Anlisis de la Presencia de Organismos Genticamente Modificados en Muestras de Alimentos

Sesin n 4 Extraccin y Purificacin de ADN

M. Somma

WORLD HEALTH ORGANIZATION REGIONAL OFFICE FOR EUROPE WELTGESUNDHEITSORGANISATION REGIONALBRO FR EUROPA

ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE ORGANIZACIN MUNDIAL DE LA SALUD OFICINA REGIONAL PARA EUROPA

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ndice Sesin n 4 Extraccin y Purificacin de ADN

Introduccin Mtodos de extraccin Mtodos de purificacin Mtodo de extraccin y purificacin con CTAB Cuantificacin del ADN mediante espectrofotometra Principios de la cuantificacin de ADN por espectrofotometra Determinacin de la concentracin de cidos nucleicos Prctica Bibliografa

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Introduccin
La extraccin y purificacin de cidos nucleicos constituye la primara etapa de la mayora de los estudios de biologa molecular y de todas las tcnicas de recombinacin de ADN. En este caso, los mtodos de extraccin permiten obtener cidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para despus realizar anlisis especficos de modificaciones genticas mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). La calidad y la pureza de los cidos nucleicos son dos de los elementos ms importantes en ese tipo de anlisis. Si se desea obtener cidos nucleicos muy purificados, que no contengan contaminantes inhibidores, es preciso aplicar mtodos de extraccin adecuados. Los contaminantes capaces de inhibir el anlisis PCR se enumeran en el cuadro 1. Con objeto de evitar los falsos negativos debidos a la presencia de inhibidores de la PCR en la muestra, se recomienda vivamente efectuar un experimento de control de la inhibicin de la PCR, que suele hacerse mediante PCR especfica de vegetales (eucariotas o cloroplastos) o de la especie. Cuadro 1. Inhibidores de la PCR. Inhibidor Dodecilsulfato sdico Fenol Etanol Isopropanol Acetato de sodio Cloruro de sodio EDTA Hemoglobina Heparina Urea Mezcla de reaccin Concentracin de inhibicin > 0,005 % > 0,2 % >1% >1% > 5 mM > 25 mM > 0,5 mM > 1 GM/ml > 0,15 UI/ml > 20 mM > 15 %

Dada la gran variedad de mtodos de extraccin y purificacin de cidos nucleicos existentes, la eleccin de la tcnica ms adecuada suele efectuarse conforme a los criterios siguientes: cido nucleico diana; organismo fuente; material inicial (tejido, hoja, semilla, material transformado, etc.); resultados deseados (rendimiento, pureza, tiempo que requiere la purificacin); uso posterior (PCR, clonacin, etiquetado, transferencia, RT-PCR, sntesis de ADNc, etc.).

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A continuacin se recogen los principios de algunos de los mtodos de extraccin y purificacin de cidos nucleicos que ms se emplean en la actualidad.

Mtodos de extraccin
Para extraer los cidos nucleicos del material biolgico es preciso provocar una lisis celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los cidos nucleicos de los restos de clulas. El procedimiento de lisis idneo suele consistir en un equilibrio de tcnicas y ha de ser suficientemente fuerte para romper el material inicial complejo (un tejido, por ejemplo), pero suficientemente suave para preservar el cido nucleico diana. Entre los procedimientos usuales de lisis figuran los siguientes: rotura mecnica (trituracin, lisis hipotnica, etc.); tratamiento qumico (detergentes, agentes caotrpicos, reduccin con tioles, etc.); digestin enzimtica (Proteinasa K, etc.). Es posible romper la membrana celular e inactivar las nucleasas intracelulares al mismo tiempo. Por ejemplo, una misma solucin puede contener detergentes que solubilicen las membranas celulares y sales caotrpicas fuertes que inactiven las enzimas intracelulares. Tras la lisis celular y la inactivacin de las nucleasas, los restos de clulas se eliminan fcilmente por filtracin o precipitacin.

Mtodos de purificacin
Los mtodos empleados para purificar los cidos nucleicos de extractos celulares suelen ser combinaciones de dos o ms tcnicas de las siguientes: extraccin/precipitacin; cromatografa; centrifugacin; separacin por afinidad.

En los prrafos siguientes se describen brevemente estas tcnicas (Zimmermann et al., 1998).

Extraccin/precipitacin
A menudo se efecta una extraccin con disolventes para eliminar los contaminantes de los cidos nucleicos. Por ejemplo, suele emplearse una combinacin de fenol y cloroformo con objeto de eliminar las protenas. Para concentrar los cidos nucleicos suele realizarse una precipitacin con isopropanol o etanol. Si la cantidad de cido nucleico diana es escasa, puede aadirse a la mezcla

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un portador inerte (como el glucgeno) para favorecer la precipitacin. Tambin puede realizarse una precipitacin selectiva con concentraciones salinas elevadas (precipitacin salina) o una precipitacin de las protenas mediante cambios del pH.

Cromatografa
Pueden emplearse diversas tcnicas cromatogrficas de separacin: permeacin sobre gel, intercambio inico, adsorcin selectiva o unin por afinidad. La permeacin sobre gel aprovecha las propiedades de las partculas porosas del gel para tamizar molculas. Se emplea una matriz con poros de tamao definido, que dejan pasar las molculas ms pequeas por difusin, pero no las ms grandes, que quedan eluidas en el volumen vaco. As pues, las molculas quedan eluidas por orden de tamao decreciente. La cromatogrfica de intercambio inico es otra tcnica, que se basa en la interaccin electrosttica de la molcula diana con un grupo funcional de la matriz en columna. Los cidos nucleicos (polianiones lineales con fuerte carga negativa) pueden eluirse de las columnas de intercambio inico con simples Tampones salinos. En la cromatografa de adsorcin, los cidos nucleicos se fijan selectivamente en slice o vidrio, en presencia de determinadas sales (por ejemplo, sales caotrpicas), mientras que otras molculas biolgicas no se fijan. A continuacin, los cidos nucleicos pueden eluirse con agua o un tampn hiposalino y se obtiene una muestra que puede emplearse directamente en las aplicaciones posteriores.

Centrifugacin
La centrifugacin selectiva constituye un mtodo de purificacin eficaz. As, por ejemplo, la ultracentrifugacin en gradientes autogenerados de CsCl con fuerzas g elevadas se lleva empleando mucho tiempo para purificar plsmidos. La centrifugacin suele asociarse a otros mtodos, como la cromatografa de columna centrifugada, en cuyo caso se combina la permeacin sobre gel y la centrifugacin para separar el ADN o ARN de contaminantes ms pequeos (sales, nucletidos, etc.), intercambiar tampones o seleccionar segn el tamao. Algunos procedimientos combinan la adsorcin selectiva en matriz cromatogrfica (vase el apartado anterior Cromatografa) y la elucin por centrifugacin para purificar de forma selectiva un tipo de cido nucleico.

Separacin por afinidad

En los ltimos aos, cada vez son ms los mtodos de purificacin que combinan la inmovilizacin por afinidad de cidos nucleicos y la separacin magntica. Por ejemplo, los ARNm poli A + pueden unirse a partculas magnticas revestidas de
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estreptavidina mediante oligo dT marcados con biotina, y el complejo de partculas puede eliminarse de la solucin (y de los contaminantes libres) con un imn. Esta tcnica en fase slida simplifica la purificacin de los cidos nucleicos, pues permite sustituir las etapas de centrifugacin, extraccin orgnica y separacin de fases por una operacin de separacin magntica, nica y rpida.

Mtodo de extraccin y purificacin con CTAB

El protocolo del mtodo del bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB) fue elaborado por Murray y Thompson en 1980 (Murray y Thompson, 1980) y publicado posteriormente, en 1987, por Wagner y sus colaboradores (Wagner et al., 1987). El mtodo es adecuado para extraer y purificar ADN de vegetales y alimentos derivados de vegetales y est especialmente indicado para eliminar los polisacridos y los compuestos polifenlicos, que, de otro modo, alteraran la pureza del ADN y, por tanto, su calidad. Este procedimiento se ha aplicado con frecuencia en gentica molecular de los vegetales y ha sido probado en ensayos de validacin para detectar OGM (Lipp et al., 1999; 2001). Se han elaborado algunas variantes adicionales para adaptar el mtodo a una amplia gama de matrices de alimentos transformados o sin transformar (Hupfer et al., 1998; Hotzel et al., 1999; Meyer et al., 1997; Poms et al., 2001).

Principios del mtodo del CTAB: lisis, extraccin y precipitacin

Las clulas vegetales pueden lisarse con el detergente inico bromuro de cetiltrimetil amonio (CTAB), que forma un complejo insoluble con los cidos nucleicos en medio hiposalino. De ese modo, los polisacridos, los compuestos fenlicos y los dems contaminantes permanecen en el sobrenadante y pueden eliminarse por lavado. El complejo de ADN se solubiliza aumentando la concentracin salina y se precipita con etanol o isopropanol. En esta seccin se describirn los principios de las tres etapas principales: la lisis de la membrana celular, la extraccin del ADN genmico y su precipitacin. Lisis de la membrana celular: Tal como se ha mencionado anteriormente, la primera etapa de la extraccin del ADN es la rotura de la membrana celular y nuclear, para lo cual la muestra homogeneizada se trata primero con el tampn de extraccin, que contiene EDTA, Tris-HCl y CTAB. Todas las membranas biolgicas presentan la misma estructura general, integrada por molculas de lpidos y de protenas, unidas por interacciones no covalentes.

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ADN
Membrana

nuclear

Figura 1. Representacin simplificada de las membranas celulares1. Tal como muestra la figura 1, las molculas lipdicas estn ordenadas en una doble capa continua, en la que las molculas protenicas estn disueltas. Las molculas lipdicas estn formadas por extremos hidrfilos, denominados cabezas, y extremos hidrfobos, denominados colas. En este mtodo, el detergente (CTAB) contenido en el tampn de extraccin provoca la lisis de la membrana. Dado que la composicin de los lpidos y del detergente es similar, el componente de CTAB del tampn de extraccin captura los lpidos que integran la membrana celular y nuclear. La figura 2 ilustra el mecanismo de solubilizacin de los lpidos con un detergente.

Figura 2. Solubilizacin de los lpidos.

Las ilustraciones que figuran en esta pgina y en las siguientes proceden del Genetic Science Learning Center, Universidad de Utah, http://gslc.genetics.utah.edu.

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La figura 3 ilustra cmo se libera el ADN genmico cuando el detergente captura los lpidos y las protenas al entrar en contacto la membrana celular y el tampn de extraccin con CTAB. Con una concentracin salina (NaCl) determinada, el detergente forma un complejo insoluble con los cidos nucleicos. El EDTA es un componente quelante, que se une al magnesio, entre otros metales. El magnesio es un cofactor de la desoxirribonucleasa. Al unir el magnesio al EDTA, la actividad de la desoxirribonucleasa presente disminuye. El Tris-HCl confiere a la solucin la capacidad de amortiguar el pH (un pH inferior o superior daa el ADN). Es importante sealar que, como los cidos nucleicos se degradan fcilmente en esta fase de la purificacin, debe reducirse al mnimo el tiempo transcurrido entre la homogeneizacin de la muestra y la adicin de la solucin tampn con CTAB. Una vez que se han roto las membranas de la clula y de los orgnulos (como los que se encuentran alrededor de las mitocondrias y los cloroplastos), se purifica el ADN.

Figura 3. Rotura de la membrana celular y extraccin del ADN genmico. Extraccin - En esta etapa, se separan los complejos formados por los cidos nucleicos y el CTAB de los polisacridos, los compuestos fenlicos, las protenas y los dems lisados celulares disueltos en la solucin acuosa. Es especialmente importante eliminar los polisacridos y los compuestos fenlicos, pues pueden inhibir numerosas reacciones enzimticas. En concentraciones hiposalinas (NaCl < 0,5 M), los contaminantes de los complejos de cidos nucleicos no precipitan y pueden eliminarse extrayendo la solucin acuosa con cloroformo. El cloroformo desnaturaliza las protenas y facilita la separacin de las fases acuosa y orgnica. La fase acuosa suele constituir la fase superior. No obstante, si dicha fase es densa debido a la concentracin salina (> 0,5 M), formar la fase inferior. Adems, si el pH de la solucin acuosa no se ha equilibrado debidamente (pH 7,8 8,0), los cidos nucleicos tendern a repartirse en la fase orgnica. Si es preciso, la extraccin con

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cloroformo se realizar dos o tres veces, con objeto de eliminar por completo las impurezas de la capa acuosa. Para perfeccionar la extraccin de los cidos nucleicos, puede retroextraerse la fase orgnica con una solucin acuosa, que se aade a continuacin al extracto anterior. Una vez purificados los complejos de cidos nucleicos, puede procederse a la precipitacin, ltima etapa del procedimiento. Precipitacin - En esta ltima etapa se separan los cidos nucleicos del detergente, para lo cual la solucin acuosa se trata primero con una solucin de precipitacin compuesta por una mezcla de CTAB y NaCl en concentracin elevada (NaCl > 0,8 M). Una alta concentracin salina es necesaria para que se forme un precipitado de cidos nucleicos. Puede ser preferible emplear acetato de sodio en lugar de NaCl por su capacidad tampn. En estas condiciones, el detergente, que es ms soluble en alcohol que en agua, puede eliminarse por lavado, mientras que los cidos nucleicos precipitan. El posterior tratamiento con etanol al 70 % permite una mayor purificacin o elucin de los cidos nucleicos de la sal residual.

Cuantificacin del ADN mediante espectrofotometra

El ADN, el ARN, los oligonucletidos e incluso los mononucletidos pueden cuantificarse directamente en soluciones acuosas, en forma diluida o sin diluir, midiendo la absorbancia A (o densidad ptica, DO) de luz ultravioleta (tambin puede hacerse en el intervalo visible). Si la muestra es pura, es decir, no contiene cantidades significativas de contaminantes como protenas, fenol o agarosa, la medicin espectrofotomtrica de la irradiacin ultravioleta absorbida por las bases es sencilla y exacta. En este mtodo, los tampones acuosos con escasa concentracin inica (por ejemplo, tampn TE) resultan idneos. La concentracin de cidos nucleicos suele determinarse midiendo a 260 nm y comparando con un blanco. La interferencia de contaminantes puede determinarse calculando un cociente. Dado que las protenas absorben a 280 nm, se emplea el cociente A260/A280 para calcular la pureza de los cidos nucleicos. Los cocientes respectivos del ADN y el ARN puros son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Una absorcin a 230 nm significa que la muestra est contaminada con hidratos de carbono, pptidos, fenoles, compuestos aromticos u otras sustancias. El cociente A260/A230 de las muestras puras es de 2,2 aproximadamente. Cuando la cantidad disponible de cidos nucleicos es escasa, puede emplearse el mtodo de la placa de agarosa con bromuro de etidio. Permite calcular la cantidad de cidos nucleicos a partir de la intensidad de la fluorescencia emitida por el
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bromuro de etidio irradiado con luz UV, comparndola con unos patrones de concentracin.

Principios de la cuantificacin de ADN por espectrofotometra

El espectrofotmetro se funda en la transmisin de la luz a travs de una solucin para determinar la concentracin de un soluto presente en la misma. El aparato funciona conforme a un principio sencillo: se irradia una muestra con una radiacin luminosa de longitud de onda conocida y se mide la energa luminosa transmitida con una clula fotoelctrica situada detrs de la muestra. Tal como muestra la figura 4, el espectrofotmetro de haz nico consta de una fuente luminosa, un prisma, un recipiente con la muestra y una clula fotoelctrica. Los distintos elementos estn conectados a los sistemas elctricos o mecnicos adecuados para controlar la intensidad luminosa y la longitud de onda y para convertir en variaciones de tensin la energa recibida en la clula fotoelctrica. Las variaciones de tensin se miden en un contador o se registran en un ordenador para su posterior anlisis.

F i g Figura 4. Representacin esquemtica de la transmisin de la luz. Cada molcula absorbe la energa radiante a una longitud de onda especfica, a partir de la cual es posible extrapolar la concentracin de un soluto en una solucin. Con arreglo a la ley de Lambert-Beer, existe una relacin lineal entre la absorbancia A (tambin denominada densidad ptica, DO) y la concentracin de la macromolcula, conforme a la ecuacin siguiente: A = DO = lc (1)

donde es el coeficiente de extincin molar, c es la concentracin y l es el paso de luz de la cubeta. Las protenas y los cidos nucleicos absorben la luz en el intervalo

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ultravioleta, a longitudes de onda comprendidas entre los 210 y los 300 nm. Tal como se ha sealado anteriormente, la absorbancia mxima de las soluciones de ADN y ARN corresponde a 260 nm y la de las soluciones de protenas, a 280 nm. Dado que las soluciones de ADN y ARN absorben parcialmente la luz a 280 nm y las que contienen protenas hacen lo propio a 260 nm, el cociente de los valores obtenidos a 260 nm y a 280 nm (A260/A280) proporciona una estimacin del grado de pureza de los cidos nucleicos. Los cocientes A260/A280 respectivos del ADN y el ARN puros son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Con un paso de luz de 10 mm y una longitud de onda de 260 nm, una absorbancia A = 1 corresponde aproximadamente a 50 g/ml de ADN bicatenario, 37 g/ml de ADN monocatenario, 40 g/ml de ARN o 30 g/ml de oligonucletidos. Si la muestra tambin contiene protenas, el cociente A260/A280 ser considerablemente inferior a dichos valores y no podr determinarse con exactitud la cantidad de cidos nucleicos. Debe precisarse que la espectrofotometra no permite identificar de forma fiable impurezas de ARN presentes en las soluciones de ADN. Puede emplearse la absorbancia a 325 nm para poner de manifiesto la presencia de restos en la solucin o la suciedad de la cubeta.

Determinacin de la concentracin de cidos nucleicos

Eleccin de la cubeta. La cantidad de solucin de cidos nucleicos necesaria para medir la absorbancia A depende de la capacidad de la cubeta. Debe elegirse una cubeta apropiada atendiendo al intervalo de concentracin de la muestra, el factor de dilucin y el volumen de la muestra. En la mayor parte de los procedimientos empleados para detectar OGM, el volumen de ADN genmico disponible vara entre 50 y 100 l. Para la cuantificacin espectroscpica de pequeos volmenes de cidos nucleicos se emplean diversos tipos de cubetas de microvolumen, cuya capacidad oscila entre 5 y 70 l. Preparacin. Para calibrar el espectrofotmetro es importante: establecer el paso de luz correcto; establecer el factor correcto (ADN bicatenario, ADN monocatenario o ARN); medir la solucin en blanco (establecer la referencia), que ser agua o solucin tampn (A260 = 0); cerciorarse de que la referencia establecida se renueva peridicamente; medir una cantidad conocida de cidos nucleicos puros para comprobar la fiabilidad de la referencia establecida.

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Medicin en una muestra desconocida. Para medir la concentracin, se utilizan cantidades determinadas de solucin de ADN en funcin de la capacidad de la cubeta empleada (por ejemplo, 5 l de ADN diluidos en 195 l de agua si la capacidad de la cubeta es inferior a 0,2 ml). Despus de calibrar el espectrofotmetro y de aadir la solucin de cidos nucleicos, se tapa la cubeta, se mezcla la solucin y se mide la absorbancia. Con objeto de reducir los errores de pipeteado, debe efectuarse la medicin al menos dos veces y siempre con 5 l de solucin de ADN, como mnimo. Se desaconsejan los valores de A260 inferiores a 0,02 o comprendidos entre 1 y 1,5 (segn el instrumental empleado) por el elevado margen de error que entraan. La concentracin c de un cido nucleico determinado presente en una solucin se calcula conforme a las ecuaciones siguientes: ADN monocatenario: ADN bicatenario: ARN monocatenario: Oligonucletido: c(pmol/l) = A260/0,027 c(pmol/l) = A260/0,020 c(pmol/l) = A260/0,025 c(pmol/l) = A260100/1,5NA+0,71NC+1,20NG + 0,84NT

donde A260 es la absorbancia medida a 260 nm. El cuadro 2 recoge un ejemplo de los valores de la absorbancia de ADN de timo de ternera muy purificado, en suspensin en un tampn TNE 1x, considerando que el ADN de referencia es ADN bicatenario, con una A260 = 1 a 50 g/ml, en una cubeta cuyo paso de luz es de 10 mm. La concentracin nominal de ADN era de 25 g/ml. Cuadro 2. Valores de la absorbancia de ADN de timo de ternera muy purificado, en tampn TNE 1x. Longitud de onda 325 280 260 230 Absorbancia 0,01 0,28 0,56 0,30 A260/A280 2,0 Conc. (g/ml) 28 -

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Prctica
Instrumental OBSERVACIONES Antes de utilizar todo el instrumental hay que esterilizarlo y eliminar todos los residuos de ADN. Para evitar la contaminacin, deben usarse puntas de pipeta con barrera protectora contra aerosoles.

Instrumental reductor (hoja de bistur estril, mortero, etc.) Bao mara o calentador Microcentrifuga Micropipetas Mezclador de torbellino Tubos para microcentrifuga de 1,5 ml Bandejas de pesar o equivalente Esptulas Balanza capaz de efectuar mediciones de 0,01 g Asas Soporte para tubos de microcentrifuga

Optativo: desecador en vaco para secar los sedimentos de ADN.

Reactivos OBSERVACIONES Todos los productos qumicos han de ser de calidad de biologa molecular. El agua desionizada y los Tampones han de esterilizarse en autoclave antes de su utilizacin. Ningn producto qumico debe contener ADN ni desoxirribonucleasa.

Bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB) Cloroformo Isopropanol Na2EDTA Etanol NaCl Proteinasa K

N CAS 124-03-8

N CAS 6381-92-6

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Ribonucleasa A Trometamol (Tris-HCl) Agua desionizada esterilizada

Tampn a base de CTAB CTAB 20 g/l NaCl 1,4 M Tris-HCl 0,1 M Na2EDTA 20 mM Aadir 100 ml de agua desionizada; ajustar el pH a 8,0 con NaOH 1 M; completar hasta 200 ml y esterilizar en autoclave; conservar el Tampon a 4C (seis meses como mximo). 4g 16,4 g 3,15 g 1,5 g

Solucin de precipitacin a base de CTAB CTAB 5 g/l NaCl 0,04 M Aadir 100 ml de agua desionizada; ajustar el pH a 8,0 con NaOH 1 M; completar hasta 200 ml y esterilizar en autoclave; conservar la solucin a 4C (seis meses como mximo). 1g 0,5 g

NaCl 1,2 M Disolver 7,0 g de NaCl en 100 ml de agua desionizada; esterilizar en autoclave y conservar a temperatura ambiente.

Solucin de etanol al 70 % (v/v) Mezclar 70 ml de etanol puro y 30 ml de agua desionizada estril. Ribonucleasa A 10 GM/ml: conservar a 20C. Endopeptidasa K 20 GM/ml: conservar a 20C.

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Procedimiento Debe efectuarse en condiciones estriles. La contaminacin durante la preparacin de la muestra puede evitarse empleando material desechable y soluciones de descontaminacin y evitando la formacin de polvo. Depositar 100 GM de muestra homognea en un tubo estril de 1,5 ml para microcentrfuga; aadir 300 l de agua desionizada estril y mezclar con un asa; aadir 500 l de tampn a base de CTAB y mezclar con un asa; aadir 20 l de proteinasa K (20 GM/ml), agitar e incubar a 65C durante 30-90 minutos ;
* *

aadir 20 l de ribonucleasa A (10 GM/ml), agitar e incubar a 65C durante 5-10 * minutos ; centrifugar durante 10 minutos a 16 000 g aproximadamente; trasladar el sobrenadante a un tubo de microcentrifugacin que contenga 500 l de cloroformo y agitar durante 30 segundos; centrifugar durante 10 minutos a 16,000 g hasta que se separen las fases; trasladar 500 l de la capa superior a otro tubo de microcentrifugacin que contenga 500 l de cloroformo y agitar; centrifugar durante 5 minutos a 16 000 g; trasladar la capa superior a otro tubo de microcentrifugacin; aadir 2 volmenes de solucin de precipitacin a base de CTAB y mezclar pipeteando; incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente; centrifugar durante 5 minutos a 16 000 g; desechar el sobrenadante; disolver el precipitado en 350 l NaCl (1,2 M); aadir 350 l de cloroformo y agitar durante 30 segundos; centrifugar durante 10 minutos a 16,000 g hasta que se separen las fases; trasladar la capa superior a otro tubo de microcentrifugacin; aadir 0,6 volmenes de isopropanol y agitar; centrifugar durante 10 minutos a 16 000 g;

Estas etapas optativas se suelen incluir ahora en el mtodo de extraccin con CTAB para aumentar el rendimiento de la extraccin de ADN genmico de matrices muy complejas.

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desechar el sobrenadante; aadir 500 l de solucin de etanol al 70 % y agitar con cuidado; centrifugar durante 10 minutos a 16 000 g; desechar el sobrenadante; secar los sedimentos y volver a disolver el ADN en 100 l de agua desionizada estril.

La solucin de ADN puede conservarse en la nevera dos semanas como mximo o en el congelador a - 20C durante ms tiempo.

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Bibliografa
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