de estas protenas si inicialmente se colocan formando una banda de 0.4 cm de espesor. Resp. 0.51 h 11.4.- La movilidad electrofortica de las clulas de glbulos rojos humanos es independiente de las razas, edad, sexo y varios otros factores. Esta propiedad permite tomar a este tipo de clulas como un patrn electrofortico (Brinton y Lauffer, 1959). Estimar la movilidad de glbulos rojos en un medio M/15 de fosfatos a pH=7.4, si la viscosidad del medio puede tomarse como la del agua, el potencial Z es de 0.0168 Voltios y la constante dielctrica es de 9.8 x 10~9 coulombio'2/N - m2. Resp. 1.31 (m cm/V s
11.7. BIBLIOGRAFA
659
11.7
Bibliografa
Bier, M. 1986. Scale-Up isoelectric focusing. En: Separation, Recovery and Purification in Biotechnology. Asenjo J.A. y Hong, J. (Eds). ACS Symposium Series 314. ACS. Washington, D.C. 13, 185-192. Bier, M., Palusinski, O.A., Mosher, R.A. y Saville, D.A. 1983. Electrophoresis: Mathematical modeling and computer simulation. Science. 219, 4590, 1281-1286. Bird, R.B., Stewart, W.E. y E.N. Lightfoot. 1964. Fenmenos de Transporte. Reverte. Barcelona. 2, 25-28. Brinton, C.C. y Lauffer, M.A. 1959. The electrophoresis of virues, bacteria, and cells, and the microscope methods of electrophoresis. En: Electrophoresis: Theory, Methods, and Applications. Bier, M. (Ed.). Academic Press. New York. 10, 427-492. Castellan, G.W. 1971. Fisicoqumica. Fondo Educativo Interamericano. Mxico. 18,430-431. Condeelis, J.S. 1977. A sodium dodecil sulfate microgel-electrophoresis technique suitable for routine laboratory analysis. Analytical Biochemistry. 77, 195-207. Eby, M.J. 1991. Prep-phoresis: A wealth of novel possibilities. Bio/Tech 9, 528-530. Frenz, J. y Hancok.,, W.S. 1991. High performance capillary electrophoresis. Tibtech. 9, 243-250. Gobie, W.A. y Ivory, C.F. 1986. High-resolution, high-yield continuous-flow electrophoresis. En: Separation, Recovery and Purification in Biotechnology. Asenjo J.A. y Hong, J. (Eds). ACS Symposium Series 314. ACS. Washington, D.C. 12, 169-184. Hamel, J.P. y Hunter, J.B. 1990. Modeling and applications of downstream processing. En: Downstream Processing and Bioseparations. Hamel, J.P., Hunter, J.B. y Skidar, S.K. (Eds.). ACS Symposium Series 419. ACS. Washington, D.C. 1, 1-35.
660
CAPTULO 11.
ELECTROFORESlS
Horstmann, B.J. y Chase, H.A. 1989. Modelling the affinity adsorption of inmunoglobulin G to protein A inmobilised to agarose matrices. Chem. Eng. Res. Des. 67, 243-254. Ivory, C.F. 1990. Electrically driven separation processes: Analytical and preparative methods. En: Separation Processes in Biotechnology. Asenjo, J.A. (Ed.). Marcel Dekker. New York. 16, 517-567. Lehninger, A.L. 1989. Bioqumica. 2 ed. Omega. Barcelona, Espaa. 7, 131-132. Rudge, S.R. y Ladisch, M.R. 1986. Process considerations for scaleup of liquid chromatography and electrophoresis. En: Separation, Recovery and Purification in Biotechnology. Asenjo J.A. y Hong, J. (Eds.). ACS Symposium Series 314. ACS Washington, D.C. 10, 122-152.
Parte V Operaciones de Acabado
663
Las operaciones finales en un proceso de bioseparacin son las operaciones de acabado del producto. Estas operaciones permiten incrementar la pureza del producto, facilitar su manejo y mejorar su apariencia. En esta parte, se revisan dos de las operaciones de acabado ms utilizadas en los procesos biotecnolgicos. En el captulo 12, se trata la operacin de cristalizacin que es muy empleada tanto en la obtencin de productos biotecnolgicos tradicionales como los antibiticos, como en la obtencin de productos provenientes de la tecnologa del r-DNA como las protenas teraputicas. En el captulo 13 se presenta la operacin de secado la cual se utiliza como fase terminal de los procesos de cristalizacin, o bien para el secado de caldos en la produccin masiva de algunos productos.
Captulo 12 Cristalizacin
12.1 Introduccin
La operacin de cristalizacin consiste en separar un soluto de una solucin mediante la formacin de cristales de ste en el seno de la solucin. Una vez formados los cristales se separan de la solucin obtenindose el soluto con un alto grado de pureza. Durante el proceso de cristalizacin los cristales deben formarse primero y luego crecer. Al fenmeno de formacin de pequeos cristales se le llama nucleacin y a la formacin capa por capa del cristal se le llama crecimiento. La sobresaturacin es la fuerza impulsora tanto de la nucleacin como del crecimiento de los cristales. Si la solucin slo est saturada los cristales no se transforman ni crecen, mientras que si est subsaturada stos tienden a disolverse. La cristalizacin es ampliamente utilizada a nivel industrial para recuperar sales como cloruro de sodio y sulfato de amonio a partir de soluciones acuosas. Algunas sustancias orgnicas como la sacarosa y la glucosa tambin son obtenidas mediante procesos que involucran una operacin de cristalizacin. Varios productos biotecnolgicos de uso masivo como algunos antibiticos y cidos orgnicos, as como algunos productos teraputicos, son comercializados en forma de cristales. Esta diversidad de procesos se traduce en una gran variabilidad en la capacidad de los cristalizadores
665
666
CAPTULO 12.
CRISTALIZACIN
industriales que oscila de gramos a cientos de toneladas por da. La cristalizacin es una operacin ampliamente utilizada en los procesos biotecnolgicos debido a que ofrece las siguientes ventajas: - Se puede obtener en una sola etapa un producto de una pureza de hasta un 99 %. - Se puede controlar la cristalizacin de tal manera que se produzcan cristales uniformes que faciliten su manejo, empaque y almacenamiento. - La cristalizacin mejora la apariencia del producto para su comercializacin. - Es una operacin que puede llevarse a cabo a temperaturas moderadas. Frecuentemente la operacin de cristalizacin va acompaada de un lavado de los cristales en un equipo de separacin slido-lquido y de un secado final, en un arreglo como el mostrado en la Figura 12.1. El diseo apropiado del cristalizador es esencial en el funcionamiento de todo el arreglo anterior debido a que el tamao de los cristales y la concentracin de estos en la solucin de salida, son determinados en gran medida en la operacin de cristalizacin; a su vez estos parmetros determinan el diseo del separador slido-lquido y del secador. La cristalizacin es en gran medida un arte mas que una ciencia; sin embargo, el conocimiento actual de los mecanismos de formacin y crecimiento de los cristales, y de la fuerza impulsora de stos, la sobresaturacin, permite abordar el crecimiento de cristales de una manera ms cientfica. La estrategia para el diseo de cristalizadores comprende el establecimiento de las relaciones de equilibrio, la forma de operar del cristalizador (el mtodo para generar la sobresaturacin) y el estilo de cristalizador que se va emplear. Una vez obtenido el diseo conceptual del cristalizador, el problema de diseo restante consiste en determinar el diseo funcional que permita satisfacer los requerimientos de tamao de cristal mediante el estudio cintico del sistema (Figura 12.2).
12.1.
INTRODUCCIN
667
Alimentacin -
Solvente de lavado
Fase
-soiwnt*
., .. H-Soluto disiMlto liquida 1-impur.as
Solvente
Producto seco
Figura 12.1: Esquema de un sistema de cristalizacin. Adaptada de: Moyers y Rousseau, 1987.
668
CAPTULO 12.
CRISTALIZACIN
Equilibrio - Seleccin del solventa - Sobresaturacin
Modos de Operacin - Generacin de sobresaturacin -Presin - Temperatura - Composicin
Tipo de Cristalizador - Flujo de vapor - Presin de operacin -Tratamiento dla suspensin -Tamao del producto
Cintica Diseo Funcional -Dimetro Tiempo de residencia -Velocidad de circulacin -Materiales -Equipo auxiliar
Figura 12.2: Estrategia de diseo de un cristalizador. Adaptada de Moyers y Rousseau, 1987.

Reproducida con el permiso de John Wiley and Sons. Copyright 1987. Todos los derecho reservados.
2.2. FUNDAMENTOS
669
Para abordar los aspectos relacionados con la cristalizacin en la eccin 12.2 de este captulo se revisan los fundamentos de la cristaliacin: el equilibrio, los modos como se puede efectuar una operacin le cristalizacin y la cintica de la cristalizacin. En la seccin 12.3 e describen los equipos de cristalizacin ms empleados. El diseo de :ristalizadores se presenta en la seccin 12.4.
12.2
Fundamentos
Para evaluar el uso de la cristalizacin como alternativa para la purificacin de un producto es necesario contar con determinada informacin bsica relacionada con el producto y sus soluciones como: Tipo de cristales que forma el producto. Pureza de los cristales que forma el producto. Equilibrio: Solubilidad y sobresaturacin de soluciones del soluto en agua u otro solvente. Modos de operacin posibles para generar la sobresaturacin de la solucin del soluto. Cintica: Velocidad con que se originan (nucleacin) y crecen los cristales en la solucin. Distribucin de tamaos en poblaciones de los cristales.
12.2.1
Tipos de Cristales
Un cristal es un slido compuesto por tomos, iones o molculas dispuestos en un arreglo tridimensional ordenado y peridico, o retcula espacial. La distancia entre los tomos del cristal de cualquier material es constante y caracterstica de dicho material. Los ngulos entre las caras de los cristales tambin son caractersticos y dan origen a cinco tipos bsicos de cristales y a siete sistemas cristalogrficos. En el
670
CAPTULO 12.
CRISTALIZACIN
sistema ms sencillo, el sistema cristalogrfico cbico, tanto las distancias caractersticas (largo, ancho y alto) como los tres ngulos caractersticos son iguales. Otros tipos de sistemas difieren de este comportamiento originando los sistemas tetragonal, ortorrmbico, hexagonal monoclnico, triclnico y trigonal. Desde el punto de vista industrial el trmino "habitat del cristal" se refiere a los tamaos relativos de las caras del cristal. El habitat de un cristal es de gran importancia: los cristales largos como agujas se rompen muy fcilmente durante su centrifugacin y secado; los cristales en forma de disco son difciles de lavar durante su centrifugacin y difciles de filtrar. Los cristales esfricos son los ms fciles de manejar.
12.2.2
Pureza de los Cristales
La mayora de las soluciones cuando forman cristales a velocidades de crecimiento moderadas y a condiciones constantes, los cristales formados slo contienen un componente alcanzado purezas hasta de 99.8 %. Las impurezas de los cristales generalmente son debidas al atrapamiento de lquido en el cristal en pequeas bolsas u oclusiones. Adems de este tipo de impureza, normalmente despus de la separacin de los cristales de la solucin, parte de la solucin queda adherida a la superficie del cristal, lo que hace necesario lavar los cristales. La separacin alcanzada en una cristalizacin puede ser caracterizada mediante la distribuccin del soluto y las impurezas entre las fases, de acuerdo a la siguiente ecuacin:
^=fi donde: ( 12J )
masa de soluto A en el producto masa de soluto A en la f a s e liquida de manera similar para la impureza B,
> masa de impureza B en el producto masa de impureza B en la fase liquida
n o (12.
12.2. FUNDAMENTOS
671
El grado de separacin o selectividad del proceso es ms efectivo conforme (3 aumenta. El factor de cristalizacin E (anlogo al factor de extraccin) depende de la naturaleza del sistema solvente-solutoimpurezas, de las condiciones de temperatura y presin a las que se realice la cristalizacin, y del grado de saturacin (sobresaturacin) con que se realice la operacin.
12.2.3
Equilibrio: Solubilidad y Sobresaturacin
Solubilidad Las relaciones de equilibrio para los sistemas de cristalizacin se presentan en forma de curvas de solubilidad (Figura 12.3). En estas curvas la solubilidad se expresa comnmente en porciento de peso de soluto a peso de solvente. Las curvas de solubilidad representan la solubilidad de soluciones saturadas a diferentes temperaturas. Esta solubilidad es la mxima que puede alcanzar la solucin en forma termodinmicamente estable. La saturacin es resultado del equilibrio entre la fase slida y la fase lquida, y consecuencia de la igualacin de sus potenciales qumicos. Los datos experimentales de equilibrio sirven de base para la evaluacin de las diversas opciones que existen para llevar a cabo un proceso de cristalizacin ya que permiten entre otras cosas: - Determinar si el slido que se cristaliza slo contiene el soluto de inters. - Seleccionar el solvente. - Establecer el rango de temperatura y presin de operacin. - Conocer la concentracin del lquido de salida del cristalizador. - Determinar la recuperacin mxima posible de la operacin. Con ayuda de la Figura 12.3 se pueden describir algunos comportamientos generales de la solubilidad de las sustancias en funcin de la temperatura.
672
CAPTULO 12.
CRISTALIZACIN
150 h
Glutamato Monosdico
% peso
Acido Adpico
90
Temperatura C
Figura 12.3: Curva de solubilidad. Tomada de: Belter ti al, 1988.

12.2.
FUNDAMENTOS
673
- Existen sustancias como la hexametilentetramina cuya solubilidad no vara apreciablemente con la temperatura. - Otras sustancias como el cido fumrico muestran un incremento moderado en solubilidad con respecto a la temperatura. - Algunas sustancias como el cido adpico y el glutamato monosdico muestran una gran dependencia de su solubilidad con la temperatura. El conocimiento del comportamiento de la solubilidad de una sustancia es bsico en la seleccin del modo para realizar su cristalizacin: Es factible obtener cristales de cido adpico por enfriamiento de una solucin de ste, pero no es factible obtener cristales de hexametilentetramina por este mismo mtodo. Ejemplo 12.1.- Solubilidad de 1-serina. Se determin la solubilidad de 1-serina (Charmolue y Rousseau, 1991) en agua en el rango de 35 - 50(7. Los datos experimentales se ajustaron a la recta dada por: S= 146.13 + 80.834 T donde T es la temperatura en grados centgrados y S es la solubilidad de la 1-serina en g/lOOO g de agua. La solubilidad de 1-serina tambin fue obtenida a partir de la teora de las soluciones ideales que es aplicable a sistemas donde existe similitud qumica entre el soluto y el solvente, y se expresa como:
donde: X>2'. Fraccin mol de soluto en la saturacin. A//^: Entalpia de fusin en el punto de fusin. Tm: Temperatura de fusin en grados Kelvin.
674
CAPTULO 12.
CRISTALIZACIN
T: Temperatura en grados Kelvin. Para 1-serina la temperatura de fusin Tm es de 501 K y la entalpia de fusin A//^ se ha estimado en 4,230.82 cal/g-mol. A partir de la informacin anterior comparar los resultados experimentales con los derivados de la teora de las soluciones ideales para 1-serina.
Solucin:
Sustituyendo valores en la ecuacin de las soluciones ideales se tiene:
i
A
4,230.82-^-7 ' gmol

ca 1.987 gmolJ\ OK
~X~2 ~
x 501/\ \N f ~ ' )
I/sol ""-1 7
.. \ \
de tal manera que:

A 2 = exp
La solubilidad S en g/1000 g de agua puede obtenerse mediante la expresin:

S = (M
/1000A / >\-.
X2
donde MI= 18 y M2=105.1, son los pesos moleculares del agua y la 1-serina , respectivamente; con estos valores la expresin anterior puede ser escrita como:
5-5,838.89
combinando ambas expresiones, la solubilidad terica de la 1-serina
es:
O
5,838.89
exp [4.25 (^ - 1)] - 1
En la Figura 12.4 se muestra una comparacin de los datos experimentales de solubilidad de 1-serina con los que predice la teora de las soluciones ideales.
12.2.
FUNDAMENTOS
675
Temperatura *C
Figura 12.4: Solubilidad de 1-serina. Rousseau, 1991.

1991. Todos los derechos reservados.
Tomada de: Charmolue y
Reproducida con el permiso del American Institute of Chemical Engineers. Copyright AIChE
Sobresaturacin Pudiera pensarse que una solucin con una concentracin de soluto mayor a la de saturacin forma inmediatamente cristales pequeos o ncleos. Sin embargo, actualmente es bien conocido que bajo diferentes condiciones una solucin puede contener ms soluto que el correspondiente a la saturacin, formando lo que se conoce como solucin sobresaturada. El estudio del fenmeno de sobresaturacin es fundamental en el diseo de cristalizadores. La curva de solubilidad (Figura 12.5) separa dos regiones: la regin de subsaturacin donde una solucin es capaz de disolver ms soluto a las condiciones dadas, y la regin de sobresaturacin. El comportamiento de las soluciones en la regin de sobresaturacin fue descrito por H.A. Miers a fines de los aos veinte. Estos estudios han conducido a dividir la regin de sobresaturacin en tres zonas cuya delimitacin no es muy precisa. - La regin metaestable, donde el soluto en exceso a la concentracin de equilibrio se deposita en cristales ya existentes (sembrados o formados por nucleacin) pero no forma cristales nuevos o ncleos.
676
CAPTULO 12.
CRISTALIZACIN
Regin sobresaturada
Regin subsaturada
Peso de soluto
Solubilidad
Regin de operacin intermitente Regin de operacin continua Temperatura
Figura 12.5: Zonas de sobresaturacin, a) Metaestable b) Intermedia c) Lbil. - La regin intermedia, donde el soluto en exceso a la concentracin de equilibrio se deposita en cristales existentes y forma nuevos cristales o ncleos . - La regin lbil, donde la formacin de cristales nuevos o ncleo ocurre en forma espontanea a partir de una solucin que no contiene cristales o semillas. A diferencia de la solubilidad de equilibrio, los limites de estas tres zonas se controlan no slo por el equilibrio, sino tambin por los parmetros del proceso como el grado de agitacin. El conocimiento de la regin de sobresaturacin permite determinar regiones de operacin. En el caso de una operacin intermitente, con el propsito de lograr un tamao de cristal lo ms uniforme posible, el grado de sobresaturacin se mantiene en la regin metaestable, de tal manera que la sobresaturacin generada sirva para el crecimiento de los cristales ya existentes (sembrados) y no exista formacin de cristales nuevos.
12.2. FUNDAMENTOS
677
En una cristalizacin continua la sobresaturacin debe ser mantenida en el limite inferior de la regin intermedia, de tal manera que el nmero de cristales que se retiran en la corriente de salida sea igual al nmero de cristales generados por nucleacin. Adems es necesario proveer un mecanismo de clasificacin de cristales, de tal manera que slo se retiren cristales de un mismo tamao. Esto se logra utilizando un lecho fluidizado de cristales, el cual proporciona una rea adecuada para remover la sobresaturacin mediante el crecimiento de los cristales.
12.2.4
Seleccin del Modo de Operacin
El modo de operacin en una cristalizacin es la tcnica empleada para generar la sobresaturacin de la solucin. La seleccin del modo de operacin est fuertemente influenciada por las caractersticas de la solubilidad en equilibrio del sistema. Una vez que se ha seleccionado el modo de operacin del cristalizador es posible desarrollar los balances de masa y energa del sistema. Los principales modos para generar la sobresaturacin (Figura 12.6) son los siguientes: - Sobresaturacin por enfiamiento. - Sobresaturacin por enfriamiento evaporativo. - Sobresaturacin por evaporacin trmica. - Sobresaturacin por evaporacin trmica al vaco. Sobresaturacin por Enfriamiento Cuando la solubilidad del soluto vara sensiblemente con la temperatura, el enfriamiento de la solucin a tratar permite la formacin de cristales con altos rendimientos y bajo consumo energtico. Este enfriamiento puede realizarse en forma externa mediante un intercambiador, o directamente utilizando un lquido refrigerante inmiscible con la solucin y con propiedades termodinmicas que minimicen el trabajo de compresin necesario. En este tipo de operacin la evaporacin de solvente es mnima.
678
CAPTULO 12.
CRISTALIZACIN
f~
n
1
-V.
I Refrigerante
r j V ^ - Vacio
Alimentacin
V Y
Refrigerante Producto
< /
\
Alimentacin
/
(
i
Condnsado
V / \ /
f k,
Alimentacin
Vapor Producto
Figura 12.6: Modos para generar sobresaturacin. A) Enfriamiento B) Enfriamiento evaporativo C) Evaporacin trmica D) Evaporacin trmica al vaco. Adaptada de: Moyers y Rousseau, 1987.
12.2. FUNDAMENTOS Sobresaturacin por Enfriamiento Evaporativo
679
En este modo el enfriamiento se produce con auxilio de un sistema de vaco. La alimentacin entra a una temperatura mayor que la mantenida en el cristalizador enfrindose adiabticamente dentro de ste. Este modo tambin es aplicable cuando la solubilidad del soluto es muy sensible a la temperatura. Sobresaturacin por Evaporacin Trmica En este modo se transfiere calor al sistema para evaporar solvente y generar la formacin de cristales por "salting out". Este modo se emplea slo cuando la solubilidad del soluto es insensible a la temperatura. Sobresaturacin por Evaporacin Trmica al Vaco En este modo la alimentacin tiene una temperatura mayor que la mantenida en el cristalizador y al entrar se enfra adiabticamente. Paralelamente se transfiere calor al sistema para evaporar solvente con auxilio de un sistema de vaco. Este modo es empleado para la cristalizacin de solutos cuya solubilidad tiene una dependencia intermedia respecto a la temperatura.
12.2.5
Cintica de la Cristalizacin
Los fenmenos cinticos asociados a la cristalizacin son la nucleacin o formacin de cristales nuevos, y el crecimiento de stos. La fuerza impulsora de ambos fenmenos es la sobresaturacin. A niveles elevados de sobresaturacin ambos fenmenos compiten por el soluto disponible. Nucleacin La velocidad de nucleacin afecta el tamao que los cristales pueden alcanzar en un cristalizador intermitente. Conforme mayor sea la velocidad de nucleacin menor es el tamao de los cristales obtenidos. En el caso de una cristalizacin continua el aumento de la velocidad de nucleacin se traduce en un mayor tiempo de residencia de los cristales. Existen dos mecanismos de formacin de cristales:
680
CAPTULO 12.
CRISTALIZACIN
- Nucleacin primaria. En la nucleacin primaria el cristal nuevo se origina espontneamente a partir de la solucin sobresaturada (nucleacin homognea) o bien se origina a partir de un material insoluble, ya sean impurezas o cristales del mismo material previamente sembrados. - Nucleacin secundaria. Es la formacin de cristales nuevos como resultado de la presencia de cristales ya crecidos de soluto, y puede originarse por medio de varios mecanismos: - Sembrado. Al colocarse cristales del material en una solucin sobresaturada, se piensa que el cristal libera pequeos cristales que se formaron durante el proceso de secado y que dan origen a nuevos cristales. - Contacto. Consiste en la produccin de cristales nuevos mediante el rompimiento de los cristales por choques entre s o con las diferentes partes del equipo: tanque, bombas y agitadores. - Esfuerzo cortante. Cuando la solucin sobresaturada fluye sobre la superficie de los cristales se considera que puede despegar segmentos de cristal, que pueden a su vez originar nuevos cristales. La velocidad de nucleacin es funcin de la sobresaturacin y del mecanismo que la origina. En general se observa que la dependencia de la velocidad de nucleacin primaria con la sobresaturacin es de mayor orden que la de la velocidad de nucleacin secundaria. Esto se muestra en la Figura 12.7 en forma cualitativa. La mayora de los cristalizadores operan en la regin de baja sobresaturacin para que el crecimiento del cristal sea regular y el producto puro. Por tal motivo la nucleacin secundaria es la ms empleada a nivel industrial. Por otro lado, los mecanismos para controlar la nucleacin secundaria pueden establecerse con relativa facilidad a ese nivel. Ante la carencia de una descripcin matemtica detallada que englobe los diferentes mecanismos de nucleacin posibles, la velocidad
12.2.
FUNDAMENTOS
681
Velocidad de nudeacin primaria
Nmero Tiempo
Velocidad de nudeacin secundaria
Sobresaturacin
Figura 12.7: Influencia de la sobresaturacin sobre la velocidad de nucleacin. Adaptada de: Moyers y Rousseau, 1987.
682
CAPTULO 12.
CRISTALIZACIN
de nucleacin generalmente se expresa por medio de una correlacin emprica de la siguiente forma:
dN B= = kn(c-c*)1
(12.4)
donde: B: Velocidad de nucleacin. [Ncleos/- volumen de solvente]. kn: Parmetro emprico. i: Parmetro emprico. c c*: Sobresaturacin. [M/L3]. [M/L3].
c: Concentracin de soluto en la solucin.
c*: Concentracin de saturacin del soluto. [M/L3]. N: Nmero de ncleos por unidad de volumen de solvente. [M/L3]. Crecimiento El crecimiento de cristales es un fenmeno cuya fuerza impulsora tambin es la sobresaturacin. El crecimiento de un cristal es un proceso de adicin capa por capa. En la Figura 12.8 se muestra el proceso donde un cristal cbico ideal crece por adicin de pequeos cubos sobre su superficie. El crecimiento slo puede ocurrir en la superficie del cristal y las resistencias involucradas en el crecimiento son la de la difusin del soluto hasta la superficie del cristal y la resistencia a la integracin del soluto a la superficie del cristal; dado que estas resistencias actan en serie, la velocidad de crecimiento de un cristal se puede expresar en forma emprica como: = KcA(c-c') en la ecuacin anterior Kc est dada por: (12.5)
12.2.
FUNDAMENTOS
683
Figura 12.8: Crecimiento de un cristal. Tomada de: Bennett, 1973.

JL kL
J_
ks
(12.6)
donde: Mc: Masa de un cristal. [M]. t: Tiempo, [t]. Kc: Coeficiente global de transferencia de masa. [L/.t], ki,: Coeficiente transferencia de masa en la pelcula. [L/t]. ks: Velocidad especfica de integracin del soluto a la superficie del cristal. [L/t]. c c*: Sobresaturacin. A: rea del cristal. [L2]. Es importante hacer notar que la expresin de la cintica del crecimiento es de primer orden, a diferencia de la expresin de la velocidad de nucleacin cuyo orden es variable. [M/L3].
684
CAPTULO 12.
CRISTALIZACIN
En sistemas no agitados la velocidad de crecimiento est controlada por la difusin y el trmino l/ks se cancela de la ecuacin (12.6). Cuando la velocidad de agitacin es alta el trmino I/&L es el que puede ser despreciado. El coeficiente &/, es funcin de algunos parmetros como la agitacin y la viscosidad del medio, mientras que ks no lo es. Por otro lado, ki vara ligeramente con la temperatura, mientras que k$ generalmente es un funcin exponencial de sta, y puede cambiar dramticamente durante un proceso de enfriamiento. Uno de los objetivos de la cristalizacin es producir cristales de tamao uniforme, por tal motivo la velocidad de crecimiento de un cristal generalmente se asocia a una longitud caracterstica medible. Esta longitud puede ser determinada por varios mtodos, siendo el ms utilizado el del tamizado de los cristales bajo estudio. Se puede asociar la velocidad de crecimiento de un cristal expresada en unidades de masa por unidad de tiempo, con una velocidad expresada en longitud por unidad de tiempo, partiendo de la siguiente relacin conocida: Mc = PcVc (12.7)
donde pc y Vc son la densidad y el volumen de un cristal, respectivamente. Si se supone que el cristal mantiene una similitud geomtrica durante su crecimiento, una longitud caracterstica del cristal que sea seleccionada mantendr un proporcin constante con las otras dimensiones. En base a lo anterior la ecuacin (12.7) puede ser expresada en funcin de esta longitud caracterstica de la siguiente manera: Mc = pc(<f>vl3) (12.8) donde (f>y es un factor geomtrico que relaciona la longitud caracterstica / del cristal, con su volumen. De igual manera el rea del cristal puede relacionarse con la longitud caracterstica mediante: A = <]>Al2 donde ^ es un factor geomtrico de rea. (12.9)
12.2. FUNDAMENTOS
685
Ejemplo 12.2.- Longitud caracterstica y factores geomtricos. Determinar la longitud caracterstica y los fatores geomtricos de volumen y rea para: a) Una esfera. b) Un cubo. Solucin: a) El rea de la esfera de dimetro d es:
A = xd2
el volumen,
de tal manera que:
V = ~
b) En el caso de un cubo de lado L,
A = 6L*
V = L3
de tal manera que: <>A - 6

tv = 1 /=
686
CAPTULO 12. CRISTALIZACIN
Se puede combinar la ecuacin (12.5) con las ecuaciones (12.8) y (12.9) para obtener una expresin de la velocidad del crecimiento de un cristal en funcin de una longitud caracterstica, r)(c-c*)
UrC/
(12.10)
o bien, (12.11)
PcJ \$Vj\ '
La ecuacin (12.11) puede escribirse en forma simplificada de la siguiente manera:
donde kg es la constante cintica de crecimiento de un cristal. La velocidad de crecimiento expresada en funcin de una longitud caracterstica se simboliza como (7, de tal manera que:
G = kg(c-cf)
(12.13)
Las ecuaciones (12.4) y (12.13) describen la velocidad de formacin y crecimiento de cristales, respectivamente. Ambos fenmenos dependen de la sobresaturacin pero son independiente del tamao de los cristales ya formados. Ley Delta L: AL Se ha demostrado experimentalmente que todos los cristales de un material que son geomtricamente similares, cuando crecen en una misma solucin crecen a una velocidad constante e igual para todos los tamaos de cristal, cuando la velocidad es medida en funcin de una longitud caracterstica. Es decir este tipo de cristales cumplen con la ecuacin (12.13).
12.2.
FUNDAMENTOS
Nmero Volumen
Tamao de cristal, I
Figura 12.9: Curva de densidad poblacional. Adaptada de: Belter et al, 1988.
12.2.6
Distribucin de Tamao en Poblaciones de Cristales
Para caracterizar una operacin de cristalizacin tambin es necesario describir la distribucin del tamao de los cristales en una suspensin o "magma". Este tipo de distribucin es necesaria para realizar los balances de masa y energa en los cristalizadores. La distribucin de tamaos de una poblacin de cristales, generalmente se describe por medio de una curva de densidad poblacional como la que se muestra en la Figura 12.9. Un punto sobre la curva relaciona a i con yVt-, donde lt es una longitud dada de cristal y Nr es el nmero ce cristales por unidad de volumen de solvente con una longitud entre O y I i.
La p e n d i e n t e de la curva p e r m i t e obtener la densidad poblacional // q u e es u n a m e d i d a d e l n m e r o d e c r i s t a l e s p u r u n i d < t d de v o l u m e n e n un i n t e r v a l o diferencial de l o n g i t u d : es decir.
688
CAPTULO 12.
lim
A TV dN
CRISTALIZACIN
(12 14 A/ÔA/ di ' ' El uso apropiado de la variable densidad de poblacin n permite estimar importantes caractersticas de una poblacin de cristales, mediante los momentos fraccionarios de esta distribucin. De acuerdo a la definicin de momentos de una distribucin, el momento fraccionario k de la distribucin de tamas de cristales est dado por:
n=
fllkn(l)dl
Jo
o . f ck * l n(l)dl
(12-15)
donde n(l] es la densidad poblacional para el tamao /. Los casos particulares de inters son: Para k = O, el momento fraccionario //o representa la fraccin del nmero de cristales de una poblacin que tiene un tamao entre O y/,
*> = r~ \yu/
J0
n l dl
fln(l)dl
()
Para k = 1, el momento fraccionario JL\ es la fraccin que representa la suma de las longitudes de los cristales de tamao entre O y /, de la longitud total de los cristales de una poblacin.
Para k = 2, el momento fraccionario ^ 2 es 1a fraccin que representa la suma del rea de los cristales de tamao entre O y /, del rea total de una poblacin de cristales.
.
</>AJo
f oo / 2 2
I n(l)dl
(12.18J
12.3. EQUIPO DE CRISTALIZACIN
689
Para k = 3, el momento fraccionario ;/3 es la fraccin que representa la masa de los cristales de tamao entre O y /, de la. masa total de una poblacin de cristales .
pc<t>v Jo fll3n(l)dl v 3 ' ,/ f- ~ I roo n 3 ,'n ,, pc(l)v J0 I n(l)dl
(19 ( J Z .1Q^ iyj
12.3
Equipo de Cristalizacin
La seleccin del tipo de cristalizador est influenciada tanto por el volumen de produccin como por el modo de operacin seleccionado. En general los equipos de cristalizacin pueden operar en dos formas: Intermitente Continua.
12.3.1
Cristalizadores Intermitentes
Los cristalizadores intermitentes son tanques agitados con sistemas de vaco y enfriamiento (Figura 12.10). El ciclo de la cristalizacin dura entre 2 y 8 horas. Al final del ciclo, el material cristalizado se retira del cristalizador para lavarse y secarse. La mayora de los productos biotecnolgicos que involucran una cristalizacin se obtienen en forma intermitente.
12.3.2
Cristalizadores Continuos
Existen tres tipos bsicos de cristalizadores continuos: Cristalizador-Evaporador con circulacin de lquido (tambin llamado cristalizador con clasificarin de la suspensin o tipo Oslo).
690
CAPTULO 12.
CRISTALIZACIN
Condensador baromtrico"
Vapor
Agua Vapor
Eyector de dos etapas Alimentacin
Agitador de propela
Vlvula de descarga
Figura 12.10: Cristalizador intermitente. Adaptada de: Bennett, 1988.

12.3. EQ UlPO DE CRISTA LIZA ClON
691
Alimentacin
Figura 12.11: Cristalizador-Evaporador con circulacin de lquido. Adaptada de: Bennett, 1988.
Cristalizador-Evaporador con Circulacin de Lquido En el cristalizador-evaporador con circulacin de lquido (Figura 12.11) la sobresaturacin se produce por evaporacin. La alimentacin concentrada y caliente se mezcla con la corriente de recirculacin y se bombea a la cmara de evaporacin donde el solvente se evapora adiabticamente con ayuda de un sistema de vaco. El lquido sobresalurado fluye hacia la parte inferior del cristalizador a travs de un tubo de bajada y despus hacia arriba a travs de un lecho fluidizado de cristales que permite una liberacin efectiva de la sobresaturacin. Los cristales ms grandes sedimentan y son retirados por el fondo del cristalizador. Los cristales ms finos pueden ser retirados por la parte superior para incrementar el tamao de los cristales. Cristalizador al Vaco y Circulacin Forzada de Magma
'J c n s t a . i i / a d o r al vaco v c i r c u l a c i n (orzada de- n a e n - a i l ' i i ' u r a l ' . i l : f a i b i ' 1 ! ! conocido r ( M i ) u c n . M . a i i / a d o r c o n R e m o c i n < ! ' P r o d ^ c n M e "ado v S n s p c n s i i > : ! M c / e j ^ , i; h'l ' M S \! ' a. i--''O < ' < ! ; ; c u * : ; . . ; m >
692
CAPTULO 12.
No condontabtos
CRISTALIZACIN
Enfrxted*
V*p<K
I
Intercambiado?
Figura 12.12: Cristalizador al vaco y circulacin forzada de magma . Adaptada de: Bennett, 1988.
apropiado para retener los cristales en crecimiento. La alimentacin se mezcla con la corriente de salida del cuerpo principal y se hace pasar por un intercambiador donde se eleva su temperatura entre 2 y 6 C. La suspensin en la superficie del cristalizador libera parte ;del solvente producindose la sobresaturacin.
Cristalizador con Tubo de Tiro y Mampara En el cristalizador con tubo de tiro y mampara (Figura 12.13), los cristales de mayor tamao que sedimentan en el fondo del cristalizador son impulsados hacia la regin superior donde se efecta la evaporacin y se origina la sobresaturacin, mediante un impulsor grande que se mueve a bajas velocidades. Una mampara externa al tubo de tiro permite formar una zona de sedimentacin externa, a partir de la cual los cristales finos pueden ser retirados para incrementar el tamao del cristal. La alimentacin mezclada con la corriente de finos se hace pasar por un intercambiador de calor y se introduce por la parte inferior del cristalizador.
12.4. DISEO DE
CIUSTALIZAUItM
Figura 12.13: Cristalizador con tubo de tiro y mampara. Adaptada de: Bennett, 1988.
Reproducida con el permiso de Me Gravv Hill Inc. Copyright 1988. Todos los derechos reservados.
12.4
Diseo de Cristalizadores
Actualmente se han logrado avances importantes en la modelacin de cristalizadores para su anlisis, diseo y optimizacin, en aplicaciones a situaciones de importancia i n d u s t r i a l . Sin embargo, existen an varias limitaciones debido a lo complejo que resulta describir de manera racional la forma como se relacionan los fenmenos de nucleacin y crecimiento de cristales, con las variables de operacin y la configuracin de los cristalizadores. En esta, seccin se describe como se c o m b i n a n los balances poblacionales de cristales, los balances de masa y los balances de energa, en el diseo de tres sistemas de inters en c r i s t a l i z a c i n : * (Yista.bzadur c
694
CAPTULO 12.
CRISTALIZACIN
Q *
Figura 12.14: Esquema de un cristalizador continuo.
12.4.1
Cristalizador Continuo
La Figura 12.14 muestra un esquema de un cristalizador continuo perfectamente agitado operando en modo "cristalizacin por enfriamiento". El cristalizador es alimentado continuamente con un flujo volumtrico de solvente F que presenta una concentracin y A de soluto disuelto por volumen de solvente. La distribucin del tamao de los cristales a la entrada est dada por n^. El cristalizador contiene un volumen V de solvente, con una concentracin de soluto disuelto por volumen de solvente y y una distribucin de tamao de cristales caracterizada como n. Como el cristalizador est perfectamente agitado el flujo volumtrico de solvente a la salida F tambin est caracterizado por y y n. Balance Poblacional Los balances poblacionales de cristales consideran que el nmero de cristales es una cantidad balanceable. En estos balances se supone que los cristales son lo suficientemente numerosos y pequeos, de tal manera que su distribucin de tamao puede considerarse una funcin continua de la longitud caracterstica o tamao del cristal. Se supone adems en el siguiente caso que no ocurre rompimiento ni aglomeracin
12.4. DISEO DE CRISTALIZADORES
(>95
de cristales. El balance poblacional de cristales en el cristalizador continuo considerando slo los cristales en un rango de tamao di l / i , puede expresarse en palabras como: [La variacin con el tiempo, al interior del cristalizador, del nmero de cristales de tamao en el rango di.} es igual a [La velocidad de e n t r a d a de cristales de t a m a o en el rango di en la a l i m e n t acin.] menos [La, velocidad de salida de cristales de tamao en el rango di del cristalizador.] ms [El nmero de cristales por unidad de tiempo que al crecer en el cristalizador entran al rango de tamao di.} menos [El nmero de cristales por unidad de tiempo que al crecer en el cristalizador salen del rango de tamao di.} lo cual se expresa matemticamente como:
j-t(Vn) = FAnA -Fu- V^^-
(12.20)
La ecuacin anterior ha sido resuelta para algunos casos de inters particular como el que se describe a continuacin. Cristalizador Continuo con Remocin de Producto Mezclado - Suspensin Mezclada. (RPMSM).- La ecuacin (12.20) ha sido resuelta para un caso p a r t i c u l a r de cristalizador continuo bien agitado llamado: Remocin de Producto Mezclado - Suspensin Mezclada (RPMSM). que est sujeto a las siguientes restricciones: - El cristalizador opera en estado estacionario, por lo que:
696
nA=0
(12.22)
- El crecimiento de cristales al interior del cristalizador sigue la ley de A/, es decir
dG
aT =
(12.23)
en base a lo anterior, el ltimo trmino de la ecuacin (12.20) puede expresarse de la siguiente manera:
d(nG) dG ^dn fin -~~ = n-T + G = G
(12.24)
'
- El cristalizador est perfectamente agitado y no existen prdidas de solvente. - El volumen es constante. - No existe variacin del nmero de cristales por aglomeracin o rompimiento. Si estas restricciones se aplican la ecuacin (12.20) con las ecuaciones (12.21) - (12.24) se transforma en : 0 (1,25)
como el tiempo de residencia promedio en el cristalizador est dado por: r = r entonces la ecuacin (12.25) puede ser expresada como: (12.26)
al r Cuando / es muy pequea (tiende a cero) la densidad poblacional n(0) se deriva preferentemente de la nucleacin de nuevos cristales, entonces,
G^ + U- = O
(12.27)
697
E fo n(0) = n = -j|- =
(12.28)
71
La ecuacin (12.28) puede utilizarse como condicin de frontera para la integracin de la, ecuacin (12.27), obtenindose la ecuacin: n = nexp( ~- ) \GT ) o bien, _ /" "xp ~vri i/ ^j
ii
(12.29)
ni ^ 9. o Ifh ^ ui
Como todo modelo la ecuacin (12.30) puede ser utilizada para: - Estimacin de parmetros en un cristalizador RPMSM. - Diseo de cristalizadores RPMSM. Estimacin de parmetros en un cristalizador RPMSM.- La ecuacin (12.30) puede ser utilizada para obtener velocidades de nucleacin y crecimiento de cristales, mediante datos de densidad poblacional obtenidos en un cristalizador RPMSM. Para tal efecto, la ecuacin (12.30) puede rearreglarse para ser expresarse como: (12.31) De acuerdo con la ecuacin anterior los datos experimentales de Inra vs / ajustados a una linea recta, presentarn una pendiente m = (l/Gr) y una ordenada en el origen igual a \n(B/G). El tiempo de residencia en el cristalizador y la pendiente permiten determinar G. La ordenada en el origen conjuntamente con el valor de G permiten determinar B. Existen varias tcnicas para obtener la distribucin de tamao de partculas de una poblacin. Los procedimientos para determinar n a partir de los datos que se generan con las tcnicas, vara con cada una de ellas. Dos tcnicas son de particular inters:
698
CAPTULO 12.
CRISTALIZACIN
- El analizador electrnico de partculas. - El analizador de malla. Analizador electrnico de partculas.- El analizador electrnico de partculas, para determinar el tamao de las mismas mide el cambio de alguna propiedad como difraccin de la luz, dispersin de la luz, bloqueo de luz o conductividad elctrica, conforme la poblacin de partculas fluye por el sensor. El cambio de tales propiedades es funcin del volumen de la partcula, de tal manera que ste es el parmetro que se correlaciona con las mediciones del instrumento. La dimensin caracterstica que se le asigna a cada partcula es la correspondiente al dimetro de una esfera equivalente al volumen medido. Mediante estas determinaciones es posible obtener densidades poblacionales en forma directa o indirecta, dependiendo del equipo. Analizador de mallas.- Los analizadores de mallas consisten en un conjunto de cilindros cortos sin tapa superior y con una malla en el fondo, arreglados verticalmente de mayor a menor tamao de malla. Una vez que se coloca la muestra en el cilindro superior, el sistema se somete a movimiento mecnico, de tal manera que se genere un fenmeno de cribado. Funcionan en seco o en hmedo y proporcionan una distribucin acumulativa de peso. Los cristales del magma bajo estudio requieren cierto tratamiento previo: deben ser filtrados, lavados, secados y durante su manejo debe evitarse su rompimiento. Una vez que se ha cribado la muestra es necesario determinar n a partir de los datos de la masa de cristales acumulada en cada malla, lo cual puede realizarse de acuerdo a la ecuacin (12.14) mediante la siguiente expresin: n= A//9C<M3
(\.6)
donde: T'- Densidad de cristales en el magma (masa de cristales por unidad de volumen de solvente en la suspensin). : Fraccin de la masa total de cristales retenida en una malla.
12.4. DISEO DE CRISTALIZADORES /: Longitud de la abertura de la malla.
699
A/: Intervalo de abertura de malla donde se retienen los cristales. pc\ Densidad de los cristales. <f)v'- Factor geomtrico de volumen. El numerador de la ecuacin (12.32) representa la masa de cristales de tamao promedio /. El denominador contempla la masa de un cristal de tamao promedio / y el intervalo A/. Ejemplo 12.3.- Anlisis de la cristalizacin de urea. Se desea calcular la velocidad de nucleacin y crecimiento en una cristalizacin a partir de una muestra de cristales de urea obtenida en un cristalizador RPMSM, donde la masa de cristales en la suspensin es de 450 g/dm3, la densidad de la urea es de 1.335 g/cm3 y el tiempo de residencia de 3.38 h. El factor geomtrico de volumen <j>v puede considerarse igual a la unidad. En la Tabla 12.1 se presentan los datos del anlisis de mallas practicado a la muestra: en la columna (1) el tamao nominal de la malla, en la columna (2) el porcentaje de masa acumulada en la malla respectiva, en la columna (3) la fraccin masa acumulada entre mallas y en la columna (4) la abertura de la malla en mm. Solucin: De acuerdo con la ecuacin (12.31) es necesario generar una grfica de Inn vs /, para lo cual es necesario utilizar la ecuacin (12.32). Entre la malla 14 y la malla 20 los clculos a realizar son: A/ = 1.19 mm-0.841 mm A/ = 0.349 mm - _ 1.19 mm +0.841 mm 2 / = 1.016 mm de tal manera que mediante la ecuacin (12.32) se obtiene:
700
CAPTULO 12.
CRISTALIZACIN
Tabla 12.1: Datos y clculos del Ejemplo 12.3.

Malla
(1)
14
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
%de masa acumulada
Frac, masa
AW
Tamao abertura malla (mm) 1.190
Longitud promedio
7 (mm)
Incremento
A/ (mm)
(?)
(8) "
Inn
0.044
20 28 35 48 65 100 4.4
1.016 0.841 0.718

0.595 0.508 0.420 0.359 0.297 0.254
0.349 0.246
40,581 533,070 3,566,200 18,795,000 36,865,000 70,703,000
10.61 13.19 15.09 16.75 17.42 18.07
0.144 14.4
0.242
0.175 0.123
0.087
24.2 0.316 31.6 0.155 15.5

0.074
7.4
0.210 0.180 0.149

0.025
0.061
Fondo
2.5
Fuente: Bennett, 1973. Reproducida con el permiso de Me Graw Hill Inc. Copyright 1973. Todos los derechos reservados.
(450 :r)(0.044) (0.349 mm)(1.335 ^)(1)(1,016 mm)' Vloo0mm3 nmero de cristales = 40,581 mm dm3
= 10.61
Los clculos para las otras mallas aparecen en la Tabla 12.1 en las columnas (5), (6), (7) y (8). Los datos de In n vs / se presentan en la forma grfica en la Figura 12.15. Los parmetros de la recta ajustada son:
Pendiente = 9.05 mm: ordenanda en el origen = 19.765
12.4. DISEO DE
CRISTALIZADORES
701
222018 ln(n)
16 14 12 10
0.0
0.2
0.4
I (mm)
0.6
0.8
i.o
Figura 12.15: Cristalizacin de urea.
702
CAPTULO 12.
CRISTALIZACIN
Con estos datos es posible calcular la velocidad de crecimiento y nucleacin de los cristales. a) Velocidad de crecimiento. De acuerdo a la ecuacin (12.31),
_ _ 1 m- -de tal manera que:
G = --_
' (3.38 h)
\ '
b) Velocidad de nucleacin. De acuerdo a la ecuacin (12.28),
B = nG
como: lnn = 19.765 entonces,
ta eS = 3.838 x 108 nmer d C"*3 '
mm dm
y la velocidad de nucleacin es:
.
B
(3.838x10
mm c/77?,3
k
o.0327
k /
ter = l.255xlOTnii" J
Ejemplo 12.4.- Orden de nucleacin. Combinando estudios de laboratorio y estudios piloto, se obtuvieron valores de \& velocidad de crecimiento y nucleacin mediante anlisis con mallas a diferentes tiempos de residencia, manteniendo la masa total
12:4. DISEO DE CRISTALIZADORES Tabla 12.2: Datos del Ejemplo 12.4. Corrida T (min)
1 2 3
0
703
r< ( M \ ImtJ
DO / num. \ ^ ^ cm3 min i
315 630
1,260
0.092 0.042 0.019
13,993 9,960 6,729
Fuente: Moyers y Rousseau, 1987.

de cristales por unidad de volumen constante e igual a 0.84 g/cm3. La densidad de los cristales es de 1.23 g/cm3 y el factor geomtrico de volumen <f>y = 1. Los datos obtenidos se presentan en la Tabla 12.2. Considerando los datos anteriores, derivar una expresin de la variacin de la velocidad de nucleacin con la velocidad de crecimiento.
Solucin:
De acuerdo con las ecuaciones (12.4) y (12.13),
B = kn(c-c*y
combinando estas expresiones se obtiene
B = kN (G)'
G = kg(c-c*)
(12.33)
donde:
k /ir
N
La expresin obtenida en forma logartmica se expresa como:
704
CAPTULO 12.
CRISTALIZACIN
9.69.59.4In(B')
Q3_
9.29.19.08.98.8-4
-3.8
-3.6
-3.4
-3.2 ln(G)
-3.0
-2.8
-2.6
-2.4
Figura 12.16: Orden de nucleacin del Ejemplo 12.4.
ln B ln kjy -f i ln G
de tal manera que los datos de ln B vs ln G se pueden ajustar a una recta de pendiente i y ordenada en el origen ln &/vEn la Figura 12.16 se presenta la grfica correspondiente a los datos de la Tabla 12.2, de la cual se obtiene:
0.46 10.66
de tal manera que,
705
El valor de 0.46 indica una dependencia moderada de la velocidad de nucleacin respecto a G (o a la sobresaturacin). Esto es caracterstico de molculas grandes e indica que el mecanismo de nucleacin no es muy sensible a la sobresaturacin y que la nucleacin secundaria es la dominante. Dado que i es especfico del sistema se supone que este valor no cambia con la escala y puede determinarse mediante experimentos de laboratorio (cristalizador de 4 a 8 dm3). El parmetro &/v es necesario determinarlo en una corrida a nivel piloto o a escala real, ya que es dependiente de la escala. Esto se realiza efectuando un anlisis de mallas a la escala de inters para obtener G y B. Con estos valores y la i determinada en el laboratorio se obtiene UN mediante la ecuacin (12.33). Diseo de cristalizadores RPMSM.- En un RPMSM el tiempo de residencia r es constante y la relacin BG tambin es constante, de tal manera que la densidad poblacional dada por la ecuacin (12.29) est completamente determinada a las condiciones de operacin dadas. Varias caractersticas de diseo de un cristalizador se derivan del uso de la distribucin poblacional dada por la ecuacin (12.29) y de los parmetros G y B que se obtienen mediante experimentacin. A continuacin se presentan algunas de ellas: 1) Momentos. Contando con la expresin de la densidad poblacional y en conjuncin con las expresiones de momentos, se pueden determinan los momentos O, 1, 2 y 3 de la poblacin de cristales. A continuacin se ejemplifica lo anterior mediante el clculo del momento 0. Momento Cero: Fraccin del nmero total de cristales de tamao entre O y /. De acuerdo a la ecuacin (12.16) y la ecuacin (12.29) el nmero total de cristales por unidad de volumen est dado por la expresin:
NT = I n exp ( ) di
Li T
706
CAPTULO 12. la cual puede resolverse para obtener, NT=nGr
CRISTALIZACIN
(12.34)
El nmero de cristales por unidad de volumen de tamao entre O y / es:
./
Ni
Ni = nG> de tal manera que la fraccin del total de la poblacin es:
(12.35)
fraccin J fraccin
nGr (12.36)
1 exp(X)
donde X es una longitud adimensional dada por:
X =
Empleando un procedimiento similar al anterior se pueden obtener los otros momentos. En la Tabla 12.3 se presentan las expresiones de los momentos restantes. 2) Tamao de cristal dominante. La longitud de cristal a la cual la densidad de la masa de cristales es mxima se llama tamao de cristal dominante //> La masa de cristales por unidad de volumen de solvente en un rango de tamao de los cristales est dada por:
12.4. DISEO DE
CRISTALIZADORES
707
Tabla 12.3: Momentos de un cristalizador RPMSM (X = l/Gr). Momento I Significado I Total I Fraccin \-e~A nmero de nGr 0 cristales l - ( l + X)e- A 1 longitud de n(Gr} los cristales l-(l + X+X')e-A 2 rea de los 2^n(Gr) 3 cristales masa de los ^vpcn(GrY 3 l - O + X + ^ + p^Je-* cristales
dM = pc<j>vl3ndl
(12.37)
de la Tabla 12.3 la masa total de cristal por unidad de volumen es: MT 6(j>vpcn(GT^ combinando las dos expresiones anteriores se tiene: (12.38)
dW
di
n 6(<7r) n<
4
(12.39)
donde W es la fraccin masa de cristales. Las ecuaciones (12.29) y la (12.39) conducen a:
dW di
(12.40)
derivando con respecto a / la ecuacin (12.40) e igualando a O se obtiene:
ID
(12.41)
708
CAPTULO 12.
CRISTALIZACIN
Este tamao caracterstico de los cristales frecuentemente es utilizado como base para el diseo de cristalizadores. 3) Coeficiente de variacin. El coeficiente de variacin es una medida de la dispersin de la densidad de masa alrededor del valor ID y est dado por:
En el caso de la distribucin para el RPMSM este valor es aproximadamente del 50%. Tal dispersin es muy amplia para ser aceptable para algunos productos cristalinos como el azcar comn. 4) Densidad del magma. La masa de cristales por unidad de volumen de solvente MT es funcin de los parmetros cinticos n y G (Tabla 12.3), y adems puede ser medida independientemente de la distribucin de tamao de cristales. Debido a lo anterior MT puede ser utilizada para corroborar velocidades de nucleacin y crecimiento estimadas mediante anlisis de mallas. Este procedimiento se muestra en el Ejemplo 12.5. Ejemplo 12.5.- Evaluacin de G y B. En un cristalizador experimental la densidad medida de cristales en el magma es de 450 g/dm3. Los resultados de los anlisis de mallas generan los valores de G = 0.0327 mm/h y B = 1.255 x 107 nmero/dm? h. (Datos del Ejemplo 12.3). La densidad de los cristales es de 1.335 g/cm3 y el tiempo de residencia es de 3.38 h. Comparar la densidad experimental del magma con la estimada a partir del anlisis de mallas. Solucin: De acuerdo a la Tabla 12.3,
MT = 6
12.4. DISEO DE CRISTALIZADORES o bien,
709
MT
a cm3 1.255 x 107 = 6 x 1 x 1.335 x - x cm3 103 mm3 0.0327 ^ n 4 mm \ (0.0327 ^p x3.38 h\
= 458
9
MT
dm3
El valor experimental de MT = 450 g/dm3 y el calculado de 458 g/dm3 sugieren consistencia de los datos. El siguiente ejemplo muestra como una vez obtenidos los parmetros cinticos, stos pueden ser utilizados para caracterizar una cristalizacin. Ejemplo 12.6.- Cristalizacin de sulfato de amonio. Un cristalizador RPMSM de 100 dm3 es alimentado a 50 dm3/h con una solucin sobresaturada de sulfato de amonio. La suspensin de cristales es retirada a un flujo de 50 dm3/h. Los estudios cinticos indican que la velocidad de nucleacin es de de 1.88 x 107 nmero/'dm3 h y la velocidad de crecimiento G es 0.056 mm/h. Los cristales presentan una densidad pc de 1.769 g/cm3 y de acuerdo a su forma <f>y = 1. Estimar : a) El tamao de cristal dominante. b) El nmero de cristales con un tamao menor o igual al tamao dominante. c) La fraccin del nmero de cristales totales con un tamao igual o menor que el tamao dominante.
710
CAPTULO 12.
CRISTALIZACIN
d) La densidad de la suspensin . e) Predecir la fraccin masa de cristales por tamao (utilizar tamaos de mallas estndares).
Solucin:
a) De acuerdo a la ecuacin (12.41) el tamao de cristal dominante
es: ID
3Gr
/ = (3)10.056 (o.
ID = 0.336 mm
dm3 ' 10 50
^r
b) El nmero de cristales TV de tamao igual o menor a ID es:
o 6en,
. -f.
N =
TV =
ndl
(total de cristales)(fraccin en el rango)
de acuerdo a la Tabla 12.3,
TV =
(n0GT)(l-e~x)
y X = -^ = 3
con n = B/G
A^ = sustituyendo valores, /
\
(B0T)(\-e~x)
N N
nurn 1.88 x 10 - 3
7
dm - h
100 dm3 \ . ,. x -51 - e~ 3

50 ^ I
= 3.57 x 107 ""'"
12.4.
DISEO DE CRISTALIZADORES
711
c) De acuerdo a la Tabla 12.3 la fraccin de cristales de tamao en el rango O < / < /D es:
(1 - e~3) = 0.95
d) De acuerdo a la Tabla 12.3 la densidad de la suspensin est dada por: MT = 6</>vpcn(GT)4 sustituyendo valores con n B/G,
,
w x
fr = (6)(1) (1.769
mm
<7 \ /
ero-
\ / 1-88 x 107 3^
1000 mm 3 ; \
X
0.056 =
50 4s
MT = 560 -pam-3 e) De acuerdo a la Tabla 12.3, la fraccin masa de cristales con tamao menor o igual a / es:
Fraccin masa = 1 - (1 -f X + -X2 + -X3)e~x

2 6
de tal manera que la fraccin de masa retenida en la malla de tamao
/ es / v-2 Y3\ Frac, masa retenida = ( 1 -f X -\ 1 1 e~

\ 2 6/
En la Tabla 12.4 se presentan los resultados obtenidos al utilizar la expresin anterior.
12.4.2
Cristalizadores Continuos con Remocin Selectiva
En un cristalizador RPMSM el control de la distribucin de tamao de los cristales es muy limitada. Las velocidades de crecimiento y nucleacin, estn determinadas por las variables de operacin y la geometra del cristalizador.
712
CAPTULO 12.
CRISTALIZACIN
Tabla 12.4: Resultados Ejemplo 12.6 inciso e). Malla Tamao

20
A
~ Gr
( mm) 0.841
Masa retenida. %
5.4
7.51
28 35 48 100
0.595 0.420 0.297

0.149
5.31 3.75 2.65 1.33
22.3 48.3 72.6 95.4
Los cristalizadores continuos pueden hacerse ms flexibles mediante el uso de dispositivos para la remocin selectiva de cristales, lo cual altera el tiempo de residencia de los materiales que salen del cristalizador. La funcin de estos dispositivos puede visualizarse ms fcilmente en trminos de los modelos idealizados: - Modelo de extraccin de lquido. - Modelo de remocin de finos. - Modelo de remocin de gruesos. La extraccin de lquido consiste en la remocin de lquido libre de cristales del cristalizador. Esto provoca un aumento de la densidad de cristales al interior del cristalizador y un aumento en el tiempo de residencia de stos. El objetivo principal en la remocin de finos es la remocin continua de cristales cuyo tamao sea menor al especificado. Despus de ser retirados los cristales se redisuelven y alimentan nuevamente al cristalizador. Esto permite obtener cristales de mayor tamao. La remocin de gruesos consiste en remover los cristales cuyo tamao sea mayor al especificado. Los efectos de cada dispositivo de remocin pueden ser descritos en trminos de la funcin de densidad poblacional n. En el caso de un modelo combinado de remocin ideal de finos y gruesos llamado modelo R-Z , los balances poblacionales conducen (Moyers y Rousseau, 1987) a las tres expresiones de intervalo siguientes:
12. 4. DISEO DE CRISTALIZADORES

1.- Para/ < //: - 1 Gr
713
(12.43)
2.- Para // < / < l
3.- Para / > lc
- donde: //: Tamao mnimo aceptable de los cristales. lc: Tamao mximo aceptable de los cristales. R: ndice de remocin de finos. Z: ndice de remocin de gruesos. Cuando R = 1 no existe remocin de finos, cuando Z = 1 no existe remocin de gruesos. Un cristalizador con remocin tanto de finos como de gruesos, produce una distribucin de cristales con tamao de cristal dominante alto y bajo coeficiente de variacin.
12.4.3
Balances de Masa y Energa en Cristalizadores Continuos
En la optimizacin de un proceso de separacin es necesario calcular la eficiencia en la recuperacin de producto como funcin de las variables de diseo. De acuerdo con la Figura 12.17 en un proceso de cristalizacin el rendimiento estar dado por:
714
CAPTULO 12.
CRISTALIZACIN
Vapor
ntacin
Q <
-? 1
Suspensin: Solucin S Rc Cristales C
Figura 12.17: cristalizador continuo general.
Rend. = donde:
a ~ S Rc
F s1 f*-a *
(12.46)
Fs: Flujo msico de solvente en la alimentacin. [M/i\. Ra: Masa de soluto por masa de solvente en la alimentacin. [M/Mj. 5: Flujo msico de solvente en la suspensin de salida. [M/t]. Rc: Masa de soluto disuelto por masa de solvente en la solucin de salida. [M/M]. Rse: Masa de solvente evaporada por masa de solvente alimentada. [M/M]. C: Flujo msico de cristales en la suspensin de salida. [M/i\. El flujo de solvente Fs y la fraccin masa libre de soluto /?a, generalmente se fijan por las operaciones previas a la cristalizacin. La fraccin masa libre de soluto del soluto disuelto fc, es la solubilidad del soluto en el solvente a la temperatura de operacin. Por lo tanto, el rendimiento puede ser controlado en cierto grado, mediante un control de la temperatura o cambiando el tipo de solvente. Otra variable que puede ser controlada en una cristalizacin es el flujo msico de solvente a la salida 5*, mediante los diferentes modos de operacin de los cristalizadores:
715
- En los sistemas con evaporacin S disminuye debido a la corriente de vapor producido y el rendimiento se incrementa. - En el modo de enfriamiento adiabtico la cantidad de vapor liberada est fijada por los balances de energa. - En los sistemas con evaporacin o en los sistemas combinados de enfriamiento adiabtico con evaporacin, el diseador puede controlar la presin para fijar la temperatura y por lo tanto /?c, as como administrar calor externo para controlar 5, de tal manera que ambos efectos contribuyen a incrementar el rendimiento de la operacin. - Cuando la cristalizacin es slo por enfriamiento, el nico control sobre el rendimiento es la temperatura. La conclusin de la discusin anterior es que para una Fs y Ra dados, y una relacin de solubilidad dada, el modo de la cristalizacin determina la recuperacin mxima de soluto alcanzable. Para sistemas binarios es posible desarrollar expresiones para el rendimiento y las composiciones de las corrientes en funcin de: las condiciones de entrada, la cantidad de solvente evaporado y las condiciones dentro del cristalizador. A continuacin se presenta este procedimiento. De acuerdo a la Figura 12.17 el balance de masa total est dado por:
Fs + FsRa = FsRse + 5 + C/+ SRc

El balance de soluto est dado por:
(12.47)
(12.48) y el balance de solvente por: Fs = FsRse + S (12.49)
Combinando las ecuaciones (12.47) y (12.48) se puede obtener la ecuacin para el flujo de solvente,
716
CAPTULO 12.
CRISTALIZACIN
S=
1 -\- ric
Combinando las ecuaciones (12.48) y (12.49) se puede obtener una ecuacin para el flujo msico de cristales, C = Fs[Ra - (1 - Rae)Rc] (12.51)
El rendimiento dado por la ecuacin (12.46) puede tambin ser expresado como:
C Rend. = -
rafia
(12.52)
sustituyendo la ecuacin (12.51) en la (12.52),

end. =
ft. -(l-ft.)*.
Ra
(12 53)
La ecuacin (12.53) permite calcular el rendimiento mediante los datos de diseo Ra, de equilibrio Rc y de operacin Rae. La fraccin masa de cristales en la suspensin de salida ST es:
combinando (12.51) y (12.54) se obtiene:
i + fi. - R~
Las ecuaciones (12.53) y (12.55) se simplifican para los modos de operacin particulares que se describen a continuacin. 1.- Cristalizacin por Enfriamiento Indirecto En este caso no existe evaporacin de solvente por lo que: fl = 0 y las ecuaciones (12.53) y (12.55) se expresan como: (12.56)
12A. DISEO DE CRISTALIZADORES
717
Rend. = RaD
Rc
Ra
(12.57)
(1258)
2.- Cristalizacin Slo por Evaporacin
En este caso la fraccin masa de soluto en la alimentacin es igual a la fraccin masa en la solucin de salida, Ra = Rc y las ecuaciones (12.53) y (12.55) se expresan como: Rend. = Rse (12.60) (12.59)
ST = -R"Rse p 1 + Ra Rse
(12.61)
3.- Cristalizacin por Evaporacin Adiabtica sin Reflujo

En este caso a diferencia de los dos casos anteriores, adems de los balances de masa se requiere efectuar un balance de energa para determinar la cantidad de solvente evaporado en el cristalizador. Este balance puede ser expresado en palabras como: [La velocidad de salida de calor por evaporacin del solvente.] es igual a \ [El calor liberado por la cristalizacin de enfriamiento.] ms [Entrada convectiva de calor.] ms [Calor liberado por cristalizacin por "salting out"] y mediante la ecuacin: FsRse\v = Fs(Ra+FsRcRseX} (12.62)
718 donde:
CAPTULO 12.
CRISTALIZACIN
AT: Temperatura de alimentacin menos temperatura del cristalizador. [grados]. Cp: Capacidad calorfica de la alimentacin. [cal/M grado]. \v: Calor de evaporacin del solvente. [cal/M]. A/: Calor de cristalizacin del soluto. [cal/M]. de tal manera que las ecuaciones de enfriamiento adiabtico son: _ \(Ra - Re) + CPAT(l + Ra) "~ A. - A/ + Rc Ra - (1 - Rsf)Rc
tta
(12 63)
'
ST = "~
1 + Hc tiae
"
(12.65)
Las ecuaciones anteriores pueden ser resueltas si se conoce la concentracin de soluto disuelto en la suspensin de salida Rc. Generalmente es aceptable suponer que esta concentracin corresponde a la de saturacin. Los sistemas en los cuales sto ocurre se llaman sistema tipo II o de rpido crecimiento, en oposicin a los sistemas tipo I donde la concentracin de salida Rc es mayor que la de saturacin debido al lento crecimiento en estos sistemas. Ejemplo 12.7.- Balances de masa y energa en un cristalizador adiabtico. Se desea analizar la variacin con la presin de operacin del rendimiento y la concentracin de slidos en la corriente de salida de un cristalizador. En las columnas (1), (2) y (3) de la Tabla 12.5 se muestran los datos de equilibrio para el sistema a cuatro presiones absolutas diferentes. La solucin alimentada al cristalizador contiene 0.379 g de soluto por g de solvente y se alimenta a una temperatura de \00UC. El calor de
12.4. DISEO DE
CRISTALIZADORES
719
Tabla 12.5: Datos y solucin del Ejemplo 12.7.
Presin mm de Hg
(1)
160 135 90 60
(2) T C 65 60 50 40
(3)
RC g soluto g solvente
(4)
Rse g solv. evap. g solv. alim.
(5) Rend.
g cristales g soluto alim.
(6) ST
g cristales g totales
0.100 0.072 0.043 0.028
0.374 0.419 0.502 0.582
0.835 0.890 0.944 0.969
0.316 0.347 0.400 0.453

vaporizacin del solvente es de 100 cal/g, el calor de fusin del cristal es de 33.3 cal/g y la capacidad calorfica de la solucin de 0.556 cal/gC. Calcular la fraccin masa de cristales a la salida del cristalizador y el rendimiento bajo cada una de las presiones de operacin.
Solucin:
Considerando un sistema de cristalizacin tipo II, el flujo msico de evaporacin adiabtica de solvente puede calcularse utilizando la ecuacin (12.63) y aparece en la columna (4) de la Tabla 12.5. El rendimiento y la fraccin masa se calculan utilizando las ecuaciones (12.64) y (12.65), respectivamente. Estos valores aparecen en las columnas (5) y (6) de la Tabla 12.5. Tanto la fraccin masa de cristales como el rendimiento aumentan al disminuir la presin de operacin.
Balances y Cintica
En el diseo de un cristalizador es necesario combinar las expresiones de la cintica de la cristalizacin con los balances de masa y energa. El uso de la cintica de la cristalizacin para el anlisis y diseo provee una nueva dimensin a las tcnicas de diseo disponible. Contando con la cintica de la cristalizacin es posible evaluar la sensibilidad de
720
CAPTULO 12.
CRISTALIZACIN
la distribucin de tamao de cristales a las diferentes parmetros de operacin: - Tiempo de residencia. - Remocin de finos. - Remocin de gruesos. - Densidad de la suspensin. - Temperatura. - Sembrado. - Operacin en serie. Ejemplo 12.8.- Diseo de un cristalizador continuo. Se desea disear un cristalizador para producir 455 kg/h de un compuesto. Los criterios de diseo son los siguientes: - 75% de la masa de los cristales debe tener un tamao mayor a 100 - La fraccin de masa de cristales ST a la salida debe ser de 0.5. - El rendimiento debe ser mayor a 0.95. Los datos y condiciones de operacin se presentan en la Tabla 12.6 y los datos de equilibrio se presentan en la Tabla 12.7. Los estudios realizados a nivel laboratorio y a nivel piloto en un cristalizador RPMSM, manteniendo constante MT en 0.84 g/cm3 generaron la expresin cintica siguiente: = 42,699(6')
46
num cm min
3
donde G est en unidades de mirain y k^ en
2.4. DISEO DE
CRISTALIZADORES
721
Tabla 12.6: Datos y condiciones de operacin del Ejemplo 12.8. Composicin alimentacin Temperatura alimentacin Calor especfico de la suspensin y solucin Calor de evaporacin del solvente Calor de cristalizacin Gravedad especfica de los cristales Gravedad especfica del lquido Factor volumtrico del cristal
n O7Q
g solvente '
100C. 0.556 cal/g o. 100 cal/g. 33.3 cal/g. 1.23. 0.84. 1.

Tabla 12.7: Datos de equilibrio del Ejemplo 12.8. Presin mmHg 160 135 90 60 40 T Cristalizador C 65 60 50 40 30
masa soluto masa solvente
Rc
0.100 0.072 0.043 0.028 0.018

Reproducida con el permiso de John Wiley and Sons . Copyright 1987. Todos los derechos reservados.
722
CAPTULO 12.
CRISTALIZACIN
cm 0 mtn ,0.46
Solucin: El diseo del cristalizador se efecta mediante los siguientes pasos: a) Elaboracin de los balances de masa y energa. b) Estudio cintico: Efecto del tiempo de residencia, punto de corte de finos // y proporcin de remocin de finos, sobre la distribucin de tamao de cristales. c) Dimensionamiento y especificacin de equipo. a) Balances de masa y energa. Los datos de equilibrio de la Tabla 12.7 sugieren una alta sensibilidad de la solubilidad del soluto a la temperatura, de tal manera que es factible la cristalizacin por enfriamiento. Considerando un sistema de cristalizacin tipo II y dos modos de cristalizacin: enfriamiento indirecto y enfriamiento adiabtico, los clculos de rendimiento y fraccin masa de los cristales a la salida del cristalizador, se pueden realizar mediante las ecuaciones (12.57) y (12.58) para enfriamiento indirecto, y mediante las ecuaciones (12.63), (12.64) y (12.65) para enfriamiento adiabtico. Los resultados correspondientes se presentan en la Tabla 12.8. De acuerdo a los balances de la Tabla 12.8 el modo de cristalizacin por enfriamiento indirecto, no permite cumplir con la especificacin de diseo que establece una fraccin masa de cristales a la salida ST = 0.5, an cuando se alcanza el rendimiento deseado. El modo de operacin de enfriamiento adiabtico tambin alcanza el rendimiento deseado, pero ni an a 40C (60 mm de Hg) satisface 1? condicin de ST 0.5. En base a lo anterior se selecciona el modo de operacin adiabticc con adicin de calor externo para producir una solucin ms concentrada.
12.4. DISEO DE
CRISTALIZADORES
723
Tabla 12.8: Balances de masa y energa para Ejemplo 12.8.
TC 65 60 50 40 30
Enfriamiento Indirecto Enfriamiento Adiabtico Rend. Rend. ST ST 0.74 0.32 0.20 0.83 0.22 0.35 0.81 0.89 0.40 0.89 0.24 0.94 0.45 0.93 0.25 0.97 0.95 0.26 0.51 0.98
Considerando la conveniencia de una temperatura de operacin intermedia que permita operar el condesador sin el uso de un agente condensante refrigerado, se sugiere emplear una temperatura de operacin de 50C, en un cristalizador con calentamiento externo. La presin de operacin ser entonces de 90 mm de Hg (Tabla 12.7). Una vez tomada la decisin anterior se puede calcular Rse mediante la ecuacin general (12.55),
ST =
Ra (1 Rse)Rc 1 + Ra Rse
0.5 =
0.379 - (1 - Rse) x 0.043 1 + 0.379 - Rse
se obtiene:
R,f = 0.65
Este resultado indica que es necesario remover el 65% del solvente que entra para cumplir con ST = 0.5. El balance de masa del sistema de acuerdo a la Figura 12.18 puede desarrollarse de la siguiente manera: En la corriente de salida,
0.5 =
masa de cristales masa total
724
CAPTULO 12.
CRISTALIZACIN
SO'C
,
Q
V1
So
Suspensin
=0.65 g/g
\/
Alimentacin 100*C * F, R =0.379 g/g
-bRc=0.043 g/g k * C =455 Kg/h
Figura 12.18: Diagrama de flujo Ejemplo 12.8.
455 O5 (5 + Sfe) + 455 f

como fc = 0.043 (Tabla 12.7, T= 500C) entonces , kg de solvente _
436.24
SRr = 18.76
kg de soluto disuelto h
El balance global de soluto es: FsRa = de tal manera que:

455 ^ + 18.76 li
p
s
0.379 ^ kg
Fs
= 1250 ^ //
= 473.76
FsRa
El flujo de solvente evaporado es:
725
FsR*r = 812.5
El rendimiento de acuerdo a la ecuacin general (12.53) es: Rend. =

Rg (1 ~ RSe)Rc
RO.
0.379 - (1 - 0.65) x 0.043 Rend. 0.379 Rend. = 0.96 El balance de energa permite calcular el calor adicional necesario, y est dado por:
Salida de calor por evaporacin del solvente = -f+ + Calor liberado durante la cristalizacin Entrada de calor por conveccin Calor liberado por Saling Out Calor suministrado
y en forma de ecuacin como: FsRse\v = FsRcRse\f de tal manera que: Q = 1250^ hr

n * 0.65 ,nn -~- x 100
Cal
kg
100
9 - kg
(0.379 - 0.043) l + 0.379

kq
7
x 33.3
g
x
x
cal
kg kg
1000 q
9j
x 0.556
ka
x (100 -
0.043 7^ x 0.65 -r- x 33.3 x kg kg g kg

Q = 1.818 x 10
cal
726
CAPTULO 12.
CRISTALIZACIN
Los balances de masa y energa permiten determinar los requerimientos para cumplir con dos criterios de diseo: 1) Rend. > 0.95
2) ST = 0.5
El problema de diseo restante consiste en determinar como cumplir con la distribucin de tamao de cristales, b) Estudio Cintico. El tamao de cristal vara con tiempo de residencia y con el sistema de remocin de gruesos y finos. Para explorar la influencia del tiempo de residencia en el tamao de cristal deseado, que de acuerdo al criterio de diseo al menos el 75% de la masa de cristales debe tener un tamao mayor a 100 /m, se pueden combinar las expresiones siguientes: B = kN(G?
MT =
*-
/
MT
\$<
para obtener la siguiente ecuacin que permite relacionar r con G,
De acuerdo a los balances de masa, la masa de cristales por unidad de volumen de solvente en la suspensin est dada por:
MT = -nr-rr455
[1250-(1250xO.G5)] 0.84 -^r
MT = 0.87 -^-
727
La fraccin masa de cristales menores a / = 100 /m (Tabla 12.3) est dada por:
/ 1 o 1 -A Y Frac, masa - 1 - 1 + X -f -X2 + -X3 } e~x
Para r = 107 mzn,

i
3.46
X~r
__
( 87
mzn
x """
/ \ 0.46
3
6x1.23 x 42,699 ( y". ) (zaa) ' Vcrn." min/ V w / G = 0.328 '"" la longitud adimensional es:
A
v
(107 min) '

v
100
(0.328 -?V mtn x 107 mn) /
^ = 2.85
La fraccin de masa menor a 100 fm es: (2.85)2 , (2.85): . _.2.85 1 + 2.85 + ^-^- + ^^- I e
o /
Frac, masa = 1 Frac, masa = 0.32
En la Tabla 12.9 se muestran los resultados del resto de los clculos del efecto de la variacin del tiempo de residencia sobre la velocidad de crecimiento, el parmetro X y la fraccin masa de cristales de longitud menor a 100 /im De acuerdo a estos resultados el tamao de los cristales disminuye al aumentar el tiempo de residencia. Esto se debe al mayor impacto de la sobresaturacin sobre la velocidad de nucleacin que sobre la velocidad de crecimiento. Se selecciona el tiempo de residencia de 315 min para continuar el diseo. Una disminucin mayor del tiempo de residencia podra evitar
728
CAPTULO 12.
CRISTALIZACIN
Tabla 12.9: Efecto del tiempo de residencia sobre la fraccin masa de cristales menor a 100 um.
T
G
um/min 0.328 0.094 0.042 0.019 0.009
X
Adim 2.8 3.4 3.8 4.2 4.7
min 107 315 630 1260 2520
Frac, masa < 100 nm 0.32 0.44 0.52 0.60 0.68
el consumo de la sobresaturacin, provocando que este sistema de tipo II se conviertiera en un tipo I. Una vez analizado el impacto del tiempo de residencia sobre el tamao de los cristales, se debe analizar el impacto del sistema de remocin de finos sobre ese parmetro de diseo. Existen varias opciones para remocin de finos que se derivan de las posibles combinaciones entre el tamao de corte lj y el ndice de remocin R. Es obvio que conforme // aumenta a R constante, la fraccin de cristales menor a 100 /m disminuye. Asimismo conforme R aumenta a // constante, la fraccin de cristales menor a 100 //ra tambin disminuye. Este comportamiento se muestra en la Figura 12.19. La figura tambin muestra tres combinaciones de // y R que permiten cumplir con la tercer condicin de diseo que establece que el 75 % de la fraccin masa de cristales tenga una longitud mayor a 100 fim. Una R = 1.8 y una // = 60 /m son seleccionadas para el diseo final. c) Dimensionamiento. La masa de cristales en el interior del cristalizador se puede obtener a partir del flujo y el tiempo de residencia en el cristalizador, de tal manera que:
ka 455 - n
Masa de cristales = (315 mm)
mi
. DISEO DE
CRISTALIZADORES
729
Tamao de corte de la trampa de finos _______ 20 Hm
40 im
60 Hm
Frac, masa de cristales
l< 100 Jim
igura 12.19: Sensibilidad del tamao del producto al tamao de corte e finos. Tomada de: Moyers y Rousseau, 1987.
eproducida con el permiso de John Wiley and Sons. Copyright 1987. Todos los derechos servados.
730

Masa de cristales 2,388.75 kg La masa de la suspensin en el interior del cristalizador es: ., . Masa de suspensin = Masa de suspensin = El volumen de la suspensin es: (2388.75 kg)
* s;
'j
2388.75 kg r 0.5 4a kg 4, 777.5 kg
susp.
1 ZO
_9_ v 1000 cm3
'
cm3
dm3
kg
* 1000 g
2388.75 kg 0.84 -*- x l^fni 5

cm.3 arn-
^_
1000 g
= 4786 dm3
455 4786 dm3 kg 0.095
Productividad Productividad
El rea de la seccin transversal del cristalizador deber considerar el tamao de corte de finos que se desea separar. La Figura 12.20 muestra el diseo conceptual del cristalizador.
12.4.4
Cristalizadores Intermitentes
La cristalizacin intermitente es muy utilizada en la fase de acabado de la produccin de antibiticos, cido ctrico y varios otros productos de peso molecular intermedio, cuyos volmenes de produccin son bajos (menores a 50 tons/dia) y la alimentacin disponible es intermitente. Al igual que en la cristalizcicin continua, la forma de generar la sobresaturacin o modo de operacin determina en gran medida el rendimiento y la distribucin del tamao de cristales en la operacin intermitente. Sin embargo, la operacin intermitente tiene una mayor
'2.4. DISEO DE CRISTALIZADORES
731
Vapor Flecha
Cuerpo del cristalizador
Tubo de tiro Mampara Tubo de circulacin
Alimentacin
Condensado Producto Condensado
Figura 12.20: Diseo conceptual que satisface las condiciones de diseo del Ejemplo 12.8. Tomada de: Moyers y Rousseau, 1987.
732
CAPTULO 12,
CRISTALIZACIN
dependencia de la forma como se genera la sobresaturacin. Cuando sta se genera por enfriamiento existen varias formas de realizarlo: - Enfriamiento con una fuente externa de temperatura constante. - Enfriamiento a velocidad de transferencia de calor constante. - Enfriamiento a sobresaturacin constante. - Enfriamiento a velocidad controlada para optimizar el tamao de cristal y la pureza. El desarrollo de modelos y el anlisis de los cristalizadores intermitentes est limitado por la disponibilidad de datos cinticos de velocidad de crecimiento de cristales y de de nucleacin. En trminos generales los mtodos de diseo y anlisis de cristalizadores intermitentes estn menos desarrollados que los de los cristalizadores continuos. Por otro lado, existe un creciente inters en los experimentos intermitentes dado que se puede obtener ms informacin en un solo experimento y de 1 cierta forma son ms fciles que los RPMSM. \ > Uno de los principales problemas de los cristalizadores intermitentes es mantener la distribucin de tamao de cristales entre una corrida y otra. Esto se evita mediante el sembrado de cristales, y mediante el control de las condiciones de mezclado y enfriamiento. Los experimentos con cristalizadores intermitentes sembrados permiten generar expresiones cinticas de crecimiento cuando se suprime la nucleacin. Para obtener la informacin relativa a la nucleacin, se requiere efectuar mediciones de distribucin de tamao. Debido a lo anterior, el diseo de operaciones de cristalizacin intermitente requiere la generacin de informacin experimental para determinar aspectos como: - Rendimiento potencial de la operacin. - Pureza de los cristales. - Permeabilidad del lecho de cristales. - Curva de solubilidacl-temperatura.
12.4.
DISEO DE CRISTALIZADORES
733
- Distribucin de tamao de cristales. mediante experimentos donde se vara: la concentracin inicial de soluto, la temperatura final o el tiempo de operacin. Una de las desventajas de la cristalizacin intermitente sin control de la velocidad de enfriamiento, consiste en que este modo de operacin produce generalmente un producto de baja pureza y baja uniformidad. Esto se debe a que las velocidades de enfriamiento son ms altas al inicio del proceso, generando un exceso de nucleacin con la consecuente disminucin de tamao de cristal dominante, as como efectos de incrustamiento sobre las paredes de enfriamiento que reducen la transferencia de calor. Esto puede ser minimizado mediante un control de temperatura que permita una velocidad de enfriamiento variable. Cristalizacin Intermitente: Enfriamiento Controlado y Nucleacin Suprimida Los balances poblacionales para cristalizadores intermitentes son ms complejos debido a que tanto la velocidad de crecimiento de los cristales 6?, como la velocidad de nucleacin #, son funcin de la sobresaturacin que es variable en el proceso intermitente, disminuyendo continuamente desde su valor inicial hasta su valor al final del proceso. Por esta razn el enfoque de diseo utilizado en los cristalizadores continuos es poco til para los cristalizadores intermitentes. En la cristalizacin intermitente con enfriamiento controlado, inicialmente la generacin de sobresaturacin por enfriamiento es lenta debido a que los cristales son an pequeos. Conforme aumenta el rea de los cristales la velocidad de generacin de sobresaturacin por enfriamiento tambin se aumenta. En los cristalizadores con control de temperatura se ha utilizado un enfoque emprico para determinar la curva de enfriamiento del sistema (la variacin de la temperatura con el tiempo dentro del cristalizador) debido a que es difcil establecer la cintica del sistema. Esta curva es empleada para disear el sistema de control. En enfoque emrico se supone que al inicio de la cristalizacin tocios los cristales tienen el mismo tamao y se busca determinar le dinmica
734
CAPTULO 12.
CRISTALIZACIN
que debe seguir la temperatura para mantener una velocidad de crecimiento constante. Con este propsito es necesario realizar un balance de la cantidad de soluto de sobresaturacin dentro del cristalizador el cual puede ser descrito en palabras como: [La variacin de la masa de soluto de sobresaturacin] es igual a [La variacin de la masa de soluto de sobresaturacin por efecto de la temperatura] ms [La velocidad de consumo de soluto por crecimiento del cristal] ms [La velocidad de consumo de soluto por nucleacin] Las cristalizaciones intermitentes generalmente se desarrollan en la regin metaestable para controlar el tamao del cristal minimizando la nucleacin. Esto requiere que los cristales sean sembrados para iniciar el crecimiento. En este caso la variacin de la masa de soluto de sobresaturacin y el consumo de masa por nucleacin pueden ser despreciados, simplificndose el balance anterior a los dos primeros trminos del lado derecho. Este balance puede ser expresado con ayuda de las ecuaciones (12.5) y (12.6) de la siguiente forma: ^
donde T es el rea de todos los cristales, variable que depende de la velocidad de crecimiento, por lo tanto, *
(
T
fjf f> fi \ : I
cristal/
(12.67) (12.68)
= J-Mls
+ Gtf
donde: MS- Mas<?i total de los cristales sembrados. ls: Longitud de los cristales sembrados.
735
en la ecuacin (12.68) G es la velocidad lineal de crecimiento del cristal dada por la ecuacin (12.11), es decir;
/~i _
~dt
(c-c*)
(12.69)
sustituyendo las ecuaciones (12.68) y (12.69) en la ecuacin (12.66 ) se obtiene :
de'
dado que c* es funcin de la temperatura,
de* _ de* dT ~dt ~ ~dT~dt combinando (12.70) y (12.71),
(12.70)
(12.71)
dt
(12.72)
dT
La ecuacin anterior permite obtener la variacin de temperatura para mantener una velocidad de crecimiento de cristales constante. Esta expresin puede simplificarse si se considera un intervalo corto de temperatura donde la variacin de la solubilidad sea constante; en este caso la ecuacin (12.72) puede ser integrada para obtener:
M V de* dT
Gt
Gt
(12.73)
donde T0 es la temperatura a la cual los cristales inician su crecimiento. La ecuacin anterior puede expresarse adimensionalmente utilizando la expresin de la longitud final del cristal,
lf = l, + Gtj
(12.74)
donde tf e el tiempo necesario para alcanzar l. A partir de la ecuacin (12.74) se define un tiempo adimensional T dado por:
736
CAPTULO 12.
Gt
CRISTALIZACIN
T =
(12.75)
y se define una longitud adimensional 77 que caracteriza las veces que se incrementa la longitud del cristal respecto a su tamao inicial dada por:
If-ls
1.
(12.76)
sustituyendo (12.75) y (12.76) en (12.73) se obtiene:

M.
T = Tn-
V de* dT
(12.77)
de acuerdo a la ecuacin (12.77) la masa final de los cristales menos la masa sembrada de los cristales est dada por: (12.78) combinando las expresiones (12.77) y (12.78) se obtiene la expresin adimensional:
T T J- -lo
1 + r / r +-(7?r) 2
(12.79)
suponiendo que la densidad de cristales pc permanece constante se puede derivar la siguiente expresin:
M, M,
(12.80
la cual puede ser simplificada para ls bajos, de acuerdo a la ecuacio (12.76) como:
1
Mf T/3
(12.81
y la ecuacin (12.79) se puede aproximar a:
737
fc^r
T T
r3
(12 82)
que es la expresin de la curva de enfriamiento que permite mantener un crecimiento constante y evitar la nucleacin inicial excesiva. Escalamiento de Cristalizadores Intermitentes Para realizar el escalamiento de cristalizadores intermitentes se requiere desarrollar una expresin de la velocidad de nucleacin como funcin de la velocidad de enfriamiento, de la agitacin y de la geometra del cristalizador. Dado que generalmente el mecanismo de nucleacin controlante a escala industrial es la nucleacin secundaria, varios criterios de escalamiento se fundamentan en los aspectos de mezclado. Estos criterios plantean mantener constante entre las escalas algunos parmetros como: - La potencia por unidad de volumen. - La agitacin. - La velocidad de punta del agitador. - La velocidad mnima del agitador que permita mantener la suspensin. Ejemplo 12.9.- Cristalizacin intermitente de cido succnico.
Obtener la curva de enfriamiento para cido succnico en el intervalo de enfriamiento de 30 a 20(7 y un tiempo de operacin de 120 min. Solucin: Utilizando la ecuacin (12.82),
738
T-C
26-
20
40
60
80
Figura 12.21: Curva de enfriamiento del Ejemplo 12.9.
30 -T 30-20
T
En la Figura 12.21 se presenta la curva de enfriamiento que genera la expresin anterior . Inicialmente la temperatura permanece constante luego baja abruptamente. Este comportamiento es caracterstico de de la cristalizacin intermitente con control de temperatura (Qiu y Rasmuson, 1991).
12.5
Sumario
La cristalizacin es una operacin de acabado ampliamente utilizada a nivel industrial, que permite purificar un soluto mediante la formacin de cristales. La fuerza impulsora de la cristalizacin es la sobresaturacin de la solucin. Existen varias formas para generar la sobre-
12.5. SUMARIO
739
saturacin en la solucin de inters, las cuales se basan ya sea en el enfriamiento de la solucin o en su calentamiento al vaco. La sobresaturacin que se logra en el cristalizador es la fuerza impulsora tanto de la nucleacin (origen de los cristales) como de su crecimiento. Ambos fenmenos se asocian con la cintica de la cristalizacin. Existen varios tipos de cristalizadores que pueden ser operados ya sea en forma continua o intermitente. El diseo de los cristalizadores continuos est apoyado por los balances de masa, energa y poblacionales que se realizan en este tipo de equipos. El diseo de los cristalizadores intermitentes se ha desarrollado en forma ms emprica que el de los continuos.
740
CAPTULO 12.
CRISTALIZACIN
12.6
Problemas
12.1.- En el estudio cintico de la cristalizacin por enfriamiento de NaiSOH<2O (Graber y Taboada, 1991) en un cristalizador RPMSM de forma cilindrica de 15.2 era de dimetro y 39 era de altura, cuando el cristalizador operaba en estado estacionario, se obtuvo una muestra de cristales contenidos en 2.04 / de solvente, con las siguientes caractersticas: Tamao de
abertura de
Malla No.
16
18 20 30 40 50 70 100 140 Fondo
malla (rara) 1.180 1.000 0.850 0.600 0.425 0.300 0.212 0.150 0.106
Masa en la malla (9) 9.12 32.12 39.82 235.42 89.14 54.42 22.02 7.22 1.22 0.50
Los cristales tienen una densidad de 1.464 g/crn3 y un factor geomtrico de volumen de 0.553. El tiempo de residencia fue de 0.622 h. Calcular: a) La masa total de cristales en la muestra. b) La variacin del nmero de cristales con el tama de cristal. c) La velocidad de crecimiento de cristales. d) La velocidad de nucleacin de cristales. e) La densidad experimental de cristales. f) La densidad estimada de cristales. a) Resp. 491 g c) Resp. 0.322 mm/h d) Resp. 1.045 x 7 10 num/l -h e) Resp. 240.68 g / l f) Resp. 253.8 g/l 12.2.- Se realiza una cristalizacin intermitente enfriando una solucin de cido ctrico de 60 a 40C. En esta regin la variacin de la
12.6. PROBLEMAS
741
solubilidad de equilbrio del cido ctrico es de 0.006 g/cm3 C (Bohlin y Rasmuson, 1992). Los cristales al sembrarse tienen una longitud caracterstica inicial de 90 //m, con factores geomtricos de rea y volumen de 3.1 y 0.52, respectivamente. La densidad de los cristales es de 1.54 g/cm3. La concentracin de cristales sembrados es de 7.7 x 10~5 g/cm3. El tamao final del cristal es de 1,000 /m. La sobresaturacin esperada durante la cristalizacin es de 0.2 g/cm3. El crecimiento de los cristales est controlado por la difusin con un coeficiente de transferencia de masa de 4.5 x 10~5 cm/s Calcular: a) El incremento adimensional del tamao de cristal 77. b) La velocidad de crecimiento de los cristales. c) El tiempo necesario del proceso. d) La expresin de la curva de enfriamiento de acuerdo a la ecuacin (12.77). e) La expresin de la curva de enfriamiento de acuerdo a la ecuacin (12.82) a) Resp. 10.11 b) Resp. 0.042 cm/h c) Resp. 2.18 h 12.3.- Una solucin salina que pesa 10,000 Kg con 30% en peso de Na^COs se cristaliza en forma intermitente por enfriamiento hasta una temperatura de 20C. La sal cristaliza como decahidrato y presenta una solubilidad a la temperatura final de 21.5 Kg de Na^COs anhidro por 100 Kg de agua. a) Estimar el rendimiento de la operacin cuando no existe evaporacin de agua. b) Estimar el rendimiento de la operacin cuando se evapora el 3 % del peso total de la solucin. a) Resp. 78.5 % b) Resp. 81.9 % 12.4.- En una cristalizacin intermitente se procesan 4,546 Kg de una solucin acuosa que contiene 47 Kg de FeSO* por cada 100 Kg de agua, enfrindose de 54.4C hasta 26.6c para obtener cristales de FeS4 77/20. La solubilidad del sulfato a la temperatura final es de 30.5 Kg de FeSO^ anhidro por cada 100 Kg de agua. La capacidad calorfica promedio de la alimentacin es de 0.7 cal/gC. El calor
742
CAPTULO 12.
CRISTALIZACIN
de cristalizacin de los cristales hidratados puede considerarse igual a 4.4 Kcal/gmol. Calcular: a) La masa anhidra de cristales. b) El rendimiento de la operacin. c) El calor removido cuando no hay evaporacin de agua. a) Resp. 683.2 Kg b) Resp. 47 % c) Resp. -108,258 Kcal 12.5.- Estimar la masa de cristales que se requiere sembrar en un cristalizador intermitente para alcanzar una densidad de cristales de 250 g/l, cuando se desea incrementar la longitud caracterstica del cristal de 100 a 1000 /?n, suponiendo que no existe nucleacin y que la densidad del cristal permanece constante. Resp. 0.25 g/l 12.6.- Obtener la distribucin terica de cristales de la corrida 2 del Ejemplo 12.4, para las mallas 20, 28, 35, 48, 65, 100, 115, 150 y 200. Resp. 4.42 % de masa retenida en la malla 65. 12.7.- Una solucin que contiene 200 g de cido ctrico por cada 100 g de agua, se somete a un proceso de cristalizacin intermitente al vaco, a una temperatura de 20C. A esta temperatura la solubilidad del cido es de 0.59 g/g de agua. Estimar la cantidad de agua que es necesario evaporar para obtener una recuperacin del 90% en esta operacin. Resp. 33.89 %
12.7. BIBLIOGRAFA
743
12.7
Bibliografa
Belter, P.A., Cussler, E.L. y Hu, W. 1988. Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology. John Wiley and Sons. New York. 10, 273-305 Bennett, R.C. 1973. Miscellaneous Separation Processes. En: Chemical Enginner's Handbook. Perry, R.H. y Chilton, C.H. (Eds.). 5th Ed. Me Graw-Hill. New York. Quinta edicin. 17, 1-58 Bennett, R.C. 1988. Matching crystallizer to material. Chem. Eng. Mayo 23. 118-127. Bohlin, M. y Rasmuson, A.C. 1992. Application of controlled cooling and seeding in batch crystallization. The Canadian J. of Chem. Eng. 70, 120-126. Charmolue, H. y Rousseau, R.W. 1991. L- Serine obtained by methanol addition in batch crystallization. AIChE Journal 37, 8, 1121-1128. Graber, T.A. y Tabeada, M.E. 1991. Crystallization: An interesting experience in the Ch.E. laboratory. Chem. Eng. Education. Spring. 102-105. Moyers, C.G. y Rousseau, R.W. 1987. Crystallization operations. En: Handbook of Separation Process Technology. Rousseau, R.W. (Ed.) John Wiley and Sons. New York. 11, 578-643 Qiu, Y. y Rasmuson, A.C. 1991. Nucleation and growth of succinic acid in batch cooling crystallizer. AIChE Journal 37, 9, 12931304.
Captulo 13
Secado
13.1 Introduccin
El secado es el ltimo paso en la recuperacin de ciertos productos biotecnolgicos. Consiste bsicamente en la reduccin del contenido de solvente del producto por medio de una evaporacin o una sublimacin. Tiene como propsito estabilizar el producto, preservar su actividad, reducir su volumen o recuperar el solvente. Existen varias formas de secar un material. En el caso de productos biolgicos una limitante en la seleccin del mtodo de secado, es la temperatura que puede soportar el material de inters sin perder actividad, de tal manera que las alternativas para estos materiales son ms limitadas. En la prctica de secado el solvente generalmente es agua y el medio hacia donde sta se elimina es aire. Por esta razn, el anlisis del secado se basa fundamentalmente en los sistemas aire-agua, sin embargo los resultados que se logran pueden ser generalizados a otros sistemas. Siendo el secado una operacin limitada por el equilibrio en la seccin 13.2 sobre fundamentos, se revisan los conceptos bsicos del equilibrio (de los sistemas agua-aire. Asimismo, se revisan las formas de efectuar una operacin de secado y, las expresiones bsicas para el clculo de la velocidad de secado y la velocidad de desactivacin de compuestos trmicamente lbiles. En la seccin 13.3 sobre equipo, se presentan los principales tipos de secadores utilizados en los procesos
745
746
CAPTULO 13. SECADO
biotecnolgicos. Los principios de diseo de algunos tipos de secadores se presentan en la seccin 13.4.
13.2
Fundamentos
El anlisis de la operacin de secado requiere conocer las relaciones de equilibrio que implica la distribucin de agua entre dos fases: la slida del material a secar y la gaseosa del aire seco que sirve como medio para tal efecto. Adems, es necesario conocer las diferentes formas en que puede ser conducida una operacin de secado. Asimismo, se requiere el conocimiento de la cintica de secado que depende de la velocidad de transferencia de calor y de la velocidad de evaporacin. Una cintica necesaria de considerar en esta operacin que no tiene paralelo en otras, es la velocidad de desactivacin del material de inters por efectos trmicos. De acuerdo a lo anterior en esta seccin se revisan los siguientes aspectos de la operacin de secado: Las relaciones de equilibrio que limitan la operacin. Los mtodos diponibles para realizar la operacin. La velocidad de secado que determina el tiempo para llevar a cabo la operacin. Los efectos colaterales del secado.
13.2.1
Equilibrio y Propiedades Trmicas
Si un slido hmedo se expone a una corriente continua de aire, pued ganar o perder humedad dependiendo de la presin de vapor que ejerz el agua del slido, y de la presin de vapor de la corriente del air< Si la presin de vapor del agua del slido es mayor que la presin d vapor del aire, entonces el slido pierde humedad, en el caso centran su humedad aumenta. Cuando la presin de vapor del agua del solio iguale la presin de vapor de la corriente de aire, entonces el sisterr estar en equilibrio.
13.2.
FUNDAMENTOS
747
Curva de humedad en et equilibrio
ligada
ligada
Humedad , / el equilibrio /
Contenido de humedad. Kg humedad / Kg slido seco
Figura 13.1: Curva de equilibrio para secado de un slido. La presin de vapor que ejerce la humedad contenida en un slido depende de la forma de la humedad, el tipo de slido y la temperatura. En la mayora de los materiales biolgicos se pueden distinguir dos formas del agua contenida en el slido: agua libre y agua ligada. El agua libre se caracteriza por ejercer una presin de vapor igual a la del agua pura. Este tipo de agua se localiza en los espacios entre las clulas de los materiales o en los capilares de precipitados porosos. El agua ligada se caracteriza por ejercer una presin de vapor menor a la del agua pura. Este comportamiento lo presenta el agua cuando est contenida en el interior de clulas, en algunos caldos los solutos alteran sus propiedades o forma enlaces con sustancias orgnicas. En la Figura 13.1 se presenta una curva de equilibrio tpica de un material biolgico a una temperatura dada. Se distinguen dos zonas caractersticas: la zona de humedad no ligada y la zona de humedad ligada. En el eje de las ordenadas se grfica la humedad relativa del aire definida como:
Hr =
presin parcial del agua en el aire. presin de vapor del agua pura.
(13.1
y en el eje de las abscisas la humedad del slido definida como:
748
CAPTULO 13. SECADO
masa agua masa seca de slido esta definicin es til cuando la masa de slido es constante. La zona de humedad no ligada que se muestra en la Figura 13.1 comprende desde cero humedad hasta una humedad tal que la presin de vapor del slido es igual a la del agua pura. Un slido con tal humedad estar en equilibrio con aire cuya presin parcial de vapor sea igual a la del agua pura, es decir, cuya humedad relativa sea igual a la unidad. En la zona de humedad no ligada, la humedad del slido puede ser mayor pero su presin de vapor es constante e igual a la del agua pura. De tal manera que la Hr permanece constante e igual a la unidad. En la operacin de secado se requiere conocer, a diferentes temperaturas y presiones, las propiedades trmicas y las relaciones de equilibrio del solvente en el slido y del aire que se utilice para secar. Debido a que el agua no ligada se comporta como agua pura, las relaciones de equilibrio de los sistemas aire-agua pueden ser utilizados para tal efecto. Asimismo, estas relaciones de equilibrio agua-aire son requeridas para describir el comportamiento del aire que se utiliza en la operacin de secado, dado que ste generalmente es calentado antes de usarse. Las relaciones de equilibrio vapor de agua-aire se presentan en forma de cartas psicomtricas como la de la Figura 13.2, la cual ha sido desarrollada a la presin de una atmsfera. Para utilizar adecuadamente la carta psicomtrica es necesario manejar varios trminos, algunos de ellos referidos a la masa de aire seco, ya que en un proceso de secado esta cantidad puede considerarse constante. A continuacin se describen diez de estos trminos. 1. -Humedad. La humedad H de una mezcla aire-agua se define como la masa de vapor de agua por unidad de masa de aire seco. masa agua (13 3V masa a'e seco Utilizando la ecuacin general de los gases ideales se puede expresar la ecuacin (13.3) como: _
a=
P-r-P
\M
13.2.
FUNDAMENTOS
749
0.12
0.10
0.04
0.02
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Figura 13.2: Carta psicomtrica agua-aire. Presin de una atmsfera.
750 donde: PA' Presin parcial del agua en el aire. PT\ Fresn total de la mezcla aire- agua. MA'- Peso molecular del agua (18 g/mol). MB'- Peso molecular del aire (29 g/mol).
CAPTULO 13. SECADO
Se puede deducir de la ecuacin anterior que la humedad slo depende de la presin parcial del agua y de la presin total del sistema. 2. -Humedad de saturacin. Una mezcla aire-agua est saturada a cierta temperatura y presin, cuando la presin parcial del agua en la mezcla es igual a la presin de vapor del agua pura , de tal manera que:
donde P es la presin de vapor del agua pura a la temperatura y presin dadas y HS es la humedad de saturacin.. 3.-Porcentaje de humedad. El porcentaje de humedad se define como la relacin porcentual de la humedad con respecto a la humedad de saturacin, es decir %H = -^- x 100 (13.6) Hs 4.-Relacin entre % H y Hr. Es necesario advertir que el porcentaje de humedad no es igual al porcentaje de humedad relativa. Esto puede ser demostrado combinando las ecuaciones (13.4), (13.5) y (13.6),

y comparar este resultado con la ecuacin (13.1).
13.2.
FUNDAMENTOS
751
Ejemplo 13.1.- Clculo de humedad a partir de datos de presin de vapor. El aire de una habitacin tiene una temperatura de 20(7 y la presin es de una atmsfera. La presin parcial del agua en el aire es de 12 mm de Hg. Calcular: (a) La humedad, H. (b) La humedad de saturacin, HS. (c) El porcentaje de humedad, % H. (d) El porcentaje de humedad relativa, % Hr. Solucin: (a) La humedad H puede calcularse.aplicando la ecuacin (13.4),
12 mm de Hg (760 - 12) mm de Hg
18 29
Kc
Kmol Kg Kmol
H = 0.01
Kg de agua Kg de aire seco
(b) En tablas de vapor puede encontrarse que a 20C la presin de vapor de agua es de 17.5 mm de Hg. Aplicando la ecuacin (13.5),
17.5 mm de Hg (760- 17.5) mmde Hg
18
Kc
Kmol
29 Kmol
Hs
= 0.0146
Kg de agua Kg de aire seco
(c) Mediante la ecuacin (13.6) y los resultados anteriores,
%H
= 68.4%
(d) Aplicando la ecuacin (13.1),
752
CAPTULO 13. SECADO Tabla 13.1: Datos y solucin del Ejemplo 13.2.
T(C) PAS (KPa) 0.7577 3 2.0640 18 5.0340 33 19.9400 60 38.5800 75 70.1400 90 84.5500 95
rr "d
( Kg de agua \ \Kg aire seco J
0.0047 0.0129 0.0324 0.1521 0.3816 1.3958 3.1275
%Hr
e 17.5 mm de tig %Hr = 68.57%
x 100
Ejemplo 13.2.- Curva de 100 % de humedad.

Construir una grfica de la humedad de una mezcla aire-agua en el rango de O a 100 C, considerando una presin total de una atmsfera y la presin parcial del agua en la mezcla como la correspondiente a la presin del agua pura a cada temperatura. Solucin: En las columnas (1) y (2) de la Tabla 13.1 se presenta la presin de vapor para el agua pura a varias temperaturas en el rango considerado. Estos valores son obtenidos de tablas de vapor. En la columna (3) de la Tabla 13.1 se encuentran los datos de HS calculados mediante la ecuacin (13.5) a una presin total de una atmsfera (101.33 KPa). El valor de Hs tiende a infinito conforme la presin de vapor se aproxima a la temperatura de ebullicin del agua. La curva de 100 % de humedad ce la carta psicomtrica (Figura 13.2) representa la solucin grfica de este ejemplo. La curva de 50
13.2. FUNDAMENTOS
753
% de humedad de la carta psicomtrica puede trazarse tomando la mitad de la distancia vertical entre la curva de saturacin y el eje de la temperatura, a cada temperatura. 5.-Punto de roco. El punto de roco de una mezcla aire-agua es la tempertura a la cual dicha mezcla (sin estar en contacto con agua) se satura al ser enfriada a presin total constante. Cuando una mezcla en su punto de roco se enfra ms alia de este punto, el vapor de agua condensa formando una neblina o roco. En este proceso la humedad de la mezcla no cambia, de tal manera que se puede calcular el punto de roco de una mezcla utilizando la carta psicomtrica. Ejemplo 13.3.- Clculo del punto de roco de una mezcla aire-agua. Estimar el punto de roco de una mezcla aire-agua con 20 % de humedad que se encuentra a 55C y a una atmsfera de presin. Solucin: Sobre la carta psicomtrica (Figura 13.2) se localiza el punto 55C y 20 % humedad, horizontalmente se avanza hacia la curva de 100 % humedad y se lee la temperatura de roco de 26.5C en el eje T. Todas las mezclas con humedad de 0.023 tendrn el mismo punto de roco. 6.-Calor hmedo de una mezcla aire-vapor de agua. El calor hmedo es la capacidad calorfica de la mezcla aire-vapor de agua, y es el calor necesario para incrementar un grado centgrado la temperatura de una mezcla aire-vapor de agua, por Kg de aire seco de la mezcla, o Cs = CB + HCA
donde:
(13.7)
Cs'- Calor hmedo de la mezcla en KJ/Kg aire seco K. CB'- Capacidad calorfica del aire seco. 1.005 KJ/Kg aire seco K. C A'- Capacidad calorfica del vapor de agua. 1.88KJ/ Kg vapor K. KJ: Kilojoules, unidad de energa.
754
CAPTULO 13. SECADO
Dado que las capacidades calorficas pueden considerarse constantes en el intervalo normal de temperaturas, la ecuacin (13.7) puede expresarse como: Cs = 1.005 + 1.884//
KJ
Kg aire seco K
(13.8)
Cuando no existe cambio de estado (evaporacin o condesacin) el calor necesario para incrementar la temperatura AT grados de una masa mjg de aire y su vapor acompaante, puede ser calculada con la siguiente expresin: Q = mBCs&T (13.9)
Ejemplo 13.4.- Clculo del calor hmedo de una mezcla aire-agua. Calcular el calor hmedo de una mezcla aire-vapor de agua que se encuentra a 55C y presenta una humedad //=0.08 Kg de agua /Kg de aire seco. Utilizar el valor calculado para estimar el calor necesario para incrementar 15 grados la temperatura de 5 Kg de aire seco y su vapor acompaante. Solucin: a) El calor hmedo puede calcularse utilizando la ecuacin (13.8),
Cs = 1.005+ (1.884)(0.08)
Kg aire seco K
CS = 1.156
A g aire seco A
KJ
b) El calor necesario puede calcularse utilizando la ecuacin (13.9),
Q = 5 Kg de aire seco x 1.156 x 15 K : Kg aire seco K Q = 86.7 KJ Q = 363 Kcal
13.2. FUNDAMENTOS
755
7.- Volumen hmedo. El volumen hmedo es el volumen total de una mezcla aire-vapor de agua por Kg de aire seco a la presin de una atmsfera. De acuerdo a la ley de los gases ideales el volumen hmedo puede calcularse mediante: m3 mezcla Kg aire seco
VH = (0.00283 + 0.0045677) (T + 273)
(13.10)
8.- Entalpia total. La entalpia total de un Kg de aire seco y su vapor acompaante referida a una temperatura T0, est dada por el calor sensible de la mezcla aire-vapor de agua ms el calor latente del vapor de agua a la temperatura T0, esto puede expresarse como: Ent. = CS(T - T0) + H\0 (13.11)
Cuando T0 QC el calor latente \0 =2,502 KJ/Kg y la ecuacin (13.11) se expresa como:

f kJ 1 : [Kg aire seco]
Ent. = (1.005 + 1.884#)T + 2502# en la ecuacin anterior T est en C.
(13.12)
9.-Curvas de saturacin adiabtica. Considrese un proceso como el que se muestra en la Figura 13.3. En ste, una mezcla airevapor de agua a una temperatura T y una humedad //, se pone en contacto con agua a una temperatura TS (menor que T), de tal manera que la mezcla aire-vapor al alcanzar el estado estable sale con una humedad saturada HS a una temperatura TS (el aire cede calor sensible para evaporar el lquido). No fluye calor hacia dentro o hacia fuera del sistema y al fenmeno se le denomina proceso adiabtico. Efectuando un balance de energa en la mezcla aire-vapor se obtiene, entalpia a la entrada = entalpia a la salida. si se toma como temperatura de referencia TS este balance se expresa como:
756
CAPTULO 13. SECADO
Entrada del gas _ H, T
\ Jr
x ''
/
A
,
'
Salida del gas fri

\**N
X
HS-TS
Agua de reposicin H 2 0
; m ) i ~n i )
\
^
Ts
Figura 13.3: Proceso adiabtico.
CS(T - Ts) + H\s = CS(TS - Ts) + Hs\s combinado las ecuaciones (13.8) y (13.13) se tiene: H-Hs _ _Cs_ _ (1.005+ 1.884#)
(13.13)
T - Ts ~ ~ Xs ~ ~
\s
(13.14)
Las curvas de saturacin adiabtica de la carta psicomtrica (Figura 13.2) han sido construidas utilizando la ecuacin (13.14). En el caso que el contacto no sea suficiente para alcanzar H$ y TS a la salida, la mezcla presentar una temperatura y una humedad menor, localizadas sobre la misma linea de saturacin adiabtica. Ejemplo 13.5.- Saturacin adiabtica. Se tiene una mezcla aire-vapor a 80C con una humedad de 0.032 Kg de agua / Kg aire seco. Si este aire se enfria y humidifica adiabticamente, estimar: a) La temperatura y humedad final si la mezcla alcanza un 90 % de humedad. b) La temperatura y humedad final si la mezcla sale saturada. Solucin: a) Sobre la carta psicomtrica se localiza la temperatura y humedad que representa a la mezcla original. Entonces esta mezcla se humidifica
13.2. FUNDAMENTOS
757
y enfra adiabticamente, siguiendo una curva de saturacin adiabtica, hasta el cruce con la curva de 90 % de humedad donde se lee: T = 43C H = 0.049 Kg de agua Kg de aire seco
b) Continuando sobre la misma linea de saturacin adiabtica hasta la interseccin con la curva del 100 %, se puede leer:
Ts
= 4QC Kg de agua Kg de aire seco
Hs = 0.05
10.- Temperatura de bulbo hmedo. La temperatura de bulbo hmedo es la temperatura de estado estable que alcanza una pequea masa de agua cuando se pone en contacto con una corriente de aire en condiciones adiabticas. Para determinar temperaturas de bulbo hmedo se puede utilizar un termmetro cuyo bulbo se recubre con una tela impregnada de agua. El termmetro se sujeta mediante una cuerda y se hace girar en el aire. Si el aire no est saturado se produce un descenso en la lectura del termmetro debido a la evaporacin de agua de la tela. La lectura final de estado estacionario es la temperatura de bulbo hmedo (en contraposicin, a la lectura normal del termmetro se le llama temperatura de bulbo seco). Para sistemas aire-agua (nicamente) la descripcin del proceso adiabtico del bulbo hmedo puede realizarse en forma satisfactoria mediante la ecuacin de saturacin adiabtica. La importancia prctica del anlisis anterior, es que mediante mediciones de temperaturas de bulbo hmedo y bulbo seco, y con auxilio de la carta psicomtrica, es posible determinar con relativa facilidad la humedad de mezclas aire-vapor de agua.
758
CAPTULO 13. SECADO
Ejemplo 13.6.- Determinacin de humedad. Una mezcla de aire-vapor de agua tiene una temperatura de 70C. La temperatura de bulbo hmedo de esta mezcla es de 30C. Calcular la humedad de la mezcla. Solucin: Se puede suponer que la temperatura de bulbo hmedo es igual a la temperatura de saturacin adiabtica. Recorriendo la curva de saturacin adiabtica de 30C hasta la temperatura de bulbo seco de 70C, se puede leer la humedad de 0.01 Kg agua/Kg aire seco.
13.2.2
Mtodos de Secado
El mtodo de secado que debe ser utilizado en un bioproceso depende del tipo de producto, sus propiedades fsicas, su tolerancia a la temperatura y los requerimientos de proceso en cuanto a la forma de operacin ya sea intermintente o continua. Los mtodos de secado se pueden clasificar de acuerdo a la forma de transferir calor y eliminar el solvente en dos tipos: - Mtodo adiabtico. - Mtodo no adiabtico. Mtodo Adiabtico Este mtodo consiste en adicionar calor por medio de aire caliente. Los secadores por aspersin y los secadores de tipo instantneo operan de acuerdo a este mtodo. Son utilizados para secar partculas que no toleran altas temperaturas como protenas unicelulares y enzimas. Mtodos no Adiabticos o por Conduccin En el secado no adiabtico el calor se proporciona en forma indirecta por conduccin a travs de una pared metlica. Generalmente los secadores no adiabticos operan a presin reducida y se emplean para el secado
13.2. FUNDAMENTOS
759
de cristales y precipitados, donde las temperaturas de secado deben ser menores a 60 C. El secado por congelamiento, un caso de secado no adiabtico, se efecta por sublimacin de agua congelada empleando bajas presiones y temperaturas. Se emplea para secar protenas teraputicas que no toleran temperaturas arriba de las ambientales.
13.2.3
Velocidad de Secado
En el diseo de secadores, adems de las relaciones de equilibrio, es necesario establecer relaciones que permitan determinar la velocidad del secado o el tiempo de secado. Debido a que el conocimiento de los mecanismos bsicos del secado no es completo, frecuentemente es necesario efectuar mediciones experimentales de la velocidad de secado. Cuando se seca un slido ocurren dos procesos fundamentales y en forma simultnea: - Se transfiere calor para evaporar un lquido. - Se transfiere masa: como lquido o vapor al interior de slido, y como vapor del slido al aire. Los factores que controlan la velocidad de estos procesos determinan la velocidad del secado. Los mecanismos de transferencia de masa estn intimamente relacionados con el tipo de slido a secar (homogneo, granular, etc), mientras que la forma de transferir calor depende del mtodo de secado (adiabtico o no adiabtico).
13.2.4
Efectos Colaterales del Secado
Cuando el secado de un material no se realiza apropiadamente, se presentan daos que afectan la calidad del producto. En el caso de productos biotecnolgicos los daos tpicos que se presentan en el secado son: endurecimiento, deshidratacin qumica y desnaturalizacin. El fenmeno de endurecimiento se presenta cuando la velocidad de secado es muy alta y el slido forma una capa interior hmeda y una, capa exterior'seca e impermeable, que impide la evaporacin y el secado
760
CAPTULO 13. SECADO
apropiado. Este fenmeno puede evitarse desminuyendo la velocidad de secado. La deshidratacin qumica consiste en la eliminacin de agua de la estructura molecular del producto y tambin se origina por una velocidad de secado alta. El tercer tipo de dao es la desnaturalizacin que sufren las protenas en el secado. Este proceso generalmente sigue una cintica de primer orden que depende de la concentracin de agua, la temperatura y el tiempo, de acuerdo a la siguiente expresin: ai donde: Pr: Medida de la concentracin de la protena no desnaturalizada. k0: constante caracterstica del material. [t~1]. E: Energa de activacin del material, [cal /mol]. R: constante de los gases ideales, [cal mol K]. T: Temperatura absoluta. [K]. La integracin de la ecuacin (13.15) entre los lmites:
t = t0
Pr = Pr0
Pr "-"- ^ ---) RTJ
(13.15)
t =t
produce la expresin:
Pr = Pr
(13.16) que indica que entre menor sea la temperatura y el tiempo de secado menor es el grado de desnaturalizacin. Generalmente es ms conveniente utilizar una combinacin de una temperatura baja con un tiempo alto de secado, para evitar una desnaturalizacin excesiva.
13.2. FUNDAMENTOS
Ejemplo 13.7.- Desnaturalizacin de catalasa.
761
Cuando se seca a 37C por 10 min una pasta concentrada de la enzima catalasa, , se desnaturaliza 63 % de la enzima. Cuando se seca a 20(7 por 30 min, se desnaturaliza en un 28 %. Estimar el grado de desnaturalizacin si el material se seca por 90 min a 4C.
Solucin:
Utilizando la ecuacin (13.16) se pueden obtener dos ecuaciones que permiten determinar los parmetros k0 y E.
Pr i o In ^ Pr, = Pr0 - 0.63
, i o exp FI I,
-E . I 10 min mi; . . , \
l mo-A' '
In = &0 exp v | Pr0 - 0.28 Pr0 \ 1.99
1 30 min n"T' '
resolviendo las expresiones anteriores se obtiene:
E = 23,453 . mol k0 = 3.22 x 1015 min~l Con estos parmetros se puede estimar el grado de desnaturalizacin, utilizando la misma ecuacin, con T = 4(7 y t=90 min. Pr I 23453 ca \ 15 l In 2- = 3.22 x 10 min~ exp , ^ 90 min Pr \ 1.99 moôK x 277 K I
Pr0 -ET Pr Pr
1
= 1-10
Pr io
= 0.91
se desnaturaliza slo el 9 % de la enzima.
762
CAPTULO 13. SECADO
13.3
Equipo de Secado
El equipo de secado es muy variado. Los empleados en los procesos biotecnolgicos se pueden clasificar de acuerdo al mtodo de secado empleado en: Secadores adiabticos. Secadores no adiabticos.
13.3.1
Secadores Adiabticos
Los principales tipos de secadores adiabticos (Quinn, 1983) son: - El secador por aspersin. - El secador instantneo. - El secador de lecho fluidizado.
Secador por Aspersin

En los equipos de secado por aspersin (Figura 13.4) es posible secar soluciones o suspensiones de slidos, rociando stas en un recipiente a travs del cual se hace pasar una corriente de aire caliente. Los secadores por aspersin son utilizados para la produccin de grandes volmenes de productos termolbiles como enzimas, levaduras y protenas. Uno de los componentes claves del secador por aspersin es el atomizador que permite formar pequeas gotitas de la mezcla, incrementando notablemente el rea de secado, de tal manera que el tiempo del secado sea menor que el tiempo que dura la gota en alczar la pared del recipiente. Existen dos tipos bsicos de atomizadores: Los tipos disco giratorio (15,000 a 24,000 rpm) y los tipos de eyector a presin. El primero es ms empleado en los procesos biotecnolgicos debido a que presentan menos problemas de taponamiento y ofrece la posibilidad de controlar el tamao de la gota controlando la velocidad del disco.
13.3. EQUIPO DE SECADO
763
Alimentacin
X*Xx'
~NvO
V\
Calentador de aire
Figura 13.4: Secado por aspersin. Tomada de: Brocklebank, 1990.

764
CAPTULO 13. SECADO

Salida de aire
Calentador de aire
Figura 13.5: Secador instantneo. Las capacidades de los secadores por aspersin son muy variadas. Las capacidades de evaporacin varan de 1 Kg/h hasta 2 Ton/h de agua, con dimensiones tpicas de 2 x2 x3.5 m para los modelos pequeos y de 10 x 5 x 12 ra para los modelos intermedios. Secador Instantneo Los secadores instantneos o flash (Figura 13.5) son utilizados para secar slidos de baja humedad o slidos difciles de manejar por formar partculas muy pequeas o ser muy pegajosos en forma seca (protenas y almidn). En un secador instantneo el material slido que se va a secar se alimenta conjuntamente con aire caliente a un ducto, a travs del cual el slido viaja y se seca por accin del aire. Al final del ducto la corriente
765
de aire-slido se separa por accin de un cicln. Parte de la corriente es recirculada para secar las partculas grandes que son ms difciles de secar. Si debido a su tamao las partculas de la alimentacin no pueden ser transportadas por el secador, el secador puede incorporar un molino desintegrador a la entrada del ducto de secado. Secador de Lecho Fluidizado El secador de lecho fluidizado (Figura 13.6) puede ser utilizado para secar rpidamente materiales slidos que permitan su fluidizacin por medio de una corriente de aire caliente (Treybal, 1980). El material se alimenta a un lecho soportado por una malla inferior y se le hace pasar una corriente de aire caliente, de tal manera que las partculas del slido se separan y forman una suspensin fluida, que permite su transporte hasta el punto de descarga. Los secadores de lecho fluidizado continuos pueden ser circulares, cuadrados o rectangulares en su seccin de flujo. Pueden alcanzar capacidades de hasta 10 Ton/h de producto seco, mientras que los intermitentes son utilizados en escalas ms pequeas del orden de 500 Kg/carga.
13.3.2
Secadores no Adiabticos
Los secadores no adiabticos requieren un sistema de calentamiento y generalmente trabajan con sistemas de vaco. Los principales secadores no adiabticos utilizados en biotecnologa son: el tipo charola, el de doble cono, el tambor rotatorio y el liofilizador (De Vivo, 1983). Secador de Charola Los secadores de charola (Figura 13.7), son utilizados a escala piloto o para producciones bajas de productos de alto valor econmico, suceptibles a temperaturas elevadas o a dao por manejo mecnico excesivo. En el secador de charola la muestra se coloca en las charolas y stas dentro de una cmara. Las charolas son calentadas por medio de chaquetas de vapor y la cmara cuenta con un sistema de vaco, lo cual permite el secado de la muestra a condiciones moderadas.
766
CAPTULO 13. SECADO

Alimentacin de los slidos
Salida de los slidos secos
Figura 13.6: Secador de lecho fluidizado.
Conexin de vado
Puerta
Charolas
(Conexiones para _T~ calentamiento
JJ,
J,
Figura 13.7: Secador de charola.
767
Secador de Doble Cono

El secador de doble cono es un secador giratorio al vaco (Figura 13.8), que tiene dos conos unidos por sus bases por medio de un cilindro corto. Este recipiente gira sobre un eje para inducir el movimiento del material y evitar zonas de sobrecalentamiento. El secador cuenta con un sistema de vaco para facilitar el secado. Este tipo de secador es ampliamente utilizado en la obtencin de productos biotecnolgicos a escala industrial.
Secador Tipo Tambor Rotatorio

El secador tipo tambor rotatorio (Figura 13.8b) es un recipiente cilindrico horizontal que no gira y el movimiento del material se realiza por accin de agitadores internos que remueven el material de las paredes calientes del tambor.
Liofilizadores
Los liofilizadores son utilizados para obtener slidos secos de alto valor comercial. Se emplean cuando los slidos muy lbiles o frgiles para ser tratados por un mtodo convencional de secado o una filtracin, o bien son muy solubles (sales de sodio) de tal manera que no pueden ser obtenidos por precipitacin o cristalizacin. La liofilizacin ha sido empleada para la obtencin de enzimas, hormonas y otro tipo de protenas de uso farmacutico. En un proceso de liofilizacin (Figura 13.9) la solucin a secar con una concentracin entre 5-25 % peso/volumen se alimenta a un sistema de filtrado (0.2 (m) para ser esterilizada y entrar al secador que opera en forma estril. En el proceso de secado la solucin primero se congela, y posteriormente se deshidrata mendiante un sistema de calentamiento y un sistema de vaco, acoplados de tal manera que el agua de la muestra siempre est en forma slida y su prdida sea slo por sublimacin.
768
CAPTULO 13.
SECADO
conexiones para calentamiento conexin de vaco
motor
(a)
vlvula de descarga
agitador
alimentacin
conexin
de vacjo
motor vlvula de descarga
(b)
Figura 13.8: a) Secador de doble cono b) Secador de tambor rotatorio.
13.4. DISEO DE SECADORES

placa de P--" calentamiento
769
muestra congelada chaqueta refrigerada cubierta seca ndeo congelado
producto seco
Figura 13.9: Proceso de liofilizacin.
13.4
Diseo de Secadores
Los mtodos para el diseo de equipos de secado estn ntimamente relacionados con la forma en que se transfiere el calor en el equipo y con el grado de complejidad de la descripcin del mismo. Dos tipos de diseo de secadores son de particular importancia: Diseo de secadores adiabticos. Diseo de secadores no adiabticos.
13.4.1
Diseo de Secadores Adiabticos
El diseo de un secador requiere de la determinacin de valores experimentales. Para obtener experimentalmente la velocidad de secado de un material slido, se procede a colocar una muestra en una charola, de tal menera que slo se exponga la superficie del slido a la corriente de aire que se utilice para secar. La variacin de la humedad del slido puede medirse por medio de una balanza. Las condiciones de secado deben ser constantes y aproximadamente iguales a las que se utilizarn a gran escala. La Figura 13.10 muestra una curva tpica de un secado experimental. La Figura 13.10a muestra la variacin del contenido de humedad de
770
CAPTULO 13.
SECADO
Tiempo
Contenido de agua
Figura 13.10: Curva de secado experimental. Tomada de: Porter ti a/, 1973.
Reproducida con el permiso de Me Graw Hill inc. Copyright 1973. Todos los derechos reservados.
slido (W) con el tiempo. Diferenciando estos datos se puede obtener la velocidad de secado y granearla contra el contenido de humedad como aparece en la Figura 13.10b, o contra el tiempo. Revisando la forma de las curvas de la Figura 13.10 se observan dos regiones: La regin A-B de las curvas, donde la humedad del slido desciende linealmente y la velocidad de secado se mantiene constante, llamada regin de velocidad de secado constante; y la regin B-C de las curvas donde la humedad decrece en forma ms lenta y la velocidad de secado desminuye con el tiempo, llamada regin de velocidad de secado decreciente. Las regiones caractersticas del secado pueden ser racionalizadas en
13.4. DISEO DE SECADORES funcin de los conceptos: - Agua libre en el slido. - Agua ligada en el slido.
771
En la regin de velocidad de secado constante, se presenta la evaporacin del agua libre, de tal manera que su movimiento a travs del slido por capilaridad o difusin es ms rpido que su velocidad de evaporacin. El secado se efecta por evaporacin de agua de la superficie saturada del slido a travs de la pelcula estancada de aire localizada sobre ste. Cuando esta superficie empieza a perder el 100 % de saturacin la velocidad de secado desminuye. El agua ligada empieza a evaporarse dentro del slido, y el vapor a difundirse a travs del slido hasta el aire. Este proceso es ms lento y por lo tanto retarda la velocidad de secado. Debido a la situacin descrita anteriormente, el tiempo de secado de un proceso debe ser calculado sumando los tiempos de los perodos de secado constante y de secado decreciente. Velocidad de Secado constante Cuando el calor de evaporacin en el perodo de velocidad de secado constante es proporcionado por aire caliente, se establece un equilibrio dinmico entre la velocidad de transferencia de calor del aire al slido y la velocidad de evaporacin. Bajo estas condiciones la superficie del slido alcanza la temperatura de saturacin adiabtica o temperatura de bulbo hmedo. De acuerdo a la Figura 13.11 la velocidad de transferencia convectiva de calor q (energa / tiempo) est dada por: q = \\A(T-Ti) donde: h: Coeficiente de transferencia de calor entre la superficie del slido y la pelcula estancada de aire sobre sta (anlogo a los coeficientes de transferencia de masa), [cal/L2 t}. A: rea expuesta al secado. [Z/ 2 ]. (13.17)
772
CAPTULO 13. SECADO
gas
T. H, C
Cj.Tj.Hj
Humedad hada la superficie
Figura 13.11: Transferencia convectiva de calor. T: Temperatura en el seno del aire. []. T: Temperatura en la superficie del slido. El flux msico de agua puede ser expresado como:
J = k(d - C)
(13.18) (13.19)
J = kp(Hi-H) donde:
J: Flux de agua. [M/L2 - t]. C{\ Concentracin de agua en la superficie del slido. [M/L3]. C: Concentracin de agua en el seno del aire. [M/L3].
k: Coeficiente de transferencia de masa en la pelcula estancada de aire sobre el slido. [L/t]. p : Densidad de aire seco. [M aire seco/L3 de mezcla].
p: l/VH
El balance de agua en el sistema puede expresarse como:

m
dW = -JA dt
(13.20
773
donde m es la masa de slido seco utilizado y W la humedad del slido. Combinando las ecuaciones (13.19) y (13.20) se obtiene: (13.21)
dt
este resultado es difcil de utilizar debido a que generalmente las humedades no son medidas directamente. Entonces las humedades de la ecuacin (13.21) se expresan en funcin de temperaturas combinando esa ecuacin con el balance de energa. En un proceso adiabtico la transferencia de calor del aire al slido es igual al total del calor latente de evaporacin, de tal manera que: Calor transferido = (Calor latente de evaporacin) (Masa evaporada) o bien, q = XJA (13.22)
Combiando las ecuaciones (13.17), (13.21) y (13.22) se puede obtener la siguiente expresin:
esta ecuacin es equivalente a la ecuacin (13.21), pero est expresada en funcin de dos temperaturas fcilmente medibles: la temperatura de bulbo seco del aire T y la temperatura de saturacin adiabtica o temperatura de bulbo hmedo Tt. Se puede calcular el tiempo de secado en el perodo de velocidad de secado constante integrando la ecuacin (13.23) entre los limites siguientes: t=O W = W0 t = tc W=WC obtenindose:
,, \\A(T -
(13.24)
774
CAPTULO 13. SECADO
donde tc es el tiempo para alcanzar la humedad crtica del slido que es la humedad a la cual termina el perodo de velocidad de secado constante. Para el clculo de tc es necesario calcular h. Este coeficiente depende de la geometra del secador: En el caso de secado con flujo de aire paralelo a la superficie de un slido y una temperatura entre 45 150C, el coeficiente de transferencia de calor puede ser evaluado con la ecuacin, h = 0.0204 G-8 donde: G: Flux msico de aire. [Kg/h m 2 )]. h: Coeficiente de transferencia calor. [Wattsm2 A']. En el caso de gases en flujo turbulento y sistemas aire-agua, tambin puede ser utilizada la analoga de Reynolds la cual establece una relacin directa entre el coeficiente de transferencia de masa y el coeficiente de transferencia calor de la siguiente forma:
k = -^ pCp (13.26)
(13.25)
donde: k: Coeficiente de transferencia de masa dado por la ecuacin (13.18). p: Densidad msica total del gas. Cp: Capacidad calorfica. [cal/M0]. La ecuacin (13.24) puede ser utilizada en forma combinada con la ecuacin (13.25) o con la (13.26).
13.4. DISEO DE SECADORES Velocidad de Secado Decreciente
775
En el perodo de secado de velocidad constante generalmente se evapora la mayor parte del agua contenida en el slido, pero puede implicar slo una pequea fraccin del tiempo total de secado. Por otro lado, el perodo de velocidad de secado decreciente puede involucrar una evaporacin menor de agua pero una mayor fraccin del tiempo total de secado. En el perodo de velocidad de secado decreciente la evaporacin del agua (ligada) es ms difcil, la velocidad de evaporacin depende de su movimiento por difusin o capilaridad al interior del slido en forma de vapor o en forma de lquido. El anlisis detallado del perodo de velocidad de secado decreciente es complejo y su descripcin se realiza en forma aproximada. Uno de los modelos ms sencillos para describir este perodo establece una relacin lineal de la velocidad de secado con la humedad, de la siguiente forma:
dt
= -aW
(13.27) v ;
donde a es una constante. La ecuacin (13.27) puede integrarse entre los lmites:
t = te t =t W =WC W =W
1
obtenindose la ecuacin siguiente: *-* = -ln^

W
(13.28)
El tiempo total de una operacin de secado puede calcularse sumando las ecuaciones (13.24) y (13.28):
En el diseo de secadores el clculo del tiempo de secado permite su dimensionamiento adecuado. En el caso de los secadores por aspersin, el tiempo de secado debe ser menor al tiempo que dura la partcula en alcanzar la pared del secador, de tal manera que cuando esto ocurra la partcula ya este seca y deslice suavemente por la pared del secador. Es decir, el tiempo de secado determina el dimetro del secador.
776
CAPTULO 13. SECADO

Ejemplo 13.8 .- Secado en la regin de velocidad constante.
Un material granular insoluble se va a secar en una charola de 45.7 x 45.7 x 2.54 cm. El material ocupa completamente la charola y se puede considerar que los lados y el fondo de la bandeja estn aislados, de tal manera que el calor slo se transmite por conveccin desde una corriente de aire que fluye paralela a la superficie a una velocidad de 6.1 m/s. El aire est a una temperatura de 65.6 C y tiene una humedad de 0.010 Kg de agua/Kg de aire seco. Estimar la velocidad de secado del slido. Solucin: Para el clculo de la velocidad de secado se utiliza la ecuacin (13.23):
m dW
El empleo de esta ecuacin requiere calcular T t , h y A. a) Clculo de T. Para una humedad de H = 0.010 y una temperatura de bulbo seco de 65.60C, mediante la carta psicomtrica y utilizando la linea de saturacin adiabtica se puede encontrar, T = 28.9C b) Clculo de h. Se puede utilizar la ecuacin (13.25) con G = vp. Para el clculo de la densidad del aire se necesita calcular el volumer hmedo del aire. Utilizando la ecuacin (13.10), , m3 de mezcla = (0.00283 + 0.00456//)(T + 273) Kg de aire seco m3 de mezcla = v(0.00283 + 0.00456 x0.01)(65.6 +273) ; : M [Kg de aire seco
VH
VH VH
= 0.974
m3 de mezcla Kg de aire seco
La densidad de 1.0 Kg de aire seco y 0.01 Kg de agua acompaant

es:
777
_ 1_+0.01 El flujo msico es:
G =
s/ \
h m2
G = 22,770
El coeficiente de transferencia de calor es:
h = 0.0204(22,770)'8 Watts
h = 62.45
m2 - K
c) Clculo de A El calor de evaporacin se obtiene de tablas de vapor a T, = 28.90C, este valor es: A = 2,433^ Kg y de acuerdo a la ecuacin (13.23),
m dW dt
m c?VF A dt
es:
62.45
x x ^ x (65.6 - 28.9)A' 2 , 4 3 3 x 1000 J
'
/^ de agua h m2
el rea de transferencia de acuerdo a las dimensiones de la charola
A = 0.457 m x 0.457 m /I = 0.209 m 2
778
CAPTULO 13.
SECADO
F-(Kg/h) 25% (Kg/Kg) 758C
Aire T=15 8 C H - 50 %
G
Calentador de aire 316 JSSL de antibitico h T = 60C, H= 5%
Figura 13.12: Secador por aspersin. de tal manera que la velocidad de secado es: dW Kg de agua m = 0.709 dt h Ejemplo 13.9.- Secado de un antibitico. Se requiere utilizar un secador por aspersin, en un arreglo como el que se muestra en la Figura 13.12, para secar una solucin de antibitico que contiene 25 % (Kg/Kg) de slidos y se encuentra a una temperatura de 20C. El aire que entra al secador es tomado de la atmsfera a 15 (7 y con 50 % de humedad, y es calentado hasta 150C en un intercambiador de calor utilizando vapor en forma indirecta. El aire de salida tiene una temperatura de 750C. La capacidad calorfica de los slidos es de 0.4 Kcal/Kg C y la temperatura de referencia es de 0C. Si se desea producir 316 Kg/h de antibitico, el cual sale con 5 % de humedad y a 60C, estimar: a) El flujo de alimentacin.
779
b) La cantidad de agua evaporada en el proceso. c) El flujo de aire necesario y la humedad de aire a la salida. Solucin: a) El flujo de alimentacin puede ser calculado mediante un balance de slidos. Entrada de slidos = Salida de slidos
( F}
f) 9*
"^ ~~ ~ '
/ 01,-
"^
f r> r\r
^^
SO
âOS \
Kg totales J
hJ \ F = 1200 I<9 h
Kg totales J
b) La cantidad de agua evaporada puede calcularse mediante un balance de agua en los slidos.
Agua evaporada Agua evaporada
= Agua a la entrada Agua en el producto = 1200 - 0.75 h ) V
Kg Kg\ f n, Kg _ r.05 h J\ Kg )
Agua evaporada
= 884 -r h
c) La humedad del aire a la salida y el flujo de aire, pueden calcularse mediante un balance de masa y un balance de energa. 67(# 2 -#i) = 884
HI puede encontrarse con los datos del aire de entrada y la carta pisicomtrica de la Figura 13.2, #1 - 0.005 Kg de aire seco El balance de energa est dado por: [Entalpia de la alimentacin] + [Entalpia del aire a la entrada]:
780
CAPTULO 13. [Entalpia del producto] -f [Entalpia del aire a la salida] La entalpia de la alimentacin est dada por: {a de slido
SECADO
0.4
K9
Kg slido - KQ\ ( Ka de aqua\ 1200 - 0.75 h ) \ Kg )

Kcal
\ Kg de agua C = 15,300
I<Cal
l5-0)'g
La entalpia del producto es:

deshdo
316
o.95
0
o.4 (6o -ore Kg solido- C J

316
,,
o.05
(60 - 0)'C
Kg de agua L
=
8,152.8^
La entalpia del aire a la entrada puede calcularse utilizando la ecuacin (13.12),
{[1.005 + (1.884)(0.005)] (150) (2502)(0.005)}

KJ Kg de aire seco J \4.187 KJ
13.4. DISEO DE SECADORES = 39.33 G Kcal h
781
de igual manera la entalpia de aire a la salida es:
{[1.005 + (1.884)(//2)] (75)+ Kg de aire secoJ y4.187 KJ Kcal 18 G + 631.3 GH-2
El balance de energa puede ser expresado como: (15,300) + (39.33 G) = (8152.8) + (18 G + 631.3 GH2) resolviendo simultneamente las ecuaciones de balance de masa y energa se obtiene:
G = 30,320
2
= 0.0341
Kg de aire seco
13.4.2
Diseo de Secadores no Adiabticos
En los secadores no adiabticos la velocidad de secado depende de la velocidad de transferencia de calor, a travs de una pared, hacia el slido que se desea secar. Este tipo de secado se efecta al vaco para remover rpidamente el vapor formado. La velocidad de secado debe ser tal que evite la formacin de zonas de sobrecalentamiento que daen el material. Dos tipos de secadores no adiabticos son de particular importancia: - Secadores no adiabticos de torta estacionaria. - Secadores no adiabticos giratorios.
782
CAPTULO 13. SECADO
lmite del slido
slido hmedo
Calor
Figura 13.13: Secado de tortas estacionarias. Secado de Tortas Estacionarias Para calcular el tiempo de secado de slidos en charolas o en liofilizadores se puede utilizar un modelo aproximado. De acuerdo con la Figura 13.13, el calor para producir la evaporacin (o la sublimacin) del agua, se transfiere por la pared del recipiente y a travs del slido. Este calor permite que el agua se evapore a partir de una superficie mvil localizada a una distancia Z. Arriba de esta superficie el slido est seco y abajo de ella hmedo. Conforme el slido se seca el frente desciende, aumentando la zona seca. Este modelo implica que tanto el agua lquida ligada como la no ligada, no se transportan en el interior del slido. De acuerdo con el modelo el secado del slido se logra cuando la distancia Z es igual a cero. El tiempo para lograr lo anterior se puede obtener realizando balances de energa. Suponiendo que la velocidad de secado es lenta, de tal manera que el calor transferido de la pared hacia el slido es igual al valor de estado estacionario (constante) dado por: q = \iA(T0-Tz) que para el caso de slidos puede ser expresada como: (13.30)
donde:
13A. DISEO DE SECADORES h: Coeficiente de transferencia de masa, [cal/ L2 t]. K: Conductividad trmica. [cal/L t]. T0: Temperatura en la base de la charola. []. TZ' Temperatura en el frente de secado. [j. q: Flujo de calor, [cal/t].
783
El calor transferido puede ser relacionado con el movimiento del frente de secado por medio del balance de calor en estado estacionario: [Calor transferido] = (Agua e vaporada) (Calor de evaporacin) o en forma de ecuacin: (13.32) donde: A: rea de la seccin transversal de la charola. [L2]. A: Calor de evaporacin. [cal/M].
p0: Concentracin de agua ligada y no ligada por volumen de slido mojado. [M/L3]. Combinando las ecuaciones (13.31) y (13.32) e integrando entre los limites,
t =t
se obtiene:
Z= Z
(13.33) al final de la operacin cuando t = t j , todo el slido est seco y Z O, la ecuacin (13.33) se puede expresar como:
784
CAPTULO 13. SECADO
[K(T0-TZ)\
(13.34)
Este resultado indica que el espesor de la torta es un factor importante en el tiempo de secado. Si el espesor se dobla el tiempo de secado se incrementa cuatro veces. La ecuacin (13.33) tambin puede utilizarse para calcular la evolucin del secado con el tiempo, como porcentaje o fraccin de la zona seca 0, expresndola de la siguiente manera: Z [ (2K(T.-TZ)\Y
-T i -I
= 1
p.w
)']
(13 35)
'
El anlisis anterior es sencillo y til como punto de partida en el diseo de secadores no adiabticos.
Secado Giratorio La descripcin del secado en equipos giratorios como los secadores de tipo tambor o los de doble cono, es ms compleja. La carga de materia se mueve constantemente, de tal manera que las partculas contactan h superficie caliente en forma intermitente y en repetidas veces, durant su residencia en el equipo de secado. El diseo de este tipo de secadores se basa en determinaciones ex perimentales a nivel piloto y un escalamiento considerando que el pro ducto del tiempo de secado, por el rea de secado por unidad de volu men, se mantiene constante al cambiar de escala, es decir:
A
Piloto V / Industrial
Esta ecuacin supone que las condiciones a nivel piloto son iguak a las de nivel industrial: Las temperaturas, los niveles de vaco, y ' porcentaje del volumen total que es ocupado por el slido.
13.5. SUMARIO
785
13.5
Sumario
El secado es una operacin empleada en la preparacin final de los productos. Consiste en una reduccin del contenido de humedad de los slidos con el propsito de mejorar su estabilidad, reducir su volumen y preservar su actividad. Las formas de realizar una operacin de secado se clasifican en adiabticos y no adiabticos. En el secado adiabtico se agrega aire caliente directamente sobre el material que se desea secar. El secado no adiabtico se realiza mediante un calentamiento indirecto del material de inters. Existen diversos equipos de secado, los cuales se pueden clasificar mediante la forma en que se realiza el secado. Los secadores adiabticos ms utilizados son el de aspersin, el secador instantneo y el de lecho fluidizado. Entre los no adiabticos se pueden citar los secadores tipo charola, de doble cono, tambor rotatorio y los liofilizadores. El diseo de los secadores est basado en una combinacin de la teora de secado y datos experimentales obtenidos directamente con el material de inters.
786
CAPTULO 13.
SECADO
13.6
Problemas
13.1.- El aire de una habitacin tiene una humedad H de 0.021 Kg de agua Kg aire seco, se encuentra a 32.2 C y a una atmsfera de presin. Calcular: a) El porcentaje de humedad del aire de la habitacin. b) El porcentaje de humedad relativa. Resp. (a) 67.5 % (b) 68.9 % 13.2.- Una mezcla ai re-vapor de agua tiene una temperatura de bulbo seco de 65.6C y una temperatura de bulbo hmedo de 32.2 C. Calcular la humedad de la mezcla. Resp. H = 0.0175 Kg de agua/Kg de aire seco 13.3.- Se desea secar aire con temperatura de bulbo seco de 37.8 C y temperatura de bulbo hmedo de 26.7 C, enfriando primero a 15.6 C para condensar vapor de agua y despus calentndolo a 23.9 C. (a) Calcular la humedad y porcentaje de humedad iniciales. (b) Calcular la humedad y el porcentaje de humedad finales. Resp. (b) H = 0.0115 Kg de agua/Kg de aire seco.%H = 60% 13.4.- Una torta de filtrado se coloca en una charola de 30.5 x 30.5 x 2.54 cm. Se seca por la parte superior con aire cuya temperatura de bulbo hmedo es de 26.6 C y su temperatura de bulbo seco es 48.9 C. El aire fluye en forma paralela a la superficie con una velocidad de 45.75 m/min. Estimar el tiempo para pasar el slido de una humedad inicial de 0.2 Kg de agua/Kg de slido seco, hasta su humedad crtica de 0.09 Kg de agua/Kg slido seco. Resp. t = 13.3 h 13.5.- En el secado de una muestra de 3.765 Kg de un alimento mediante.un flujo de aire sobre la superficie superior de una charola d< 0.186 m 2 de rea, se obtuvieron los siguientes datos:
13.6.
PROBLEMAS Tiempo (h) 0.0 0.4 0.8 1.4 2.2 3.0 4.2 5.0 7.0 9.0 12.0 Peso (Kg) 4.944 4.885 4.808 4.699 4.554 4.404 4.241 4.150 4.019 3.978 3.955
787
a) Granear los datos de humedad del slido W contra el tiempo. b) Obtener la velocidad de secado en cada punto y granearla contra la humedad del slido. c) Estimar la velocidad de secado en el perodo de velocidad constante. d) Estimar la humedad crtica. e) Estimar la humedad de equilibrio. f) Estimar el tiempo para disminuir la humedad del slido de 0.25 a 0.09 Kg/Kg. c) Resp. 0.996 Kg/h - m2; d) Resp. 0.17 Kg/Kg] e) Resp. 0.05 Kg/Kg] f) Resp. 4.1 h
788
CAPTULO 13. SECADO
13.7
Bibliografa
Belter, P.A., Cussler, E.L. y Hu, W. 1988. Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology. John Wiley and Sons. New York. 11, 307-333. Brocklebank, M.P. 1990. Downstream processing plant and equipment. En: Separation Processes in Biotechnology. Asenjo, J.A. (Ed.). Marcel Dekker. New York. 19, 617-740. De Vivo, J. 1983. Nonadiabatic drying. En: Fermentation and Biochemical Engineering Handbook. Principies, Process Design, and Equipment. Vogel, H.C. (Ed.). Noyes Publications. New Jersey. 11, 317-330. Porter, H.F., McCormick, P.Y., Lucas, R.L. y Wells, D.E. 1973. Gassolid systems. En: Chemical Engineer's Handbook. Perry, R.H. y Chilton C.H. (Eds.). 5th Ed. Me Graw Hill. New York. 20, 1-121. Quinn, J.J. 1983. Adiabatic drying. En: Fermentation and Biochemical Engineering Handbook. Principies, Process Design, and Equipment. Vogel, H.C. (Ed.). Noyes Publications. New Jersey. 12, 331-362. Treybal, R.E. 1980. Operaciones de Transferencia de Masa. Me Graw Hill. 2 ed. Mxico. 12, 723-791.
Apndice A Material Biolgico

A.l Introduccin
En los procesos de bioseparacin los productos finales pueden ser clulas enteras, compuestos extracelulares o compuestos intracelulares. El conocimiento de las caractersticas bsicas de estos productos es fundamental para el diseo, seleccin y manejo de las operaciones de biosparacin. En las operaciones de liberacin de producto es muy importante la naturaleza de la membrana y pared celular; en la adsorcin, precipitacin, electroforsis es necesario conocer las cargas externas de los productos, slo para citar algunos ejemplos. Con el propsito de resaltar algunas caractersticas bsicas de los productos biotecnolgicos, en este apndice se presenta una descripcin general de la estructura y funcin de las clulas y sus principales compuestos. En la seccin A.2 de este apndice se abordan algunos conceptos bsicos sobre la estructura celular, en la seccin A.3 se presentan las principales molculas biolgicas: protenas, lpidos, azcares y cidos nucleicos. Finalmente en la seccin A.4 se establece la forma como puede describirse el crecimiento celular.
A.2
Clulas y Virus
En 1938 Matthias Schleiden y en 1939 Theodor Schwann establecieron que las plantas y los animales estn compuestos de clulas, las cuales
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790
APNDICE A. MATERIAL BIOLGICO
son la unidad bsica de los seres vivos (Brachet, 1961). En la actualidad la teora celular comprende dos ideas bsicas: 1. Todos los seres vivos estn compuestos de clulas y productos celulares. 2. Slo se forman clulas nuevas a partir de clulas preexistentes. El conocimiento actual de los organismos vivos, desde los unicelulares hasta los vegetales y mamferos, permite afirmar que un organismo vivo es un sistema abierto, isotrmico, de molculas orgnicas autoensamblables, autorregulables y autoreplicables; operando bajo el principio de mxima economa en cuanto a partes y procesos, el cual promueve mltiples reacciones secuenciales para la transferencia de energa y para la sntesis de sus componentes, por medio de catalizadores orgnicos que ellos mismos producen (Lehininger, 1989). Los organismos vivos pueden clasificarse dependiendo de la estructura y complejidad de sus clulas en procariotes y eucariotes. Dentro de estas categoras se han agrupado desde los ms simples hasta los ms complejos. Recientemente el hombre ha sido capaz de modificar el contenido gentico de las clulas mediante la transferencia controlada de genes, creando las clulas recombinantes. Los virus constituyen tambin una entidad biolgica de gran importancia biotecnolgica, a pesar de no constituir propiamente organizaciones celulares. En esta seccin se revisan las caractersticas bsicas de cuatro tipc de organizaciones biolgicas que participan en las bioseparaciones: Clulas procariticas Clulas eucariticas Clulas recombinantes Virus
A.2. CLULAS Y VIRUS
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A.2.1
Clulas procariticas
Las clulas procariticas son las primeras clulas que surgieron de la evolucin biolgica, son tan sencillas que poseen nicamente una membrana celular y no contienen ncleo. Las dimensiones tpicas de estas clulas van de 0.5 a 3 fin. Dentro de los organismos procariotes se encuentran las bacterias y las algas cianfitas. La Figura A.l muestra la estructura de una clula de Escherichia coli (E. coli) que es una procariote tpica, as como sus principales componentes: pared celular, membrana, zona nuclear, ribosomas y granulos. La pared celular o membrana externa, es una estructura que encierra a toda la clula incluyendo la membrana plamtica y aparece en algunas clulas procariticas. Est compuesta de polisacridos, pptidos y lipoprotenas, y su funcin es darle proteccin a la clula La membrana plasmtica de las clulas procariticas delimita a la clula y est compuesta por un 45% de lpidos y un 55% de protenas. Esta membrana es una caracterstica comn a todas las clulas y tiene funciones nicas, entre las que destaca su papel como barrera altamente selectiva en la regulacin del transporte de molculas hacia adentro y hacia afuera de la clula. La regin nuclear est desprovista de membrana, razn por la cual en ocasiones el material nuclear (cido desoxirribonucleico o DNA) puede agruparse en ms de una regin. Es en las molculas de DNA donde se almacena la informacin gentica que le permite a la clula reproducirse y vivir. Los ribosomas son estructuras supramoleculares conformadas por dos subunidades, en ellas se lleva a cabo la traduccin del mensaje gentico para realizar la sntesis de protenas. Los granulos estn compuestos de polisacridos y funcionan como almacenes de combustible. El citosol es todo el material celular contenido por la membrana.
Bacterias
Las bacterias son los organismos procariticos de gran importancia biotecnolgca. An cuando existen miles de especies diferentes de
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APNDICE A. MATERIAL
BIOLGICO
Figura A.l: Estructura tpica de una clula procariote (E. coli). a) pared celular b) membrana plasmtica c) zona nuclear d) ribosomas e) granulos f) citosol.
A.2. CLULAS Y VIRUS
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bacterias, las clulas de estos organismos se caracterizan por presentarse solamente en una de tres formas diferentes: esfrica o elipsoidal, cilindrica o de bastn y helicoidal o de espiral. En particular, a las que presentan forma esfrica se les llama cocos y presentan un dimetro del orden de 1 fim. A las que tienen forma de bastn se les llama bacilos y tienen dimensiones del orden de 0.5 a 1.0 firn de ancho por 2 a 3 //ra de largo. Las diferencias morfolgicas entre las bacterias no son muchas, sin embargo presentan una gran diversidad fisiolgica que les ha permitido desarrollarse en una gran variedad de habitats, soportando pH's en el rango de 1 a 11, y temperaturas entre O y 92C'; siendo capaces de desarrollarse tanto en condiciones aerbicas como anaerbicas (Millis, 1985). Los productos que se obtienen mediante la fermentacin con clulas procariotes pueden ser: Biomasa o protema unicelular; Productos finales como solventes y cidos. Metabolitos primarios como aminocidos, protenas y nucletidos. Metabolitos secundarios como antibiticos, pigmentos y polisacridos. En la Tabla A.l se presentan algunas de las clulas procariticas que se utilizan para producir productos finales y metabolitos. Al utilizarse una bacteria para obtener un producto biotecnolgico, se pueden presentar dos casos: que la bacteria excrete el producto como parte de su metabolismo, o que el producto permanezca dentro de la bacteria. En el segundo caso cobra especial importancia el conocimiento que se tenga sobre las estructura de la pared y de la membrana celular, as como el de la ubicacin del producto, ya que el proceso de bioseparacin que se disee debe contemplar la ruptura de la clula. En el estudio de la pared celular de bacterias se ha empleado la tcnica de tincin de Gram que ha permitido clasificar a las bacterias en bacterias Gram positivas (Gram-(-) y bacterias Gram negativas (Gram). En la Tabla A.2 se presenta una comparacin de las principales caractersticas de estas bacterias(Tortora et a/, 1989).
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Tabla A.l: Productos obtenidos de organismos procarioticos

Producto Organismo Producto Enzimas Amilasa Asparagiiiasa Catalasa Fumarasa (3- Glucanasa Glucosa isomerasa C. gluiamicum " " " " Lactasa Penicilin acilasa Peuiciliiiase B. subtilis E. coli E. carotovora M. lysodeikticus B. ammoniagenes B. subtilis B. circulara A. mussouriensis B. coagulants E. coli E. coli, B. megaterium B. subtilis
Organismo
cidos (orgnicos) Actico Glucnico Lctico 2-Oxoglucnico cidos (amino) Glutmico Isoleucina Leucina Lisina Valina A. aceti P. ovalis L. delbrueckii P. fluorescens
Antibiticos de Bacilos
Colistina Gramicidina S. Bacitracin Antibiticos de Estreptomices Cloranfenicol Eritromicina Kanamicina Lincomicina Estreptomicina Tetraciclina 5. venezuelae 5. eriytkreus 5. canamyceticus S. lincolnensis 5. griseus S. aureojaciens B. polymyxa B. brevis B. lich.eniform.is
Nucletidos Acido guanlico Acido Xantlico Polisacridos Dextran

Xantana
B. B. B. B.
subtillis ammoniagenes subtillis ammoniagenes
L. mesenteroides X. campestris
Solventes/combustibles Acetona Etanol
C. acetobutylicum Z. mobilis
Fuente: Millis, 1985. Reproducida con el permiso de Elsevier Science Inc. Copyright 1985. Todos los derechos res vados.
A.2. CLULAS Y VIRUS
795
Tabla A.2: Caractersticas comparativas de las Bacterias Gram-f y Gram-. Caracterstica Reaccin Gram Gram-Positiva Gram-Negativa Puede ser decolorada Retiene el cristal violeta y permanece y permanece roja de color prpura Gruesa (multicapa) Delgada (simple) Virtualmente no tiene Bajo Abundantes Ausente Ausente Exotoxinas primarias Alta Alta Marcada Alta Alto Alto Ausentes Presente Presente Endotoxinas primarias Baja Baja (requiere pretratamiento) Mucho menos marcada Baja
Capa de peptidoglucano Contenido de lipopolisacridos Contenido de lpidos y lipoprotenas cidos teicoicos Espacio periplsmico Membrana exterior Produccin de toxinas Resistencia a rompimiento fsico Rompimiento de la pared celular por lisozima Suceptibilidad a detergentes amnicos Resistencia a secado
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Las paredes celulares de las bacterias Gram-f y Gram- (Figura A.2) poseen una caracterstica molecular comn, en ambas existe un rgido esqueleto que est constituido por cadenas polisacridas paralelas, entrecruzadas covalentemente por medio de cadenas peptdicas. Este rgido armazn, recibe el nombre de peptidoglucano o murena. La unidad bsica que se repite en la estructura del peptidoglucano es la de disacrido constituido por N-acetil-D-glucosamina y el cido Nacetilmurmico. En las paredes de las clulas Gram-positivas la capa de peptidoglucano es mucho ms gruesa que en las clulas Gram-negativas. En estas ltimas la capa de peptidoglucano se encuentra localizada en el espacio periplsmico enlazndose covalentemente a las lipoprotenas de la capa exterior de la pared celular. El espacio periplsmico esta constituido por una sustancia semejante a un gel, que contiene una alta concentracin de enzimas degradativas y protenas de transporte. La estructura del peptidoglucano de la pared celular bacteriana es resistente a la accin de las enzimas que hidrolizan los pptidos, las cuales no atacan a los pptidos que contienen D-aminocidos como los que se encuentran en la estructura de la pared (D-alanina, Dglutamina).
A.2.2
Clulas Eucariticas
La clula eucaritica tiene un alto nivel de organizacin y presenta une estructura muy compleja. Son clulas de mayor tamao que las proca riotes alcanzando dimetros hasta de 20 jum. En las clulas eucariotica: las funciones se llevan a cabo en organelos, cada uno de los cuale realiza una funcin especfica y est limitado por una membrana propia Son clulas que tienen un ncleo verdadero, ya que ste esta confinadpor la membrana nuclear. Los microorganismos constituidos de clula eucariotes son: algas, protozoarios y hongos. De este tipo de clula estn constituidos adems, los organismos superiores como los vegetak y los animales. En la Figura A.3 se presentan esquemas de clulas eucaritic tpicas: .clula animal y clula vegetal; puede verse en la figura qi existen algunas diferencias esenciales entre las clulas vegetales y 1; animales, algunas de las ms relevantes son las siguientes:
A.2. CLULAS Y VIRUS
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pared celular capas de peptidoglucano
(a)
fosfolpido proteina
capa de peptidoglucano
lipoprotena
lipopolisacarido fosfolfpido
pared celular
membrana plasmtica
(b)
fosfolpido
Figura A.2: Estructura de la pared celular bacteriana, a) bacterias Grarn-)- b) bacterias Gram-.
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En las clulas vegetales existe una rgida pared celular, constituida por celulosa, cuya funcin es similar a la de las clulas procariticas: brindar proteccin a la clula. Las clulas animales no presentan pared celular. Las clulas vegetales presentan cloroplastos, que son los organelos en los cuales se lleva a cabo la captura de la energa solar y la conversin de la misma en energa qumica durante el proceso fotosinttico. Los cloroplastos estn ausentes de las clulas animales. En la Tabla A.3 se presenta una descripcin de las estructuras celulares comunes a todas las clulas eucariticas, y sus funciones. En la seccin anterior se prest atencin especial a las bacterias pues este tipo de microorganismos es de particular inters en la biotecnologa. En el caso de las clulas eucariotes adems de las clulas de organismos superiores, interesan particularmente los hongos. Los hongos son microorganismos de dos tipos: mohos y levaduras. Los mohos son hongos superiores con estructuras vegetativas llamadas miscelios, presentan un dimetro entre 5 1 5 fim y una longitud entre 50 5000 /ira. Las levaduras tienen forma elipsoidal y miden de 1 a 5 fj,m. Las levaduras son ampliamente usadas, por ejemplo en \ produccin de bebidas y pan, mientras que los mohos se utilizan en le produccin de cido ctrico y antibiticos. En la Tabla A.4 se presen tan algunos productos obtenidos a partir de algunas clula eucariote: (levaduras y mohos). Recientemente tambin las clulas eucariticas animales han sid( utilizadas en los procesos biotecnolgicos. Las clulas animales presen tan varias formas dependiendo del tipo de tejido al cual pertenecen ^ su dimetro aproximado es de 20 //m. A diferencia de las clulas mi crobianas, la velocidad de crecimiento en las clulas animales es baja Su crecimiento presenta inhibicin por contacto. Con frecuencia la clulas animales se cultivan o crecen formando tumores y actualment se estn desarrollando nuevas tcnicas tanto para su cultivo como par su cosecha. El cultivo de clulas animales presenta problemas que a: no se solucionan del todo y se encuentra en una etapa de desarrolle
A.2. CLULAS Y VIRUS
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Cuerpo de inclusin
Citoplasma
Vacuola
Membrana celular Tilacoides Cloroplasto
Figura A.3: Clulas eucariotes tpicas: a), clula animal; b) clula vegetal.
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Tabla A.3: Estructuras comunes de las clulas eucariticas y sus funciones.

Estructura
Descripcin
Funcin
Ncleo Celular Ncleo Nuclolo Gran estructura rodeada por una doble membrana, contiene nuclolo y cromosomas Cuerpo granular dentro del ncleo, consta de RNA y protenas. Compuestos de un complejo de DNA y protenas llamado cromatina. Control de la clula Lugar de sntesis ribosmica; ensamble de subunidades del ribosoma Contienen genes (unidades de informacin hereditaria que gobiernan la estructura y actividad celular). Contiene al citoplasma, regula el paso de materiales haca dentro y fuera de la clula; ayuda a mantener la forma celular; comunica a la clula con otras. Sitio de sntesis de lpidos y de protenas de membrana; origen de vesculas intracelulares de transporte, que acarrean protenas en proceso de secrecin. Sntesis de polipptidos (protenas) Modifica, empaca (para secrecin) y distribuye protenas a vacuolas y a otros organelos. Contiene enzimas que degradan material ingerido, las secreciones y desperdicios celulares. Transporta y almacena material ingerido, desperdicios y agua.
Cromosomas
Sistema de Membranas de la Clula Membrana Celular Membrana limitante de la Clula viva
Retculo endoplasmtico (RE)
Red de membranas internas que se extienden a travs del citoplasma
Ribosomas
Aparato de Golgi
Granulos compuestos de RNA y protenas, algunos unidos al RE, otros libres en el citoplasma Compuesto de saculacioiies membranosas planas Sacos membranosos (en animales) Sacos membranosos (en plantas, hongos y algas)
Lisosomas
Vacuolas
A.2. CLULAS Y VIRUS
801
Tabla A.4: Productos obtenidos de organismos eucariotes

Organismos cidos Ctrico Furnrico Glucnico Antibiticos Cefalosporina (C y P) Zeranol Penicilinas Enzimas a Amilasa Catalasa Glucosa oxidasa Invertasa Lipasa Proteasa - Acida - Alcalina - Neutra Solvente/combustible Etanol A. niger R. nigricus A. niger C. acremonium F. graminearum P. chrosogenum A. oryzae; A. niger A. oryzae, A. niger A. oryzae; A. niger S. cereviseae A. oryzeae; A. niger M. rn.ieh.ei A. oryzae; A. niger A. oryzae A. niger; A. oryzae S. cereviseae
Conversin de esteroides Deshidrogenacin en 1 y 2 C. radicla Hidroxilacin en F. javanicum 6, 7,9, 11 y 15 C. lunata, R. nigricans, A. ochraceus, A. niger Vitaminas Riboflavina Adaptada de: Millis, 1985. Reproducida con el permiso de Elsevier Science Inc. Copyright 1985. Todos los derechos reservados. A. gossypii
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APNDICE A. MATERIAL
BIOLGICO
Tabla A.5: Productos obtenidos de clulas animales

Producto Interfern Urokinasa Vacunas virales: Influenza Enfermedad de Newcastle Rubola Fiebre amarilla Adaptada de: Millis, 1985. Reproducida con el permiso de Elsevier Science Inc. Copyright 1985. Todos los derechos reservados. Linea celular Leucocitos humanos Rion humano Fluido Fluido Fluido Fluido de de de de embrin embrin embrin embrin de de de de pollo pollo pato pollo
En la Tabla A.5 se presentan algunos productos obtenidos a partir de este tipo de clulas.
A.2.3
Clulas Recombinantes
La manipulacin de la molcula de DNA utilizando tcnicas de inge niera gentica ha permitido transformar clulas silvestres en clula recombinantes. La organizacin celular de la recombinante es la mism que la de la clula natural, slo que a las clulas recombinantes se le ha transferido o adicionado uno o ms genes, con el propsito que 1 clula exprese la informacin que est codificada en tales genes. De est manera, por medio del cultivo de clulas recombinantes ha sido posibl la obtencin de productos tales como hormona de crecimiento, insulin humana, interferones, activador del plasmingeno tisular, vacunas, anticuerpos monoclonales, entre otros. Los microorganismos ms utilizados para producir clulas recomb nantes son las bacterias y en particular la E. coli. Debido a la simp cidad de las clulas procariticas y a su alta velocidad de crecimient ha sido posible aplicar exitosamente en estas clulas las tcnicas de ingeniera gentica.
A.3. BIOMOLECULAS.
803
A.2.4
Virus.
Los virus constituyen un material biolgico cuya nica funcin es la autoreplicacin, lo cual ocurre nicamente cuando parasitan a una clula. El virus carece de membrana y no tiene citoplasma. Su genoma puede estar constituido por DNA o RNA pero nunca por ambos y constar de una o dos cadenas. El genoma se encuentra encerrado dentro de una cpsula constituida de protena. Su tamao vara entre 0.03 0.1 //m y su importancia radica en que son ampliamente utilizados en la produccin de vacunas. En general los virus se clasifican por sus caractersticas morfolgicas.
A. 3
Biomolculas.
En esta seccin se estudia la estructura y principales propiedades de cuatro tipos de molculas constituyentes de las clulas: Protenas Carbohidratos Lpidos cidos nucleicos
A.3.1
Protenas
Las protenas son polmeros de alto peso molecular formadas por subunidades llamadas aminocidos. Son las molculas orgnicas ms abundantes en la clula, constituyen el 50% o ms de su peso seco. El peso molecular de stas oscila entre 5,000 y 40,000,000 daltons. Existen muchas clases diferentes de protenas y cada una de ellas se especializa en una funcin biolgica diferente. Cada protema tiene en su forma nativa una forma tridimensional caracterstica llamada conformacin. De acuerdo a su conformacin las protenas pueden clasificarse en fibrosas y globulares. En la Tabla A.6 se listan algunas protenas de estos tipos y se especifican sus funciones.
804
Tabla A.6: Clasificacin de las protenas por su funcin biolgica

Tipos y ejemplos Enzimas: Hexoquinasa Citocromo c DNA-polimerasa Protenas de reserva: Ovoalbmina Casena Ferritina Protenas de transporte: Hemoglobina Mioglobina Seroalbmina /?i-Lipoprotena Localizacin o funcin Fosforila glucosa Transfiere electrones Replica y repara DNA
Proteiia de la clara de huevo Protena de la leche Reserva de hierro en el bazo
Transporta O- en la sangre de los vertebrados Transporta O- en el msculo Transporta cidos grasos en la sangre Transporta I/pidos en la sangre
Protenas contrctiles: Miosina Dinena Protenas protectoras en la sangre de los vertebrados: Anticuerpos Fibringeno Trombina Toxinas: Toxina diftrica Venenos de serpiente Gosipina Hormonas: Insulina Hormona adrenocorticotrpica Hormona del crecimiento Protenas estructurales: Protenas de recubrimiento viral Glucoproteiias a-Queratina Colgeno Elastina Mucoproteiias
Filamentos estacionarios en las miofibrillas Cilios y Bjelos
Forman complejos con protenas extraas Precursor de la fibrina en la coagulacin sangunea Componente del mecanismo de coagulacin
Toxina bacteriana Enzimas que hidrolizan los fosfoglicridos Protena txica de la semilla de algodn
Regula el metabolismo de la glucosa Regula la sntesis de corticoesteroides Estimula el crecimiento de los huesos
Cubierta alrededor del cromosoma Recubrimientos celulares y paredes Piel plumas uas pezuas Tejido conectivo fibroso (tendones, carflago) Tejido conectivo elstico (ligamentos) Secreciones mucosas, fluido sinovia!
A.3.
BIOMOLECULAS. Tabla A.7: Clasificacin de las protenas conjugadas

Protena Conjugada Nucleoprotena Lipoprotena Glicoprote/na Hemoprotena Flavoprotena Metaloprotena Grupo Prosttico Acido nucleico Lpido Oligosacrido Hierro Nucletido de flavina Metal
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Las protenas fibrosas son insolubles en agua y en soluciones salinas diluidas, fsicamente son muy resistentes y constituyen los elementos estructurales bsicos del tejido conjuntivo de los animales superiores. Ejemplos de esta clase de protenas son el colgeno, la aqueratina y la elastina. Las protenas globulares por regla general son solubles en agua y tienen una funcin activa dentro de la clula. Todas las enzimas son protenas globulares, tambin los anticuerpos, algunas hormonas y muchas protenas de transporte como la hemoglobina. Dependiendo de su composicin, las protenas se dividen en simples y conjugadas. Las simples son aquellas que por hidrlisis producen solamente aminocidos y contienen generalmente 50% de carbono, 23% de oxgeno, 7% de hidrgeno, 16% de nitrgeno y de O a 3% de azufre. Las conjugadas son aquellas que por hidrlisis producen no solamente aminocidos, sino tambin algunos componente orgnicos o inorgnicos. La porcin no aminocida de la protena conjugada se denomina grupo prosttico. De acuerdo a la naturaleza qumica de este grupo las protenas conjugadas se clasifican en los seis grupos que se muestran en la Tabla A.7 (Palmer, 1991). Todas las protenas que se conocen tienen funciones diferentes dentro de la clula y estn constituidas por nicamente 20 tipos de aminocidos, lo que sugiere que la funcin de cada una de ellas puede estar determinada por la secuencia de aminocidos de su cadena polipptidica. En consecuencia es importante conocer la estructura de los aminocidos que las constituyen.
806
APNDICE A. MATERIAL
BIOLGICO
H I R-C-COOH I
NHa
Figura A.4: Frmula de la estructura general de los a aminocidos encontrados en las protenas Aminocidos La Figura A.4 muestra la estructura general de los 20 aminocidos que se encuentran en las protenas. Todos ellos tienen un grupo carboxilo libre y un grupo amino libre, excepto la prolina. Todos los aminocidos encontrados en las protenas son a aminocidos, puesto que el grupo amino est sobre el tomo de carbono a. Los aminocidos se caracterizan adems por una cadena lateral o grupo R sustituido en su carbono a. Los a aminocidos se han clasificado en base a la polaridad de sus grupos R. De acuerdo a esta clasificacin existen dos clases principales de aminocidos: con grupos R no polares y con grupos R polares. Aminocidos con grupos R no polares: Un grupo no polar e; enteramente covalente y es hidrofobia), es decir, es relativamente in soluble en soluciones acuosas y soluble en solventes orgnicos com< el hexno. Los aminocidos no polares o hidrofbicos son: alanina leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano y metionina Los grupos R de los primeros cinco son hidrocarburos alifticos, el grup> R del ltimo contiene azufre y los dos restantes contienen un anill aromtico dentro del grupo R. Aminocidos con grupos R polares: Un grupo R polar tieri carcter inico y es hidroflico, es ms soluble en agua que un n polar debido a que en soluciones acuosas su estructura puede ser e; tabilizada por puentes de hidrgeno. Los grupos polares pueden s<
A.3. BIOMOLECULAS. neutros, bsicos o cidos.
807
1. Polares sin carga : En este grupo se encuentran los aminocidos: serina, treonina y tirosina que deben su polaridad a sus grupos hidroxilo; la asparagina y la glutamina cuya polaridad proviene de sus grupos amdicos; la cistena cuya polaridad proviene de la presencia de un grupo sulfhidrilo y finalmente la glicocola, que en muchos casos se considera como no polar. Dentro de estos aminocidos, la cistena y la tirosina son los que presentan una polaridad ms marcada. 2. Polares con carga positiva (bsicos): En este grupo se encuentran los aminocidos que poseen carga neta positiva a pH 7. Todos ellos tienen seis tomos de carbono y son: lisina, arginina e histidina. La histidina presenta un grupo funcional imidazol y posee propiedades lmites. A pH 6 ms del 50% de las molculas de histidina poseen un grupo R cargado positivamente, pero a pH 7 menos del 10% de ellas poseen carga positiva. 3. Polares con carga negativa (cidos): Los aminocidos que presentan carga neta negativa a pH 7 son los cidos asprtico y glutmico. Presentan carga negativa debido a que cada uno de ellos posee en el grupo R un segundo grupo carboxilo que se encuentra completamente ionizado y, por lo tanto, cargado negativamente. Propiedades cido-bsicas de los aminocidos. En gran medida la comprensin del comportamiento de las protenas est basada en el conocimiento de las propiedades cido-base de los aminocidos que la constituyen. Los aminocidos tanto en forma cristalina como en solucin, presentan una estructura ionizada que genera considerables momentos dipolares. Esto se traduce en altas constantes dielctricas y altos puntos de fusin. En la Figura A.5 se muestran las formas: no ionizada y de ion hbrido de los aminocidos. El comportamiento cido-base de los aminocidos se formula en trminos de la teora de Brnsted-Lowry. De acuerdo con esta teora, cuando un aminocido en forma de ion hbrido cristalizado se disuelve
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H I
APNDICE A, MATERIAL
H |
BIOLGICO
R C COOH
NH2
R c COO
Figura A. 5: Formas de un aminocido: a) no disociada b) de ion hbrido. en agua, puede actuar como un cido (donador de protones) o como una base (aceptor de electrones). Por ejemplo, si se disuelve alanina en agua sta puede actuar en alguna de las siguientes formas (Lehninger, 1989): como cido: H3N+CH(CH3)COO~ <-* H+ + H2NCH(CH)3COQcomo base: H+ + H3N+CH(CH3)COQ- -> H3N+CH(CH3)COOH las sustancias que poseen esta propiedad son anfteras y se denominar anflitos. Niveles Estructurales de la Protena Comnmente se emplean cuatro trminos para designar los diferente; niveles estructurales de la protena: estructura primaria, estructura secundaria, estructura terciaria y estructura cuaternaria. Estructura Primaria. Los aminocidos que forman las protenas, s< encuentran unidos entre s formando las llamadas cadenas peptdicas La estructura primaria como se muestra en la Figura A. 6 a), es la s cuencia de aminocidos que forma el esqueleto covalente de dichas ca denas. Un enlace peptdico une el grupo a carboxilo de un aminocid. con el grupo a animo de el siguiente aminocido de la cadena. Est
A.3. BIOMOLECULAS.
809
a) Estructura primara: scuncfa d* aminocidos

R R* R
H H O H H O H H O H H O b) Estructura secundaria: hlice y laminar
aminocido
c) Estructura terciaria.
d) Estructura cuaternaria.
Figura A.6: Niveles estructurales de la protena: a) Estructura primaria b) Estructura secundaria c) Estructura terciaria d) Estructura cuaternaria.
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APNDICE A. MATERIAL
BIOLGICO
es un enlace covalente altamente estable en el cual el grupo imino (NH-) del enlace no posee tendencia significativa a ionizarse o a captar protones en el intervalo de pH entre O y 14 y el enlace C-N (que posee 40% de carcter de enlace covalente doble) del enlace peptdico es relativamente rgido y no puede girar libremente. Cuando dos aminocidos se unen por medio de este enlace se pierde una molcula de agua, por lo que se comunmente se dice que slo se unen los residuos. En esta estructura los grupos R quedan fuera de la cadena y cada cadena presenta en un extremo un grupo aamino libre y en el otro extremo un grupo carboxilo libre. Existe una amplia evidencia experimental que indica que el enlace peptdico es el nico enlace covalente que existe entre los aminocidos que forman la cadena. Sin embargo, puede presentarse otro tipo de enlace covalente que es el enlace disulfuro de la cisteina. Este acta en algunas protenas como enlace transversal entre dos cadenas polipeptdicas separadas o entre curvaturas de una misma cadena. Estructura Secundaria: La estructura secundaria de una protena (Figura A.6 b) se refiere al ordenamiento regular y peridico que presenta al menos parte de una cadena polipeptdica a lo largo de una direccin, el cual es estabilizado por puentes de hidrgeno entre los grupos R de la misma cadena. La estructura secundaria es caracterstica en las protenas fibrosas. La direccionalidad del ordenamiento se pierde con la presencia de ciertos aminocidos en este arreglo regular y se pasa a otro nivel estructural. Estructura Terciaria: El hecho de que existen aminocidos que pueden ocasionar el cambio de direccin de la cadena, conduce a que exista un gran nmero de diferentes posibles estructuras de la cadena originadas por la libre rotacin alrededor de los enlaces en ese punto de doblamiento. Sin embargo, se ha encontrado que cada cadena polipeptdica tiene solamente una forma caracterstica de doblamiento en esos puntos, a este arreglo especfico se le llama estructura terciaria. Este tipo de estructura es estabilizada por los enlaces que se presentan entre los residuos aminocidos de diferentes partes de la cadena. Debe notarse que debido al giro de la cadena peptdica, dos aminocidos que
A.3. BIOMOLECULAS.
811
estn muy separados entre s en la estructura primaria, pueden quedar espacialmente juntos en la estructura terciaria. Estructura Cuaternaria: La estructura cuaternaria se refiere a la estructura tridimensional completa de una protena. Esto es, la forma en que se disponen en el espacio las cadenas polipeptdicas individuales de una protena que posee ms de una cadena. La mayora de las protenas grandes, ya sean globulares o fibrosas poseen dos o ms cadenas polipeptdicas. Conformacin: A la estructura combinada secundaria, terciana y cuaternaria de una protena se le llama conformacin. Las cadenas polipeptdicas de una protema poseen solamente una conformacin en condiciones normales de temperatura y pH. Se denomina conformacin nativa y es la que le confiere actividad biolgica y estabilidad a la protena. Las protenas mantienen su actividad biolgica slo en un estrecho rango de temperatura y pH. Cuando las protenas globulares se exponen a pH extremos o a altas temperaturas pierden su conformacin y consecuentemente su actividad. En estas condiciones se dice que la protena est desnaturalizada, siendo el efecto ms visible de esto un descenso en su solubilidad. Se ha encontrado que la desnaturalizacin no afecta los enlaces covalentes de la secuencia peptdica (estructura primaria), y que es posible que la protena recupere su conformacin nativa mediante un proceso llamado renaturalizacin. Ese hecho sugiere que la secuencia de aminocidos de la cadena polipeptdica contiene la informacin necesaria para especificar su conformacin nativa. Enlaces que Mantienen la Estructura de la Protena Debido a los aminocidos que conforman las protenas, stas presentan caractersticas anfotricas, de tal manera que en su superficie existen regiones cargadas positivamente, negativamente, regiones neutras y regiones no polares. Por lo tanto las interacciones que mantienen la conformacin de la protena son diversas y complejas, entre stas se encuentran: enlaces covalentes (simples y dobles), interacciones electrostticas, efectos dipolares (puentes de hidrgeno), interacciones de
812
van der Waals e interacciones hidrofbicas. Las caractersticas ms importantes de estas interacciones son las siguientes: Enlaces Covalentes. Cuando un par de electrones es compartido por dos tomos se forma un enlace covalente, en este enlace cada tomo aporta un electrn. La distribucin de los electrones entre los tomos produce una fuerza neta de atraccin electrosttica que mantiene unidos a los tomos y les proporciona una gran estabilidad. Por otra parte, el enlace covalente permite que los tomos unidos por l puedan girar libremente en torno al enlace. La distancia entre los tomos que estn involucrados en este enlace es de 2 a 4 A (Angstroms). Si dos tomos comparten dos pares de electrones entre ellos entonces se forma un enlace covalente doble. En este caso, la fuerza electrosttica es mucho mayor, la distancia es menor y el enlace es mucho ms rgido, lo que ocasiona que las molculas no puedan rotar alrededor del enlace. Por lo antes mencionado puede esperarse que la estructura primaria de la protena, la cual est constituida de residuos de aminocidos unidos entre si por enlaces covalentes peptdicos, sea bastante estable. Otros enlaces covalentes que se presentan son los enlaces disulfuro (S-S-) de la cistina, stos estn involucrados en el mantenimiento de la estructura terciaria de la protena. Interacciones Electrostticas. Otro mecanismo que contribuye a la estabilidad de las molculas de protena, son las interacciones electrostticas que se presentan entre los grupos cargados de stas. La interaccin electrosttica ocurre entre pares de grupos en el mismo medio. La fuerza (F1) entre dos grupos (A y B) en una solucin diluida est dada por la Ley de Coulomb: ZAZBe2 Dr* donde Z y Zg son los nmeros de unidades de carga acarreados por el grupo A y B respectivamente, e es la carga elctrica del electrn, r es la distancia entre los grupos y D es la constante dielctrica del medio . Las estructuras terciaria y cuaternaria de la protena pueden involucrar interacciones electrostticas entre aminocidos con grupos R que
A.3. BIOMOLECULAS.
813
tengan cargas opuestas, por ejemplo entre lisina y cido glutmico. Sin embargo, cabe mencionar que en un medio acuoso un grupo cargado establece enlaces con el agua ms fcilmente que con cualquier otro grupo cargado de la protena. Efectos Dipolares En la formacin de enlaces covalentes ocurre con frecuencia que el par de electrones no est igualmente compartido entre los dos tomos, sino que los electrones pueden asociarse ms con uno de ellos que con el otro, producindose as una distribucin asimtrica de carga entre los tomos llamada efecto dipolar. Este efecto origina que el tomo con mayor densidad electrnica tenga una carga parcial negativa y pueda formar enlaces electrostticos dbiles con otro tomo que tenga una carga parcial positiva. El enlace ms importante de este tipo es el enlace de hidrgeno o puente de hidrgeno, el cual se forma entre tomos de oxgeno (carga parcial negativa) de un grupo, y tomos de hidrgeno (carga parcial positiva) en el otro. La distancia a la cual ocurren este tipo de enlaces est entre 1.5 y 5 A. Los enlaces de hidrgeno son relativamente dbiles comparados con los covalentes. Los enlaces de hidrgeno en agua lquida poseen una energa de enlace de aproximadamente 4.5 Kcal/mol, mientras que los enlaces covalentes H-O de la misma poseen una energa de enlace de 110 Kcal/mol. En contraparte a su baja energa de enlace, el puente de hidrgeno presenta un efecto coligativo, ocasionando que se intensifique la fuerza de atraccin entre las molculas de agua. Debido a este efecto las molculas de agua presentan una alta estabilidad ya que todas ellas se unen por puentes de hidrgeno. Cuando la protena se encuentra en solucin acuosa se pueden establecer enlaces de hidrgeno entre los diferentes pptidos de sta y el medio, as como tambin entre los diferentes residuos aminocidos de una misma cadena, lo cual contribuye a incrementar la estabilidad de las estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria de la protena. Enlaces de van der Waals. Hay muchas molculas que tienen un momento dipolar elctrico permanente, en particular, como ya se dijo antes, la molcula de agua. Una molcula polar es capaz de atraer a otras molculas que normalmente no presentan momento dipolar. El
814
APNDICE A. MATERIAL
BIOLGICO
campo elctrico de la molcula polar produce una distribucin asimtrica de densidad de cargas en la otra molcula, de tal manera que se crea un dipolo inducido en el mismo sentido al de aquella. El resultado es una fuerza de atraccin entre ellas. Los enlaces que resultan de estos efectos dipolares son llamados enlaces de van der Waals. Estos enlaces juegan un importante papel en el tipo de estructura tridimensional que adopta la protena. Son mucho ms dbiles que los enlaces covalentes y de ellos depende adems, la tensin superficial, los cambios de fase, la adherencia, la cohesin y la viscosidad. Su radio de accin va de 10 a 1000 A.
Enlaces no polares o Hidrofbicos Los enlaces hidrofbicos se realizan estre especies no polares y se explican mejor en el marco de los sistemas protena-solvente. Las molculas de agua se unen entre s por medio de enlaces de hidrgeno y son muy estables. Consecuentemente, la~ estructura ms estable para una protena en solucin acuosa ser aquella que posibilite la formacin del mayor nmero de enlaces de hidrgeno entre sta y el medio acuoso que la rodea. Ahora bien, los aminocidos que presentan grupos R no polares (hidrofbicos) no pueden establecer puentes de hidrgeno con el agua y con frecuencia forman regiones hidrofbicas constituidas por varios aminocidos no polares, las cuales normalmente se encuentran en el interior de la estructura proteica. Esto hace que este tipo de enlaces sea muy importante en la estabilidad de la estructura terciaria de la protena.
A.3.2
Carbohidratos
Los carbohidratos o sacridos son compuestos que se encuentran en todos los seres vivos. Los carbohidratos se dividen en: monosacridos, disacridos, oligosaccridos y polisacridos. Funcionan como elementos estructurales y en particular los polisacridos funcionan como almacenes de combustible. La frmula general de los carbohidratos es ((7//20) n , con n > 3.
A.3.
BIOMOLECULAS,
815
Figura A.7: Estructura qumica de la D- glucosa

5
CHjOH
CH2OH
OH )H
Figura A.8: Estructura qumica de: a) Ribosa b) Desoxirribosa
Monosacridos: D- glucosa
Los monosacridos o azcares simples son los carbohidratos ms pequeos y contienen de tres a nueve carbonos. Los monosacridos de tres carbonos son llamados triosas, los de cinco pentosas y los de seis carbonos se denominan hexosas. En la Tabla A.8 se presentan los monosacridos ms comunmente encontrados en la naturaleza. Uno de los monosacridos ms importantes es la D- glucosa. La D-glucosa puede existir en dos formas isomricas diferentes: a Dglucosa y la (3 D- glucosa. En solucin la D- glucosa se presenta comunmente con una estructura en forma de anillo como la que se muestra en la Figura A.7. Otro monosacrido de inters es el azcar de cinco carbonos llamado D- Ribosa (Figura A.8), debido a que es el principal componente de los cidos nucleicos tanto en su forma natural como oxidada (desoxiribosa). Un derivado importante de los monosacridos es el cido N - acetil-
816
Tabla A.8: Monosacridos presentes en los sistemas biolgicos

Aldosas derivadas de aldehido
CHO
Clase Triosa (tres carbonos)
Cetosas derivadas de ke tonas CHiOH
HCOH CH2OH D-Gliceraldehido Pentosa (cinco carbonos)

CHO
C =O \ \ CH-zOH Dihiroxiacetona
CH-OH
C =0
HCOH HCOH HCOH CHÔH D-Ribosa Hexosa (seis carbonos) 7//0

HC 1OH
HCOH HCOH CH2OH D-Flibulosa CHO \ HCOH HO 7W HO 7// HC1OH CH2OH D-Galactosa CH2OH \ C =O i 1 HOCH i 1 HCOH i 1 HCOH 1 CH?OH D-Fructuosa
HO 7//
HC 1OH HC 1OH
CH?OH D-Glucosa
CHO \ HOCH i 1 HOCH \ \ HCOH i 1 HCOH i 1 CH2OH D-Manosa
A.3. BIOMOLECULAS.
817
murmico que es la unidad estructural ms importante del esqueleto polisacrido de las paredes celulares bacterianas. Est constituido por el aminoazcar N - acetil-D-glucosamina unido mediante enlace ster al cido D-lctico. Los monosacridos pueden unirse entre s mediante enlaces llamados glucosdicos. Mediante este tipo de enlaces los monosacridos dan origen a los disacridos, trisacridos y, en forma general a polisacridos. Los enlaces glucosdicos ms comunes son: el o;(l > 4), el 3(1 > 4) y el a(l -> 6)
Polisacridos En la sntesis de la mayora de los polisacridos como el almidn, la celulosa y el glucgeno, interviene el monosacrido D-glucosa. El almidn es la forma principal de almacenamiento de energa en muchas plantas, se encuentra en dos formas: la a amilasa y la amilopectina. La a amilasa son cadenas largas no ramificadas del monosacrido D- glucosa, unidas entre s por enlaces a(l > 4) glucosdicos. La amilopectina forma cadenas ramificadas constituidas por unidades de D- glucosa unidas entre si por enlaces a(l > 4) glucosdicos, excepto en los puntos de ramificacin donde el enlace que se presenta es a(l > 6) glucosdico. La celulosa es componente estructural de las paredes celulares y es el polisacrido ms abundante en el reino vegetal. Es el principal componente de la madera y el algodn. La celulosa es un polmero lineal de la D- glucosa que posee enlaces /?(! * 4) glucosdicos. El glucgeno, parecido al almidn en estructura, es el principal polisacrido de reserva de las clulas animales. Se encuentra en cantidades importantes en el hgado (10% de su peso hmedo). En las clulas hepticas el glucgeno aparece en forma de granulos. Se presenta en forma de cadenas mucho ms ramificadas que las de la amilopectina. Tambin es un polisacrido de la D- glucosa con enlaces a(\ * 4) glucosdicos y en los puntos de ramificacin los enlaces son a (I > 6) glucosdicos.
818
APNDICE A. MATERIAL Tabla A.9: Clasificacin de los lpidos

Tipo de L'pido Esqueleto
BIOLGICO
Complejos (saponifcables) - Acilglicridos - Fosfoglicridos - Esfingolpidos - Ceras
Glicerina 3 fosfato de glicerilo Esfingosina Alcoholes no polares de elevado peso molecular
Simples (insapouificables) - Terpenos - Esteroides - Prostraglandinas
A.3.3
Lpidos
Los lpidos son molculas biolgicas prcticamente insolubles en el agua y pueden extraerse de sus fuentes mediante solventes no polares como el benceno, el cloroformo y el ter. Debido a esta caracterstica los lpidos se encuentran presentes en fases biolgicas no acuosas. Desempean importantes funciones biolgicas como: a) Componentes estructurales de las membranas. b) Formas de transporte y almacenamiento del combustible catablico c) Componentes de la superficie celular relacionados con el reconocimiento de las clulas, la especificidad de especie y la inmunidad de los tejidos. Dentro de las lpidos se encuentran las hormonas y las vitamina que son sustancias que presentan una alta actividad biolgica, as come tambin las grasas, las cuales sirven como almacenes de combustible Los lpidos adems se presentan formando parte de molculas ms com plejas como las lipoprotenas y los glucolpidos. Los lpidos se clasifican, de acuerdo a su estructura, en lpidos com piejos y lpidos simples (Tabla A.9). Los primeros se caracteriza]
A.3. BIOMOLECULAS.
819
CH3 ( CH2
) C
Figura A.9: Frmula general de los cidos grasos saturados porque contienen cidos grasos como componentes y tambin reciben el nombre de lpidos saponificables porque pueden producir jabones al reaccionar con lcalis. Los segundos no contienen cidos grasos en su estructura y por lo tanto son no saponificables.
cidos Grasos
Los cidos grasos se encuentran en grandes cantidades en los sistemas biolgicos como componentes de los lpidos complejos. Los cidos grasos ms abundantes encontrados en las plantas y en los animales poseen un nmero par de tomos de carbono, las cadenas hidrocarbonadas tienen entre 14 y 22 tomos de carbono. Dependiendo de su cadena hidocarbonada, los cidos grasos pueden ser saturados o insaturados. La Figura A.9 muestra la frmula general de los cidos grasos saturados. Un cido graso insaturado se forma cuando se reemplaza un enlace saturado (-C C} por un enlace doble ( C = C). Entre los cidos grasos saturados ms comunes se encuentran el cido palmtico (C\o) y el cido esterico (Cis), y entre los insaturados est el cido oleico (Cis)Los cidos grasos saturados e insaturados difieren en sus configuraciones estructurales. Los cidos grasos saturados presentan cadenas hidrocarbonadas que pueden existir en un nmero infinito de conformaciones debido a que los enlaces simples que unen los tomos de carbono pueden girar libremente. La forma de cadena extendida que adopta este tipo de cidos grasos es la de mnima energa. Este no es el caso de los cidos grasos insaturados. En este tipo de cidos, los sitios donde se unen los tomos de carbono por medio de un enlace doble presentan un doblamiento rgido en la cadena, lo que provoca que la cadena hidrocarbonada slo presente dos tipos de configuraciones en sus enlaces dobles:
820
APNDICE A. MATERIAL
BIOLGICO
la configuracin cis y la configuracin trans. Monocapas, bicapas y micelas lipdicas: Los lpidos son biomolculas prcticamente insolubles en el agua, sto se debe a que su larga cadena hidrocarbonada no es soluble en soluciones acuosas, sin embargo el grupo carboxilo que presentan es hidroflico. Debido a lo anterior, cuando un lpido polar (por ejemplo un fosfoglicrido) es colocado en una interfase aire - agua, o en agua, las cabezas polares y las colas hidrofficas dan lugar a diversos arreglos (Figura A. 10). En la Figura A. 10a se observa como se forman en agua los agregados llamados micelas. En este tipo de estructuras las colas hidrocarbonadas se orientan en forma opuesta al medio acuoso y forman una fase hidrofbica interna, mientras que las cabezas polares (hidroflicas) estn expuestas en la superficie. Los fosfoglicridos forman tambin bicapas para separar dos compartimentos acuosos, como se muestra en la Figura A.lOb. En la interfase aire - agua (Figura A.lOc) se forma una monocapa con el grupo polar hidratado y la cola orientada hacia el aire. Los liposomas (Figura A.lOd) son estructuras vesiculares formadas por bicapas completamente cerradas, que se forman por exposicin de suspensiones de fosfoglicridos en agua con oscilacin snica. Este tipo de sistemas de bicapas tienen algunas propiedades fsicas similares a las de las membranas protoplasmticas y son objeto de estudio como modelos de membranas naturales. Lpidos Simples Los lpidos sencillos no contienen cidos grasos como componentes estructurales, aparecen en las clulas y en los tejidos en cantidades menores que los lpidos complejos y algunos de ellos tienen una intensa actividad biolgicas. Hay dos clases de lpidos sencillos: los terpenos y los esteroides. Dentro de los primeros se encuentran algunas vitaminas y dentro de los segundos algunas hormonas. Tanto las vitaminas como las hormonas son muy importantes en el funcionamiento normal de la clula y son requeridas por sta en cantidades muy pequeas. Los esteroides son lpidos que presentan una estructura bsica general que se muestra en la Figura A. 11 a. Todos los esteroides se originan del escualeno (Figura A . l l b ) . Dentro de stos se encuentran las hor-
A.3.
BIOMOLECULAS.
821
Pared
Agua
Aire
WLULLILUM Agua
Agua
Figura A. 10: Sistemas estables fosfoglicrido-agua. a) Micelas formadas en el agua, b) Bicapa de fosfoglicrido que separa dos compartimentos acuosos, c) Monocapa en la interfase aire-agua d) Seccin transversal de un liposoma.
822
APNDICE A. MATERIAL
BIOLGICO
<?H,
CH,
CH,
Cf C Cl
C-CHCH2-CH1--CH-CH2-CH2-C-CH-CH2-CH2-CH= C-CH2-CH-CH-C-CH2
CH, CH, CH,
CH,
I HC(CH2)3-CH-(CH,)2
CH,'
Figura A.11: Estructura de algunos esteroides: a) Estructura bsic general b) Estructura del escualeno c) Estructura del colesterol
A.3. BIOMOLECULAS.
823
monas, las cuales son controladores extremadamente potentes de las velocidades de reaccin en los sistemas biolgicos. Las hormonas pueden ser efectivas a niveles de 10~18 M en tejidos humanos. El colesterol (Figura A.lie) es un esteroide muy importante, es el precursor de muchos otros esteroides dentro de los cuales se incluyen: los andrgenos ( hormonas sexuales masculinas), los estrgenos (hormonas sexuales femeninas), la progesterona y las hormonas adrenocorticales. Sistemas de Lipoprotenas Los sistemas de lipoprotenas son sistemas que se forman de la asociacin de lpidos y protenas especficas, en los cuales se fusionan las propiedades fsicas de las dos biomolculas. Los principales tipos de lipoprotenas son: lipoprotenas de transporte y sistemas de membranas. En estos sistemas los lpidos y las protenas se mantienen unidos mediante enlaces hidrofbicos que se establecen entre las componentes no polares de estas biomolculas. Los sistemas de membranas pueden llegar a constituir hasta el 80% de la masa celular seca total en algunas clulas eucariticas. El modelo mas usado de la estructura de membrana es el modelo del mozaico fluido de S.J. Singer y G. L. Nicolson. Este modelo establece que los fosfolpidos de las membranas se hallan ordenados en bicapas formando una matriz fluida de cristales lquidos y postula que las protenas de la membrana son globulares. Este modelo explica satisfactoriamente muchas de las propiedades y caractersticas de las membranas, en particular su alta resistencia elctrica y su relativa impermeabilidad respecto de molculas muy polares. Las lipoprotenas de transporte son complejos caractersticos del plasma sanguneo. Este tipo de lipoprotenas transportan lpidos insolubles en agua entre los diferentes rganos por medio de la sangre, en forma de partculas muy pequeas cuyo dimetro y peso permanece constante.
A.3.4
cidos Nucleicos
Los cidos nucleicos son macromolctilas en forma de cadena cuya funcin esencial es el almacenamiento y la transferencia de la infor-
824
Base
HO
HOP-0CH, .0
OH OH
H H
Figura A. 12: Estructura general de los nucletidos: a) Ribonucletido b) Desoxirribonucletido macin gentica. Son componentes fundamentales de la clula y constituyen entre el 5 y el 15% de su peso seco. Existen dos tipos de cidos nucleicos: el cido desoxirribonucleico (DNA) y el cido ribonucleico (RNA). Al igual que los aminocidos son los componentes estructurales de las protenas, los nucletidos son los componentes estructurales de los cidos nucleicos.
Nucletidos
Las unidades estructurales del DNA se denominan desoxirribonucletidos y las del RNA se llaman ribonucletidos. Como puede observarse en la Figura A.12, cada nuclotido est constituido por tres componentes: una base nitrogenada heterocclica que es un derivado de purina o de pirimidina; una pentosa y, una molcula de cido fosfrico. El nombre de desoxirribonucletidos deriva de que la base esta unida a la pentosa 2-desoxi-D-ribosa (Figura A. 12). Las diferencias qumicas y fsicas entre desoxirribonucletidos radican en las diferentes bases que los constituyen. En los ribonucletidos la base esta unida a la pentosa D-ribosa. De igual manera, la diferencia entre los ribonucletidos estriba en la base que los conforma. Hay cinco bases nitrogenadas (Figura A. 13) que pueden formar parte de un nuclotido: adenina, guanina, ti mi na, citosina y uracilo. Las primeras dos son purinas y las tres restantes son pirimidinas. El grupo fosfato que constituye los nucletidos (Figura A. 12) se une
A.3. BIOMOLECULAS.
825
Purinas
NH,
Nf^C^\
Pirimidinas
O
HNlT>CH
N H
1
^N' H
o
1
HNf^cA
I I ,CH -C,>,/
NH2
'Cî^CH
rfV
H 5
Figura A. 13: Estructura de las bases de los nucletidos. (1) Adenina (2) Guanina (3) Uracilo (4) Timina (5) Citosina
826
APNDICE A. MATERIAL
BIOLGICO
mediante un enlace ster al tomo de carbono 5 de la pentosa. Cuando el grupo fosfato de un nucletido se separa por hidrlisis, la estructura residual recibe el nombre de nuclesido. Todos los ribonuclesidos y desoxirribonuclesidos aparecen en las clulas no solamente en forma de monofosfatos, sino tambin en forma de difosfatos o trifosfatos. En particular, para la adenosina se tiene el 5'-monofosfato de adenosina (AMP), el 5'-difosfato de adenosina (ADP) y el 5'-trifosfato de adenosina (ATP). El ADP y el ATP son cidos relativamente fuertes que en su disociacin producen tres o cuatro protones respectivamente, producto de sus grupos fosfricos. El sistema ATPADP es el sistema principal para la transferencia de energa qumica en la clula.
DNA
En 1953 J. D. Watson y F. H. C. Crick postularon una estructura para el cido desoxirribonucleico. Propusieron que dicha estructura est constituida por dos cadenas helicoidales antiparalelas, cada una de ellas enrrollada alrededor del mismo eje. Cada cadena consiste de grupos fosfato di-ester unidos a residuos de 3D-desoxirribofuranosa (Ddesoxirribosa), por medio de enlaces 3'-5' (Figura A. 14). Propusieron adems que las cadenas se mantienen unidas entre si por medio de puentes de hidrgeno entre las bases purinas y pirimidinas en sus formas tautmericas (Figura A.14b y Figura A.14c), mediante los pares de bases: adenina (purina) con timina (pirimidina) y guanina (purina) con citosina (pirimidina). El dimetro de la doble hlice es de 20 A y una vuelta se completa cada 34 A. Cada vuelta de la cadena consta de aproximadamente 10 nucletidos. De la complementaridad de la unin de las bases, Watson y Crick concluyeron que si la secuencia de bases de una cadena est dada, entonces la secuencia de la otra cadena se determina automticamente. Consecuentemente estaba planteado un mecanismo de copiado para la transferencia del material gentico. Se ha considerado que la estructura del DNA propuesta por Watson y Crick, es uno de los hechos ms sobresalientes en el campo de la ciencia hasta nuestros das. El desarrollo ce los postulados anteriores ha conducido a lo que se ha
A.3.
BIOMOLECULAS.
827
Pares de bases complementaras
BaM
(b)
Esqueleto de azcar-fosfto
Timina
\ x~/ H x ~c^ ^-N n-^fS \ t
\ M "--.</
Puente de hidrgeno / 8
Adenina
(a)
Desoxirribosa
(c)
Figura A. 14: Esquema del Acido Desoxirribonuleico: a) Estructura de una sola cadena, b) Estructura de la doble hlice c) Bases purinas y pirimidinas unidas por puentes de hidrgeno.
828
APNDICE A. MATERIAL
BIOLGICO
denominado dogma central de la gentica molecular, que establece que la informacin gentica fluye del DNA al RNA y de ste a la protena. El dogma central establece tres procesos: Replicacin: Es el primer proceso y es el proceso mediante el cual el DNA produce molculas hijas idnticas a la progenitura. Transcripcin: Es el proceso mediante el cual se realiza el copiado del mensaje gentico contenido en el DNA al RNA mensajero. Traduccin: Es el proceso que permite traducir las unidades de informacin gentica o codones a secuencias de aminocidos en una cadena peptdica. Esta traduccin se lleva a cabo en los ribosomas. La traduccin del mensaje gentico da origen a la sntesis de protenas. Replicacin del DNA: El proceso de replicacin del DNA permite que la informacin gentica sea perpetuada mediante su paso de una generacin a otra. El inicio de la replicacin del DNA es un proceso que antecede al fenmeno de la divisin celular y consiste en la separacin de las dos cadenas de DNA, mismas que actan como moldes de dos cadenas nuevas (Figura A. 15). La sntesis de las cadenas nuevas ocurre por la adicin de nucletidos complementarios a las cadenas que sirven de molde. La adicin de cada nucletido se realiza en la direccin 5' > 3'. La replicacin del DNA produce dos dobles hlices, cada una de las cuales tiene una cadena de la doble hlice original y una cadena nueva. A este tipo de replicacin se le llama replicacin semiconservativa. El proceso de replicacin del DNA es esencialmente el mismo en todos los organismos vivos, siendo ms complejo en los organismos superiores. La replicacin completa del DNA slo ocurre durante la divisin celular, pero existen con mucha frecuencia otros momentos de la actividad celular en los cuales se copia slo una parte de la informacin gentica. Esto sucede cuando se transcribe por ejemplo, el gene que tiene codificada la informacin para sintetizar una determinada protena.
A.3. BIOMOLECULAS.
829
Figura A. 15: Replicacin semiconservativa de la molcula de DNA: Cada cadena de la doble hlice progenitora sirve como molde para generar dos cadenas hijas idnticas a ella. Fuente: Watson et a/, 1983
Reproducida con el permiso de W.H. Freeman and Co. Copyright 1983. Todos los derechos reservados.
830
APNDICE A. MATERIAL
BIOLGICO
La Transcripcin del Mensaje Gentico: El RNA Los genes estructurales que almacenan la informacin para la sntesis de protenas, se copiarn de acuerdo a la demanda de protenas que tenga el organismo. Sin embargo, el DNA no es el molde directo que se usa en la sntesis de protenas sino que la informacin codificada en el DNA se trascribe al RNA y es ste el que acta como molde para la sntesis proteica. Este mecanismo ha permitido explicar cmo la sntesis de protenas que se efecta en el protoplasma puede ser controlada por el DNA localizado en el ncleo. La Figura A. 16 muestra la estructura de un segmento de cido ribonucleico (RNA). Este a diferencia del DNA, est constituido por una sola cadena de nuclotidos. En la figura se puede observar adems que la pentosa que forma parte del esqueleto de la cadena es una ribosa. La informacin gentica codificada en el DNA en su secuencia de nuclotidos, se trascribe a una molcula intermediaria que puede moverse en el citoplasma: el mRNA o mensajero. El proceso por el cual se lleva a cabo esta transcripcin se muestra en la Figura A. 17. Las bases que constituyen la cadena de mRNA son dos purinas: adenina y guanina y dos pirimidinas: citosina y uracilo. Es importante hacer notar que existe una base en el RNA que no aparece en la cadena de DNA. Esta base es el uracilo (U), el cual es qumicamente muy similar a la timina y en el apareamiento de bases para la sntesis del RNA ocupa el lugar de sta. Esto es, cuando en la cadena de DNA aparece una adenina en la cadena de RNA se agrega un uracilo. El proceso de transcripcin se realiza observando las siguientes dos reglas: siempre ocurre, al igual que la replicacin del DNA, en la direccin 5' > 3' y solamente una de las cadenas del DNA es copiada en una molcula de RNA mensajero en un tiempo dado. El orden en el cual aparecen los nucltidos en la cadena de mRNA sintetizada, indica el orden o secuencia de los aminocidos en la cadena peptdica. La informacin para la sntesis de un aminocido est codificada en tres nuclotidos. A este grupo de tres nuclotidos se le llama codn o triplete. Ahora bien, por una parte existen solamente 4 diferentes nuclotidos y por otra, se tiene que las protenas estn constituidas por 20 tipos de aminocidos diferentes. Por lo tanto existen 64 codones (permutaciones) de tres bases cada uno para los 20
A.3.
BIOMOLECULAS.
831
Base
Base
RNA
Figura A. 16: Estructura de un segmento de cido ribonucleico RNA
Cadenas
Cadena de RNA
Figura A. 17: Transcripcin del mensaje gentico por medio de la sntesis de una cadena de mRNA
832
APNDICE A. MATERIAL BIOLGICO Tabla A. 10: Cdigo gentico

Codn Aminocido
Fen Leu " Leu
Codn
Aminocido
Ser
Codn
Aminocido
Tir
Codn
Aminocido
Gis
TTT TTC TTA TTG CTT CTC CTA CTG ATT ATO ATA ATG GTT GTA GTA GTG
TCT TCC TCA TCG CCT CCC CCA CCG ACT ACC AC ACG GCT GCC GCA GCG
TAT TAC TAA TAG CAT CAC CA CAG
Term*
His Gln
TGT TGC TGA TGG CGT CGC CGA CGG AGT AGC AGA AGG GGT GGC GGA GGG
Term Trp
Arg
Pro
He Met Val
Tre
AAT AAC AAA AAG

GAT GAC GAA GAG
Asii
Lis Asp Glu
Ser Arg Gli
Ala
Term. es un codn de terminacin del mensaje
aminocidos, de tal manera que existen aminocidos que son codificados por ms de un codn. Tambin existen codones que actan como seales de terminacin del mensaje gentico. El conjunto de codones constituye el cdigo gentico universal y se muestra en la Tabla A. 10. En la Tabla A. 11 se muestran los significados de las abreviaturas para los aminocidos y para las bases nitrogenadas. Traduccin del Mensaje Gentico: Sntesis de Protenas Cada molcula de mRNA da origen a una o varias cadenas peptdicas. El proceso de traduccin del mensaje del mRNA se realiza en los ribosomas. En este proceso intervienen adems otros tipos de RNA: el rRNA y el tRNA. El primero es un cido ribonucleico que se encuentra localizado en los ribosomas y el segundo es un RNA de trasferencia (tRNA) que acta como adaptador en el ordenamiento lineal de los aminocidos especficos conforme a la secuencia del ni RNA. La Figura A. 18 muestra
A.3.
BIOMOLECULAS.
833
Tabla A.ll: Especificacin de las bases y los aminocidos

Nucletidos
G= A = T= C
Aminocidos
Ala Asn Asp Arg Gis Fen Gli Gln Glu His = = = = = = = = = =
Guanina Alanina Timina Citosina
Alanina Asparagina Acido asprtico Arginina Cistena Fenilalanina Glicina Glutamina Acido glutmico Histidina
Ile Leu Lis Met Pro
= = = = =
Ser ^ Tir = Tre =
Trp = Val =
Isoleucina Leucina Lisina Metionina Prolina Serina Tirosiia Treonina Triptofano Val na
como se realiza este proceso y la forma estructural del tRNA. Como puede verse en la Figura A.18a la estructura del tRNA presenta tres lazos. En la parte inferior del segundo lazo se localiza un triplete denominado anticodn. Este anticodn esta formado por las tres bases complementarias al codn especfico que aparece en la cadena de mRNA. La traduccin del mensaje consta de tres fases: iniciacin, elongacin y terminacin. Prcticamente todas las protenas inician con el codn AUG que codifica para metionina. A este triplete se le llama codn de iniciacin y con frecuencia es eliminado despus de la sntesis. Una vez que se inicia la sntesis ocurre la elongacin. En este proceso se van agregando sucesiva y ordenadamente (va los tRNA) los aminocidos correspondientes a cada codn presente en la cadena de mRNA. La sntesis de la cadena polipeptdica ocurre en la direccin: extremo amino (NH^) a extremo carboxilo (COOH}. La traduccin concluye cuando aparece un codn de terminacin en el mRNA. En este momento termina la sntesis y la cadena peptclica es liberada. Los mRNA pueden ser traducidos simultneamente por muchos ribosomas. Por esta razn, una sola molcula de mRNA sirve para generar varias copias de la misma cadena peptdica (Balbs y Bolvar, 1989).
834
Aminocido
(a)
<D
Ribosoma
Aminocido
(b)
Subunidades ribosomales
de inicio
segundo codon
(C)
trr
(d)
Figura A.18: a). Estructura del tRNA y sntesis de una cadena peptdica. a) Estructura del tRNA. b) Iniciacin del proceso de sntesis, c) Elongacin de la cadena peptdica. d) Terminacin del proceso de sntesis.
A.3. BIOMOLECULAS. DNA Recombinante: Recombinacin in vitro
835
Las molculas de DNA recombinante (rDNA) son construidas en el laboratorio por medio de la ingeniera gentica. Para llevar a cabo la recombinacin in vitro de una molcula de DNA, la ingeniera gentica requiere de los siguientes elementos: 1. Un mtodo que permitas romper y unir enlaces fosfodister de molculas de DNA. Existen cuatro mtodos para generar fragmentos de DNA: La digestin de la molcula de DNA con enzimas de restriccin. Ruptura mecnica del DNA en condiciones controladas. A partir de molculas de RNA. Sntesis qumica a partir de desoxirribonucletidos. En ingeniera gentica el mtodo ms comn para fragmentar el DNA es la digestin por enzimas de restriccin. La mayora de estas enzimas reconocen secuencias de bases simtricas o palindrmicas en el DNA. 2. Una molcula de DNA capaz de autoreplicarse, y capaz de replicar tambin el DNA que se le haya unido. A este tipo de molculas se les llama vehculos moleculares de clonacin o vectores. Dentro de los vectores ms usados se encuentran los plsmidos y algunos DNAs virales. Para que el vector de clonacin sea fcil de manejar (Balbs y Bolvar, 1989) debe poseer las siguientes caractersticas : Adecuada caracterizacin funcional. Caracterizacin estructural completa. Esto es, debe conocerse la ubicacin de sus genes y su secuencia nucleotdica. El tamao del vector debe ser pequeo con el fin de aumentar la eficiencia de entrada a la clula husped Presentar estabilidad dentro del husped. Esto es, no debe ser degradado.
836
APNDICE A. MATERIAL
BIOLGICO
Es muy conveniente que el vector contenga genes que puedan usarse como marcadores para seleccionar las clulas recombinantes de las silvestres. Presentar mltiple sitios nicos de restriccin dentro de los genes que se utilizan como marcadores. Debe ser capaz de incrementar (amplificar) su nmero de copias, con el fin de obtener grandes cantidades del vehculo por clula. Los vectores ms usados por su simplicidad y facilidad de manejo son los plsmidos. Los plsmidos son pequeos DNAs circulares que se encuentran en forma natural fuera del genoma de algunas clulas y que se replican autnomamente. 3. Un proceso mediante el cual se pueda introducir la molcula de rDNA a la clula receptora. Existen tres mecanismos mediante los cuales una molcula de rDNA puede ser introducido a la clula receptora: La conjugacin. La transfeccin. La transformacin. Un proceso muy usado en la ingeniera gentica es la transformacin. Este proceso conlleva la entrada del vector a la clula a travs de la pared y membrana celulares. Una vez dentro la molcula de rDNA puede replicarse autnomamente o recombinarse con el genoma de la clula receptora. 4. Un mtodo que permita seleccionar de un gran nmero de clulas a aquellas que han adquirido la molcula de rDNA. En la Figura A. 19 se presenta un esquema de el proceso mediante el cual se produce un DNA recombinante, mismo que a su vez da lugai a una clula recombinante. En la "Figura A.19 se observan dos caminos paralelos que se unei para formar la molcula recombinante. Por una parte se extrae ui
A.3.
BIOMOLECULAS.
837
plasmido fragmentado con enzimas d restriocio'n
DNA
^ /fragmentado X / con enzimas /~~~?~^ de restriccin DNA pasajero
marcador '(resistencia a antibiticos)
Figura A. 19: Representacin esquemtica de la clonacin molecular del DNA utilizando un plsmido como vector. Fuente: Watson et a/, 1983
Reproducida con el permiso de W.H. Freeman and Co. Copyright 1983. Todos los derechos reservados.
838
plsmido de la clula seleccionada y se fracciona especficamente utilizando endonucleasas de restriccin. Por otra parte, del DNA fraccionado de la clula de inters, se toma el DNA que se desea insertar o clonar. A este DNA se le llama DNA pasajero o exgeno, este DNA se rompe de la misma manera que el plsmido. Enseguida tanto el plsmido como el DNA fragmentados se ponen en contacto y ocurre la recombinacin. En este punto se obtiene una molcula de DNA recombinante o (rDNA). La molcula de rDNA se introduce dentro de la clula husped y ocurre la transformacin. La clula as obtenida es una clula recombinante, misma que se replicar y contendr la informacin clonada.
A.4
Crecimiento Celular.
Independientemente de que el producto de inters sea intracelular (poi ejemplo una protena), extracelular (metabolitos secundarios) o la ce lula misma, es necesario cultivar las clulas con el fin de obtener e producto deseado. En un cultivo de clulas microbianas de tipo intermitente, todas la clulas estn sujetas a las mismas condiciones de temperatura (T), pH concentracin de sustrato ( S ] , concentracin de oxgeno (O), etc. E crecimiento celular en este tipo de cultivo depende de las condicione mencionadas y puede ser expresado en trminos del cambio con respect al tiempo de la concentracin de clulas; lo anterior puede expresare como:
= f(T,PH,S,0,...)
dx
(A.:
En la Figura A.20 se muestra un esquema del comportamiento tpi< que sigue el crecimiento celular en un cultivo intermitente sujeto a L condiciones dadas por la ecuacin (A.l). En esta figura se observa varias fases en la curva de crecimiento. Las fases se originan por 1 cambios que experimenta la poblacin celular debido a cambios en medio. En la fase lag se observa un crecimiento casi nulo de las clulas, tiempo que dura esta fase se interpreta como el tiempo que tardan ]
A A. CRECIMIENTO CELULAR.
839
(c)
Figura A.20: Representacin esquemtica del crecimiento celular en cultivo intermitente, a) Fase lag b) Fase exponencial c) Fase estacionaria d) Fase de declinacin o muerte clulas en adaptarse al medio de cultivo. Despus de esta fase se tiene la fase exponencial en la cual se observa un crecimiento muy rpido de la biomasa hasta un determinado tiempo. Se considera que en esta fase las clulas ya adaptadas crecen rpidamente debido a que en el medio encuentran todos los requerimientos nutricionales y ambientales para reproducirse. La fase exponencial es la de mximo crecimiento y la biomasa alcanza su valor ms alto; la terminacin de la misma se considera que sucede por la carencia de algn nutriente o porque alguno de los productos que la clula secreta al medio inhibe el crecimiento poblacional. En la fase estacionaria el crecimiento celular cesa y la biomasa permanece constante. Finalmente en la fase de declinacin o muerte las clulas empiezan a morir y la biomasa disminuye. En este momento se considera que las clulas mueren debido a que no pueden mantener su metabolismo o por autolisis. Cabe mencionar que en la segunda fase (exponencial) la clulas sintetizan compuestos que les permiten crecer (duplicarse) y mantenerse vivas en el medio de cultivo. A este tipo de compuestos se le llaman metabolitos primarios. En la fase estacionaria la clula excreta al medio productos llamados metabolitos secundarios, este tipo de compuestos no esta asociado al crecimiento celular y muchos de ellos tienen importancia comercial. Cuando el crecimiento celular en un cultivo intermitente est limitado slo por la cantidad de sustrato inicial, la curva de crecimiento puede expresarse con auxilio de la ecuacin de Monocl que describe la relacin entre la velocidad especia fica de crecimiento y la concentracin
840
de sustrato, establecindose la siguiente expresin para el crecimiento celular:
donde: x: Concentracin de biomasa. [M/L3] t: Tiempo, [t] fj,: Velocidad especfica de crecimiento.^"1] y la ecuacin de Monod:
;
J\ " | ~ J
(A.3
donde: lmax' Velocidad mxima de crecimiento. [t~l] S: Concentracin de sustrato limitante. [M/L3] Ka: Concentracin de sustrato para / = 0.5 fJ>max En la Figura A.21 muestra la representacin grfica de la ecuaci (A.3) para un caso particular. Puede observarse en la figura que la J velocidad mxima de crecimiento /mar es el valor asinttico de la curv. y Ks es el valor de S cuando /z = fimax/2Con frecuencia la velocidad del crecimiento celular se describe e trminos del tiempo de doblado esto es, del tiempo en el cual la ma celular se duplica. La expresin para /u se obtiene integrando la ecuacic (A.2) de la siguiente forma:
dx
'Xl
td = fr'
JO
donde:
A.4. CRECIMIENTO
CELULAR.
84
0.0 Ks0.22
Figura A.21: Representacin esquemtica de la variacin de la veloc dad especfica de crecimiento (/u) con el sustrato (S). Xi =: Masa celular al tiempo t = O t: Tiempo de doblado para obtener:
In2
por lo tanto el tiempo requerido para que la masa celular se dupliqi esta dado por:
A,
VEl cultivo de las clulas se lleva a cabo en dispositivos llamad biorreactores los cuales deben disearse con el fin de proporcionar stas las mejores condiciones fsicas para su desarrollo. Una vez qi se ha realizado el cultivo de la clula y se tiene el producto de nter dentro de la clula misma o en el caldo de cultivo, el paso siguiente es realizacin del mejor proceso para obtener el producto con la activid y pureza deseada, con el menor costo posible. El establecimiento ( dicho proceso es el objetivo del estudio de las Bioseparaciones.
842
A. 5
Bibliografa
Brachet, J. 1961. La clula viva. En: La Clula Viva. Selecciones de Scientific American. Editorial Blume. Mxico. Lehninger, A. L. 1989. Bioqumica. Ediciones Omega. Espaa. Millis, N. F. 1985. The organisms of biotechnology. En: Comprenhensive Biotechnology. Murray, M.Y. (Ed.). Permagon Press. New York. 1, 7-18. Palmer, T. 1991.-Understanding Enzymes. Ellis Horwood Ltd. Inglaterra. 31-35 Tortora, G.J., Funke, B.R. y Case, C.L. 1989. Microbiology: An Introduction. 3ra Edicin. The Benjamin/Cummings Publishing Co. New York. Watson,-J. D. y Crick, H. C. 1953. Molecular Structure of Nucleic Acids: A structure for deoxyribose nucleic acid. Nature. 737. Watson, J. D., Tooze, J; y Kurtz, D. 1983. Recombinant DNA a short course. Scientific American.Books. New York. 2, 11-30.
USUARIO:
ESTE EJEMPLAR ES NUEVO, NO LO MALTRATES POR FAVOR
U. R I. B, L
BIBLIOTECA
O A. Tejeda O R. M. Montesinos O R. Guzmn
Bioseparaciones
Armando Tejeda M.
Centro de Investigaciones Cientficas y Tecnolgicas Universidad de Sonora Hermosillo, Sonora. Mxico.
Rosa Ma. Montesinos C.

Depto. de Matemticas Universidad de Sonora Hermosillo, Sonora, Mxico.
Roberto Guzmn Z.
Department of Chemical Eng.
<
c "-
University of Arizona Tucson, Arizona. USA. Editorial Unisn Hermosillo, Sonora. Mxico.
Contenido
El Proceso de Bioseparacin
1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 Evolucin de los Bioprocesos . . . . Caractersticas de los Bioprocesos . Sumario Problemas Bibliografa
1 Introduccin
2 Seleccin del Proceso

2.1 Introduccin 2.2 Fundamentos 2.2.1 Mercado y Especificacin del Producto 2.2.2 El Proceso 2.3 Equipo 2.4 Diseo 2.4.1 Desarrollo de un Caso Base 2.4.2 Sntesis de Proceso 2.5 Sumario 2.6 Problemas 2.7 Bibliografa
vi
CONTENIDO
II Remocin de Insolubles y Ruptura Celular. 65

3 Filtracin 69 3.1 Introduccin 69 3.2 Fundamentos 71 3.2.1 La Filtracin como parte de los Sistemas de BSL 72 3.2.2 Pretratamiento de Caldos para BSL 74 3.2.3 Teora de la Filtracin 77 3.3 Equipo de Filtracin 80 3.3.1 Filtros Intermitentes a Presin 80 3.3.2 Filtros Continuos al Vaco 81 3.4 Diseo de Equipo de Filtracin 84 3.4.1 Filtracin Intermitente 85 3.4.2 Filtracin Continua 98 3.5 Sumario 105 3.6 Problemas .106 3.7 Bibligrafa 110 4 Centrifugacin 4.1 Introduccin 4.2 Fundamentos de la Centrifugacin 4.2.1 Ley de Stokes 4.2.2 Sedimentacin por Accin de la Gravedad 4.2.3 Sedimentacin Centrfuga 4.2.4 Factor G 4.3 Equipo de Centrifugacin 4.3.1 Equipos de Filtracin-Centrfuga 4.3.2 Equipos de Sedimentacin Centrfuga 4.4 Diseo de Equipo de Centrifugacin 4.4.1 Diseo de Centrfugas Tubulares 4.4.2 Centrfuga de Discos 4.4.3 Escalamiento 4.4.4 Filtracin Centrfuga 4.5 Sumario 4.6 Problemas 111 111 112 112 . . . .115 116 119 120 120 121 132 132 141 148 153 157 158
CONTENIDO 4.7 Bibliografa 1
vii 162 165 165 166 167 168 169 174 178 178 190 196 199 200 212 215 218 221
5 Rompimiento de Clulas 5.1 Introduccin 5.2 Fundamentos 5.2.1 Estructura de la Pared Celular 5.2.2 Sistemas Celulares de Secrecin 5.2.3 Mtodos de Rompimiento Celular 5.2.4 Mtodos de Permeabilizacin 5.3 Equipo de Rompimiento Celular 5.3.1 Molino de Perlas de Alta Velocidad 5.3.2 Homogeneizador de Alta Presin 5.3.3 Microfluidizador 5.4 Diseo de Equipo de Rompimiento 5.4.1 Molino de Perlas de Alta Velocidad 5.4.2 homogeneizador de Alta Presin 5.5 Sumario 5.6 Problemas 5.7 Bibliografa
III
Concentracin del Producto
223
6 Extraccin 227 6.1 Introduccin 227 6.2 Fundamentos de la Extraccin 228 6.2.1 Tipos de Sistemas de Extraccin Lquido-Lquido 229 6.2.2 Qumica de la Extraccin Lquido-Lquido . . . . 229 6.2.3 Seleccin del solvente 242 6.2.4 Extraccin en Dos Fases Acuosas Inmiscibles . . . 243 6.3 Equipo de Extraccin 256 6.3.1 Equipo de Extraccin Intermitente 257 6.3.2 Equipo de Extraccin Continua 258 6.4 Diseo de Equipo de Extraccin 263 6.4.1 Extraccin Intermitente 264 6.4.2 Extraccin Continua 273
vni
CONTENIDO
6.5 6.6 6.7 6.4.3 Extraccin Fraccionaria Sumario Problemas Bibliografa 292 298 299 304
7 Adsorcin.
307
7.1 Introduccin 307 7.2 Fundamentos 309 7.2.1 Tipos de Adsorcin Segn el Tipo de Interaccin Soluto-Adsorbente 310 7.2.2 Tipos de Adsorbentes 310 7.2.3 Relaciones de Equilibrio 319 7.2.4 Cintica de la Adsorcin 324 7.3 Equipos de Adsorcin 338 7.4 Diseo de Adsorbedores 342 7.4.1 Adsorbedores Tipo Tanque Agitado Intermitentes 342 7.4.2 Adsorbedores Tipo Tanque Agitado Continuo . . 358 7.4.3 Adsorcin en Lecho Fijo 363 7.5 Sumario 407 7.6 Problemas 408 7.7 Bibliografa 413
IV
8.1 8.2
Purificacin del Producto

Introduccin Fundamentos 8.2.1 Tipos de Cromatografa Lquida segn el Principio de Separacin . 8.2.2 Matrices 8.2.3 Tipo de Cromatografa de Acuerdo a la Presin de Operacin 8.2.4 Relaciones de Equilibrio 8.2.5 Cintica de la Adsorcin Equipo Cromatogrfico
415 419
419 420 . 422 424 431 431 432 432
8 Cromatografa por Elucin.
1C
8.3
CONTENIDO 8.4 Diseo de Columnas Cromatogrficas 8.4.1 Modelos Cromatogrficos 8.4.2 Criterios de Evaluacin Tcnica del Comportamiento de las Columnas: Resolucin, Pureza y Rendimiento 8.4.3 Escalamiento y Optimizacin 8.5 Sumario 8.6 Problemas 8.7 Bibliografa 9 Precipitacin 9.1 Introduccin 9.2 Fundamentos 9.2.1 Precipitacin por Disminucin de la Solubilidad 9.2.2 Precipitacin de Protenas por Desnaturalizacin Selectiva 9.2.3 Precipitacin por Afinidad 9.3 Equipo de Precipitacin 9.4 Diseo de Precipitadores 9.4.1 Cintica de la Precipitacin 9.4.2 Diseo de Precipitadores 9.5 Sumario 9.6 Problemas 9.7 Bibliografa 10 Ultrafiltracin 10.1 Introduccin 10.2 Fundamentos 10.2.1 Procesos de Membrana 10.2.2 Flujo Cruzado o Tangencial 10.2.3 Teora de la Ultrafiltracin 10.3 Equipos 10.3.1 Membranas 10.3.2 Mdulos 10.4 Diseo de Procesos de UF 10.4.1 Objetivo de la UF
ix 434 434 463 471 482 483 490 493 493 494 . 495 516 522 525 525 527 533 543 544 545 547 547 548 548 554 555 573 573 574 579 581
x
10.4.2 Mecnica de Fluidos 10.4.3 Mtodos de Operacin 10.4.4 Diseo de la Unidad de UF 10.5 Sumario 10.6 Problemas 10.7 Bibliografa
CONTENIDO
583 586 .589 610 611 615
11 Electroforesis 617 11.1 Introduccin 617 11.2 Fundamentos 618 11.2.1 Carga y Punto Isoelctrico de las Protenas . . . . 619 11.2.2 Teora Electrocintica 619 11.2.3 Fenmenos de Dispersin 629 11.2.4 Medios y Modos de la Electroforesis 636 11.3 Equipos 640 11.3.1 Equipos de Flujo Libre 643 11.3.2 Equipos de Flujo Libre con Recirculacin 646 11.3.3 Equipos Electrocromatogrficos 647 11.4 Diseo 652 11.4.1 Teora de Platos 652 11.4.2 Teora Cintica 656 11.5 Sumario 657 11.6 Problemas 658 11.7 Bibliografa 659
Operaciones de Acabado
661
665 . 665 669 669 670 671 677 679
12 Cristalizacin 12.1 Introduccin 12.2 Fundamentos 12.2.1 Tipos de Cristales 12.2.2 Pureza de los Cristales 12.2.3 Equilibrio: Solubilidad y Sobresaturacin 12.2A Seleccin del Modo de Operacin 12.2.5 Cintica de la Cristalizacin
CONTENIDO
xi
12.2.6 Distribucin de Tamao en Poblaciones de Cristales687 12.3 Equipo de Cristalizacin 689 12.3.1 Cristalizadores Intermitentes 689 12.3.2 Cristalizadores Continuos . 689 12.4 Diseo de Cristalizadores 693 12.4.1 Cristalizador Continuo 694 12.4.2 Cristalizadores Continuos con Remocin Selectiva 711 12.4.3 Balances de Masa y Energa en Cristalizadores Continuos 713 12.4.4 Cristalizadores Intermitentes 730 12.5 Sumario 738 12.6 Problemas 740 12.7 Bibliografa 743 13 Secado 13.1 Introduccin . . . 13.2 Fundamentos 13.2.1 Equilibrio y Propiedades Trmicas 13.2.2 Mtodos de Secado 13.2.3 Velocidad de Secado 13.2.4 Efectos Colaterales del Secado . 13.3 Equipo de Secado 13.3.1 Secadores Adiabticos 13.3.2 Secadores no Adiabticos 13.4 Diseo de Secadores 13.4.1 Diseo de Secadores Adiabticos 13.4.2 Diseo de Secadores no Adiabticos 13.5 Sumario i . 13.6 Problemas 13.7 Bibliografa A Material Biolgico A.l Introduccin A.2 Clulas y Virus A.2.1 Clulas procariticas A.2.2 Clulas Eucariticas 745 745 746 746 758 759 759 762 762 765 769 769 781 785 786 788 789 789 789 791 796
xii A.2.3 Clulas Recombinantes A.2.4 Virus A.3 Biomolculas A.3.1 Protenas A.3.2 Carbohidratos A.3.3 Lpidos A.3.4 cidos Nucleicos A.4 Crecimiento Celular A.5 Bibliografa
CONTENIDO 802 803 803 803 814 818 823 838 842

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Parte I

depende en gran medida de la adecuada seleccin del proceso de bioseparacin.

Evolucin de los Bioprocesos

1.1. EVOL UCIN DE LOS BIOPROCESOS

Esterilizacin y preparacin del medio

Esterilizacin del caldo si es recombinante

' Remocin de desechos celulares

Recuperacin y concentracin del producto

Purificacin del producto

IOZ ' K) I01 K)2 I03 K>4 K)5 O6 KJ7 K)" O9

1.2. CARACTERSTICAS DE LOS BIOPROCESOS

Tabla 1.2: Caractersticas de los Productos Biotecnolgicos

Generacin Segunda Insulina humana

Tercera Factor VIII

Alta Baja Bajo

Muy alta Alta Alto

Muy alta Alta Alto

Caractersticas de los Bioprocesos

Salida delire este'ril

Esterilizador continua (A)

1 Sedimentador o*1 Sedimentador2 (B) ' filtra de aire esteVH

Compresor Tratamiento de i* desechos Tanque de

otras corrientes de desecho CNBr formato

Reactor para eliminacin de CNBr (H)

Del tratamiento dCNBr

Reactor de cuMonan (K) bufer bufer Iris tris*NaCt _,;?

Reactor de renaturalizacin (L)

Figura 1.3: Continuacin.

Paso Rompimiento celular Precipitacin Intercambio inico Crom atografa gel

12.000 1.800 0.240 0.036

0.080 0.060 0.048 0.036

6.667 33.333 200.000 1000.000

Prot. tot. (g)

Enzima tot. (g)

Fraccin enz. XlO~ 3

% Recup* racin Por etapa Global

12.000 1.800 0.240 0.036

0.080 0.060 0.048 0.036

6.667 33.333 200.000 1000.000

1.2. CARACTERSTICAS DE LOS BIOPROCESOS

Rompimiento celular con sulfato de amonio

% de saturacin Cromatografa de intercambio inico

Elucin Nmero de fraccin

Cromatrografia de filtracin por gel

1.3.- Completar la siguiente tabla relacionada con la purificacin de una enzima:

Conc. prot. mg/ml

Prot. total "IR

Act. enzim. U/ml

Act. esp. U/mg

Rend. Total Etapa

Captulo 2 Seleccin del Proceso

CAPTULO 2. SELECCIN DEL PROCESO

ESPECIFICACIN DEL PRODUCTO

PROCESO - Operaciones y secuencia -Escala Etapas o tiempo por operacin -Costo

FUNDAMENTOS Tabla 2.1: Influencia del mercado en el precio del producto.

Datos de: Spalding, 1991. * Somatotropina de Bovino

Mercado y Especificacin del Producto

CAPTULO 2. SELECCIN DEL PROCESO

Operaciones de Separacin y su Secuencia

Tabla 2.2: Operaciones de separacin y su propiedad bsica. Mtodo (Operacin) Propiedad

CAPTULO 2. SELECCIN DEL PROCESO

__ Homogmizactn Intercambio inico Filtracin n Gl

CAPTULO 2. SELECCIN DEL PROCESO