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Daniel Bello Gil, Emilia Carrera Bocourt, Yuset Daz Maqueira Determinacin de azcares reductores totales en jugos mezclados de caa de azcar utilizando el mtodo del cido 3,5 dinitrosaliclico ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caa de Azcar, vol. XL, nm. 2, mayo-agosto, 2006, pp. 45-50, Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caa de Azcar Cuba
Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=223120664006

ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caa de Azcar, ISSN (Versin impresa): 0138-6204 revista@icidca.edu.cu Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caa de Azcar Cuba

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Daniel Bello Gil*, Emilia Carrera Bocourt y Yuset Daz Maqueira Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caa de Azcar (ICIDCA) e.mail: daniel.bello@icidca.edu.cu

RESUMEN Se desarroll un procedimiento para determinar la concentracin de azcares reductores totales en jugos mezclados de caa de azcar por el mtodo del cido 3,5 dinitro saliclico (DNS). Se evaluaron dos procedimientos para la preparacin del reactivo del DNS: en fro y en caliente. Se realiz un anlisis comparativo con el mtodo de Eynon- Lane para diferentes diluciones del jugo. El mtodo del DNS en fro mostr menores desviaciones que el mtodo de Eynon-Lane y que el mtodo del DNS en caliente, tomando como referencia los g/L de sacarosa que reporta el Manual Analtico para el Control Unificado (MACU) para soluciones puras de sacarosa a los diferentes Brix de jugo ensayados. El mtodo del DNS en caliente mostr las mayores desviaciones en la determinacin de azcares reductores totales en jugos de caa de azcar. Palabras clave: azcares reductores totales, mieles de caa de azcar, jugos de caa de azcar, Eynon- Lane, cido 3,5 dinitrosaliclico. ABSTRACT It was developed a procedure to determine the concentration of total reducing sugars in mixed Sugarcane juices using the method of the 3,5 dinitrosalicylic acid (DNS). Two procedures for the preparation of the reagent of the DNS were evaluated: in cold and hot. It was carried out a comparative analysis with the method of Eynon-Lane for different dilutions of the Sugarcane juice. The method of the DNS in cold showed minor deviations than the Eynon-Lane method and the DNS in hot method, taking like reference the saccharose concentration that Analytical Handbook of Unified Control reports for pure solutions of saccharose to the assayed Brix. The method of the DNS in hot showed the higher deviations in the determination of total reducing sugars in Sugarcane juices. Key words: total reducing sugars, Sugarcane molasses, Sugarcane juices, Eynon-Lane, 3,5 dinitrosalicylic acid. ICIDCA No. 2, 2006 45

INTRODUCCIN El desarrollo de mtodos analticos es esencial en el seguimiento y control del proceso de fabricacin de azcar y alcohol. En la Industria sucro-alcoholera es comn el empleo del mtodo desarrollado por Eynon y Lane para la determinacin de azcares reductores en mieles y caldos de fermentacin de destileras(1,2), siendo ste el aceptado por las normas cubanas y el recomendado por la Comisin Internacional para los Mtodos Uniformes de Anlisis de Azcar (ICUMSA en Ingls) (3,4). El mtodo de Eynon-Lane tiene como principal inconveniente el ser un mtodo volumtrico donde el punto final de la valoracin se detecta por cambio de color, adems es un mtodo poco productivo. Sin embargo, ha demostrado ser exacto y preciso en la determinacin de azcares reductores en mieles y baticiones de mieles (2,5). Sumner y colaboradores desarrollaron otro mtodo utilizando el cido 3,5 dinitrosaliclico (DNS) para calcular la concentracin de azcares reductores en distintos materiales. El procedimiento se basa en una reaccin redox que ocurre entre el DNS y los azcares reductores presentes en la muestra (6,7,8,9). Este mtodo ha sufrido varias modificaciones a travs de los aos para adecuarse al anlisis de diferentes materiales y su principal ventaja radica en su alta sensibilidad y productividad debido a que es un mtodo espectrofotomtrico (10,11). El mtodo del DNS no es recomendable utilizarlo para la determinacin de azcares reductores en muestras intensamente coloreadas como mieles y caldos de fermentacin que la contengan. Estudios de Otero y colaboradores muestran dispersin en la determinacin de azcares reductores en mieles por el mtodo del DNS con la modificacin de Miller (12). En la actualidad, el programa alcoholero cubano y en especial la produccin de alcohol a partir de jugos mezclados de caa de azcar necesita del desarrollo de nuevos procedimientos analticos: precisos, de elevada productividad y de poca manipulacin tcnica que permitan llevar con exactitud la contabilidad y eficiencia global del proceso. En el presente trabajo se desarrolla un procedimiento para la determinacin de
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azcares reductores totales en jugos mezclados de caa de azcar por el mtodo del cido 3,5 dinitrosaliclico. Adems, se hace un anlisis comparativo con el mtodo de Eynon y Lane. MATERIALES Y MTODOS 2.1. Tratamiento del Jugo mezclado de caa de azcar Se preparan diferentes diluciones del jugo mezclado de caa de azcar para que queden a los siguientes Brix: 14.4; 12.9; 11.8; 11.1; 9.0; 6.9 y 5.15. Se centrifuga 10 ml de cada dilucin de jugo a 10 000 r.p.m, 10 min y se filtra el sobrenadante por papel de filtracin rpida. 2.2. Inversin del jugo mezclado de caa de azcar Se toma 1 ml de jugo filtrado en matraz de 100ml y se le adicionan 5 ml de H:Cl 1:1 (v/v). Se coloca a 65 C en bao de agua por 10 min. Se deja enfriar a temperatura ambiente y se neutraliza con NaOH al 10 % (w/v). Se enrasa con agua destilada (1,2). 2.3. Soluciones de sacarosa pura Se preparan soluciones de sacarosa pura a las siguientes concentraciones: 60, 80, 100, 120, 140 g/L. 2.4. Preparacin del reactivo del cido 3,5 dinitrosaliclico: en fro y en caliente Se pesan 5 g de cido 3,5 dinitrosaliclico, 150 g de tartrato de Na-K y 8 g de NaOH. Se disuelve el NaOH en 200 ml de agua (d) y se aade en agitacin el tartrato de Na-K lentamente. Se completa con agua (d) hasta 400 ml y se comienza a aadir lentamente el cido 3,5 dinitrosaliclico. Se deja en agitacin toda la noche, se enrasa a 500 ml y se filtra. La preparacin del reactivo en caliente es idntica pero se hace en agitador magntico con calentamiento (6,7,8,9). 2.5. Desarrollo de la reaccin del DNS En tubos de cristal de 10 ml se adicionan 0.5 ml de muestra y 0.5 ml del reactivo de DNS. Los tubos se colocan en bao de agua a 100 C por 5 min. Se enfran hasta temperatura ambiente y se le aade 5 ml de agua destilada. Se agita y se realiza la lectura a 540 nm en espectrofotmetro.
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2.6. Curva patrn de Glucosa Se prepar la solucin patrn de Glucosa a las siguientes concentraciones: 0.5, 0.7, 0.9, 1.1, 1.3, 1.5, 1.7 y 1.9 g/L. Se desarrolla la reaccin con el reactivo DNS segn acpite 2.5. 2.7 Mtodo de Eynon-Lane Se desarroll el mtodo de Eynon-Lane segn modificacin ICIDCA (1,2,5). RESULTADOS Y DISCUSIN 3.1 Curva patrn de Glucosa Se obtuvieron altos coeficientes de correlacin para las curvas patrn de Glucosa utilizando el mtodo del DNS en caliente y en fro (figura 1 y 2).

Figura 2. Curva patrn de Glucosa (DNS en frio)

Ambos mtodos detectan los cambios en la concentracin de azcares reductores con cambios proporcionales en las lecturas de densidad de ptica a 540 nm. 3.2 Determinacin de azcares reductores totales en jugos de caa mezclado Las tablas 1 A y B muestran los resultados de determinacin de azcares reductores totales utilizando los mtodos del DNS en fro, DNS en caliente y por Eynon-Lane para los diferentes Brix de trabajo. Se tom como referencia los valores de concentracin que reporta el MACU para soluciones puras de sacarosa a los diferentes Brix ensayados (13). Las figuras 3, 4 y 5 muestran las curvas de correlacin Brix vs g/L de azcares

Figura 1. Curva patrn de Glucosa (DNS en caliente)

Tabla 1 A y B . Resultados de la concentracin de azcares reductores totales en g/L por el mtodo de DNS en fro, DNS en caliente y Eynon -Lane. A: Experimento 1 y B Experimento 2.

A
Brix 14,4 12,9 11,8 11,1 9 6,9 5,15 g/l MACU 152,15 135,48 123,38 115,74 93,06 70,76 52,97 g/l (DNS frio) 154,3 142,7 133,4 123,7 96,8 78,7 54,8 g/l (DNS caliente) 158 146 144 128 103 82,5 55,4 g/l Eynon-Lane 140 126 116 103 88 67 46

B
Brix 14,4 12,9 11,9 10,9 9,2 7,2 5,1 g/l MACU 152,15 135,48 124,48 113,56 95,21 73,92 51,93 g/l (DNS frio) 153,3852281 140,4417089 132,2954381 122,5199131 93,19333816 73,28023172 53,91020999 g/l (DNS caliente) 161, 223491 143, 278956 136, 0195759 128, 7601958 95, 56280587 73, 21137031 55,84013051 g/l Eynon-Lane 140 125 114 103 90 70 46

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reductores por el mtodo del DNS en caliente, DNS en fro y Eynon-Lane respectivamente. Se obtuvieron altas correlaciones por los tres mtodos, o sea, un cambio en el Brix del jugo de caa se tradujo en un cambio proporcional en la concentracin de azcares reductores por los tres mtodos ensayados.

dos con respecto a los valores de referencia del MACU. La desviacin se calcul para cada Brix de jugo segn: Desviacin g/L = g/L reductores calculadosg/L sacarosa MACU

Figura 3. Correlacin Brix vs g/l de azcares reductores totales para el mtodo del DNS en caliente.

Figura 6 A. Desviacin en g/L de la concentracin de azcares reductores totales para los tres mtodos ensayados con respecto a las concentraciones de sacarosa reportadas por el MACU para los diferentes Brix de trabajo (Experimento 1).

Figura 4. Correlacin Brix vs g/l de azcares reductores totales para el mtodo del DNS en frio.

Figura 6 B. Desviacin en g/L de la concentracin de azcares reductores totales para los tres mtodos ensayados con respecto a las concentraciones de sacarosa reportadas por el MACU para los diferentes Brix de trabajo (Experimento 2).

Figura 5. Correlacin Brix vs g/L de azcares reductores totales para el mtodo de Eynon y Lane.

Las figuras 6 A y B muestran las desviaciones en g/L para los tres mtodos ensaya48

En los dos experimentos realizados con jugo de caa de azcar mezclado (A y B) el mtodo del DNS en fro mostr las menores desviaciones y el DNS en caliente y el mtodo de Eynon mostraron las mayores desviaciones. Se comprob que de manera general a medida que disminuye el Brix del jugo mezclado las desviaciones para los tres mtodos ensayados son menores. Tambin los valores de concentracin de azcares reductores totales en g/100 ml tienden a acercarse al valor del Brix ensayado. Esta
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tendencia se reporta por el MACU para soluciones puras de sacarosa, a medida que estas soluciones son ms diluidas la concordancia Brix-g/100 ml de sacarosa es mayor. El aumento de la concentracin de sacarosa en los jugos influye directamente en la densidad del jugo, alejando progresivamente los valores de concentracin de azcares reductores en g/ 100 ml del valor del Brix ensayado. 3.3 Determinacin de azcares reductores totales en soluciones de sacarosa puras Se realiz un estudio de determinacin de azcares reductores totales en soluciones puras de sacarosa. La tabla 2 muestra los resultados obtenidos por los tres mtodos ensayados y la figura 7 las desviaciones obtenidas por los tres mtodos para cada concentracin de sacarosa. Al igual que en los experimentos con jugos de caa mezclados se obtuvo una mayor desviacin en el mtodo del DNS en caliente, utilizando esta metodologa se sobrestima la determinacin de azcares reductores totales en soluciones de sacarosa puras. Se obtuvieron menores desviaciones

para el mtodo de Eynon-Lane, seguido del mtodo del DNS en fro. Este resultado difiere del obtenido en jugos de caa de azcar mezclado donde el mtodo que mostr las menores desviaciones fue el DNS en fro seguido del Eynon- Lane. La presencia de fangos, cenizas y otros contaminantes en los jugos de caa pudiera estar afectando en mayor medida la determinacin de azcares reductores totales por el mtodo de EynonLane. CONCLUSIONES Se estableci un procedimiento para la determinacin de reductores totales en jugos mezclados de caa de azcar por el mtodo del cido 3,5 dinitrosaliclico. Utilizando este procedimiento el DNS en fro mostr menores o comparables desviaciones a las obtenidas cuando la determinacin se realiz por el mtodo de Eynon y Lane. Con el mtodo del DNS en caliente se obtuvieron las mayores desviaciones por lo que no es recomendable su uso para la determinacin de azcares reductores totales en los tipos de sustratos ensayados. El mtodo del DNS en fro mostr altos coeficientes de correlacin g/L de azcares reductores totales vs Brix jugo. Tambin se demostr que el mtodo del DNS en fro es ms productivo que el mtodo tradicional de Eynon-Lane, siendo sta una ventaja importante para la posible inclusin del mismo en la marcha analtica diaria de una destilera de alcohol. Adems, se demostr que los contaminantes presentes en los jugos de caa de azcar afectan, en mayor medida, la determinacin de azcares reductores totales por el mtodo de EynonLane.

Figura 7. Desviacin en la determinacin de azcares reductores totales en g/L para el mtodo del DNS en fro, el DNS en caliente y el mtodo del Eynon-Lane.

Tabla 2. Resultados de la concentracin de azcares reductores totales en g/L por el mtodo de DNS en fro, DNS en caliente y Eynon -Lane C (Sacarosa) g/l 140 120 100 80 60 g/l DNS frio 142,2519913 128,1317886 106,0463432 87,94351919 51,19478639 g/l DNS caliente 162,6101142 144,502447 115,954323 96,7862969 55,02446982 Eynon-Lane 132 121 96 82 63

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Agradecimientos Los autores desean dejar constancia de su gratitud al MSc Reynaldo Fraga y al Dr. Antonio Bell. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 1. Manual de tcnicas analticas, ICIDCA,1974. 2. Biart J. R, Manual de Tcnicas analticas de las plantas de Levadura, ICIDCA ,1976. 3. Catlogo de Normas Cubanas, NC 81-42: 88, 2004 4. International Commission of Unified Methods of Sugar Analysis (ICUMSA), Methods Book, 2005. 5. Lane J. H., Eynon L., Int. Sug. J. 25, 143, 1923.

6. Sumner J. B., J. Biol. Chem. 47, 5, 1921. 7. Sumner J. B., J. Biol. Chem. 62, 287, 1924. 8. Sumner J. B., J. Biol. Chem. 65, 393, 1925. 9. Sumner J. B. y Sisler E. B., Arch. Biochem 4, 333, 1944. 10. Miller G. L., Anal. Chem. 31, 426, 1959. 11. Rivers D. B., Granchek S. J., Woodfoord L.C. y Emert G. H., Biotechnol. and Bioeng. 26, 800, 1984. 12. Otero M. A. y colaboradores, Limitaciones del mtodo del cido 3,5 DNS en mieles finales, Revista ICIDCA No 1, XX, 1986. 13. Manual analtico para el Control Unificado (MACU) de alcohol y levadura Sacharomyces. Control analtico Parte 1, Cuba, 1975.

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