BAB III METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan selama 3 bulan di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan Fakultas Biologi, Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Kedokteran dan Laboratorium Biologi Farmasi Jurusan Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu-Ilmu Kesehatan Unsoed Purwokerto. B. Alat dan Bahan 1. Alat Penelitian Alat yang digunakan adalah timbangan, neraca analitik, oven, autoklaf, penangas air, evaporator, lumpang alu, alat-alat gelas, inkubator, mikropipet, lampu spirtus, corong buchner, jarum ose, wrapping, kapas, cotten bat steril, batang drgalsky, kertas alumunium foil dan bunsen. 2. Bahan Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah buah manggis dari Kecamatan Rawalo, Kabupaten Banyumas. Bahan kimia yang digunakan adalah etanol 70%, isolat S.flexneri dari Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Kedokteran UNSOED, media Nutrien Broth (NB), media Muller Hinton Agar (MHA), akuades dan ciprofloksasin.

14

15

C. Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorium. dengan konsentrasi ekstrak kulit buah manggis yang digunakan adalah 6 konsentrasi yaitu 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,12 %, dan 1,56%. Masing-masing konsentrasi akan diulang sebanyak 3 kali. Variable penelitian yang diamati adalah sebagai berikut : 1. Variabel Bebas Variabel bebas adalah variasi konsentrasi ekstrak etanol 70% kulit buah manggis. 2. Variabel Terikat Variabel terikat adalah kadar hambat minimum (KHM) dan kadar bunuh minimum (KBM) ekstrak etanol kulit buah manggis. 3. Variabel Terkendali Variabel terkendali adalah suhu incubator.

Tahapan penelitiannya adalah sebagai berikut : 1. Ekstraksi kulit buah manggis dengan menggunakan metode maserasi. 2. Uji KHM dan KBM ekstrak etanol kulit buah manggis terhadap bakteri S.flexneri dengan metode dilusi cair.

16

Tahapan penelitian secara skematis yang akan dilakukan dapat dilihat pada gambar 3.1
Kulit buah manggis (G. mangostana) Dideterminasi Dibersihkan Dikeringkan

Serbuk simplisia

Ekstrasi Dimaserasi denagan etanol 70% selama 3x24 jam dievaporasi

Ekstrak kental

Uji KHM dan KBM dengan dilusi cair

Analisis

Kesimpulan

Gambar 3.1. Diagram Alir Penelitian

D. Jalannya Penelitian 1. Determinasi Tumbuhan Buah manggis diperoleh dari Kecamatan Rawalo Kabupaten Banyumas. Kemudian buah manggis dilakukan determinasi dan deskripsi

17

untuk mengetahui kebenaran sampel yang digunakan dalam penelitian. Determinasi ini dilakukan di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan Fakultas Biologi UNSOED. 2. Penyiapan Bahan Buah manggis dibersihkan kemudian dipisahkan antara buah dan kulit buah manggis. 10 kg buah manggis didapatkan 4,8 kg kulit buah manggis. Kulit buah manggis yang telah dipotong kecil-kecil kemudian dijemur terlebih dahulu selama 7 jam dipanas matahari dengan ditutup kain hitam kemudian dikeringkan di dalam oven dengan suhu 700 C selama 1x18 jam. Kemudian simplisia kering ditumbuk sampai menjadi serbuk lalu diayak dengan ayakan 4/18 (Poeloengan, 2010). 3. Pembuatan Ekstrak Hasil dari simplisia kering didapatkan serbuk kulit buah manggis 400 gram. Serbuk direndam dalam etanol 70% selama 3x24 jam, kemudian diambil filtratnya dengan cara disaring menggunakan corong buchner. Filtrat dipekatkan dengan menggunakan evaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat dan tidak mengandung etanol. 4. Uji Antibakteri a. Pembuatan Medium Nutrien Broth (NB) Pembuatan medium NB oxoid menurut aturan yang tertera dalam kemasan adalah sebanyak 13 gr dilarutkan kedalam 1000 ml aquades. Satu kali pengujian membutuhkan 10 tabung, 1 tabung berisi 10 ml medium cair.

18

Pengujian dilakukan 3 kali pengulangan. Medium disterilkan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 1210C, tekanan 1 atm selama 15 menit. b. Pembuatan Medium Mueller Hinton Agar (MHA) Medium yang digunakan untuk pengujian adalah Mueller Hinton Agar Oxoid yang memiliki formula (300 gr/L), Casein hydrolysate (17,5 gr/L), Starch (1,5 ge/L), Agar (17 gr/L). Medium MHA dibuat dengan cara melarutkan sebanyak 3,8 gram serbuk medium MHA (Oxoid) instan ke dalam 100 ml aquades. Selanjutnya medium dipanaskan di atas hot plate dan di aduk sehingga semua bahan larut. Medium dimasukkan ke dalam beberapa tabung reaksi 15 ml, lalu ditutup dengan alumunium foil dan disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121C dan tekanan 1 atm selama 15-20 menit (Bridson, 1998). c. Pembuatan Inokulum Bakteri Uji Sebanyak satu ose isolat S. flexneri dari biakan agar dan diinokulasikan ke dalam 10 ml media NB steril. Kemudian diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 37C selama 24 jam. d. Pembuatan Larutan Uji Variasi konsentrasi larutan uji dibuat dengan pengenceran ekstrak kental ditambahkan akuades. Pengenceran rumus pengenceran. larutan stok ini menggunakan

19

V1 C1 = V2 C2 Ket: C1 = konsentrasi larutan stok V1 = volume larutan stok C2 = konsentrasi larutan uji V2 = volume larutan stok e. Uji KHM dan KBM S. flexneri (Khunaifi, 2010). Penelitian ini menggunakan metode dilusi yang meliputi dua tahap, yaitu penentuan KHM (Kadar Hambat Minimum) dan KBM (Kadar Bunuh Minimum). Konsentrasi ektrak etanol kulit manggis yang digunakan adalah 6 konsentrasi yaitu 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,12 %, dan 1,56% . Masing-masing konsentrasi yang telah dibuat diambil 1 ml dan ditambah 0,1 ml suspensi bakteri S flexneri dan ditambah 5 ml Nutrien Broth. Ada 2 kelompok tambahan yaitu kelompok kontrol

negatif dan kontrol positif masing-masing pelakuan diinkubasi selama 1x24 jam. Sehingga penelitian ini dibagi menjadi 8 kelompok: 1. Kelompok perlakuan 1 (P1) untuk konsentrasi 50% : sebanyak 1 ml ekstrak etanol kulit buah manggis 50% ditambah dengan Nutrien Broth 5 ml kemudian ditambah 0,1 ml suspensi bakteri S flexneri. 2. Kelompok perlakuan 2 (P2) untuk konsentrasi 25% : sebanyak 1 ml ekstrak etanol kulit buah manggis 25% ditambah dengan Nutrien Broth 5 ml kemudian ditambah 0,1 ml suspensi bakteri S.flexneri.

20

3.

Kelompok perlakuan 3 (P3) untuk konsentrasi 12,5% : sebanyak 1 ml ekstrak etanol kulit buah manggis 12,5% ditambah dengan Nutrien Broth 5 ml kemudian ditambah 0,1 ml suspensi bakteri S.flexneri

4.

Kelompok perlakuan 4 (P4) untuk konsentrasi 6,25% : sebanyak 1 ml ekstrak etanol kulit buah manggis 6,25% ditambah dengan Nutrien

Broth 5 ml kemudian ditambah 0,1 ml suspensi bakteri S flexneri 5. Kelompok perlakuan 5 (P5) untuk konsentrasi 3,12% : sebanyak 1 ml ekstrak etanol kulit buah manggis 3,12% ditambah dengan Nutrien Broth 5 ml kemudian ditambah 0,1 ml suspensi bakteri S flexneri 6. Kelompok perlakuan 6 (P6) untuk konsentrasi 1,56% : sebanyak 1 ml ekstrak etanol kulit buah manggis 1,56% ditambah dengan Nutrien Broth 5 ml kemudian ditambah 0,1 ml suspensi bakteri S.flexneri 7. Kelompok kontrol negatif (K-) yaitu 5 ml Nutrien Broth ditambah 0,1 ml suspensi bakteri S.flexneri 8. kelompok kontrol positif (K+) yaitu 5 ml Medium Nutrien Broth ditambah ciprofloksasin yang dilarutkan dengan etanol dan ditambah 0,5 ml suspensi bakteri S.flexneri Masing-masing kelompok diatas dilakukan pengulangan sebanyak tiga kali. Semua tabung tersebut diinkubasi pada suhu 37C selama 1x24 jam, kemudian diamati antara kelompok perlakuan dan kontrol. Larutan sampel dengan kosentrasi terkecil yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri (ditandai dengan kejernihan secara visual yang dinilai oleh tiga pengamat secara independent) dinyatakan sebagai Kadar Hambat Minimum (KHM). Umtuk

21

mengetahui nilai Kadar Bunuh Minimum (KBM) dapat diketahui dengan cara menggoreskan larutan yang telah didapat pada penentuan KHM pada medium Mueller Hinton Agar (MHA) setelah itu baru dimasukkan dalam inkubator selama 1x24 jam . Konsentrasi terendah dimana pada media tidak terdapat pertumbuhan koloni bakteri ditentukan sebagai KBM. Pertumbuhan bakteri dapat dihitung dengan menggunakan colony counter. Masing-masing dilakukan 3 kali pengulangan (Ramadanti, 2008). Pengamatan dan perhitungan dilakukan pada jumlah koloni dan rata-rata koloni, kemudian dapat ditentukan presentase penghambatannya dengan menggunakan perhitungan sebagai berikut :

Keterangan : A = Rata-rata koloni kontrol B = Rata-rata koloni perlakuan E. Analisis Data Data hasil penelitian Kadar Hambat Minimum dan Kadar Bunuh Minimum suatu bakteri dilakukan secara deskriptif dengan melihat kejernihan secara visual yang dilihat oleh tiga pengamat independent. Setelah didapatkan data kemudian dianalisis dan ditarik kesimpulan.