U.M.S.A.

Universidad Mayor De San Andres

Docente:

Dra. EuIemia Briancon Gutierrez

Autor:

Univ. Javier Mendoza Callata


Fecha
Miercoles 26 de Junio del 2013
U.M.S.A.
| Microbiologia |
CIV 358


1. Objetivo.

Determinar la existencia de los indicadores de contaminacion Iecal, especiIicamente del grupo
coliIorme, en bebidas de consumo de la poblacion en general.
Detectar si la muestra a analizar es apta para consumo humano.
Familiarizarse con la tecnica del NMP.
Organizar e interpretar los resultados obtenidos durante la practica.

2. Introduccin.

Debido a que un gran numero de enIermedades son transmitidas por via Iecal-oral utilizando como
vehiculo los alimentos y el agua, es necesario contar con microorganismos que Iuncionen como indicador de
contaminacion Iecal. Estos deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia Iecal, deben tener
una sobrevivencia similar a la de los patogenos intestinales y deben ser capaces de desarrollarse extra
intestinalmente.
Forma de adquisicion de coliformes

Fuente. Guia de Higiene - MINISTERIO DEL AGUA VICEMINISTERIO DE SERVICIOS BSICOS

U.M.S.A.
| Microbiologia |
CIV 358


Se denominan oketqqticpkuoqu kpfkecfqtgu fg eqpvcokpcekp hgecn a aquellos que se encuentran en
grandes cantidades en las heces humanas y en las de los demas vertebrados de sangre caliente, que son de
Iacil identiIicacion y deteccion, y permiten evaluar la rqvgpekcn presencia de otros microorganismos
patogenos que suelen acompaarlos.
El grupo de bacterias generalmente utilizadas como indicadoras de contaminacion Iecal son las
eqnkhqtogu. Este grupo pertenece a la Iamilia Enterobacteriaceae e incluye varios generos: Escherichia,
Citrobacter, Enterobacter y Klebsiella. Estos microorganismos son bacilos aerobios y anaerobios
Iacultativos, Gram negativos, no Iormadores de esporas, capaces de utilizar a la lactosa como Iuente de
carbono y energia con produccion de gas y acido en 48 horas a 35C.
Existen microorganismos que reunen estas caracteristicas que viven asociados a vegetales o al suelo y no
necesariamente se asocian a contaminacion Iecal. Por esta razon se han desarrollado diIerentes metodos para
la deteccion de coliIormes Iecales.
Los microorganismos coliIormes, algunos de los cuales son saproIitos de vida libre, pueden multiplicarse
en lavaderos de cuero, madera, cuerdas de piscina y empaquetadoras de yute, y producir a veces cienos en el
interior de las tuberias. La diIerenciacion de los coliIormes tiene valor en el momento de determinar la Iuente
de la que procede el aumento de su densidad y que es consecuencia de la multiplicacion de microorganismos
sobre o dentro de materiales organicos. La presencia de un gran numero de coliIormes del mismo tipo en el
agua de un pozo o manantial o en un solo griIo de un sistema de distribucion sugiere que se ha producido la
citada multiplicacion.
Los residuos industriales tambien poseen elevadas concentraciones de elementos nutritivos para las
bacterias y pueden Iavorecer grandes Iloraciones de coliIormes en aguas de eIluentes y aIluentes. Estos
crecimientos tambien pueden aparecer en los sistemas de distribucion de aguas tratadas.
Una de las pruebas estandar para el grupo de los coliIormes puede realizarse mediante la Tecnica de
Fermentacion en Tubos Multiples en la cual los resultados del estudio de los tubos y diluciones replicados se
comunican en terminos de Numero Mas Probable (NMP) de microorganismos existentes (numero
equivalente a la densidad media de coliIormes en la muestra). La precision del metodo depende del numero
de tubos utilizados, pudiendo ser de tres o cinco series de tubos por dilucion. La densidad bacteriana puede
calcularse mediante una Iormula o por medio de la tabla que utiliza el numero de tubos positivos en las
diluciones multiples.
Las muestras que pueden utilizarse para la determinacion de coliIormes, incluyen: agua dulce (potable o
no), agua salada, lodos, sedimentos, Iangos y alimentos (carnes y leche). La prueba estandar para detectar
U.M.S.A.
| Microbiologia |
CIV 358


bacterias coliIormes consta basicamente de dos Iases: la prueba presuntiva y la prueba conIirmatoria, aunque
suele realizarse una tercera denominada prueba complementaria.

Lugar de donde se obtuvo la muestra

Fuente. Elaboracion propia
Nota:
En ningun momento se trata de menospreciar la Iorma de realizar sus productos las caseritas que dia a
dia nos oIrecen sus productos. Simplemente se trata de realizar un estudio academico que para nada quiere
perjudicar a los comerciantes.

Mas al contrario creo que debemos de estar agradecidos todos los paceos, puesto que gracias a la
descuidada Iorma de preparacion de; Jugos, comidas, etc. El estomago boliviano ha ganado una resistencia a
los microorganismos, esto se nota cuando gente de otro pais consume lo que cada dia consumimos los
paceos, y a ellos les hace dao, mientras que a nosotros no.

Fgpukfcf dcevgtkcpc

La densidad bacteriana puede calcularse mediante la Iormula Iacilitada o por medio de la tabla que
utiliza el numero de tubos positivos en las diluciones multiples, elaborada en base a una distribucion de
Poisson (dispersion aleatoria). Sin embargo, si la muestra no se ha agitado adecuadamente antes de hacer las
U.M.S.A.
| Microbiologia |
CIV 358


porciones o si existe agrupamiento de bacterias, el valor del NMP podra resultar menor que el numero real
de densidad bacteriana.

Rtwgdc Rtguwpvkxc

Es un procedimiento de criba en el que una reaccion negativa excluye la presencia del grupo
coliIorme y una reaccion positiva indica su posible presencia. Se dispone en una gradilla una serie de 15
tubos con caldo lactosado de simple y doble concentracion, segun el volumen de muestra a inocular en cada
tubo, mediante pipetas esteriles.

Se siembra los tubos de la serie tomando los volumenes del agua, homogeneizada, que se indican en
la tabla, despues de homogeneizar los tubos sembrados, se incuban estos a 35 2 C durante 24 horas, y
hasta 48 horas.

Se consideran tubos positivos aquellos en los que se observa enturbiamiento, acidez (detectada por un
indicador colocado en el medio) y aparicion de gas en la campana de Iermentacion, independientemente de
su cantidad.

La produccion de gas se pone tambien de maniIiesto por el desprendimiento de pequeas burbujas
que atraviesan el medio al agitar suavemente el tubo. La ausencia del gas al cabo de 48 horas se considera
como prueba negativa.

Rtwgdc Eqphktocvkxc

Es un procedimiento mediante el cual una reaccion negativa excluye la presencia de organismos
coliIormes, mientras que una reaccion positiva indica su presencia inequivoca. Deben someterse a esta
prueba todos los tubos que hayan resultado positivos en la prueba presuntiva.

Se trata basicamente de resembrar cada tubo positivo de la prueba presuntiva en un medio especiIico
para detectar la presencia de un organismo de tipo determinado, mediante un asa bacteriologica. Para lo cual
se emplearan los siguientes medios:

U.M.S.A.
| Microbiologia |
CIV 358


Caldo lactosado bilis verde brillante al 2 para la conIirmacion de coliIormes totales.
Caldo EC para la conIirmacion de coliIormes termorresistentes.
Caldo EC-MUG la conIirmacion de Escherichia Coli.

La incubacion se realizara:

Los tubos con caldo lactosado bilis verde brillante se incubaran a 35 2 C durante 24 horas
Los tubos con caldo EC y caldo EC-MUG se incubaran a 44.5 C durante 24 horas
Los tubos con Caldo EC-MUG deberan atemperarse previamente por 30 minutos a 44.5 C, para
asegurar la reaccion de la enzima -galactosidasa.

Si se observa crecimiento bacteriano con produccion de gas a las 24 horas o antes, la presencia de
bacterias coliIormes se considerara conIirmada.

Para el calculo del NMP de coliIormes totales se contabilizaran como positivos aquellos tubos de la
serie elegida que hayan dado una prueba de conIirmacion positiva.

Para la conIirmacion de Escherichia Coli, en un ambiente oscuro se pasa una lampara UV a cada
tubo que presente gas y enturbiamiento, considerandose positivos los tubos que emitan luminiscencia.

Luego se analiza el numero de tubos positivos para cada medio segun la tabla. Si todos los tubos
dieran resultado positivo en la prueba conIirmativa, se procede a preparar diluciones, aadiendo otros 15
tubos con muestra en concentraciones decrecientes, y diluyendola con Agua de Dilucion.
Agua de Dilucin
El agua de dilucion esta Iormada por dos soluciones:

La solucion Stock A, preparada en base a IosIato monopotasico,
La solucion Stock B, preparada en base a cloruro de magnesio hexahidratado.

U.M.S.A.
| Microbiologia |
CIV 358


La adicion de estas dos soluciones (1.25 ml de solucion Stock A y 5 ml de solucion Stock B en 1 litro de
agua destilada) se distribuye en tubos de ensayo (9 0.2 ml) para diluir en ellos las muestras.

Una vez preparadas las diluciones en concentraciones decrecientes, mediante la adicion sucesiva de 1 ml
de muestra en cada tubo, se incuban estos de igual Iorma que para la Prueba ConIirmativa: los tubos con
caldo lactosado bilis verde brillante, a 35 2 C durante 24 h; y los tubos con caldo EC y caldo EC-MUG se
incubaran a 44.5 C durante 24 h despues de atemperarse los tubos con caldo EG-MUG por 30 minutos a
44.5 C.

La presencia de gas y enturbiamiento indica el caracter positivo del tubo.

Rtwgdc Eqorngogpvctkc

Los tubos positivos de la Prueba ConIirmativa se veriIican con la Prueba Complementaria, que consiste
en resembrar cada tubo positivo en un medio Agar especiIico para cada microorganismo:

agar m Endo o agar m-Endo Less para coliIormes totales.
agar m FC para coliIormes termorresistentes.

Se siembra asepticamente una caja de agar por tubo positivo con la tecnica del agotamiento de
cuadrantes, y los medios se llevan a su respectiva incubacion. Se toman 5 colonias tipicas Iormadas en cada
medio, que son transportadas a caldo lactosado e incubadas a 35 2C por 24 horas, para veriIicar la
presencia de gas y enturbiamiento del medio, que conIirman el resultado es positivo.

3. Materiales.

Materiales Generales

15 Tubos de ensayo
15 Campanas de Durham
Caldo Lauril Triptosa
U.M.S.A.
| Microbiologia |
CIV 358


Algodon
1 Gradilla
Mechero Bunsen
Muestra de jugo de toronja
Marcador
Propipeta
Pinza


Tubos de Ensavo v gradilla Caldo Lauril Triptosa Muestras a Anali:ar

Prueba Presuntiva

15 Tubos de ensayo
15 Campanas de Durham
Caldo Lactosado de doble y de simple concentracion.
Algodon
1 Gradilla
Mechero Bunsen
Muestra de jugo de toronja
Marcador para identiIicar los tubos de ensayo
1 Pipeta esteril graduada de 10ml
1 Pipeta esteril graduada de 1ml
1 pipeta esteril graduada de 0.1 ml
Agitador Electrico
EstuIa de Incubacion
U.M.S.A.
| Microbiologia |
CIV 358





Mechero Vibrador elctrico Incubadora
Prueba ConIirmativa

Asa Bacteriologica
Caldo lactosado Bilis Verde Brillante 2
Caldo Ec
Caldo EC MUG
Bao Maria
EstuIa de Incubacion


Caldo EC - MUG Caldo Lactosado Verde Brillante Billis



U.M.S.A.
| Microbiologia |
CIV 358


Lmpara de Rayos UV Bao Mara
Prueba Complementaria

Asa Bacteriologica
Caja Petri con Agar m FC
Caja Petri con Agar m Endo
EstuIa de Incubacion
Bao Maria
Caldo lactosado de simple concentracion


Agar m FC y Agar M Endo
4. Procedimiento.

Antes de realizar la preparacion se desinIecto el meson. Debe registrarse previamente en cada caja los
datos necesarios para la identiIicacion de la muestra.

PRUEBA PRESUNTIVA
a) Primeramente acomodamos en una gradilla los 15 tubos de ensayo: 5 tubos con caldo lactosado
de doble concentracion y 10 con caldo lactosado de simple concentracion.






U.M.S.A.
| Microbiologia |
CIV 358


Caldos utili:ados en la prueba presuntiva


Tubos de caldo lactosado de simple concentracion Tubos de caldo lactosado de doble concentracion

Fuente. Elaboracion Propia

b) Agitamos la muestra 25 veces vigorosamente.
c) IdentiIicamos con el marcador los tubos de ensayo anotando el volumen de muestra, grupo y el
numero de la muestra.
d) Colocamos 10 ml de muestra en los primeros 5 tubos de ensayo que contienen caldo lactosado de
doble concentracion; luego colocamos 1 ml de muestra en los 5 tubos caldo lactosado pero de
simple concentracion y por ultimo colocamos 0.1 ml de muestra a los 5 tubos restantes que
contienen caldo lactosado de simple concentracion.
Esquema del inciso d)

Elaboracion. Fuente propia
U.M.S.A.
| Microbiologia |
CIV 358


e) Luego Ilameamos el tubo, de manera analoga con los tubos de simple concentracion, se
procedera a Ilamear la boca del tubo antes de cerrar.
I) Luego uno a uno de los tubos voy a agitarlos durante un minuto con un agitador electronico hasta
tener una mezcla homogenea. Se debe tener cuidado de que no le entre aire a la campana ya que
esta llena del medio.
Agitado Mecanico del tubo

Elaboracion. Fuente propia

g) Colocar la gradilla con los 15 tubos en la estuIa durante 24 horas.

Gradilla dentro el horno

Elaboracion. Fuente propia
U.M.S.A.
| Microbiologia |
CIV 358


h) Despues de las 24 horas sacamos la gradilla con los tubos y observamos los tubos que tienen
desprendimiento de gas y enturbiamiento del medio para considerarselos positivos, si los tubos
no tienen estas caracteristicas entonces se los considera negativos y se los incuba nuevamente 24
horas.
Tubos recogidos del horno

Elaboracion. Fuente propia

i) Anotamos en una tabla los tubos que nos dieron positivos y estos los pasamos a la prueba
conIirmativa.

Se observa por la i:quierda una muestra negativa, v por la derecha un tubo positivo

Elaboracion. Fuente propia
U.M.S.A.
| Microbiologia |
CIV 358


PRUEBA CONFIRMATIVA
Por cada tubo positivo de la prueba presuntiva necesitamos 3 tubos para conIirmar coliIormes totales,
coliIormes termorresistentes y Escherichia coli.

Prueba presuntiva vemos la generacion de Enturbiamiento v Desprendimiento en 24 horas



Fuente. Elaboracion propia

Como se puede observar en los cuadros de arriba, tenemos en total 5 tubos positivos lo que nos indica
que necesitamos un total de 15 tubos.

a) Acomodamos en una gradilla los tubos de ensayo que contienen 10 ml de muestra, luego
colocamos tubos de ensayo con caldo Ec para conIirmar coliIormes termorresistentes, siempre y
cuando previamente haya habido un indicio del mismo, seguido de tubos con caldo Ec MUG para
conIirmar Escherichia coli y por ultimo acomodamos tubos con caldo lactosado bilis verde
brillante 2 (CLBVB) para conIirmar coliIormes totales. Hacemos el mismo procedimiento
para los volumenes de 1 y 0.1 ml de muestra.




4 Negativo
5 Negativo
Volumen
Tubo
N
Enturbiamiento y
Desprendimiento
1 |ml|
1 Negativo
2 Negativo
3 Positivo Negativo
Positivo
Negativo
1
2
3
4
5
Volumen
Tubo
Enturbiamiento y
Desprendimiento
Negativo
Positivo
N
10 |ml|
Positivo
Enturbiamiento y
Desprendimiento
0,1 |ml|
1 Negativo
2 Negativo
3 Negativo
4 Positivo
Volumen
Tubo
N
5
U.M.S.A.
| Microbiologia |
CIV 358



Tubos positivos de la prueba presuntiva funto a los 3 caldos

Elaboracion. Fuente propia
b) Por cada tubo positivo se realiza el siguiente procedimiento: agarramos los 4 tubos con la mano
izquierda en el siguiente orden: 1 tubo con muestra, 2 tubo con caldo Ec, 3 tubo con caldo Ec
MUG y 4 tubo con CLBVB; luego aIlojamos las tapas y los algodones.

Se necesita ganar destre:a para poder agarrar los tubos

U.M.S.A.
| Microbiologia |
CIV 358


Elaboracion. Fuente propia
c) Esterilizamos al rojo vivo el asa bacteriologica y lo enIriamos en el tubo con caldo Ec.
d) Extraemos tres asadas de cada tubo positivo e inoculamos primero en el tubo con caldo Ec, luego
extraemos otras tres asadas para el tubo con caldo Ec MUG y por ultimo tres asadas para el tubo
con CLBVB.
e) Flameamos la boca de cada tubo, tapamos y esterilizamos el asa bacteriologica nuevamente.
I) El tubo con la muestra lo descartamos y colocamos los tubos en el mismo orden que estaban en el
inicio de la prueba conIirmativa.
g) Realizamos el mismo procedimiento para los tubos con muestras de 1 y 0.1 ml.
h) Antes se debe identiIicar todos los tubos de ensayo.
i) Incubamos todos los tubos de CLBVB inoculados durante 24 horas a 35 2 C.

Incubacion de CLBJB

Elaboracion. Fuente propia



U.M.S.A.
| Microbiologia |
CIV 358



j) Incubamos todos los tubos de caldo EC-MUG y caldo Ec durante 24 horas a 44.5 C.0.5C en
Bao Maria.
Incubacion de caldos EC-MUG v Ec

Elaboracion. Fuente propia

k) Para conIirmar tubo conIirmativo positivo para coliIormes totales tiene que haber enturbiamiento
y desprendimiento de gas en el caldo lactosado de bilis verde brillante.

En la i:quierda tenemos una muestra positiva v por la derecha un tubo negativo

U.M.S.A.
| Microbiologia |
CIV 358


Elaboracion. Fuente propia
l) Para considerar tubo conIirmativo positivo para coliIormes termorresistente tiene que haber
enturbiamiento y desprendimiento de gas.

Se ve el enturbiamiento v el desprendimiento de gases del tubo positivo

Elaboracion. Fuente propia

m) Para considerar tubo conIirmativo positivo para Escherichia Coli tiene que haber la presencia de
luminiscencia o Iluorescencia. Esto lo haremos con una lampara UV 254 nm.

Equipo para la confirmacion de Escherichia Coli

Elaboracion. Fuente propia
U.M.S.A.
| Microbiologia |
CIV 358


n) Todos los valores los anotamos en una tabla.
Jalores obtenidos en Laboratorio

Elaboracion. Fuente propia

PRUEBA COMPLEMENTARIA

Solo utilizamos los tubos positivos con caldo lactosado bilis verde brillante y caldo Ec.

a) Para coliIormes totales utilizamos el Agar m Endoles.
b) Para coliIormes termorresistentes utilizamos el agar m FC.
c) Debemos marcar las cajas con el numero de grupo que realiza la prueba, el volumen de la
muestra.




U.M.S.A.
| Microbiologia |
CIV 358



Identificacion de los medios de cultivo




Marcado de Agar Remarcado de Tubo
Fuente. Elaboracion Propia

d) Esterilizamos al rojo vivo el asa bacteriologica y la enIriamos en una esquina del agar o en la
tapa.
Medios de cultivo v Esterili:acion



Agares utilizados DesinIeccion de la asa bacteriologica
Fuente. Elaboracion Propia

e) Con ayuda del asa bacteriologica tomamos una porcion de un tubo positivo de la prueba
conIirmativa para coliIormes totales lo depositamos en una esquina del agar suave sobre la
superIicie para no destruir el medio y lo estriamos una porcion.
U.M.S.A.
| Microbiologia |
CIV 358



Siembra de la muestra



Deposicion Estriamiento
Fuente. Elaboracion Propia

I) Esterilizamos otra vez el asa y lo enIriamos nuevamente en otra esquina donde no hay muestra y
de donde hemos terminado llevamos al otro lado.
g) Volvemos a quemar el asa la enIriamos y donde hemos terminado llevamos al otro lado y ahi
terminamos; a esta siembra se llama siembra por agotamiento de cuadrantes.

Grafonema reali:ado por la Doctora

Fuente. Elaboracion Propia
U.M.S.A.
| Microbiologia |
CIV 358



h) Luego incubamos el agar m Endo en una estuIa a 35 0.2C durante 24 horas.
i) Incubamos el agar m FC en Bao Maria durante 24 horas a 44.5 0.5C.

Temperatura de los Medios de Incubacion



Bao Maria Horno
Fuente. Elaboracion Propia

j) Al cabo de 24 horas si existe la presencia de coliIormes totales veremos en el agar la Iormacion
de colonias de color rojo con brillo verde metalico.

Formacion de colonias

U.M.S.A.
| Microbiologia |
CIV 358


Fuente. Elaboracion propia
k) Y para coliIormes termorresistentes veremos la Iormacion de colonias de color azul pastel sobre
el agar.
Formacion de colonias

Fuente. Elaboracion propia

l) Para coliIormes totales tomamos con la ayuda del asa bacteriologica previamente esterilizada al
rojo vivo y enIriada, 5 colonias del agar m Endoles y lo llevamos a un caldo lactosado en simple
concentracion. Incubamos a 35 0.2C durante 24 horas.

m) En caso positivo tendra que haber despues de las 24 horas enturbiamiento y desprendimiento de
gas.








U.M.S.A.
| Microbiologia |
CIV 358



n) Para coliIormes termorresistentes tambien con la ayuda del asa tomamos 5 colonias del agar m Fc
y lo llevamos a un caldo lactosado y lo incubamos en Bao Maria durante 24 horas.

o) En caso positivo habra desprendimiento de gas y enturbiamiento.




5. Resultados.





U.M.S.A.
| Microbiologia |
CIV 358



Familias, grupos e individuos fecales

Fuente. Elaboracion propia

U.M.S.A.
| Microbiologia |
CIV 358


6. Clculos.

ColiIormes Totales

Vemos que no tenemos el codigo; 2-0-2. El codigo que se acerca es 2-0-1. Si bien podriamos
utilizar la Iormula que se indica en la guia, los resultados tenemos que darlos en notacion cientiIica,
donde seguramente se perderan los decimales que se ganen con la Iormula.

Por lo que tendremos: 7x10
0
NMP/100 |ml|

ColiIormes Termorresitentes.

Vemos que no tenemos el codigo; 2-1-1. Utilizando la tabla proporcionada en la guia vemos
que tendriamos: 9x10
0
NMP/100 |ml|. Pero como este valor no puede ser mayor al obtenido en
coliIormes totales, podemos asumir que no se ha realizado un agitado vigoroso como pide el
procedimiento.
Por lo que asumimos un valor igual al de coliIormes totales; 7x10
0
NMP/100 |ml|

Escherichia Coli.

Vemos que no tenemos el codigo; 0-0-0. Utilizando la tabla proporcionada en la guia vemos
que tendriamos: 2x10
0
NMP/100 |ml|.

7. Conclusiones.

Las diIerentes lecturas realizadas para el jugo de toronja nos indican que existe presencia de
coliIormes totales y coliIormes termorresistentes lo que nos indica que existe contaminacion
ambiental.

No se encontro la presencia de Escherichia coli por lo que no hay una contaminacion por heces
Iecales. Esto debido a que en el jugo tenemos un PH acido, el cual es un ambiente inhospito para
dicho microorganismo
U.M.S.A.
| Microbiologia |
CIV 358



Siempre debemos Ilamear la boca de los tubos.

Si colocamos en nuestra mano izquierda primero el CLBVB entonces podriamos ensuciar al tomar la
muestra con el asa los otros caldos con color verde; es por esta razon que va en 4 lugar.

Una vez terminado el laboratorio debemos lavarnos la mano como tambien en el inicio de la practica.

Relacion del Codigo con el NMP
U.M.S.A.
| Microbiologia |
CIV 358



Fuente. Elaboracion propia

BIBLIOGRAFIA

Guia de laboratorio, Instituto de Sanitaria UMSA.
Dra. Maria EuIemia Briancon Gutierrez
Apuntes de Clase Microbiologia UMSA
U.M.S.A.
| Microbiologia |
CIV 358