MENGHITUNG SEL-SEL DARAH Ketiga jenis sel darah, leukosit, eritrosit dan trombosit dihitung jumlahnya per satuan

volume darah dengan terlebih dahulu membuat pengenceran dari darah yang diperiksa. Pada laboratorium besar biasanya menggunakan alat penghitung elektronik. Pada dasarnya alat semacam itu yang lazimnya dipakai bersama alat pengencer otomatik memberi hasil yang sangat teliti dan tepat. Sering alat penghitung elektronik dikaitkan dengan komputer kecil yang dapat memberi data mengenai volumeeritrosit rata-rata dan nilai Hb rata-rata. Cara menghitung sel darah secara manual dengan memakai pipet dan kamar hitung tetap menjadi upaya penting dalam laboratorium klinik. 1. Menghitung Leukosit Darah diencerkan dalam pipet leukosit, kemudian dimasukkan kedalam kamar hitung. Jumlah leukosit dihitung dalam volume tertentu, dengan mengenakan faktor konversi jumlah leukosit per ul darah dapat diperhitungkan. Larutan pengencer adalah larutan Turk yang mempunyai susunan sbb : larutan gentianviolet 1% dalm air 1 mL, aquades 100 mL. Saringlah sebelum dipakai. Cara : a. Mengisi pipet leukosit 1) Isaplah darah (kapiler, EDTA atau oxalat) sampai kepada garis tanda 0,5 tepat. 2) Hapuslah kelebihan darah yang melekat pada ujung pipet 3) Masukkan ujung pipet dalam larutan Turk sambil menahan darah pada garis-tanda tadi. Pipet dipegang dengan sudut 45 derajat dan larutan Turk diisap perlahan-lahan sampai garistanda 11. Hati-hatilah jangan sampai terjadi gelembung hawa. 4) Angkatlah pipet dari cairan, tutup ujung pipet dengan ujung jari lalu lepaskan karet pengisap 5) Kocoklah pipet itu selama 15-30 detik. Jika tidak segera akan dihitung, letakkanlah dalam sikap horizontal. b. Mengisi kamar hitung 1) Letakkanlah kamar hitung yang bersih dengan kaca penutupnya terpasang mendatar diatas meja 2) Kocoklah pipet yang diisi tadi selama 3 menit terus-menerus, jagalah jangan sampai ada cairan terbuang dari dalam pipet itu diwaktu mengocok 3) Buanglah semua cairan yang ada didalam batang kapiler pipet (3 atau 4 tetes) dan segeralah sentuhkan ujung pipet itu dengan sudut 30 derajat pada permukaan kamar hitung dengan menyinggung pinggir kaca penutup. Biarkan kamar hitung itu terisi cairan perlahan-lahan dengan daya kapilaritasnya sendiri. 4) Biarkan kamar hitung itu selama 2 atau 3 menit supaya leukosit dapat mengendap. Jika tidak dapat dihitung segera, simpanlah ka mar hitung itu dalam sebuah cawan petri tertutup yang berisi segumpal kapas basah c. Menghitung jumlah sel

1) Pakaialah lensa objektif kecil yaitu dengan perbesaran 10x. Turunkan lensa kondensor atau kecilkan diafragma. Meja mikroskop harus datar sikapnya 2) Kamar hitung dengan bidang bergarisnya diletakkan dibawah objektif dan fokus mikroskop diarahkan pada garis-garis bagi itu. Dengan sendirinya leukosit jelas terlihat. 3) Hitunglah leukosit yang terdapat dalam keempat bidang besar pada sudut-sudut seluruh permukaan yang dibagi a) Mulailah menghitung dari sudut kiri atas, terus kekanan, kemudian turun kebawah dan dari kanan ke kiri, lalu turun lagi kebawah dan dimulai lagi dari kiri ke kana. Cara seperti ini dilakukan pada keempat bidang besar b) Kadang-kadang ada sel-sel yang letaknya menyinggung garis batas sesuatu bidang. Sel-sel yang menyinggung garis batas sebelah kiri atau garis atas haruslah dihitung. Sebaliknya, sel-sel yang menyinggung garis batas sebelah kanan atatu bawah tidak boleh dihitung d. Perhitungan Ppengenceran yang terjadi dalam pipet ialah 20 kali. Jumlah semua sel yang dihitung dalam keempat bidang itu dibagi 4 menunjukkan jumlah leukosit dalam 0,1 ul. Kalikan angka itu dengan 10 (untuk tinggi) dan 20 (untuk pengenceran) untuk mendapat jumlah leukosit dalam 1 ul darah. Singkat : julah sel yang dihitung kali 50 = jumlah leukosit per ul darah. Catatan : Jika darah tepi mengandung banyak sel darah merah berinti, maka sel-sel itu akan ikut diperhitungkan seperti leukosit. Koreksi dapat diadakan dengan memeriksa sediaan apus yang dipakai untuk hitung jenis leukosit, presentasi sel darah merah berinti dicatat. Misalnya didapatkan 10000 leukosit ul darah dan dari hitungan ternyata disamping tiap 100 leukosit ada 25 sel darah merah berinti, maka jumlah leukosit yang sebenarnya ialah : 10000 (25/100+25 x 10000) = 8000 per ul darah 2. Menghitung Eritrosit Darah diencerkan dalam pipet eritrosit, kemudian dimasukkan kedalam kamar hitung. Jumlah eritrosit dihitung dalam volume tertentu, dengan menggunakan faktor konversi jumlah eritrosit per ul darah dapat diperhitungkan. Sebagai urutan pengencer dipakai larutan Hayem, natriumsulfat (berair kristal) 5 g, natriumchlorida 1 g, merkurichlorida 0,5 g, aquades ad 200 ml. Juga boleh dipakai larutan Gowers : natriumsulfat 12,5 g; asam asetat glasial 33,3 ml; aquades 200 ml. Saringlah larutan tersebut sebelum memakainya. Cara a) Mengisi pipet eritrosit Tindakannya sama seperti cara mengisi pipet leukosit : darah diisap sampai garis tanda 0,5 dan larutan pengencer sampai garis tanda 101 b) Mengisi kamar hitung

Sama seperti yang diterangkan pada menghitung leukosit c) Menghitung jumlah sel 1) Turunkan lensa kondensor/ kecilkan diafragma. Meja mikroskop harus dalam keadaan sikap rata air. 2) Atur fokus terlebih dahulu dengan memakai lensa objektif kecil (10x), kemudian lensa itu diganti dengan lensa objektif besar (40x) sampai garis bagi dalm bidang besar tengah jelas nampak. 3) Hitunglah semua eritrosit yang terdapat dalam 5 bidang yang tersusun dari 16 bidang kecil, umpamanya pada keempat sudut bidang besar ditambah yang ditengah-tengah. Cara menghitung sel sama seperti untuk menghitung leukosit, yaitu mulai dari kiri kekanan kemudian dari kanan ke kiri, dst. Kepastian untukk menghitung atatu tidaknya eritrosit yang menyinggung garis batas sama juga seperti leukosit

d) Perhitungan Pengenceran dalam pipet eritrosit adalah 200 kali. Luas tiap bidang kecil 1/400 mm2, tinggi kamar hitung 1/10 mm, sedangkan eritrosit dihitung dalam 5 x 16 bidang kecil = 80 bidang kecil, yang jumlah luasnya 1/5 mm2. Faktor untuk mendapat jumlah eritrosit per ul darah menjadi 5 x 10 x 200 = 10000 3. Menghitung Trombosit Trombosit sukar dihitung karena mudah sekali pecah dan karena sukar dibedakan dari kotoran kecil. Lagipula sel-sel itu cenderung melekat pada permukaan asing (bukan endotel utuh) dan menggupalgumpal. Cara yang lazim dipakai adalah cara langsung dan cara tidak langsung. Pada cara tidak langsung jumlah trombosit dibandingkan dengan jumlah eritrosit, sedangkan jumlah eritrosit itulah yang sebenarnya dihitung. Guna mencegah trombosit-trombosit melekat pada permukaan asing dianjurkan menggunakan alatalat gelas yang dilapisi silikon atau alat-alat plastik. Metode itu, apalagi kalau digabung dengan mikroskop fase-kontras, memberi hasil yang sangat teliti. Cara A. Cara Langsung (Rees dan Ecker) Daerah diencerkan dengan larutan Rees Ecker dan jumlah trombosit dihitung dalam kamar hitung. Larutan Rees Ecker (natriumsitrat 3,8 g; larutan formaldehida 40% 2 ml; briliantcresyblue 30 mg ; aquadest 100 ml) Larutan harus disaring sebelum dipakai. 1. Isaplah cairan Rees Ecker ke dalam pipet eritrosit sampai garis tanda 1 dan buanglah lagi cairan itu. 2. Isaplah darah sampai garis tanda 0,5 dan cairan Rees Ecker sampai 101. Segeralah kocok selama 3 menit. 3. Teruskanlah tindakan seperti itu untuk menghitung eritrosit dalam kamar hitung.

4. Biarkan kamar hitung yang telah diisi dengan sikap datar dalam cawan petri yang tertup selama 10 menit agar trombosit mengendap. 5. Hitunglah semua trombosit dalam seluruh bidang besar ditengah-tengah (1 mm2) memakai lensa objektif besar. 6. Jumlah itu dikali 2000 menghasilkan jumlah trombosit per ul darah.

B. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Cara Tak Langsung (Fonio) Bersihkan ujung jari dengan alkohol dan biarkan mengering lagi Taruhlah diatas ujung jari itu setetes besar larutan magnesiumsulfat 14% Tusuklah ujung jari dengan lanset melalui tetes magnesiumsulfat itu Setelah jumlah darah keluar menjadi kira-kira dari jumlah magnesiumsulfat, campurlah darah dan magnesium sulfat itu Buatlah sediaan apus dan pulaslah Wright atau Giemsa Hitunglah jumlah trombosit yang dilihat bersama dengan 1000 eritrosit Lakukanlah tindakan menghitung jumlah eritrosit per ul darah Perhitungkanlah jumlah trombosit per ul darah atas dasar kedua angka itu

LAJU ENDAP DARAH Untuk penetapan laju eritrosit-eritrosit mengendap biasanya diperlukan darah yang tidak dapat membeku. Biasanya menggunakan semacam antikoagulans untuk maksud itu. Cara A. Menurut Wintrobe 1. Perolehlah darah oxalat atau darah EDTA 2. Dengan memakai pipet Wintrobe, masukkanlah darah itu kedalam tabung Wintrobe setinggi garis tanda 0 mm. Jagalah jangan sampai terjadi gelembung atau busa 3. Biarkan tabung Wintrobe itu dalam sikap tegak lurus pada satu tempat yang tak banyak angin selama 60 menit 4. Bacalah tingginya lapisan plasma dengan milimeter dan laporkanlah angka itu sebagai laju endap darah

B. Menurut Westergen 1. Isaplah dalam semprit steril 0,4 ml larutan natriumsitrat 3,8% yang steril juga 2. Lakukanlah pungsi vena dengan semprit itu dan isaplah 1,6 ml darah sehingga mendapatkan 2,0 ml campuran 3. Masukkanlah campuran itu kedalam tabung dan campurkanlah baik-baik 4. Isaplah darah itu kedalam pipet Westergen sampai garis bertanda 0 mm, kemudian biarkan pipet itu dalm sikap tegak lurus dalam rak Westergen selama 60 menit 5. Bacalah tingginya lapisan plasma dengan milimeter dan laporkanlah anga itu sebaga LED

PENETAPAN NILAI HEMATOKRIT Nilai hematokrit ialah volume semua eritrosit dalam 100 ml darah dan disebut dengan % dari volume darah itu. Biasanya nilai itu ditentukan dengan darah vena atau kapiler Cara A. Makrometode menurut Wintrobe 1. Isilah tabung Wintrobe dengan darah oxalat, heparin atau EDTA sampai garis tanda 100 diatas 2. Masukkanlah tabung itu kedalam sentrifuge yang cukup besar, pusinglah selama 30 menit pada kecepatan 3000 rpm 3. Bacalah hasil penerapan itu dengan memperhatikan : a. Warna plasma diatas : warna kuning itu dapat dibandingkan dengan larutan kaliumbichromat dan intesitasnya disebut dengan satuan. Satu satuan sesuai dengan warna kaliumbichromat 1 :10000 b. Tebalnya lapisan putih diatas sel-sel merah yang tersusun dari leukosit dan trombosit c. Volume sel-sel darah merah

PENETAPAN KADAR HEMOGLOBIN A. Cara fotoelektrik : sianmethemoglobin Hemoglobin darah diubah menjadi sianmethemoglobin dalam larutan yang berisi kaliumferrisianida dan kaliumsianida. Absorbansi larutan diukur pada gelombang 540 nm atau filter hijau. Larutan Drabkin yang dipakai pada cara ini mengubah hemoglobin, oksihemoglobin, methemoglobin dan karboksihemoglobin menjadi sianmethemoglobin. Sulfhemoglobin tidak berubah karena tidak ikut diukur Cara : 1. Ke dalam tabung kalorimeter dimasukkan 5,0 ml larutan Drabkin 2. Dengan pipet hemoglobin diambil 20 ul darah (kapiler, EDTA atau oksalat); sebelah luar ujung pipet dibersihkan, lalu darah itu dimasukkan kedalam tabung kalorimeter dengan membilasnya beberapa kali 3. Campurlah isi tabung dengan membalikannya beberapa kali. Tindakan ini juga akan menyelenggarakan perubahan hemoglobin menjadi sianmethemoglobin 4. Bacalah dalam spektrofotometer pada gelombang 540 nm; sebagai blanko digunakan larutan Drabkin 5. Kadar hemoglobin ditentukan dari perbandingan absorbansinya dengan absorbansi standard sianmethemoglobin atau dibaca dari kurvetera B. Cara Sahli 1. Masukkan kira-kira 5 tetes HCL 0,1n kedalam tabung pengencer hemometer 2. Isaplah darah (kapiler, EDTA atau oxalat) dengan pipet hemoglobin sampai garis tanda 20 ul

3. Hapuslah darah yang melekat pada sebelah luar ujung pipet 4. Catatlah waktunya dan segeralah alirkan darah dari pipet kedalam dasar tabung pengencer yang berisi HCL itu. Jangan sampai ada gelembung udara. 5. Angkatlah pipet itu sedikit, lalu isap asam HCL yang jernih itu kedalam pipet 2 atau 3 kali untuk membersihkan darah yang masih tinggal didalam pipet 6. Campurlah isi tabung itu supaya darah dan asam bersenyawa; warna campuran menjadi cokelat tua 7. Tambahkan air setetes demi setetes, tiap kali diaduk dengan batang pengaduk yang tersedia. Persamaan warna campuran dan batang standar harus dicapai dalm waktu 3-5 menit setelah saat darah dan HCL dicampur. Pada usaha mempersamakan warna hendaknya tabung diputar demikian sehingga garis bagi tidak terlihat 8. Bacalah kadar hemoglobin dengan gram/100 ml darah