3 1 INTRODUO

A palavra Prpolis deriva do grego pro (em defesa de) e polis (cidade), implicando em um produto que til para a defesa da colmeia. uma mistura complexa de substncias resinosas, gomosas e balsmicas coletadas por abelhas melferas de brotos, flores e exsudatos de plantas, s quais as abelhas acrescentam secrees enzimticas, cera e plen para a elaborao final. O emprego na colnia se relaciona principalmente com suas propriedades mecnicas, sendo utilizada na construo e adaptao da colmeia, alm de propriedades antimicrobianas, garantindo um ambiente assptico [1, 2]. A atividade antimicrobiana da prpolis se d principalmente pela presena de flavonoides, alcois e cidos aromticos na sua composio. Diversos estudos demonstram ainda a atividade moduladora metablica e imunolgica dessas substncias em ensaios clnicos com animais [3]. Como o potencial farmacolgico da prpolis ainda no foi completamente elucidado, haja vista a variao de composio das amostras de acordo com a regio geogrfica de produo, estudos e ensaios clnicos devem ser executados para alicerar as bases cientficas que sustentam o uso de produtos naturais como alternativa de preveno e tratamento de diversas doenas [4]. A investigao de produtos naturais com atividade antimicrobial estimulada pelo alto nvel de bactrias resistentes atualmente e os efeitos colaterais causados pelo uso prolongado de antibiticos contra infeces bacterianas severas [5, 6]. A faringite bacteriana uma infeco das vias areas superiores, geralmente por Streptococcus pyogenes, que provoca sintomas como febre, cefaleias, dor de garganta, prostrao, vmitos e dor abdominal, congesto intensa, exsudato purulento e petquias no palato. O quadro pode se agravar ainda para reaes no supurativas tardias como a Febre reumtica e a Glomerulonefrite. A faringite muito comum em pocas mais frias do ano e um dos maiores motivos de visitas ao servio mdico peditrico todos os anos, uma vez que o principal grupo suscetvel varia de 5 a 15 anos de idade. O tratamento da faringite bacteriana por antibiticos, mas toda e qualquer interveno medicamentosa menos complexa e agressiva que o uso de antibiticos deve ser criteriosamente analisado para ser empregada [7, 8, 9]. A proposta deste projeto testar a eficincia do uso prolongado do extrato alcolico de prpolis na dieta de murinos contra infeco experimental das vias areas superiores nos animais por Streptococcus pyogenes.

4 2 JUSTIFICATIVA

As infeces das vias areas superiores so um dos problemas mais comuns encontrados nos servios de atendimento mdico peditrico [8]. Dentre elas, a faringite uma das mais comuns. Quando o agente etiolgico o Streptococcus pyogenes (faringite bacteriana), requer uso de antibiticos e se no tratada adequadamente pode levar a um quadro patolgico mais severo como a Febre Reumtica e a Glomerulonefrite [8, 9]. Uma alternativa ao tratamento teraputico da faringite bacteriana o uso do extrato da prpolis como antimicrobiano. Alm de barato e de fcil acesso, a prpolis possui diversas caractersticas farmacolgicas antimicrobianas. No h estudos clnicos dos efeitos do uso do extrato de prpolis nos alimentos ou como parte nutricional independente como medida profiltica para a faringite bacteriana. Existem estudos que evidenciam que o fornecimento do extrato de prpolis para animais de produo resultaram em ganho de massa corporal com pouca ou nenhuma alterao bioqumica importante [26]. Uma avaliao mais aprofundada da capacidade imunomodulatria do extrato de prpolis na dieta de murinos contra microrganismos especficos servir como mais uma base para estudos bioqumicos e farmacuticos que visem elucidar o potencial farmacolgico deste produto natural.

5 3 PROBLEMA

A incluso de extrato de prpolis na dieta de murinos por longos perodos poderia proteger os camundongos dos efeitos patolgicos de uma infeco de vias areas superiores por Streptococcus pyogenes?

6 4 PRESSUPOSTO A atividade antimicrobiana e imunomodulatria da prpolis poderiam proteger ou ao menos amenizar a sintomatologia de uma infeco de vias areas superiores de camundongos, por Streptococcus pyogenes, atravs do fornecimento de rao contendo extrato alcolico de prpolis.

7 5 OBJETIVOS 5.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar o potencial imunolgico do extrato alcolico de prpolis inserido na dieta de camundongos contra infeco experimental por Streptococcus pyogenes.

5.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Avaliar o sistema imune de camundongos com e sem tratamento nutricional a base do extrato de prpolis incorporado rao. Avaliar danos histopatolgicos dos animais que mesmo submetidos ao tratamento sejam infectados por Streptococcus pyogenes, comparando-os ao grupo controle.

Observar a efetividade do tratamento em relao ao tempo de tratamento.

8 6 REFERENCIAL TERICO

A prpolis um material resinoso, viscoso e duro, de composio qumica complexa, elaborado por abelhas a partir da coleta de exsudatos de diversas partes das plantas como brotos, folhas, flores e casca. Todo o material coletado transformado pela mastigao e adio de enzimas salivares da abelha, alm de cera e plen [10]. H 30 anos a prpolis teve seu uso ampliado e acabou sendo amplamente estudada. Produtos contendo prpolis so utilizados principalmente em suplementos alimentares e bebidas, como preventivo de doenas e em aplicaes tpicas para leses, principalmente no Japo, que o maior consumidor da prpolis brasileira exportada [11, 12, 13, 14]. Alguns estudos demonstram que a prpolis (ou seus derivados) apresenta toxicidade contra clulas tumorais e atividade antioxidante, antiinflamatria, hepatoprotetora, imunomodulatria e antibitica [15, 16, 17]. Sua composio qumica varia de acordo com a regio e a flora local, sendo identificadas mais de 200 substncias diferentes, como cidos fenlicos, flavonides, steres, diterpenos, sesquiterpenos, ligninas, aldedos aromticos, alcois superiores, aminocidos, cidos graxos, vitaminas e minerais [18, 19, 20]. Os flavonides e os cidos fenlicos so as classes mais importantes da composio, pois so responsveis por grande parte das atividades biolgicas constatadas para a prpolis [20]. O efeito imune-estimulativo do tratamento profiltico com uso de prpolis foi estudado em alguns ensaios clnicos. Prpolis foi fornecida e a capacidade de secreo de citocinas foi verificada durante e aps o tratamento. A capacidade de secreo de citocinas (mas no o nvel de citocinas no plasma) aumentou significativamente durante o perodo do tratamento. Os autores concluram que a prpolis permitiu um aumento da reatividade imune sem efeitos colaterais [21]. Outro estudo sobre as atividades imunomodulatrias do extrato aquoso da prpolis mostrou que os compostos hidroflicos aumentaram a proteo contra infeces por bactrias Gram-negativas, provavelmente pela via de ativao de macrfagos [22]. A atividade antibacteriana frente a vrias cepas Gram-positivas e Gramnegativas j foi evidenciada in vitro, com destaque na inibio de Gram-positivos [23].

9 O extrato alcolico de prpolis oriundo de regies diferentes da Argentina apresentou atividade antibacteriana em concentrao mnima de 7,8 g/mL para Streptococcus pyogenes e outras bactrias resistentes a antibiticos [24]. Park, et al (2000) verificaram inibio de crescimento pela formao de halo transparente ao redor das colnias de Staphylococcus aureus e Streptococcus mutans, com extratos de prpolis oriundas de regies geogrficas distintas do Brasil [25]. Em outro ensaio clnico, extrato alcolico de prpolis foi incorporado rao de roedores. Coelhas jovens foram alimentadas por 35 dias com a rao em diferentes nveis de concentrao do extrato (1000ppm, 2000ppm e 3000ppm). Todos os animais foram submetidos a testes bioqumicos, de atividade enzimtica geral e ganho de peso antes e aps o tratamento. O estudo mostrou que os animais tratados com a rao com concentrao de 1000ppm tiveram uma melhor converso alimentar e maior ganho de peso do que o grupo controle [26].

10 7 MATERIAIS E MTODOS Animais de experimentao A experimentao requer 20 camundongos BALB/c machos adultos. Os animais sero divididos em quatro grupos de cinco camundongos cada: 10 animais do grupo Controle - o grupo controle ser dividido em dois grupos de 5 camundongos - 5 animais A15 que recebero a rao por 15 dias at a infeco experimental e 5 animais A30 que recebero rao por 30 dias at a infeco experimental. Os quatro grupos sero mantidos em jejum por 24h com livre acesso gua antes do incio do tratamento. Obteno do extrato A prpolis ser coletada de apirios da regio. O material coletado ser pesado, congelado, triturado e disposto em um recipiente com lcool de cereais em proporo adequada por 10 dias em agitao constante. Alquotas do extrato final sero submetidas secagem em estufa, para obteno do valor real de massa do extrato seco em relao soluo alcolica, permitindo posterior quantificao do material de estudo e a formulao correta da rao. Preparo e fornecimento da rao O extrato ser incorporado rao antes da peletizao da mesma, na concentrao de 1000ppm. A rao ser fornecida aos quatro grupos de animais de acordo com suas exigncias nutricionais. A experimentao s iniciar a partir do 5 dia do incio do fornecimento da rao modificada, pois sero levados em conta quatro dias como um perodo de adaptao. O grupo Controle receber rao comercial comum adequadamente. O grupo A15 consumir aproximadamente 375 g de rao (formulada com 375 mg de extrato de prpolis) durante 15 dias. Haver 375 g de rao reserva para o caso em que nenhum camundongo seja infectado no 1 desafio e estes acabem recebendo novo inoculo. O grupo A30 consumir aproximadamente 750 g de rao (formulada com 750 mg de extrato de prpolis) durante 30 dias. Haver 750 g de rao reserva para o caso em que nenhum camundongo seja infectado no 1 desafio e estes acabem recebendo novo inoculo. Infeco experimental

11 O Streptococcus pyogenes ser cultivado em laboratrio. Ao final do perodo de fornecimento da rao, os quatro grupos de animais sero expostos ao patgeno pelas vias areas superiores. A partir deste instante, cada camundongo dos grupos A15 e A30 sero colocados em gaiolas separadas para verificao do progresso da infeco. Este procedimento visa garantir que um animal que foi exposto ao patgeno e no desenvolveu a infeco no corra o risco de contrair a infeco por outro indivduo. Os animais continuaro recebendo a rao modificada. Dois dias aps o desafio, os animais que tiverem sido infectados sero eutanasiados e submetidos avaliao histopatolgica e a um hemograma, os camundongos dos grupos que no apresentarem sinais de infeco sero submetidos a um novo desafio para posterior anlise de dados. Aps o segundo desafio, mesmo os camundongos que no apresentarem sintomatologia sero eutanasiados e submetidos avaliao histopatolgica e hemograma, juntos a aqueles que foram infectados.

12 8 CRONOGRAMA

ATIVIDADES
AVALIAO DO PROJETO PELA CEUA DA UFG PREVISO E PEDIDO DE COMPRA DOS ANIMAIS COLETA DE PRPOLIS PREPARO DO EXTRATO PREPARO DA RAO INCIO DO TRATAMENTO 1 DESAFIO AVALIAO DOS RESULTADOS 2 DESAFIO AVALIAO DOS RESULTADOS ANLISE DE DADOS CONCLUSO DO ENSAIO

CRONOGRAMA JAN FEV MAR ABR MAI JUN JUL AGO SET OUT NOV DEZ X X X X X X X X X X X X X X X X X

13 9 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 1. BRASIL. MINISTRIO DA AGRICULTURA. Instruo Normativa n 3, ANEXO VI. Regulamento tcnico para fixao de identidade e qualidade de prpolis. Dirio Oficial da Repblica Federativa do Brasil. Braslia, 19 de janeiro de 2001. 2. GHISALBERTI, E. L. Propolis: a review. BEE WORLD, v. 60, n. 2, p. 59-83, 1979. 3. RINDT, I. K. et al. The Immunomodulatory Effect Of Propolis: a review. LUCRRI STIINIFICE MEDICIN VETERINAR, Timisoara, v. 52 n. 1, 2009. 4. LARCERDA, R. C. C. et al. Prpolis e Segurana Alimentar. Segurana Alimentar e Nutricional, Campinas, v.18, n. 2 p.99-106, 2011. 5. CUNHA, B. A. Antibiotic side effects. MedClin North America. V. 85 p.149-185, 2001. 6. ROSSOLINI, G. M; MANTENGOLI, E. Antimicrobial resistance in Europe and its potential impact on empirical therapy. Clin Microbiol Infectology, v. 14 n. 6, p.2-8, 2008. 7. VAN CAUWENBERGE, P; INGELS, K. Effects of viral and bacterial infection on nasal and sinus mucosa. Acta Otolaryngology, v. 21, p.116:316, 1996. 8. ATTIA, M. W. et al. Performance of a predictive model for streptococcal pharyngitis in children. Archives of Pediatry and Adolescent Medicine, v. 155, n. 6, p.687-91, 2001. 9. EBELL, M. H et al. The rational clinical examination. Does this patient have strep throat? JAMA, v. 284, n. 22, p.2912-18, 2000. 10. FUNARI, C. S; FERRO, V. O. Analise de Propolis. Ciencia e Tecnologia de Alimentos, v. 26, n. 1, p.171-178, 2006. 11. DAZ, J.C.Q. et al. Empleo de la tinctura de propleo al 5% en la cura de heridas spticas faciales. Revista Cubana de Estomatologa, v. 34, n. 1, p.25-27, 1997. 12. GREGORY, S.R. et al. Comparison of propolis skin cream to silver sulfadiazine: a naturopathic alternative to antibiotics in treatment of

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