Universidade Federal do Tringulo Mineiro

Departamento de Cincias Biolgicas

Disciplina de Microbiologia Aplicada
Relatrio de Prtica
PREPARO DE MEIOS DE CULTURA E DE
MATERIAIS NO LABORATRIO DE
MICROBIOLOGIA
Marcus Vinicius Naghetini dos Santos
Rafaella Kizzy ncio dos Reis
Uberaba, novembro/2009
OBJETIVO
Preparo de meios de cultura e materiais para elaborao de prticas no laboratrio
de Microbiologia.
INTRODUO
Em um laboratrio de microbiologia, importante que existam equipamentos e
normas para proporcionar segurana e exatido nos resultados. Para isso, segundo a
ANVSA (Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria), so precisos equipamentos mnimos
para seu funcionamento adequando, como: estufa bacteriolgica, forno de Pasteur,
autoclave, microscpio binocular, centrifugador de baixa rotao, homogeneizador, banho-
maria de pequena dimenso, destilador para gua, balana para tarar tubos, balana
comum com uma ou duas casas decimais, bico de Bunsen, geladeira e capela de fluxo
laminar.
Com estes equipamentos, pode-se ento dar incio prtica de microbiologia, sem
riscos de contaminao e com segurana.
MATERIAIS E MTODOS
Foram utilizados os seguintes equipamentos:
Autoclave
Papel pardo
Barbante
Pipetas
Balo de fundo chato
Balana de preciso
Esptula de madeira
Meio de cultura slido
gua destilada
Placa de Petri
Tubo de ensaio
Bico de Bunsen
Fita crepe termossensvel
Ponteiras descartveis
Preparao dos meios de cultura
Foram preparados os meios de cultura: gar MacConkey, gar Mueller-Hinton, gar
manitol, meio SM, gar Uria e gar sangue.
Na preparao do gar MacConkey, preparou-se 500mL de gar com uma
concentrao de 51,5g/L. Para isso, pesou-se 25,75g de meio de cultura slido em uma
balana de preciso, com o auxlio de uma esptula de madeira. Essa quantidade foi
adicionada a um balo de fundo chato e, ento, adicionou-se 500mL de gua destilada. O
preparado foi homogeneizado, lacrado e autoclavado. Na retirada, o meio estava a 121C,
sendo resfriado em gua corrente, at 45C. Posteriormente, este foi adicionado a placas
de Petri para solidificao. O bico de bunsen foi utilizado para a retirada de possveis
bolhas no meio.
Os demais meios de cultura foram preparados semelhana do anterior, porm
com concentraes diferentes:
gar Mueller-Hinton: 500 mL concentrao de 36g/L.
gar manitol: 500 mL concentrao de 111g/L.
Meio SM: 100 mL concentrao de 30g/L.
gar Uria: 95 mL concentrao de 25,2g/L.
gar sangue: 800 mL concentrao de 40g/L 5% de sangue humano
Processo de autoclavagem
Foi utilizado invlucro de papel pardo, para envolver pipetas, ponteiras, tubos de
ensaio e o gargalo do balo de fundo chato. dentificou-se o material com fita crepe
termossensvel, o nome dos meios de cultura e os volumes das pipetas. Estes foram
lacrados com barbante. Em seguida adicionou-se gua destilada para cobrir a resistncia
da autoclave e, posteriormente, inseriu os materiais na autoclave. Esta foi fechada e
ligada durante 30 minutos a 121C. Aps esse tempo, aguardar a sada do vapor e
diminuio da presso, abrindo a autoclave e retirando os materiais com cuidado.
http://www2.phoenix.ind.br/?id=474
RESULTADOS E DISCUSSO
Aps a solidificao dos meios, estes so armazenados, podendo ser utilizados
para culturas e em prova bioqumicas para anlise de microrganismos.
Os equipamentos autoclavados estaro prontos para serem utilizados, com uma
capacidade de armazenamento de at 15 dias.
Segundo o manual da ANVSA "Segurana e Controle de Qualidade no Laboratrio
de Microbiologia Clnica, todos os materiais e resduos do laboratrio devero ser
descontaminados antes de serem utilizados e descartados atravs de um mtodo de
descontaminao aprovado, como a esterilizao por calor mido (autoclave). Outras
medidas para diminuir os riscos no laboratrio referem-se, principalmente, a:
Pipetagem: contra-indicada a pipetagem, com a boca, de material clnico
(sangue, liquor, urina, etc.) ou de suspenses bacterianas. Deve-se utilizar, sempre que
possvel, pipetas automticas ou bulbos de borracha;
Flambagem de Ala Bacteriolgica: Deve ser feita atravs de chama, que deve
estar entre o manipulador e a ala, sempre que for feito a manipulao de material
biolgico ou durante transferncia de massa bacteriana;
Disseminao de Esporos de Fungos: Ao se trabalhar com fungos, particularmente
os filamentosos, recomenda-se o uso de cabines biolgicas.
BIBLIOGRAFIA
1. TRABULS, Luiz Rachid; ALTERTHUM, Flavio. Microbiologia. 4. ed. So Paulo:
Atheneu, 2005.
2. KONEMAN, Elmer W. Diagnstico Microbiolgico: Texto e Atlas Colorido. 5. ed. So
Paulo: MEDS, 2001
3. AGNCA NACONAL DE VGLNCA SANTRA: Segurana e Controle de
Qualidade no Laboratrio de Microbiologia Clnica. Disponvel em:
<www.anvisa.gov.br/servicosaude/microbiologia/mod_2_2004.pdf>. Acesso em: 12 nov.
2009
4. MANUAL DE BOSSEGURANA dos Ambulatrios da Faculdade de Odontologia da
PUCRS. Disponvel em: <http://www.pucrs.br/odonto/manual.pdf>. Acesso em: 12 nov.
2009
5. SOLAMENTO DE MCRORGANSMOS COM PROVAS BOQUMCAS. Disponvel em:
<www.microbiologia.ufba.br/aulas/provas%20bioquimicas.doc>. Acesso em: 12 nov. 2009
6. AUTOCLAVES VERTCAS. Disponvel em:
<http://www.stermax.com.br/manuais/MANUAL_VERTCAS.pdf>. Acesso em: 12 nov.
2009
Universidade Federal do Tringulo Mineiro
Departamento de Cincias Biolgicas
Disciplina de Microbiologia Aplicada
Relatrio de Prtica
COLETA SEMEADURA E COLORAO DE GRAM
DE AMOSTRAS CL!NICAS
Marcus Vinicius Naghetini dos Santos
Rafaella Kizzy ncio dos Reis
Uberaba, novembro/2009
OBJETIVO
Coletar amostras de fossas nasais, orofaringe e urina, para semeadura e
identificao pelo mtodo de Gram.
INTRODUO
Quando se suspeita de uma doena infecciosa, devem ser solicitados cultivos
apropriados ou tcnicas dirigidas deteco sorolgica de antgenos e anticorpos. Em
muitas instituies e comunidades, pode-se contar com patologistas, microbiologistas e
tcnicos para auxiliar os mdicos na seleo das amostras adequadas para cultivo, e
solicitar as provas apropriadas para alcanar o mximo isolamento ou deteco do
microrganismo. possvel que a colheita apropriada de uma amostra para cultivo seja a
etapa mais importante na confirmao final de que um microrganismo responsvel pelo
processo de enfermidade infecciosa. Uma amostra mal colhida pode resultar em fracasso
no isolamento de microrganismos importantes.
As infeces urinrias esto entre as enfermidades mais freqentes na prtica
mdica, sendo que o sexo feminino o mais afetado devido proximidade do nus com a
abertura urinria e ao fato da uretra feminina ser mais curta do que a masculina entre
outros fatores, o que proporciona a predominncia de enterobactrias neste stio
anatmico, sobretudo Escherichia coli.
altamente recomendvel que os microbiologistas efetuem exames microscpicos
diretos das amostras enviadas para cultivo. No s pode ser possvel proporcionar ao
mdico um rpido diagnstico presuntivo, mas tambm a deteco de microrganismos
especficos pode servir como guia para selecionar os meios de cultura apropriados e
fornecer uma valiosa comparao de controle de qualidade com os isolados recuperados.
A colorao de Gram, descoberta h pouco menos de 100 anos, utilizada com muita
freqncia para o exame microscpico direto de amostras e subcultivos.
MATERIAIS E MTODOS
Foram utilizados os seguintes materiais:
Swab
Esptula de madeira
Bico de bunsen
gar sangue
gar MacConkey
gar manitol
Amostras biolgicas
Ala de platina
Tubos de ensaio
Lmina
Cristal violeta
Lugol
lcool etlico 95%
Fucsina de Gram
leo de imerso
Microscpio tico
Pipeta automtica
Ponteiras descartveis
Soro fisiolgico
Coleta e semeadura de material
Foram coletas amostras clnicas dos prprios estudantes, utilizando-se um swab
para material das fossas nasais e um para a orofaringe.
Nas fossas nasais, esfrega-se o swab, umedecido com soro fisiolgico, com
movimentos circulares delicados, pressionando-o contra a parede lateral do nariz,
conforme desenho abaixo:
http://www.saude.rs.gov.br/dados/12424086612881241803265859Normas%20laboratoriais%20coleta%20nf
luenza%20AH1N1.pdf
Aps a coleta, o material semeado por tcnica de esgotamento no gar manitol,
prximo chama do bico de bunsen.
Na orofaringe, colhe-se swab, umedecido com soro fisiolgicos, na rea posterior
da faringe e tonsilas, evitando tocar na lngua, abaixando esta com a esptula de madeira,
conforme desenho abaixo:
http://www.saude.rs.gov.br/dados/12424086612881241803265859Normas%20laboratoriais%20coleta%20nf
luenza%20AH1N1.pdf
Aps a coleta, o material semeado por tcnica de esgotamento no gar sangue,
prximo chama do bico de bunsen.
A urina foi coletada previamente de um paciente do Hospital Escola, e foi feita a
tcnica de semeadura em esteira, no meio MacConkey, prximo chama do bico de
bunsen.
Colorao de Gram
Aps o crescimento nos meios de cultura, foi feito um esfregao do material em
duas lminas, conforme o esquema abaixo. Na primeira, foram utilizadas trs colnias
diferentes do meio gar sangue. Na segunda, foram utilizadas uma colnia do gar
manitol (A) e uma colnia do gar MacConkey (B). Deixar secar ao ar.
Aps isso, deve-se fixar o material na lmina, passando-a trs a quatro vezes
atravs da chama do bico de bunsen, de modo que o material no seja removido durante
o procedimento durante o procedimento de colorao.
Coloca-se a lmina sobre um suporte para colorao e cobrir a superfcie com
soluo de cristal violeta. Aps um minuto, lavar bem com gua destilada. Cobrir o
esfregao com soluo de lugol durante dois minutos. Lavar novamente com gua
destilada. Sustenta-se a lmina entre os dedos polegar e indicador e cobrir a superfcie do
esfregao com lcool durante alguns poucos segundos. Lavar com gua corrente e
colocar novamente a preparao sobre suporte para colorao. Adiciona-se fucsina de
Gram durante um minuto e lavar com gua corrente. Coloca-se a lmina em posio
vertical deixando que o excesso de gua escorra e o esfregao seque. Examinar o
esfregao com leo de imerso na objetiva de 100x no microscpio ptico.
Mtodo de diluio da urina
Aps a coleta da urina, utiliza-se uma pipeta automtica para fazer a diluio em
soro desta. No primeiro tubo, contendo 100L de soro, adiciona-se 10L de urina.
Posteriormente, toma-se 10L desta soluo e adicionar no segundo tubo, que contem
1000L de soro. Homogeneizar e descartar 10L deste segundo tubo. Foram, ento,
semeadas em esteira, em trs placas contendo gar MacConkey, utilizando uma ala de
platina, sendo a primeira placa semeada com a urina sem diluio, a segunda com a urina
da primeira diluio e a terceira com a urina da segunda diluio, conforme esquema:
Aps a incubao por 24 horas a 37C, feita a contagem do nmero de colnias e
multiplica-se pelo fator de calibrao para emitir o resultado em unidades formadoras de
colnias (U.F.C) por mL.
RESULTADOS
Na cultura de gar sangue, cresceram trs tipos de colnias diferentes, todas
apresentando aspecto brilhante:
1. Acinzentada com alfa-hemlise;
2. Amarelada com gama-hemlise;
3. Transparente com gama-hemlise.
Na cultura de gar manitol (A), cresceu apenas um tipo de colnia, sendo esta rosa
e brilhante.
Na cultura de gar MacConkey (B), cresceu apenas um tipo de colnia, sendo esta
transparente, permanecendo inalterado a cor do meio.
Aps feita a colorao de Gram destas colnias, foram encontrados os seguintes
resultados, de acordo com o esquema:
Na regio 1 da placa de gar sangue, foram encontrados cocos Gram-negativos e
Gram-positivos.
Na regio 2 da placa de gar sangue, foram encontrados apenas cocos Gram-
negativos.
Na regio 3 da placa de gar sangue, foram encontrados apenas cocos Gram-
negativos.
Na regio A da placa de gar manitol, foram encontrados cocos Gram-positivos.
Na regio B da placa de gar MacConkey, no foram encontrados microrganismos.
No mtodo de diluio da urina, foi feito a seguinte contagem:
Sem diluio Houve crescimento em massa de bactrias.
Diluio 1:100 Foram contadas 200 colnias que, ao ser multiplicado pelo fator
de diluio (100), corresponde a 20.000 UFC a cada 10L. Porm, a contagem
deve ser feita em 1000L, sendo encontrado 2.000.000 UFC/mL.
Diluio 1:1000 Foram encontradas 17 colnias que, ao ser multiplicado pelo
fator de diluio (1000), corresponde a 17.000 UFC a cada 10L. Porm, a
contagem deve ser feita em 1000L, sendo encontrado 170.000 UFC/mL.
DISCUSSO
Segundo o mdulo V da apostila da ANVSA. O meio gar sangue, oferece timas
condies de crescimento a maioria dos microrganismos. A conservao dos eritrcitos
ntegros favorecem a formao de halos de hemlise ntidos, teis para a diferenciao
de Streptococcus sp e Staphylococcus sp. A interpretao da cor original do meio
vermelho. Na beta hemlise, apresenta halo transparente ao redor das colnias
semeadas (lise total dos eritrcitos). Na alfa hemlise, apresenta halo esverdeado ao
redor das colnias semeadas (lise parcial dos eritrcitos). Na gama hemlise (sem
hemlise) h ausncia de halo ao redor das colnias (eritrcitos permanecem ntegros).
Analisando os resultados obtidos da colorao de Gram de colnias retiradas do gar
sangue, pode-se fazer as seguintes inferncias:
Regio 1 A hemlise presente no gar sangue justificada pela presena de cocos
Gram-positivos, sendo estes do gnero Streptococcus produtores de hemolisinas. A
presena de cocos Gram-negativos pode ser justificado por uma mistura de colnias,
uma contaminao ou uma possvel lavagem excessiva durante a colorao de Gram.
Regies 2 e 3 A falta de hemlise no gar sangue pode ser justificada pela presena
de cocos Gram-negativos, no produtores de hemolisinas.
O gar manitol seletivo para Staphylococcus sp., atravs da fermentao do
manitol. Analisando os resultados obtidos da colorao de Gram de colnias retiradas de
gar manitol, pode-se confirmar que realmente se trata de uma espcie de
Staphylococcus.
O gar MacConkey, por apresentar cristal violeta como um de seus componentes,
inibe o crescimento de microrganismos Gram-positivos, especialmente enterococos e
estafilococos. Como a concentrao de sais de bile relativamente baixa, em
comparao com outros meios, este meio no to seletivo para Gram-negativos. Ele
utilizado para isolar estes microrganismos e verificar a fermentao ou no de lactose.
Analisando os resultados obtidos da colorao de Gram de colnias retiradas do gar
MacConkey, no se pode inferir nada, pois estas eram observadas no aumento de 10x,
mas no eram observadas no aumento de 100x.
A urina um excelente meio de cultura, bactrias contaminantes podem multiplicar-
se quando a mesma mantida temperatura ambiente e invalidar os resultados da
cultura. A semeadura deve ser feita com a urina em temperatura ambiente, espcimes
que no possam ser examinados em 2 horas aps a mico devem ser refrigerados. As
contagens bacterianas permanecem estveis por pelo menos 24 horas nessas condies.
De uma maneira geral, utiliza-se a seguinte conveno para a anlise dessas culturas:
Acima de 100.000 UFC/mL = indcio de infeco
Entre 10.000 a 90.000 UFC/mL = suspeita de infeco
Entre zero a 9.000 UFC/mL = sem significado clnico
Analisando-se os resultados obtidos nas duas diluies, ficou evidente a presena
de uma infeco, devido presena de mais de 100.000 UFC/mL.
BIBLIOGRAFIA
1. TRABULS, Luiz Rachid; ALTERTHUM, Flavio. Microbiologia. 4. ed. So Paulo:
Atheneu, 2005.
2. KONEMAN, Elmer W. Diagnstico Microbiolgico: Texto e Atlas Colorido. 5. ed. So
Paulo: MEDS, 2001
3. FRETAS, Valdionir da Rosa; PCOL, Simone Ulrich. A colorao de Gram e as
variaes na sua execuo. NewsLab, So Paulo, SP, v. 14, n. 82, p. 124-128, out. 2006.
4. TCNCA DE COLORAO DE GRAM. Braslia: Ministrio da Sade, Programa
Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e ADS. Srie TELELAB, 1997.
5. PROTOCOLOS DE MCROBOLOGA CLNCA Urocultura. Disponvel em:
<http://www.medcorp.com.br/medcorp/upload/downloads/NEWSLAB_Especial%20Protoc
olos%20de%20Microbiologia%20parte3_200872411239.pdf>. Acesso em: 12 nov. 2009
Universidade Federal do Tringulo Mineiro
Departamento de Cincias Biolgicas
Disciplina de Microbiologia Aplicada
Relatrio de Prtica
ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE COCOS
GRAM"POSITIVOS
Marcus Vinicius Naghetini dos Santos
Rafaella Kizzy ncio dos Reis
Uberaba, novembro/2009
OBJETIVO
solar e identificar, atravs de provas bioqumicas, as espcies de cocos Gram-
positivos mais comuns isolados de seres humanos.
INTRODUO
Com exceo dos membros da famlia Enterobacteriaceae, as bactrias Gram-
positivas, principalmente os cocos, so os microrganismos isolados com mais freqncia
a partir de amostras biolgicas humanas em laboratrios de microbiologia. Essas
bactrias esto amplamente distribudas na natureza, e podem ser isoladas de ambientes
ou como habitantes comensais da pele, mucosas e outros stios. Os cocos Gram-positivos
produzem uma variedade de doenas, incluindo foliculite, furnculo, carbnculo, erisipela
e celulite (estreptococos), alm de pneumonia e bacteremia (pneumococos). Portanto, o
isolamento e identificao desses microrganismos, a partir de amostras clnicas, sempre
deve ser correlacionado com o quadro clnico do paciente.
MATERIAIS E MTODOS
Foram utilizados os seguintes materiais:
Swab
Bico de bunsen
Meios de cultura gar sangue, Mueller Hinton, gar DNAse, gar manitol
Amostras biolgicas
Ala de platina
Agulha de platina
Pina
Lmina
Cristal violeta
Lugol
lcool etlico 95%
Fucsina Gram
leo de imerso
Microscpio tico
Perxido de hidrognio
Tubos de ensaio contendo plasma de coelho
Soluo salina
Discos de antibiticos (novobiocina, bacitracina e optoquina)
Tubos contendo gar bile esculina, caldo NaCl a 6,5%
Colorao de Gram
Foi feito um esfregao do material em duas lminas. Na primeira, foram utilizadas
trs colnias diferentes do meio gar sangue. Na segunda, foram utilizadas uma colnia
do gar manitol e uma colnia do gar MacConkey. Deixar secar ao ar.
Aps isso, deve-se fixar o material na lmina, passando-a trs a quatro vezes atravs da
chama do bico de bunsen, de modo que o material no seja removido durante o
procedimento durante o procedimento de colorao.
Coloca-se a lmina sobre um suporte para colorao e cobrir a superfcie com soluo de
cristal violeta. Aps um minuto, lavar bem com gua destilada. Cobrir o esfregao com
soluo de lugol durante dois minutos. Lavar novamente com gua destilada. Sustenta-se
a lmina entre os dedos polegar e indicador e cobrir a superfcie do esfregao com lcool
durante alguns poucos segundos. Lavar com gua corrente e colocar novamente a
preparao sobre suporte para colorao. Adiciona-se fucsina de Gram durante um
minuto e lavar com gua corrente. Coloca-se a lmina em posio vertical deixando que o
excesso de gua escorra e o esfregao seque. Examinar o esfregao com leo de
imerso na objetiva de 100x no microscpio ptico.
Provas io!u"micas
Produo de catalase: Colocar 2mL de gua oxigenada (H
2
O
2
) em um tubo de
ensaio. Utilizando um swab estril, tocar na colnia de cocos Gram-positivos e mergulhar
no tubo contendo H
2
O
2
. Se houver formao de bolhas a reao positiva; se no formar,
a reao negativa.
Produo de coagulase: Tocar em 2-3 colnias com a ala de platina flambada e fria e
introduzir em tubo de ensaio contendo 1mL de plasma de coelho. Homogeneizar bem e
incubar em estufa microbiolgica 37C. Fazer a primeira leitura com uma hora de
incubao e de hora em hora, at quatro horas. Se negativo, fazer nova leitura com 24
horas. Se houver formao de cogulo, o teste positivo; se no, o teste negativo.
Crescimento em gar manitol salgado: Esta prova confirmatria para as bactrias da
espcie S. aureus. Tocar as colnias com ala e semear em placa contendo meio gar
manitol salgado. ncubar a placa em estufa microbiolgica 35-37C por 18-24 horas. A
espcie S. aureus capaz de crescer e fermentar o manitol presente no meio,
modificando a cor do mesmo que originalmente era rosa para amarelo.
Presena de DNAse: Esta prova tambm confirmatria para as bactrias da espcie S.
aureus e testa a capacidade da bactria de produzir a enzima denominada DNAse, capaz
de digerir o DNA. Semear 2 a 3 colnias da bactria no centro do gar DNAse. ncubar
35-37C por 18-24 horas. Proceder leitura adicionando HCl. Se as colnias produzirem
DNAse, ao adicionar o HCl este precipitar o DNA restante no gar, tornando o meio
opaco e ao redor das colnias ser formado um halo transparente.
Sensibilidade Novobiocina: Fazer uma suspenso bacteriana em tubo contendo salina.
A turvao deve ser semelhante ao tubo 0,5 da escala de MacFarland. Umedecer um
swab estril na suspenso bacteriana e semear uniformemente em placa contendo gar
Mueller Hinton. Em seguida, utilizando uma pina, colocar um disco de Novobiocina no
centro da placa. Fixar o disco comprimindo-o em direo ao meio. ncubar a placa em
estufa microbiolgica 35-37C. A leitura feita com 24 horas; se houver um halo de
inibio do crescimento ao redor do disco de Novobiocina, a bactria considerada
sensvel; se no houver formao de halo, a bactria considerada resistente.
Prova de CAMP: Em placa de gar sangue, fazer uma estria central com bactrias da
espcie S. aureus hemoltica usando a ala de platina flambada e, em seguida, fazer
estrias perpendiculares estria central com bactrias do gnero Streptococcus a ser
identificada. A prova considerada positiva quando so formadas regies de hemlise em
formato de seta prximo ao crescimento das duas espcies.
Sensibilidade Optoquina e Bacitracina: Fazer uma suspenso bacteriana em tubo
contendo salina. A turvao deve ser semelhante ao tubo 0,5 da escala de MacFarland.
Semear a placa de gar sangue com swab estril umedecido na suspenso em toda a
superfcie da placa, uniformemente. Com o auxlio de uma pina, colocar os discos de
optoquina e bacitracina na placa. Tomar o cuidado de no coloc-los muito prximos um
do outro e nem prximos borda da placa. ncubar em estufa microbiolgica a 37C por
18-24 horas. Caso haja a formao de um halo ao redor do disco de optoquina, a bactria
pertence provavelmente a espcie S. pneumoniae; caso o halo se forme ao redor do disco
de bacitracina, provavelmente um estreptococos -hemoltico do grupo A.
Crescimento em meio Bile-esculina e NaCl a 6,5%: Com a agulha de platina, tocar a
colnia suspeita e introduzir em gar Bile-esculina. Para o caldo de NaCl, tocar a colnia
com ala e homogeneizar bem a bactria no meio lquido. ncubar ambos em estufa
microbiolgica a 35-37C por 18-24 horas. Para o meio bile-esculina, o teste
considerado positivo se o meio ficar enegrecido. Para o caldo NaCl, o teste positivo
caso haja turvao e mudana de cor do meio.
RESULTADOS
Analisando-se a lmina, observou-se cocos Gram-positivos. niciou-se a bateria de
testes bioqumicos para duas bactrias diferentes.
Primeiro #este
Teste da catalase: Houve formao de bolhas, caracterizando um teste positivo. Com isso
confirma-se o diagnstico de Estafilococos e passa a ser feita identificao do gnero.
Prova da coagulase: Houve formao de cogulo, sendo um teste positivo, indicando
Staphylococcus aureus.
Teste em gar manitol salgado: Houve crescimento neste meio, indicando teste positivo.
Presena de DNAse: Houve produo de DNAse, indicando teste positivo.
O diagnstico provavelmente de Staphylococcus aureus.
Segundo #este
Teste da catalase: No houve formao de bolhas, caracterizando um teste negativo.
Com isso confirma-se o diagnstico para Estreptococos ou Enterococos.
Teste do NaCl: Houve turvao e mudana de cor do meio, sendo um teste positivo
Teste da bile-esculina: No houve enegrecimento do meio, sendo um teste negativo.
Sensibilidade Optoquina e Bacitracina: No houve formao de halo ao redor dos discos
de antibiticos, caracterizando resistncia.
Teste de CAMP: No houver formao de reas com hemlise, caracterizando um teste
negativo.
O diagnstico provvelmente de Streptococcus agalactiae.
DISCUSSO
S. aureus , sem dvida, o patgeno humano mais importante entre os
estafilococos. encontrado no ambiente externo e em narinas anteriores de 20% a 40%
dos adultos. Outros stios de colonizao incluem pregas cutneas, perneo, axilas e
vagina. Embora esse microrganismo possa fazer parte da microbiota humana normal,
pode produzir infeces oportunistas importantes em condies apropriadas.
De acordo com o observado na lmina, a positividade do teste da catalase foi
suficiente para classificar o gnero como sendo Staphylococcus. Aps o teste da
coagulase identificar o microrganismo como S. aureus, os testes em gar manitol salgado
e DNAse foram apenas confirmatrios, devendo o teste de Novobiocina ser ignorado para
esta espcie.
S. agalactiae a principal causa de doena nos perodos neonatal e perinatal. Em
mulheres, o microrganismo coloniza vagina e reto, e a colonizao vaginal assintomtica
observada em 5% a 35% das mulheres grvidas. Na realidade, a colonizao da vagina
pode representar contaminao retal, sendo o trato gastrintestinal o principal reservatrio
desse microrganismo. O recm-nascido colonizado por transmisso vertical, seja no
tero ou durante o parto, a partir da me portadora. Entre os lactentes colonizados, a
doena pode aparecer em um a quatro deles para cada 1.000 nascidos vivos. Na maioria,
so beta-hemolticos, mas por vezes tambm so alfa-hemolticos, pelo que no podemos
usar hemlise para pesquisar os S. agalactiae. De acordo com o observado na lmina, a
negatividade do teste da catalase no foi suficiente para classificar o gnero do
microrganismo, podendo este ser Streptococcus ou $nterococcus. O diagnstico de S.
agalactiae deu-se primeiramente pela presena de incompatibilidade nos testes de NaCl e
bile-esculina, eliminando a possibilidade de ser do gnero $nterococcus sp. ou outros
$streptococos sp. Prosseguindo-se para o teste da optoquina e bacitracina, mostrando
que esse microrganismo resistente a ambos antibiticos. O que separaria S. agalactiae
de dos alfa hemolticos ( S. viridans e S. pneumoniae) seria a positividade do teste de
Camp, cujo o resultado foi negativo, provavelmente devido interferncia do sangue
utilizado no teste.
BIBLIOGRAFIA
1. TRABULS, Luiz Rachid; ALTERTHUM, Flavio. Microbiologia. 4. ed. So Paulo:
Atheneu, 2005.
2. KONEMAN, Elmer W. Diagnstico Microbiolgico: Texto e Atlas Colorido. 5. ed. So
Paulo: MEDS, 2001
3. Microbiologia Streptococcus. Disponvel em:
<http://users.med.up.pt/cc04-10/Microdesgravadas/5_Streptococcus.pdf>. Acesso em: 13
nov. 2009
4. AGNCA NACONAL DE VGLNCA SANTRA: Deteco e dentificao de
Bactrias de mportncia Mdica. Disponvel em:
<http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/microbiologia/mod_5_2004.pdf>.
Acesso em: 13 nov. 2009
Universidade Federal do Tringulo Mineiro
Departamento de Cincias Biolgicas
Disciplina de Microbiologia Aplicada
Relatrio de Prtica
BACTERIOSCOPIA
Marcus Vinicius Naghetini dos Santos
Rafaella Kizzy ncio dos Reis
Uberaba, novembro/2009
OBJETIVO
Analisar lminas contendo microrganismos corados por Gram.
INTRODUO
A morfologia dos microrganismos s pode ser observada ao microscpio. Mas,
devido ao seu reduzido tamanho e ao seu ndice de refrao muito prximo do ndice de
refrao da gua, no fcil sua observao microscpica. Sendo tambm, em geral, no
pigmentados, a observao microscpica s se torna possvel aumentando o contraste
entre o meio envolvente e o contedo celular.
Para o preparo de um bom esfregao para exame bacterioscpico, deve-se seguir
normas padronizadas para que os esfregaos sejam bem feitos. O Setor de Microbiologia,
depois de corar as lminas, tem de observar uma grande extenso destas para concluso
do diagnstico. Para permitir o estudo das propriedades das bactrias e classific-las em
grupos para efeitos de diagnstico, vrias coloraes biolgicas e procedimentos
especficos foram desenvolvidos. Das coloraes h duas que so de interesse
fundamental em Bacteriologia Mdica, a colorao de Gram e a colorao de Ziehl-
Neelsen.
MATERIAIS E MTODOS
Microscpio ptico
leo de imerso
Lminas preparadas pela colorao de Gram
Nesta prtica deve-se observar as laminas ao microscpio ptico, contendo as
bactrias isoladas, e identific-las de acordo com seu comportamento tintorial e sua
morfologia.
RESULTADOS
Foram observadas dez lminas:
1.Anlise de liquor, foi isolado %eisseria meningitidis. Diplococos Gram negativos.
2.Secreo vaginal (vaginose), observa-se Clue Cells, envolvida por Coco bacilos Gram
positivos, provavelmente Gardnerella sp.
3. Secreo oral, Streptococcus sp.
4.%eisseria sp., diplococos no citoplasma da clula.
5.Secreo vaginal normal. Presena de lactobacilos (de cor roxa) Flora Doderlaine
6.Secreo vaginal (Candida). Presena de clulas do epitlio vaginal com bactrias e em
evidencia da Candida, que possui uma tamanho bem acentuado.
7.Fezes (normal), pode-se observar todos os tipos de microrganismos, tanto bacilos
quanto cocos, gram positivos e negativos.
8.Lquido sinovial, observa-se cocos Gram positivos
9.Lquido pleural, observa-se Streptococcus pneumoniae (Pneumococos)
10.Secreo de leso genital, observa-se bacilos gram negativos possivelmente
&aemophilus ducrey.
DISCUSSO
A realizao da prtica de bacterioscopia teve como fundamento principal
proporcionar conhecimento sobre os aspectos de microrganismo comumente encontrados
em diferentes secrees do organismo humano. As lminas de microbiotas normais foram
utilizadas para evidenciar que nem toda estrutura do organismo estril, e que podem
alojar microrganismos que ao migrar para outras regies, produzem infeces de
intensidades que vo de leve a grave.
No caso da meningite a bacterioscopia agrupa morfolgica e tintorialmente os
agentes, permitindo sua classificao com pequeno grau de especificidade (bacilos Gram-
positivos, bacilos Gram-negativos, diplococos Gram-positivos, diplococos Gram-negatvos,
bacilos lcoolcido resistentes, leveduras, etc. Pode ser realizada no lquor ou no raspa-
do de pele (na presena de leses ou sufuses hemorrgicas) e escarro.
Na flora vaginal de mulheres normais so comumente isoladas: Staphylococcus
epidermidis, Streptococcus 'ecalis, (actobacillus sp, Corynebacterium sp, $. coli,
acteroides 'ragilis, )usobacterium sp, *eillonella sp, Peptococcus sp,
Peptostreptococcus sp. alm de Staphylococcus aureus , Streptococcus sp (Grupo B -
hemoltico), Clostridium per'ringens, Proteus, +lebsiella. E podem encontrar organismos
potencialmente patognicos como Pseudomonas, Streptococcus pneumoniae, (isteria
monocytogenes. Na bacterioscopia o ambiente vaginal pode ser classificado:
PADRO = EQULBRO DO ECOSSSTEMA
90 a 95% de flora de Doderlein;
5 a 10% de outras bactrias e
Ausncia ou raros polimorfonucleares(PMN)
PADRO = DESEQULBRO MODERADO DO ECOSSSTEMA
50% de flora de Doderlein;
50% de outras bactrias e
Moderada quantidade de PMN
PADRO = DESEQULBRO NTENSO DO ECOSSSTEMA
Flora de Doderlein praticamente ausente;
Quase 100% de outras bactrias e
PMN abundantes
PADRO V = COMPATVEL COM VAGNOSE BACTERANA
Flora de Doderlein ausente
Proliferao de bactrias aerbias e anaerbias (G. vaginalis)
PMN raros
PADRO V - presena de #richomonas vaginalis
PADRO V - presena de fungos do gnero Candida
O Lquido Sinovial (LS) um ultrafiltrado do plasma, acrescido de cido hialurnico
sintetizado por sinovicitos do tipo B. Suas principais funes so as de promover a
lubrificao da articulao, o amortecimento de impactos e nutrir a cartilagem articular. As
principais alteraes encontradas no LS seriam decorrentes de traumas, presena de
corpo estranho (cristais/bactrias) e inflamao primria da sinvia. A no-utilizao da
anlise laboratorial do LS, nestes casos, aumentaria o erro diagnstico em 25%
Bacterioscopia: Gram: positivo em cerca de 50% dos casos de Artrite nfecciosa. Nos
casos de etiologia estafiloccica pode chegar a 75%, enquanto que nas Artrites
Gonoccicas positivo em apenas 25% dos casos; BAAR: positividade baixa, em torno
de 20% dos casos; PAS: tambm possui baixa positividade.
Em todo o mundo, o Streptococcus pneumoniae o mais freqente agente
etiolgico de infeces adquiridas na comunidade que acometem o sistema respiratrio e
est associado com 3 a 5 milhes de mortes por ano. Nos EUA, responsvel por
500.000 casos anuais de pneumonia, 50.000 casos de bacteremia, 3.000 casos de
meningite e cerca de 7 milhes de casos de otite mdia aguda.
&aemophilus ducreyi bacilo Gram-negativo, intracelular, anaerbico facultativo,
com dimenses de um a 2m por 0,5m, com extremidades arredondadas e desprovido
de cpsula ou motilidade. Dispe-se em cadeias simples ou duplas no interior de
polimorfonucleares. Seu cultivo difcil, crescendo moderadamente em meios de gar-
chocolate. responsvel pela doena sexualmente transmissvel cancro mole,
caracterizada clinicamente pela presena de ulceraes dolorosas, em nmero variado,
de bordas irregulares e frequentemente envoltas por halo eritematoso vivo, localizadas
em regio genital, anal ou anogenital, acompanhadas ou no de adenopatia satlite.
BIBLIOGRAFIA
1. TRABULS, Luiz Rachid; ALTERTHUM, Flavio. Microbiologia. 4. ed. So Paulo:
Atheneu, 2005.
2. KONEMAN, Elmer W. Diagnstico Microbiolgico: Texto e Atlas Colorido. 5. ed. So
Paulo: MEDS, 2001
3. PORTAL DE GNECOLOGA - Vulvovaginites. Disponvel em:
<http://www.portaldeginecologia.com.br/modules.php?name=News&file=print&sid=137>.
Acessado em: 15 nov. 2009
4. SNVANLSE: Guia prtico. Disponvel em:
<http://www.cidmed.com.br/pdf/guia_pratico_sinovianalise.pdf>. Acessado em: 15 nov.
2009
5. MENNGTES Manual de nstrues Critrios de Confirmao e Classificao.
Disponvel em: <ftp://ftp.cve.saude.sp.gov.br/doc_tec/resp/manu_classmen.pdf>.
Acessado em: 15 nov. 2009
6. ZETTLER, Eduardo Walker. A reao em cadeia da polimerase na deteco da
resistncia penicilina em Streptococcus pneumoniae. J. bras. pneumol. vol.30 no.6 So
Paulo Nov./Dec. 2004
#. JUNOR, W. B.; SHRATSU, R.; PNTO, V. Abordagem nas doenas sexualmente
transmissveis. An. Bras. Dermatol. vol.84 no.2 Rio de Janeiro Mar./Apr. 2009
Universidade Federal do Tringulo Mineiro
Departamento de Cincias Biolgicas
Disciplina de Microbiologia Aplicada
Relatrio de Prtica
ANTIBIOGRAMA
Marcus Vinicius Naghetini dos Santos
Rafaella Kizzy ncio dos Reis
Uberaba, novembro/2009
OBJETIVO
Determinar o perfil de sensibilidade a antimicrobianos de amostras de cocos Gram-
positivos (Staphylococcus e $nterococcus), pelo teste de disco difuso;
Determinar o valor da concentrao inibitria mnima (CM) para a vancomicina, pelo teste
de diluio em caldo;
INTRODUO
O antibiograma um teste que oferece como resultado padres de resistncia ou
susceptibilidade de uma bactria especfica a vrios antimicrobianos (antibiticos ou
quimioterpicos). Seu objetivo tanto a anlise do espectro de sensibilidade/resistncia a
drogas de uma bactria quanto a determinao da concentrao mnima inibitria, esta
definida como a concentrao mais baixa de um agente antimicrobiano que impede
crescimento visvel de um microorganismo no teste de sensibilidade por diluio em gar
ou caldo.
A tcnica de disco-difuso (Kirby-Bauer) e de diluio em caldo so exemplos de
testes de sensibilidade e resistncia a antimicrobianos.
Para esses testes deve ter padronizao do meio de cultura, inculo (escala 0,5 Mc
Farland 108 bactrias/mL) e antimicrobianos. Estes ltimos so de acordo com a
bactria isolada e fornecido pelo Manual do Clinical and Laboratory Sandards nstitute
(CLS)/NCCLS. Nele pode-se identificar os grupos de drogas sugeridas para os
antibiogramas.
Os antimicrobianos so divididos em classes: beta-lactmicos, aminoglicosdeos,
glicopepitdeos e macroldeos. Para obter um teste de qualidade, deve-se observar a
espessura do gar na placa, o caldo na microdiluio e macrodiluio, pH, estocagem
apropriada das placas, discos, drogas e solues estoques dos antimicrobianos e
temperatura de incubao.
A tcnica de disco-difuso a mais utilizada, padronizada pelo CLS, realizada no
gar Meller-Hinton ou sangue. Esta tcnica ainda possibilita a flexibilidade na escolha
dos discos, de baixo custo, fcil execuo e interpretao e tem ainda boa
reprodutibilidade. um teste qualitativo, dando como resultado se o microorganismo
sensvel, intermedirio ou resistente. necessrio ainda para realizar a tcnica: o inculo,
os discos impregnados com antimicrobiano e a difuso da droga. A ausncia do halo de
inibio indica que o microorganismo resiste a tal antimicrobiano. A presena do halo de
inibio indica que o microorganismo pode ser sensvel, intermedirio ou resistente,
dependendo do tamanho deste halo.
A tcnica de diluio em caldo a considerada "padro ouro, no Brasil pouco
utilizado, de baixo custo, difcil execuo e tambm padronizada pelo CLS. Para
realiz-la deve-se determinar a CM (Concentrao inibitria mnima), dada em g/mL.
Este mtodo quantitativo (breakpoints), dando como resultado que o microorganismo
pode ser sensvel, intermedirio ou resistente ao antimicrobiano.
MATERIAIS E MTODOS
Foram utilizados os seguintes materiais:
Cultura axnica dos microrganismos em meio slido
Tubos de ensaio contendo soro fisiolgico estril
Tubo n0,5 da escala de Mc Farland
Swab
Bico de bunsen
Placas de Petri com gar Mueller Hinton
Ala de platina
Pinas estreis
Discos de antibiticos
Tubos de ensaio contendo caldo Mueller Hinton estril
Soluo estoque aquosa de vancomicina
Pipetas automticas
Ponteiras estreis
Estufa microbiolgica
Tabelas de sensibilidade/resistncia a antimicrobianos (CLS)
#este de ,isco ,i'uso
Faz-se uma suspenso bacteriana, a partir da cultura de bactrias, com turvao
semelhante ao tubo n0,5 da escola Mc Farland (aproximadamente 10
8
bactrias/mL).
Posteriormente, utilizando um swab, inocular a suspenso na superfcie da placa de gar
Mueller Hinton, passando o swab em toda a superfcie do gar e, posteriormente, repete-
se o procedimento outras duas vezes, girando a placa aproximadamente 60. Aps a
placa secar, coloca-se os antimicrobianos sob a superfcie da placa com a pina flambada
e fria, pressionando-os levemente contra a superfcie do meio, sendo a distncia entre
eles de 24mm, conforme figura abaixo:
http://www.juntadeandalucia.es/averroes/~29701428/salud/practi/antibio1.jpg
A placa incubada a 35-37C por 16-18 horas em estufa microbiolgica. Aps esse
tempo, mede-se o halo formado e feita a classificao dos microrganismos.
#este de ,iluio em Caldo
Faz-se uma diluio seriada da soluo estoque de vancomicina, transferindo
975L da mesma para o tubo de ensaio n1 (concentrao final de 256g/mL do
antimicrobiano) contendo 975L de caldo Mueller Hinton. Homogeniza-se e transfere
975l do tubo n1 para o tubo seguinte (n2) e assim por diante. Desprezar 975L do
ltimo tubo (concentrao final de 0,5g/mL). Posteriormente, adiciona-se 25L de
suspenso bacteriana semelhante ao tubo n0,5 da escala de Mc Farland
( aproximadamente 10
8
bactrias/mL) em cada um dos tubos contendo diferentes
concentraes da droga. Faz-se tambm, um controle positivo (25L de suspenso
bacteriana em 975L de caldo Mueller Hinton, para ser o controle de crescimento da
bactria) e um negativo (1000L de caldo Mueller Hinton em um tubo de ensaio estril,
para ser o controle de esterilidade do caldo). A incubao feita por 24 horas a 35-37C
em estufa microbiolgica. Aps esse tempo, observa-se o crescimento bacteriano nos
tubos. A concentrao inibitria mnima (CM) a menor concentrao de agente
antimicrobiano que inibe completamente o crescimento dos microrganismos nos tubos.
Posteriormente, classifica-se o microrganismo em sensvel, intermedirio ou resistente.
RESULTADOS
O antibiograma foi utilizado para uma espcie de $nterococcus.
O teste de disco difuso foi feito utilizando os seguintes antimicrobianos:
Oxaciclina, Penicilina, Azitromicina, Clindamicina, Vancomicina, Claritromicina,
Eritromicina e Sulfazotrim (Sulfametoxazol e Trimetoprim). Foram encontrados os
seguintes resultados:
Para o teste de diluio em caldo, a concentrao inibitria mnima de vancomicina
encontrada foi de 4g/mL.
importante destacar que em um dos grupos a concentrao inibitria mnima
encontrada foi de 32 g/mL. Significando resistncia a vancomicina.
DISCUSSO
Enterococcus so cocos Gram-positivos que geralmente se dispem em pares e
cadeias curtas. Freqentemente, a morfologia microscpica destes microrganismos no
pode ser diferenciada de algumas espcies de Streptococcus. $nterococcus so
anaerbios facultativos e a temperatura tima de crescimento 35C, embora a maioria
dos microrganismos se desenvolva entre 10 e 45C. Apresentam crescimento rpido em
meios de cultura suplementados com sangue, produzindo colnias brancas aps 24 horas
de incubao. As colnias so, em geral, no hemolticas, mas podem ser alfa ou
betahemolticas. $nterococcus podem ser cultivados na presena de altas concentraes
de sal (NaCl a 6,5%), toleram sais biliares a 40% e podem hidrolisar a esculina. Estas
propriedades bsicas podem ser utilizadas para distinguir enterococos de outros cocos
Gram-positivos, catalase negativos. So necessrios testes fenotpicos selecionados,
como por exemplo: reaes de fermentao, hidrlise da pirrolidonil-beta-naftilamida,
motilidade, produo de pigmento para diferenciar as espcies de enterococos
Bactria
Antimicrobiano, Tamanho do halo Resultado
Concentrao e Sigla (mm)
23 S
Penicilina PEN 10mcg 15 R
Azitromicina AZ 15mcg 22 S
Clindamicina CL 2mcg 30 S
Vancomicina VC 30mcg 19 S
Claritromicina CLA 15mcg 27 S
Eritromicina ER 15mcg 27 S
28 S
Oxaciclina OXA 1mcg
Sulfazotrim SFT 25mcg
$nterococcus sp. so comensais do trato intestinal humano e de outros animais,
mas tambm so causadores de infeces nosocomiais e de endocardite subaguda.
Durante as duas ltimas dcadas, a resistncia a drogas entre os cocos Gram-positivos
tem aumentado. A emergncia de enterococos multirresistente um desafio terapia, que
tem sido paralelo ocorrncia de enterococcus resistentes a vancomicina (VRE) pela
primeira vez relatado em 1988. Desde ento, resistncia teicoplanina e/ou vancomicina
comeou a aparecer em todo o mundo. VRE freqentemente expressa resistncia
adicional a mltiplos antibiticos, incluindo ampicilina e aminoglicosdeos, incluindo
resistncia a altos nveis de gentamicina e estreptomicina. Devido ao aumento da
resistncia a antimicrobianos, tem-se direcionado ateno ao desenvolvimento de novos
agentes antimicrobianos, como quinupristina-dalfopristina e linezolida. No entanto, pouco
aps a aprovao destes dois medicamentos, bactrias resistentes comearam a ser
encontradas. Em geral, tem sido relatado que quinupristina-dalfopristina possui atividade
inibitria contra $. 'aecium, incluindo os VRE que so resistentes a outros agentes
clinicamente disponveis.
BIBLIOGRAFIA
1. TRABULS, Luiz Rachid; ALTERTHUM, Flavio. Microbiologia. 4. ed. So Paulo:
Atheneu, 2005.
2. KONEMAN, Elmer W. Diagnstico Microbiolgico: Texto e Atlas Colorido. 5. ed. So
Paulo: MEDS, 2001
3. Camargo, lana L. B. Cunha. Estudo dos fatores de virulncia em Enterococcus sp.
isolados no Brasil. Tese apresentado ao Programa de Ps-Graduao em Biocincias
Aplicadas Farmcia, rea de concentrao: Biocincias Aplicadas Farmcia,Curso de
Doutorado. Ribeiro Preto, 2005.
Universidade Federal do Tringulo Mineiro
Departamento de Cincias Biolgicas
Disciplina de Microbiologia Aplicada
Relatrio de Prtica
ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE BACILOS
GRAM"NEGATIVOS $BGN%
Marcus Vinicius Naghetini dos Santos
Rafaella Kizzy ncio dos Reis
Uberaba, novembro/2009
OBJETIVO
solar e identificar e espcies os Bacilos Gram-negativos mais comuns isolados em
seres-humanos, a partir de processos bioqumicos empregados em testes de identificao
de bacilos Gram-negativos.
INTRODUO
Os bacilos Gram-negativos pertencentes s $nterobacteriaceae so as bactrias
isoladas com mais freqncia de amostras biolgicas. Distribudos amplamente na
natureza, esses microrganismos so encontrados no solo, gua, plantas e no trato
intestinal de seres humanos e animais. Portanto, os membros dessa famlia podem ser
suspeitos em virtualmente qualquer tipo de doena infecciosa e isolados de qualquer
amostra recebida no laboratrio.
As Enterobactrias so bacilos anaerbios facultativos e no produtores de
esporos, so fermentadores de glicose e produtores de endotoxinas e exotoxinas, alm
de serem citocromo oxidase negativa. Devido ao grande nmero de espcies, uma bateria
de provas bioqumicas deve ser feita, afim de caracterizar definitivamente um membro.
MATERIAIS E MTODOS
Bico de Bunsen
Ala de platina
Agulha de Platina
Pina
Placas contendo meio gar MacConkey
Tubos contendo meio de identificao bioqumica O/F
TS ( Trplice acar e ferro)
SM (sulfeto-indol-motilidade)
Uria de Christensen
Citrato de Simmons
Fenilalanina
Caldo Descarboxilase de Moeller (lisina, ornitina, arginina)
Voges-Proskauer (VP)
Vermelho de Metila (VM)
leo Mineral estril
Estufa microbiolgica
Tabelas de dentificao

Provas io!u"micas-
Fermentao da lactose - Bacilos islados da urina so cultivados em meio MacConkey, e
observar se estas colonias conseguem utilizar a lactose presente no meio e produzir
colnias rseas (fermentadoras de lactose) ou colnias transparentes (no fermentadoras
de lactose).
Prova da Oxidao-Fermentao (OF) da glicose O meio OF usado para determinar
se um organismo pode sintetizar carboidratos de forma oxidativa ou fermentativa.
Microrganismos sacarolticos degradam a glicose atravs de fermentao ou oxidao. O
produto final da fermentao uma mistura de cidos orgnicos. Entretanto, a quantidade
de cidos formados pela degradao oxidativa da glicose pequena, quando comparada
com a fermentao. Portanto, para a deteco, necessrio que a reao se d no meio
de Hugh e Leifson (Meio OF). O meio OF difere dos meios de fermentao de
carboidratos, por apresentar uma concentrao de peptona de 0,2%, concentrao de
carboidratos de 1% e concentrao de gar de 0,3% (semi-slido). A baixa relao entre
protenas e carboidratos reduz a formao de aminas alcalinas, que podem neutralizar a
pequena quantidade de cidos fracos formados pelo metabolismo oxidativo. A maior
quantidade de carboidratos aumenta a quantidade de cidos que pode ser potencialmente
produzidos. O meio OF pode ser usado como um teste simples de utilizao de glicose
pela via oxidativa, assim como para outros carboidratos: lactose, maltose, sucrose, xilose
e frutose. As reaes positivas so indicadas por uma colorao amarela, evidenciada
pelo indicador azul de bromotimol, que se torna amarelo em meio cido. Uma colorao
verde ou azul esverdeado indica uma reao negativa. O teste para glicose feito em
duplicata, e em um dos tubos o meio recoberto com leo mineral. A bactria ser
considerada: oxidativa, se produzir cido apenas no tubo sem leo (exposto ao ar);
fermentadora, se produzir cido em ambos os tubos; e assacaroltica, se ambos os tubos
permanecerem com pH alcalino aps a incubao. Procedimento: com agulha de platina,
flambada e fria, tocar em uma colonia da bactria Gram-negativa. ntroduzir a agulha at
dos dois tubos de ensaio contendo meio OF-glicose semi slido. Um dos tubos
mantido aberto enquanto no outro deve ser adicionado uma camada de leo mineral
estril. O teste considerado positivo quando o meio muda a cor de verde para amarelo.
Os organismos oxidativos iro produzir reao cida somente no tubo aberto, mantendo o
tubo fechado inalterado. J aqueles que so fermentativos, iro produzir reao em
ambos os tubos.
Prova de glicose/lactose (gar TS) O gar Trplice Acar um meio empregado na
triagem de enterobactrias. O meio enriquecido pela incorporao de quatro compostos
proticos, possibilitando um bom crescimento bacteriano. um meio slido e inclinado
(base e pice) em tubo, que originalmente de cor vermelha. Ele contm glicose (0,1%),
lactose (10%) e sacarose (10%), citrato frrico entre outras substncias. utilizado para
determinar a habilidade de um microrganismo em utilizar carboidratos especficos
existentes no meio bsico com ou sem produo de gs ou H
2
S.
Fermentao da glicose: a concentrao de glicose no meio de apenas 0,1%,
obtendo-se assim uma quantidade relativamente pequena de cido. nicialmente, todo o
meio torna amarelo devido degradao da glicose. Aps algumas horas, os
microrganismos comeam a decompor oxidativamente a peptona, produzindo uma
alcalinizao na superfcie do meio. No fundo do tubo, a degradao protica
insuficiente para reverter o pH cido estabelecido, e o meio mantm-se amarelo. Todas as
enterobactrias fermentam a glicose.
Fermentao da lactose e da sacarose: o meio possui uma concentrao maior
desses acares (10%), permitindo que as bactrias que utilizam a lactose, com ou sem
sacarose, produzam quantidades relativamente altas de cido, suficiente para superar a
reao alcalina desenvolvida na superfcie do meio. O tubo permanece totalmente com
colorao amarela. O indicador de pH do meio o vermelho de fenol.
Produo de gs: ocorre formao de gs devido degradao de molculas de
cido frmico, sendo evidenciado pelo aparecimento de bolhas ou rachaduras no meio.

Produo de H2S: evidenciada pelo aparecimento de um precipitado de
colorao negra (sulfeto de ferro), proveniente da reao do H2S com o citrato frrico
amoniacal contido no meio.
Procedimento: BGN inoculado nesses meios com uma agulha de platina que deve ser
introduzida at quase o final do tubo. Aps semeadura, estriar a superfcie inclinada do
gar.
Prova H
2
S - Em meio SM o BGN inoculado com uma agulha de platina at o fim do
tubo sem encostar na parede do tubo. Observa-se a produo de H
2
S quando altera a
colorao do tubo de inalterado para preto.
Prova ndol Em meio sim semeia-se a colnia de BGN, e aps o crescimento adiciona-
se o reagente de Kovacs (cor amarela) ao longo das paredes do tubo de modo q no se
misture com o meio de cultura. Este reagente reage com o indol produzindo um composto
rosado. As culturas que produzem um anel avermelhado na superfcie do meio aps
adio de do reagente, so indol positivas.
Prova da Motilidade No Meio gar SM inocula-se em linha reta o BGN, com uma agulha
de platina ate do tubo. A prova indica motilidade quando os microrganismos crescem
deslocando-se na linha de inoculao, turvando o meio. Enquanto que motilidade
negativa o crescimento s ser na zona da picada.
Prova do Citrato O gar Citrato de Simmons um meio slido e inclinado, em tubo, de
cor originalmente verde. Citrato de sdio um composto orgnico simples encontrado
como um dos metablitos do ciclo dos cidos tricarboxlicos (ciclo de Krebs). Algumas
bactrias podem obter energia utilizando o citrato como nica fonte de carbono. Esta
caracterstica importante para a identificao de alguns membros de
Enterobacteriaceae: E. coli citrato negativo, enquanto as espcies de Enterobacter e
Klebsiella so positivas. O meio a ser empregado para o teste inclui citrato de sdio e
fosfato de amnia como nica fonte de carbono e nitrognio e deve ser isento de
protenas e carboidratos. As bactrias que produze a enzima citrase conseguem utilizar o
citrato como nica fonte de carbono e utilizam o nitrognio do sal de amnio produzindo
amnia, alcalinizando o meio. O indicador utilizado azul de bromotimol, que em pH
cido amarelo e em pH alcalino azul. Caso a bactria consiga utilizar o citrato o meio
que era verde tornar azul devido a alcalinizao. Caso isso no acontea, o meio
permanecer verde (citrato negativo). Procedimento: No meio inclinado de gar Citrato de
Simmons, inocula-se o BGN com agulha de platina em linha reta. Aps a incubao, as
culturas citrato positivas so identificadas pela presena de crescimento, na superfcie da
rampa, acompanhada de colorao azul no meio da cultura.
Prova do citrato
Prova da Uria O gar Uria de Chirstensen um meio slido e inclinado em tubo, de
cor amarela. A urease uma enzima que hidrolisa a uria em amnia e dixido de

carbono. A reao utilizada na identificao de bactrias produtoras de urease. A
amnia um produto que alcaliniza o meio levando a um aumento do pH e, em
conseqncia, uma mudana de colorao do indicador de pH. Em laboratrios clnicos,
so utilizados rotineiramente dois meios para identificao da urease: caldo Stuart e gar
de Christensen. Quando acontece a viragem do pH devido a presena da enzima o meio
passa a ter colorao rosa por meio do indicador de pH vermelho de fenol. Procedimento:
semeado com ala bacteriolgica, onde uma poro do crescimento bacteriano
transportada paro o meio e semeada em estrias no pice.
Prova da urease
Prova da Fenilalanina Este meio slido e inclinado em tubo. Tem cor originalmente
bege. A desaminao de fenilalanina forma cido fenilpirvico. Dentre os membros da
famlia Enterobacteriaceae, apenas as espcies de Proteus, Morganella e Providencia
possuem a enzima necessria para a desaminao de fenilalanina. O teste consiste na
deteco de cido fenilpirvico, aps crescimento do microrganismo em meio contendo
aminocido. O aparecimento de uma colorao verde escura aps a adio de uma
soluo de cloreto frrico a 10% (trs a cinco gotas) indica resultado positivo.
Procedimento: nocular a bactria em gar fenilalanina e, aps incubao a 35C por 18-
24horas, adicionar 4 a 5 gotas de reagente de cloreto frrico. O desenvolvimento de uma
intensa cor verde, indica uma prova positiva.
Prova da fenilalanina
Caldo base de Moeller (Prova da utilizao dos aminocidos) - A prova consiste em trs
tubos contendo como base o caldo descarboxilase de Moeller e fechado com leo
mineral. Em cada um dos tubos adicionado um aminocido diferente (lisina, arginina e
ornitina), para deteco de enzimas especficas para estes substratos. A enzimas
descarboxilases hidrolisam o grupo carboxil (COOH) de aminocidos, formando aminas
alcalinas e dixido de carbono. A reao especfica, cada aminocido descarboxilado
por uma enzima particular. Lisina e ornitina so os aminocidos testados rotineiramente


na identificao de Enterobacteriaceae. A lisina descarboxilada em cadaverina e a
ornitina em putrescina. A reao se d em anaerobiose. O meio contm o indicador de pH
prpura de bromocresol, que em pH cido amarelo e em pH alcalino prpura. Quando
a bactria adicionada, ela quebra a dextrose presente e acidifica o meio, mudando a cor
de roxo para amarelo-esverdeado. Este meio cido estimula a atividade das
descarboxilase (caso a bactria o tenha) que quebram os aminocidos, produzindo
substncias diferentes. Tudo isso eleva o pH do meio, mudando a cor novamente para
roxo. Logo, o teste considerado positivo se, aps o perodo de incubao, apresentar
cor roxa (prpura). Se a bactria no produz as descarboxilase, o meio fica amarelo. Por
isso a necessidade de um tubo branco para poder fazer a comparao das cores sendo
este da cor original do meio. Procedimento: nocular a bactria no caldo base de Moeller
em quatro tubos (um para controle, um para arginina, um para ornitina e outro para lisina)
e adicionar 1mL de leo mineral. Aps a incubao, se for positiva, o tubo controle
encontra-se amarelo e os tubos contendo aminocidos encontram-se prpuras.
Prova do Vermelho de Metila (VM) um meio lquido e amarelado em tubo. um teste
quantitativo para identificar espcies bacterianas que produzem cidos orgnicos (lctico,
actico e frmico) a partir da fermentao da glicose, visto que as bactrias que seguem a
via de fermentao de cidos mistos produzem cidos suficientes para manter o pH
abaixo de 4,4 (cor vermelha). Muitas espcies de Enterobacteriaceae utilizam essa via de
fermentao da glicose. A formao desses cidos pode ser detectada pelo indicador
vermelho de metila, que tem seu ponto de viragem no pH 4,4. Escherichia coli apresenta
teste VM positivo, enquanto Enterobacter aerogenes, VM negativo. Procedimento:
Semear o caldo com um cultivo puro do microrganismo e incubar a 35C por 48-72 horas.
Aps incubao, adicionar 5 gotas de reagente de vermelho de metila. O desenvolvimento
de uma cor vermelha estvel na superfcie do meio, indica uma prova positiva.
Prova de Voges-Prouskauer (VP) um meio lquido em tubo, de cor amarelada (meio
de Clark-Lubs). Uma outra via de fermentao de glicose que as bactrias podem utilizar
a via de acetona (acetil metil carbinol). O cido pirvico formado pela degradao
fermentativa da glicose (via Embdem-Myerhoff) e metabolizado pela via de butileno
glicol, em acetona , um produto final neutro. O acetil convertido em diacetil, pela ao
de hidrxido de potssio a 40% e oxignio atmosfrico. O diacetil convertido em um
complexo vermelho pela ao cataltica de d-naftol e creatina. Espcies dos gneros
+lebsiella, $nterobacter, &a'nia e Serratia produzem acetona e apenas pequenas
quantidades de cidos mistos, que podem ser insuficientes para diminuir o pH do meio de
vermelho de metila. Procedimento: semear o caldo com u cultivo puro do microrganismo e
incubar a 35C por 24 horas. Em seguida, adicionar 0,6mL de d-naftol a 5% e 0,2mL de
KOH a 40%. Uma prova positiva indicada pelo desenvolvimento de cor vermelha aps
15 minutos ou mais da adio dos reagentes.
RESULTADOS
O bacilo Gram-negativo isolado apresentou as seguintes caractersticas em relao
s provas bioqumicas:
Prova da Oxidao-Fermentao (OF) da glicose Produo de reao cida em ambos
os tubos, mostrando-se tratar de um fermentador.
Prova de glicose/lactose (gar TS) Apresentou a base cida e o pice alcalino.
Prova H
2
S - No houve produo de H
2
S
Prova da Motilidade O microrganismo apresentou crescimento apenas na zona da
picada, sendo negativa sua motilidade.
Prova do ndol Ao adicionar-se o reagente de Kovac's, houve formao de anel incolor,
sendo classificado como uma reao negativa.
Prova do Citrato Houve crescimento na superfcie do meio e aparecimento de colorao
azul, tpicos de reao positiva.
Prova da Uria Formou-se uma colorao rosa, indicando reao positiva.
Prova da Fenilalanina Aps a adio do cloreto frrico no tubo, no houve alterao na
colorao, sendo indicativo de reao negativa.
Prova da Arginina No tubo controle (sem aminocido), a bactria mostrou-se vivel,
abaixando o pH do meio e mudando sua colorao para amarelo turvo. Como o tubo
contendo arginina mostrou-se prpura, essa reao positiva.
Prova da Lisina O tubo apresenta colorao prpura, sendo uma reao positiva.
Prova da Ornitina O tubo apresenta colorao levemente prpura, sendo uma reao
positiva.
Prova do Vermelho de Metila (VM) No houve alterao da cor do meio, sendo uma
reao negativa
Prova de Voges-Prouskauer (VP) No houve alterao da cor do meio, sendo uma
reao negativa.
Esses resultados so caractersticos de +lebsiella pneumoniae.
DISCUSSO
+. pneumoniae isolada com mais freqncia de amostras clnicas e pode causar
uma forma clssica de pneumonia primria. No comum encontrar essa bactria na
orofaringe de pessoas normais, mas pode haver uma prevalncia de 20% em pacientes
hospitalizados. Essa colonizao pode ser a fonte das infeces pulmonares que
geralmente ocorrem em pacientes em condies debilitantes, como alcoolismo, diabetes
melito e doena pulmonar obstrutiva crnica. A pneumonia tende a ser destrutiva, com
necrose extensa e hemorragia, resultando na produo de escarro. Esta bactria tambm
pode causar uma variedade de infeces extrapulmonares, incluindo enterite e meningite,
infeces urinrias e septicemia.
Apesar da maior parte dos testes serem compatveis com +. pneumoniae, h
algumas consideraes a serem feitas:
A positividade da prova da ornitina no caracterstica. sso pode ter ocorrido por tempo
insuficiente para a viragem do pH;
Os testes VM e VP foram negativos no apenas para a bactria em questo, mas sim
para todas as outras bactrias dos outros grupos. sso pode ser resultado de alguma
alterao do teste ou de seus reagentes.
BIBLIOGRAFIA
1. TRABULS, Luiz Rachid; ALTERTHUM, Flavio. Microbiologia. 4. ed. So Paulo:
Atheneu, 2005.
2. KONEMAN, Elmer W. Diagnstico Microbiolgico: Texto e Atlas Colorido. 5. ed. So
Paulo: MEDS, 2001
3. AGNCA NACONAL DE VGLNCA SANTRA: Deteco e dentificao de
Bactrias de mportncia Mdica. Disponvel em:
<http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/microbiologia/mod_5_2004.pdf>
Acesso em: 13 nov. 2009
Universidade Federal do Tringulo Mineiro
Departamento de Cincias Biolgicas
Disciplina de Microbiologia Aplicada
Relatrio de Prtica
DIAGNSTICO MICROBIOLGICO DAS MICOSES
E IDENTIFICAO DE FUNGOS
Marcus Vinicius Naghetini dos Santos
Rafaella Kizzy ncio dos Reis
Uberaba, novembro/2009
OBJETIVO
Diferenciar as colnias de fungos filamentosos e leveduriformes de acordo com as
caractersticas macroscpicas;
Executar tcnicas de macro e microcultivo para fungos filamentosos, identificar
diferentes tipos de fungos filamentosos com base nas caractersticas de cultivo
(macrocultivo) e na morfologia das estruturas fngicas.
dentificar as leveduras em espcie com base nos seus aspectos macroscpicos e
microscpicos e por meio de provas bioqumicas (zimograma e auxinograma).
INTRODUO
A identificao dos fungos , em grande parte, baseado em sua morfologia. Como
eles habitam os mais variados substratos, apresenta em decorrncia uma variao de
tipos morfolgicos,dos mais simples aos mais complexos. Considera-se no seu estudo,
aspectos da morfologia macroscpica (colnias filamentosas, cremosas, cotonosas,
pulverulentas, formao de pigmentao,etc) como tambm da morfologia microscpica.
A unidade estrutural dos fungos representada pela hifa, e o conjunto destes
elementos denominado miclio. O miclio vegetativo exerce as funes de assimilao
de alimentos e fixao em substratos, podendo se diferenciar em estrutura de frutificao
que serve reproduo.
Miclio *egetativo
Constitudo por um aglomerado de hifas, pode ser dividido de acordo com sua morfologia
em trs tipos:
1. Unicelular: caracteriza as leveduras que so constitudas por clulas arredondadas,
ovides ou ligeiramente alongadas e que podem se reproduzir por brotamento,
cissiparidade
ou por outros processos.
2. Filamentoso: caracteriza os bolores, podendo apresentar-se septado ou cenoctico. As
hifas podem se diferenciar em estruturas e funes variveis recebendo, ento,
denominaes
diversas: rizides, apressrios, anastomoses, hifas artrosporadas, etc.
3. Pseudomiclio: caracteriza um gnero de levedura (Candida). formada de
brotamentos sucessivos de clulas em determinadas condies de cultivo.
Miclio de )ruti'icao ou $ndoc.rpio
Cumpre as funes de preservao e disseminao da espcie mediante a formao de
clulas especiais denominadas esporos, que so elementos de resistncia. Estes podem
ser hialinos, pigmentados, simples, septados apresentando vrias formas caractersticas
que definem, s vezes, gneros ou espcies de fungos.
Os esporos, de acordo com sua origem, podem ser assexuados ou sexuados e
tanto um como outro podem estar ou no no interior de determinadas estruturas.
$sporos de origem asse/uada
1. Ectsporos: esporos que se formam na extremidade de hifas especiais denominadas
conidiforos. Esses esporos so denominados condios. Ex.: Aspergillus, Penicillium.
2. Endsporos: esporos produzidos no interior de estruturas denominadas esporngios.
Os esporos, nesses casos, so denominados esporangisporos. Ex.: Rhizopus
$sporos de origem se/uada
1. Ectsporos: esporos formados na extremidade de basdios denominados
basidisporos. Ex.: Basidiomicetos
2. Endsporos: esporos no interior de clulas denominadas ascos. Os esporos, nesse
caso,so denominados ascsporos. Ex.: Piedraia hortai.
MATERIAIS E MTODOS
0denti'icao de )ungos )ilamentosos-
Bico de bunsen
Alas de platina em gancho
Placas de Agar Sabouraud
Placas de Agar Batata dividido em cubos
Placas de Petri estreis para microcultivo contendo lmina, lamnula e algodo (segundo
tcnica de Ridela)
Agua destilada estril
Pina
Frascos com lactofenol-azul de algodo
Lminas de microscopia
Culturas em tubo de ensaio de diferentes fungos filamentoso
1Macrocultivo
Semear um pequeno fragmento da cultura do fungo filamentoso no centro da placa de
Agar Sabouraud, utilizando a ala de platina em gancho. dentificar a placa e incubar por
uma semana temperatura ambiente.
1Microcultivo
Colocar sobre a lmina, dentro da placa de Petri, um cubo de Agar batata, com auxlio de
pina ou da prpria ala, semear fragmentos do fungo filamentoso nos 4 cantos do Agar
batata, cobrir a preparao com lamnula estril, comprimindo-a suavemente sobre o cubo
de Agar batata; umedecer o algodo hidrfilo com gua destilada estril, criando assim
uma cmara mida; identificar as placas e incubar temperatura ambiente.
-Leitura: retirar a lamnula, cuidadosamente, e coloc-la sobre uma lmina contendo 1
gota de lactofenol-azul de algodo e examinar ao microscpio com objetiva de 10 e 40x.
0denti'icao de )ungos (eveduri'ormes-
Bico de bunsen
Alas de platina
Pinas
Lmina
Lamnulas
Vidraria para microcultivo (lmina, lamnula e algodo)
Agar Sabouraud
Agar fub-tweed80
gar base de carboidratos
Agar base para carboidratos
Agar base para nitrognio
Peptona
Nitrato de potssio
Acares liofilizados (dextrose, sacarose, trealose, lactose, galactose, maltose, rafinose,
melibiose, inositol, ramnose, xilose).
Salina estril
Tubo n 5 da escala de McFarland
Pipetas
Ponteiras
Estufa microbiolgica
Culturas de fungos leveduriformes
1Prova do tubo germinativo-
Com uma ala de platina calibrada (0,001ml), retirar uma pequena poro de uma
colnia de levedura e emulsion-la de forma assptica em 0,5 ml de soro. Evitar, se
possvel, o uso de soro humano, que pode ter anticorpos ou ainda antifngicos.
ncubar a 37C por um perodo de 2 a 3 horas em estufa bacteriolgica. Findo este
perodo, deve-se remover uma gota da suspenso e montar uma preparao do tipo
lmina-lamnula, para observao microscpica. O tubo germinativo, quando o teste for
positivo,
aparecer como filamento fino e cilndrico, originado do blastocondio da levedura, no qual
no se observa nenhuma zona de constrio, quer na base ou ao longo de sua extenso.
12imograma 3)ermentao de carboidratos4-
Preparar a suspenso de leveduras: em um tubo de ensaio,adicionar 10 ml de salina
estril; tocar as colnias da levedura e adicionar ao tubo. Observar a turvao deve ser
semelhante ao tubo n5 da escala de McFarland.
Colocar 400 ul da suspenso de leveduras em tubos de ensaio contendo o meio de
fermentao; foram utilizados 5 tubos contendo 8 mil de meio-base, um tipo de acar
(dextrose, sacarose, lactose, galactose e maltose) e tubo de Durhan invertido. Fechar os
tubos com tampa de rosca e incubar em estufa a 35C. Fazer a primeira leitura com 24hrs
de incubao. A leitura considerada positiva se houver a formao de bolhas de gs
dentro do tubo de Durhan.
15u/anograma 35ssimilao de carboidratos4-
No centro de uma placa de Petri grande, coloca-se 2,5 ml da suspenso da levedura
preparada anteriormente, para zimograma. Em seguida, coloca-se 50 ml de meio-base de
assimilao de carboidratos previamente fundido (temperatura de aproximadamente
50C). Homogeniza-se com movimentos circulares suaves e esperar solidificar. Aps
solidificao, adicionar pequenas quantidades de cada um dos 12 carboidratos a serem
testados:
1 - Celobiose 4 - nositol 7 - Melibiose 10 - Sacarose
2 - Dextrose 5 - Lactose 8 - Rafinose 11 - Trealose
3 - Galactose 6 - Maltose 9 - Ramnose 12 - Xilose
Os acares so distribudos na superfcies da placa com auxilio de uma esptula,
em pequenas pores. Deve-se manter distncia entre os pontos de inoculao. Para
facilitar a colocao dos acares e a leitura dividir a placa em 12 campos e enumerar.
ncubar a placa a 35C, com face que contm o meio com aucares voltada para cima e
fazer a leitura entre 24-96 horas.
A leitura considerada positiva quando houver turvao no local onde foi
adicionada o acar. Usar uma tabela padro para identificao da espcie da levedura.
15u/anograma 3 5ssimilao de nitrog6nio4-
No centro de uma placa de Petri pequena, coloca-se 1 ml da suspenso da levedura
preparada anteriormente, para o zimograma. Em seguida coloca-se 20 ml de meio-base
para assimilao de nitrognio, previamente fundido (~50C). Homogeneizar com
movimentos circulares suaves e esperar solidificar. Aps solidificar dividir a placa em duas
metades com a caneta. De um lado, colocar nitrato de potssio. ncubar a placa a 35C e
fazer a leitura entre 24-96 horas. A leitura deve ser interpretada da seguinte forma: a
peptona serve como controle positivo, pois todas as leveduras metabolizam esta
substancia; o nitrato de potssio s metabolizado por fungos no patognicos. Usar
uma tabela padro para identificao da espcie da levedura.
1Microcultivo de leveduras-
Coloca-se sobre a lmina de microscopia o meio Agar Fub-Tween80, previamente
fundido (~50C), cobrindo toda a superfcie da lmina. Deixar o meio solidificar. Com
auxlio de ala de platina esterilizada, tocar levemente a colnia da levedura (cultura de
24-48 horas). Semear a levedura na superfcie do meio de cultura fazendo de trs a
quatro estrias paralelas, eqidistantes 3 a 4 mm umas das outras (ver esquemas abaixo).
Cobre-se as estrias com lamnula esterilizada. Pressionar delicadamente a lamnula com
uma pina para retirar o ar retido entre a lamnula e a superfcie do Agar. dentificar a
placa e incub-la 35C, por 48-96 horas, dentro de uma placa de Petri esterilizada;
umedecer o algodo hidrfilo esterilizado com gua destilada estril e deixar no interior da
placa, criando assim uma cmara mida. Examinar as lminas ao microscpio ptico com
objetivas de 10 e 40x e observar as estruturas formadas ( hifas, pseudo-
hifas,blastocondios, clamidiocondios e artroconidios).
1#este da uria-
nocular as leveduras a serem identificadas em Agar uria com o auxilio da agulha de
platina e incubar 37C, por 24 h. Este teste ir avaliar a produo da enzima urase
pela levedura, a partir da hidrlise da uria.
1Meio de cultura cromog6nico para Candida 3Chromoagar4-
nocular as leveduras a serem identificadas no Chromoagar com auxilio da ala de platina
e incubar a 37C, por 24 h.
RESULTADOS
Na identificao de fungos filamentosos:
Na placa de Agar Sabouraud observou-se no um fungo de textura aveludada,
formato rugoso, de colorao amarelada no verso, e no anverso com colorao rosa com
o centro esverdeado.
Na leitura do microcultivo foi observada uma estrutura como a do desenho abaixo,
que sugestivo para Penicillium sp.
Na identificao de fungos leveduriformes:
-Prova do tubo germinativo: No foi observado a formao de tubo germinativo, excluindo
a possibilidade de ser C. albicans ou C. dubliniensis.
-Zimograma: nesta prova foi observada a presena de bolhas somente no tubo da
dextrose e de maltose, colocando um resultado entre Candida albicans e Candida
parapsilosis,segundo a tabela de fermentao de carboidratos e as espcies
relacionadas.
-Auxinograma (assimilao de carboidratos):
1 Celobiose (-) 4 nositol (-) 7 Melibiose (-) 10 Sacarose (+)
2 Dextrose (+) 5 Lactose (-) 8 Rafinose (-) 11 Trealose (+)
3 Galactose (+) 6 Maltose (+) 9 Ramnose (+) 12 Xilose (+)
Este resultado segundo a tabela com as espcie de fungos leveduriformes indica
ser Candida albicans ou Candida parapsilosis.
-Auxinograma ( Assimilao de nitrognio):
Turvou na presena de peptona sugerindo um FUNGO PATOGNCO
-Microcultivo de leveduras:
Na leitura da lmina deve-se procurar estruturas de reproduo por toda a lmina, esta
estrutura de reproduo neste caso possui caractersticas coloniais satlites como
aranha, e um aspecto arborescente.
-Teste da uria: prova negativa
-Meio de cultura chromagar: Observa-se uma colorao roseada. Confirmando no ser C.
albicans.
DISCUSSO
A identificao de um fungo desconhecido isolado de uma amostra biolgica no
necessariamente difcil, se forem realizadas algumas observaes preliminares. Na
maioria dos casos no difcil diferenciar a colnia lisa, entre pastosa e mucide, de uma
levedura que cresce sobre a superfcie de um meio de isolamento primrio da colnia de
aspecto cotonoso ou lanoso de um bolor. Todos os isolados devem ser considerados
potencialmente patognicos; entretanto, certos grupos, incluindo fungos dimrficos,
dermatfitos e certos fungos filamentosos negros, de crescimento lento, esto quase
sempre relacionados com doenas quando recuperados de amostras biolgicas. Portanto,
devem ser identificados sem qualquer dvida, e os informes devem estar disponveis o
mais rpido possvel, para que o tratamento antimictico possa ser institudo. Aspecto do
crescimento, velocidade de crescimento e pigmentao das colnias so observaes
teis para essa deciso inicial.
Nos fungos filamentosos o a identificao segundo a analise de microcultivo e do
macrocultivo indicou o fungo da espcie Penicillium. Nas espcies de Penicillium
pequenos condios esfricos esto dispostos em longas cadeias, a partir das
extremidades de filides, cujas pontas so rombas e parecem cortadas. As colnias de
Penicilium usualmente apresentam diversas tonalidades de verde, embora tenham sido
encontradas variantes amarelas e marrom-amareladas. Em geral, observada uma faixa
branca estreita na margem de crescimento externo da colnia.
Na anlise de fungos leveduriformes a identificao sugeriu a espcie Candida
parapsilosis, uma das especies de candida diferentes de C. 5lbicans. Estas fazem parte
da microbiota normal de superfcie cutneas e mucocutneas, e apenas em raras
ocasies foram consideradas como agentes de doena clnica. Entretanto vrias espcies
foram associadas a virtualmente todas as formas de candidase. Em uma reviso de 1591
casos de candidase divulgados em 37 trabalhos entre 1952 e 1992, verificaram que as
espcies de Cndida no-albicans haviam sido os agentes causais de 46% das infeces
sistmicas; C. tropicallis foi responsvel por 25% das infeces, C. glabrata por 8%, C.
parapsilosis por 7%, e C.7ru8ei por 4%.
Candida parapsilosis apresenta-se, desde os anos 80, como um importante
patgeno hospitalar de fungemias, sendo responsvel por 7% a 15% das candidemias na
maioria das sries publicadas nos EUA e Europa. Sua ocorrncia ainda maior em
crianas e recm-nascidos prematuros internados em unidades de terapia intensiva, onde
a prevalncia de candidemias por C. parapsilosis de 17 a 50% dos casos.
Caracteristicamente, C. parapsilosis prolifera-se em solues contendo glicose, tem
grande capacidade de produzir biofilme e freqentemente coloniza a pele. Vrios estudos
estabelecem claramente uma associao entre a utilizao de cateter venoso em posio
central e maior ocorrncia de fungemia por C. parapislosis. solados clnicos desta
espcie so sensveis a anfotericina B e aos tiazlicos. Em pases da Amrica Latina C.
parapsilosis tem sido reconhecida como a segunda principal causa de infeco invasiva
em diferentes casusticas j publicadas no nosso meio.
BIBLIOGRAFIA
1. TRABULS, Luiz Rachid; ALTERTHUM, Flavio. Microbiologia. 4. ed. So Paulo:
Atheneu, 2005.
2. KONEMAN, Elmer W. Diagnstico Microbiolgico: Texto e Atlas Colorido. 5. ed. So
Paulo: MEDS, 2001
3. COLOMBO,A.L.; Guimares,T. Epidemiologia das infeces hematognicas por
Candida spp.Rev. Soc. Bras. Med. Trop. vol.36 no.5 Uberaba Sept./Oct. 2003
4. AGNCA NACONAL DE VGLNCA SANTRA: Deteco e dentificao dos
Fungos de mportncia Mdica. Disponvel em:
<http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/microbiologia/mod_7_2004.pdf>
Acesso em: 15 nov. 2009