Biochimie Protides

PCEM 1 Biochimie : Protides Année Universitaire 2008-2009
Prof. Sylvain Lehmann 1.1

Laboratoire de Biochimie Hôpital St Eloi / Institut de Génétique Humaine du CNRS
Biochimie.Lehmann@worldonline.fr
COURS PROTIDES (9h)

GÉNÉRALITÉS SUR LES PROTIDES
ACIDES AMINÉS PROTEINOGÈNES
STRUCTURE GÉNÉRALE & ABRÉVIATIONS
PROPRIÉTÉS et APPROCHES ANALYTIQUES
DERIVÉS DES AA
MODIFICATIONS POST-TRADUCTIONELLES
PEPTIDES ET PROTÉINES
STRUCTURES 1, 2, 3, 4
EXEMPLES DE PEPTIDES et APPROCHES ANALYTIQUES
EXEMPLES DE PROTÉINES et APPROCHES ANALYTIQUES
Nouveauté 2008-2009
approches analytiques (méthodes) inclues dans le corps du cours
POLY: www.med.univ-montp1.fr Æ (rubrique enseignement)
1.1
BIOCHIMIE
Définition: La biochimie est une science expérimentale qui vise
l'étude des processus chimiques à la base de la vie.
Place de la biochimie : Fait le lien entre l’inanimé (physique, chimie)
et la vie (cellule, organisme)
Place des protides Définition : Les protides

constituent un ensemble de
Matière vivante
Æ De l’eau molécules comprenant les acides
Æ Des éléments minéraux aminés (AA) naturels et les
(Ca, P, K, Na / Cu, Fe, Mn, I) composés formés par l'union de
Æ Constituants organiques ces aminoacides, tels que les
1) Les protides (protéines) peptides (<50AA et/ou <10kDA) et
2) Les glucides (sucres)
les protéines (>=50AA et/ou
3) Les lipides (graisses) >=10kDa).
Rôles et fonctions : 1.2

Æ Structure: souvent protéines fibreuses (collagène, kératine)
Æ Enzymatique : protéines qui catalysent : enzymes.
Æ Transport intracellulaire / Mouvement: déplacement des organelles
intracellulaires, ou macroscopique (actine, myosine).
Æ Stockage / transport de molécules : (hémoglobine, céruléoplasmine).
Æ Communication / Hormones: signalisation cellulaire :kinases, hormones
peptidiques : insuline, neurotransmetteur 2.
Æ Autres fonctions…
Matériel Génétique (ADN)
Acides aminés protéinogènes ⇓
Transcription
en ARN messagers (codon)
Participent directement à la ⇓
traduction, sont incorporés dans Traduction en acides
les peptides et les protéines à aminées, protéines, peptides
ce niveau grâce à des ARNt. ⇓
20 AA classiques Modifications
2 AA « exotiques » post-traductionelles
Les 22 AA sont constitués d’atomes de C, O, H, N, S et de Se.
(carbone, oxygène, hydrogène, azote, soufre, sélénium).
Octobre 2008 Lipcom

S. Lehmann Page 1 Faculté de Médecine Montpellier-Nîmes
Structure générale des AA 2.1
Fonction
Å carboxylique Æ O O
C
Fonction amine Æ H 3N C H
Å Chaîne latérale Æ R
CHO COO
HO C H H3N C H
CH2OH R
L-Glycéraldéhyde L-α-aminoacides
Structure générale et noenclature des AA 2.1
COOH | COOH
⏐ | ⏐
H2N-C*-H | H-C*-NH2
⏐ | ⏐
R | R
Série L | Série D
H H
C C
NH2 NH2
CH3 CH3
COOH HOOC
2.2
Alanine------------------Ala A
Abbreviation Arginine----------------Arg R (aRginine)
des 20 AA Acide Aspartique--Asp D (proche de A)
Asparagine -----------Asn N
2 AA “exotiques”
Cystéine ---------------Cys C
Sélénocystéine
Acide Glutamique -Glu E (proche de G)
(Sec, U)
Glutamine -------------Gln Q (Q-lutamine)
glutathione
Glycine -----------------Gly G
peroxydase
Histidine --------------His H
Isoleucine ------------Ile I
Pyrrolysine
Leucine -----------------Leu L
methyltransferase
Lysine -------------------Lys K (proche de L)
Méthionine -----------Met M
Phénylalanine --------Phe F (F-enylalanine)
Proline ------------------Pro P
Serine ------------------Ser S
Threonine ------------Thr T
Tryptophane --------Trp W (double cycle)
Tyrosine --------------Tyr Y (tYrosine)
Valine -------------------Val V
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pKa,
pKa, Sym Sym pH
3 let Nom Formule pKb R Classe Hydro
Nom Formule pKb pHi R Classe Hydro 3 let. 1 let. i
1 let. pKr
pKr
Phényl- 2,20
~ non
Alanine 2,35 alanine Phe F 9,31 aromat -phobe
Ala non 5,5 polaire
9,87 ~6 -phobe /
A polaire
/
Proline 1,95
Arginine 1,82 ~ non
Arg polaire Pro P 10,64
8,99 ~ 11 basique -phile 6,5 polaire
R chargé /
12,48
Sérine 2,19 polaire

Acide 1,99 Ser S 9,21 ~6 non phosph
Asp polaire
Aspartique 9,90 ~3 acide -phile / chargé
D chargé
3,90
Thréonine 2,09 polaire

Asparagine 2,14 polaire Thr T 9,10 ~6 non phosph
Asn
8,72 ~ 5,5 non -phile / chargé
N
/ chargé
Trypto- 2,46 ~6
Cystéine 1,93 polaire non
Cys phane Trp W 9,41 aromat -phobe
8,37 ~5 non soufré polaire
C /
10,70 chargé
Acide 2,10 Tyrosine 2,20 polaire

Glu polaire aromat
Glutamique 9,47 ~3 acide -phile Tyr Y 9,21 ~6 non
E chargé phosph
4,07 10,46 chargé
Glutamine 2,17 polaire 2,29

Gln Valine
8,72 ~6 non -phile 9,74 non
Q Val V ~6 ramifié -phobe
/ chargé / polaire
Glycine 2,35
Gly non
9,78 ~6
G
/
polaire Les AA peuvent être classés de multiples façons comme rapporté ci-dessous :
1. Avec un hydroxyle : S, T, Y
Histidine
1,80
His polaire
2. Polaire / hydrophile : N, Q, S, T, K, R, H, D, E, (C, Y)*
9,33 ~ 7,5 basique
H chargé
6,04
Non-polaire / hydrophobe (G), A, V, L, I, P, Y, F, W, M, C
3. Soufré : C, M
4. Chargé négativement (acide) à pH neutre : D, E, (C)
Isoleucine 2,32
Ile non
9,74 ~6 ramifié -phobe
Chargé positivement (basique) à pH neutre : K, R, (H)
I polaire
/
5. Ionisable : D, E, H, C, Y, K, R
Leucine 2,33 6. Aromatique avec absorption significative à 280 nm : F, W, Y
Leu non
L
9,74 ~6
polaire
ramifié -phobe 7. Aliphatique : G, A, V, L, I, P*
/
8. Ramifié: V, I, L
Lysine 2,16 9. Forme des ponts disulfures (covalents) : C
Lys polaire
K
9,06 ~ 10
chargé
basique -phile 10. Cyclique : P (amine secondaire)
10,54
11. Essentiel: H, L, T, K, W, F, V, M, I (His, Leu, Thr, Lys, Trp, Phe, Val, Met,
Méthionine 2,13 Ile)
Met non
9,28 ~6 soufré -phobe
M polaire
/
* Remarque: AA entre parenthèse qui possède la propriété indiquée que de façon
limitée.
Classification des acides aminés 2.2
20 AA classiques 2 AA « exotiques »
à chaîne latérale Æ sélénocystéine
Æ non polaires (9) Æ pyrrolysine
Æ polaires non chargées (6)
Æ polaires chargées (5)
Acides aminés à chaîne latérale non polaire (9)
Acides aminés à chaîne latérale non polaire (9) 2.3
5
6
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Acides aminés à chaîne latérale non polaire (9) 2.3
AA à chaînes latérales polaires non chargées (6) 2.4
1
2
3
4
AA à chaînes latérales polaires non chargées (6) 2.4
6
5
AA à chaînes latérales polaires chargées (5) 2.5
1 2
Octobre 2008 Lipcom

AA à chaînes latérales polaires chargées (5) 2.5
Classification des acides aminés

Les AA peuvent être classés de multiples façons comme rapporté ci-
dessous :
3. Soufré : C, M
6. Aromatique avec absorption significative à 280 nm : F, W, Y
7. Aliphatique : G, A, V, L, I, P*
9. Forme des ponts disulfures (covalents) : C
10. Cyclique : P (amine secondaire)
11. Essentiel: H, L, T, K, W, F, V, M, I (His, Leu, Thr, Lys, Trp, Phe, Val, Met, Ile)
12. Amidifié: Q et N
* Remarque: AA entre parenthèse qui possède la propriété indiquée que de façon limitée.
2 AA « exotiques » 2.6
Sélénocystéine (Sec, U) Pyrrolysine
Æglutathione peroxydase
2.7.1
Acides aminés essentiels (9)
Lysine et Tryptophane
2.7.2
Propriétés d’absorbance
Le tryptophane (W) et dans une moindre mesure la
tyrosine (Y) et la phénylalanine (F) absorbent
fortement dans l'UV à 280 nm
Æ Utilisation du rapport des absorbances

260nm (ac. nucléiques) /280nm (protéines)
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2.7.2
Dosage des protéines par méthode spectrophotométrique
¾ Absorption à 280 nm: AA aromatiques
Une solution contenant 1 mg de protéines/mL à une

A280 de l'ordre de 0,5 à 2,0
Les avantages de cette méthode sont sa relativement bonne sensibilité

(50-100 ug), sa simplicité et sa rapidité d'exécution.
2.7.2
Dosage des protéines par méthode spectrophotométrique
¾ Absorption à 280 nm: AA aromatiques
Loi de Beer- Lambert ε: coefficient d'extinction molaire

C : concentration molaire
l : longueur de la cuve contenant la solution
A est proportionnelle à la concentration C
Propriétés oxydo-réductrices, dosage protéines 2.7.3

Rôle dans les réactions éponymes au cours de laquelle une molécule est
oxydée (agent réducteur) et une autre est réduite (agent oxydant).
Utilisation pour le dosages des protéines: méthode du Biuret et de
Lowry (Biuret + Folin) et au BCA (ac. bicinchonique)
Cuivre 2+ Æ cuivre 1+ Æ BCA
Les ions Cu2+ (ajoutés sous forme de sulfate de cuivre) se lient aux atomes
d’azote des liens peptidiques de la protéine dans des conditions de pH
alcalin, produisant ainsi un complexe de couleur mauve avec absorption
maximale à 540-550 nm.
Biuret est peu sensible (1-20 mg/L), méthode Lowry est une
amélioration par ajout réactif de Folin (utilisé pour le dosage des
phénols), plus sensible (100 fois + Biuret, elle peut mesurer 5-10 µg/l).
Souvent problème avec interférents comme le saccharose, le tris, le

glycérol, etc. Æ BCA moins sujet aux interférence et aussi sensible.
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Propriétés ioniques des AA 2.7.4
Cationique Zwitterionique Anionique
Il se comportent en solution physiologique comme des

acides faibles ou des bases faibles
HA Æ A- + H+
(acide) (base conjuguée)
[A-][H+]
on défini la constante d’ionisation : Ka = —————
[AH]
Propriétés ioniques des AA Ka [AH]

2.7.4
Isolons le paramètre [H+]: [H+] = —————
[A-]
Prenons le logarithme:
log10 [H+] = log10 Ka + log10 ([AH] / [A-])
Ou log (1 / [H+]) = log (1 / Ka) + log ([A-] / [AH])
Or, de même que pH= log (1 / [H+])
le pKa = log (1 / Ka)
Ainsi pH = pKa + log10 ([A-] / [AH])
Équation d’Henderson-Hasselbalch
pour une fonction carboxylique:
pH = pKa + log COO-/COOH

si (COO-) = (COOH) pH= pKa + log (1) = pKa pour une fonction amine:
donc : pKa = pH de 1/2 dissociation pH = pKb + log NH2/NH3+
si (NH2) = (NH3+) pH= pKb + log (1) = pKb
donc : pKb = pH de 1/2 dissociation
100 % - NH3+
50 % -
COOH
0 % -
2 4 7 10 pH
NOTE: (COO-) + (COOH) = 100% = (NH3+) + (NH2)
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Un acide aminé simple, mono-aminé et mono-carboxylique
tel que la glycine (G) : NH2-CH2-COOH

est un diacide dans sa
forme pleinement protonée : NH3(+)-CH2-COOH
Il peut donner deux protons durant

sa titration avec une base :
NH3(+)-CH2-COOH Æ NH3(+)-CH2-COO(-) + H+
NH3(+)-CH2-COO(-) Æ NH2-CH2-COO(-) + H+
PKa dissociation fonction acide -COOH

PKb dissociation fonction basique –NH2
PKR dissociation fonction chaîne latérale
Passe de NH3(+)-CH2-COOH pour pH bas à NH2-CH2-COO(-)
NH2-CH2-COO(-)
NH3(+)-CH2-COOH
pHi=(pKa+pKb)/2
CHARGE GLOBALE DE CET ACIDE AMINÉ
pH 0-1 pKa pHi pKb 12
COOH 0 -0,5 -1 -1 -1
R R R R R R
NH2 +1 +1 +1 +0,5 0
Charge
+1 +0,5 0 -0,5 -1
globale
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pHi=(pKa+pKR)/2
pHi=(pKb+pKR)/2
2.7.5
QUESTION: De la Valine (pKa= 2,3 : pKb=9,7) est mis en
solution à pH 8,8. Quel est le pourcentage de forme anionique
de cet acide aminé dans la solution.
Note, pHi=(pKa+pKb)/2 = (2,3 + 9,7)/2 = 6

On est à plus de 2 unité pH au dessus du pKa donc fonction
carboxylique complètement dissociée en COO- Æ charge -1; par
contre on est proche du pKb donc la fonction amine sera
partiellement dissociée: NH3+ et NH2 coexistent
On sera en présence de deux formes de Valine:
(COO-)—(NH3+) et (COO-)—(NH2)
de charge globale respective 0 et -1.
C’est cette dernière forme (-1) qui est la forme anionique qui va
vers l’anode (+)…
Octobre 2008
2.7.5
Pour la dissociation de la fonction amine on utilise la relation
suivante: pH = pKb + log NH2/NH3+
Æ 8,8 = 9,7 + log NH2/NH3+
Æ log NH2/NH3+ = - 0,9

Æ NH2/NH3+ = 0,126 (10-0,9)
or NH2 + NH3+ =100% donc NH3+ = 100% - NH2
Æ NH2/(100-NH2) = 0,126
Æ NH2 = 12,6 – 0,126 NH2
Æ 1,126 x NH2 = 12,6
Æ NH2 = 12,6/1,126 = 11,2 %
pKa (COOH) Æ proche de 2 pKb (NH2) proche de 9
Pour les AA on distingue 3 groupes :
1. les acides aminés acides

D et E: pHi voisin de 3, calcul pHi=(pKa+pKR)/2
(rq Cystéine pHi voisin de 5)
2. les acides aminés basiques

K, R: pHi voisins de 10-11 et H: pHi voisin de 8
pHi=(pKb+pKR)/2
3.les acides aminés neutres

soient tous les autres: pHi voisin de 6
pHi=(pKa+pKb)/2
Séparation d’AA (chromatographie sur papier) 2.7.6
A pH neutre, on peut séparer un mélange de R + A + E

(Arginine+Alanine+Ac Glutamique=Glutamate).
R migre vers la cathode, E vers l'anode, A ne se déplace pas.
Å R A E Æ
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Chromatographie sur colonne 2.7.6
¾la charge électrique : dans la chromatographie par échange

d'ions
¾la taille, la forme : dans la chromatographie d'exclusion
¾ la polarité : dans la chromatographie en hydrophobe
¾ la présence de groupements d'atomes formant des sites
particuliers : dans la chromatographie d'affinité
Chromatographie 2.7.6
Groupements sulphonique ou carboxyliques
Chromatographie 2.7.6
Groupements diéthyl-amino-éthyl
ou DEAE
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Propriétés d’hydrophobicité des AA 2.7.7
Polaire / hydrophile : N, Q, S, T, K, R, H, D, E, (C, Y)
Chromatographie de partage (plaque) 2.7.7
Chromatographie liquide haute 2.7.7

performance (HPLC)
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
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2.8.1
Histamine
Histidine H
decarboxylase N CH2 CH2 NH2
Histidine CO2
N
Histamine
Histamine:
• Synthétisée par les mastocytes
Médiateur de la réponse allergique:
vasodilatation, bronchoconstriction (récepteur H1)
• bloqueur H1: Loratidine (Clarityne®)
Stimule la sécrétion acide au niveau de l’estomac (récepteur H2)

• bloqueur H2 : Cimetidine (Tagamet®)
Sérotonine 2.8.2
Trp
hydroxylase
Decarboxylase
O2
Tryptophane 5-Hydroxy- CO2 5-Hydroxy-

(Trp) tryptophane tryptamine (5-HT);
Sérotonine
Sérotonine formée au niveau:
• du cerveau: neurotransmetteur impliqué dans
la régulation du sommeil, de l’humeur, de
l’appétit (anti-dépresseur Prozac®, drogue
hallucinogène LSD agoniste, sérotoninérgique)
• plaquettes (agrégation, effet vasoconstricteur)
• gastro-intestinal, cellules entéro-chromaffine. (contraction

muscles lisses, effet émétique certaines chimiothérapie anti-
cancéreuses)
Mélatonine 2.8.3
CH2 CH2 NHCOCH3

Acétylation H3CO
Méthylation
N
5-Hydroxy- N-acétyl- H
tryptamine (5-HT); 5-methoxytryptamine
Sérotonine Mélatonine
Mélatonine (N-acétyl-5-methoxytryptamine):
• Formée principalement au niveau de l’épiphyse
(glande pinéale)
• Sa synthèse sous contrôle en partie de la
lumière (variations nycthémérales, pic 1h-3h) et
elle diminue avec l’âge
• Rôle dans l’endormissement, effet sur la
sécrétion d’autres hormones (Gn-RH)
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Catécholamines 2.8.4
Dopamine
Dopamine
Tyrosine CO2 hydroxylase
Epinephrine
(Adrénaline)
Tyr L-DOPA
décarboxylase
hydroxylase
L-DOPA Norépinephrine Méthyl
transferase
(Noradrénaline)
Dopamine et maladie de Parkinson

Sang Cerveau
L-DOPA L-DOPA Dopamine
Dopamine La maladie de Parkinson est

associée à une diminution de la
dopamine cérébrale par la perte
de neurones dopaminergiques
Barrière hémato-encéphalique
Tyramine 2.8.5
Tyrosine
HO CO2 HO Tyramine
NH3 + NH3 +
CH2 CHCO2 - CHCO
CH2 CH -
2 NH22
2.8.6 MAO OH
Glutamate de Sodium
(MSG, Mono-Sodium Glutamate)
2.8.7 Taurine CH2 CHO
(acide 2-amino-
ethane-
sulfonique)
Peptides et protéines 3.
Æ enchaînement séquentiel et linéaire d’AA
Æ en général peptide < 50 AA, < 10 000 Da
Complexité +++
une chaîne polypeptidique de 100 résidus d‘AA classiques
20100 = 1.27x10130 variantes possibles
(le nombre d'atomes dans l'univers est estimé à environ 1080)
Æ Il existe dans les protéines natives (protéines dans leur
conformation fonctionnelle) quatre niveaux de structure.
Structure primaire 3.1

Liaison peptidique
Octobre 2008

Tetrapeptide Ala O Tyr O Asp O Gly O
Æ AYDG H H H
H3N CH C N CH C N CH C N CH C O
Ordre
CH3 CH2 CH2 H
N-terminal Æ C-terminal C O
O
Alanyl-tyrosyl-aspartyl-glycine
OH
Liaison peptidique Mais:

Rompue par hydrolyse acide W (tryptophane) Æ détruit
N (asparagine) Æ D
HCl 6N (normale= conc.) Q (glutamine) Æ E
à 110°C / 24h,
Note: W pourra être dosé après
étude de la composition en AA une hydrolyse alcaline
Notion d’épitope et
chromatographie d'affinité
Structure primaire: pont disulfure 3.1

Inter-caténaire
Cystéine
N-
-C
S
|
S
N-
-C
Intra-caténaire
-C
N-
Cystéine
S-S
Agent réducteur
β-mercaptoéthanol
Octobre 2008
Propriétés géométriques de la liaison peptidique 3.2.1
Structure secondaire 3.2.2

1) résidus proline (liaison en cis)
2) encombrement stérique des groupement latéraux
3) les liaisons hydrogènes impliquant (N-H) (C=O)
4) les interactions électrostatiques AA chargés
L’hélice α 3.2.3
- l'angle formé par les plans
successifs de 2 liaisons
chaque résidu
peptidiques est de 100°
occupe sur
l'axe de
l'hélice une
longueur de
0,15 nm
- le pas de l’hélice
est de 0,54 nm
Structure secondaire 3.2.3
Hélice de polyproline
Hélice gauche et droite
Octobre 2008
Structure secondaire: feuillet bêta 3.2.3

Feuillet β
Parallèle
Anti-parallèle
Structure secondaire: coude bêta 3.2.3
Coude β associé à un Feuillet β anti-parallèle
2 1
-C
-N
3 4
Méthodes biophysiques d’étude des structures 3.2.4

secondaires
Dichroïsme
circulaire
et
spectrométrie IR
Octobre 2008
Structure tertiaire: forces 3.3.1
Liaison de Interaction Interaction

coordination hydrophobes électrostatique
hélice feuillet Pont S-S Liaison H
Méthodes biophysiques d’étude des structures 3.3.2

tertiaires
RMN ou « résonance magnétique nucléaire »
Cristallographie (diffraction des rayons X)
Structure tertiaire: repliements 3.3.3
Chaîne d’AA
Etat final
Etats intermédiaires (plus basse énergie)
Octobre 2008
Structure tertiaire: dénaturation 3.3.4

Tendence à
Repliée l’agrégation
Dépliée / dénaturée
Agent
dénaturant
Agents dénaturants
1. la chaleur 2. des pH extrêmes Partie hydrophile
3. des solvants miscibles (alcool, acétone) Partie hydrophobe
4. des agents chaotropiques (urée, guanidinium)
5. des détergents: anioniques (dodécylsulfate de Na: SDS), cationiques,
zwitterioniques, non ioniques (Triton).
Protéines dénaturées Protéines dénaturées

Protéines natives
Forme linéaire instable stabilisées
Repliement
physiologique
SDS
sarkosyl
Mécanismes d’aggrégation des protéines 3.3.5

¾ aggrégation et précipitation :
¾ par les sels (sulfate d'ammonium)
¾ par les solvants organiques (éthanol..)
¾ par le pH et la température
Séparation des protéines agrégées 3.3.6

¾ Centrifugation :
Soumis force centrifuge
dans un rotor (en g)
Séparation des constituants d’un mélange 3.3.7
¾ Dialyse :
Permet de séparer des molécules (peptides, protéines,
détergent, sels…) en fonction de leur passage à travers une
membrane avec des pores de d’un diamètre précis, définit
« cut-off » par expl 10kDa..)
Octobre 2008
Structure quaternaire 3.4.1
Ag
en tr
éd
uct
eur
3.4.2
Etude par
électrophorèse
Electrophorèse 3.4.3
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
kDa
100-
80-
60-
40-
20-
Non dénaturant Dénaturant Dénaturant+Réducteur
Octobre 2008
Electrophorèse bidimentionelle 3.4.4

Isoelectrophocalisation (IEF)
Gel
d’électrophorèse
en condition
dénaturante
(SDS + agent
réducteur)
Coloration des protéines, détection et dosage 3.4.4
¾Méthodes basées sur des colorants:

¾ Méthode au Bleu de Coomassie (Bradford)
¾ Méthode au nitrate d’argent
Un colorant, le Coomassie Brilliant Blue G-250,

est mis en contact avec les protéines dans des
conditions de pH acide.
Le Coomassie se lie à la
protéine par des interactions
non-covalentes et sa longueur
d’absorption est modifiée.
Electrophorèse bidimentionelle 3.4.4
Octobre 2008
2D et protéomique 3.4.5
Le protéome représente l’ensemble des protéines
présentes dans un échantillon (prélèvement biologique,
cellule, tissu) à un moment donné et dans des conditions
déterminées. Son étude est appelé « protéomique »
Modifications post-traductionnelles 4.1
Acétylation
Réalisée par des acétyltransférases, réversible par action des déacétylases

Hydroxylation
Phosphorylation 4.3
Sérine
Ser S
Thréonine
Thr T
Tyrosine
Tyr Y
Octobre 2008
Glycosylation O-glycannes
(Sérine ou Thréonine)
N-glycannes
(Asparagine)
Séquences consensus
N-X-T et N-X-S
Ancres lipidiques 4.5
Myristoylation (AG C14, Gly N-ter) et
Palmitoylation (AG C16, Cys non terminale)
Ancrage GPI Glycosyl-

phosphatidylinositol
Clivages: Hydrolyse spécifique des liaisons peptidiques rôle dans

la maturation protéolytique des peptides et des protéines
N- -C
Aminopeptidase Carboxypeptidase
Endopeptidases
La Trypsine clive après les AA basique Lys (K) et Arg (R)

(l'AA suivant ne doit pas être une Proline)
La Chymotrypsine clive après les AA aromatiques (Phe, Tyr & Trp) (F, Y, W)
(l'AA suivant ne doit pas être une Proline)
Le Bromure de Cyanogène (CNBr) coupe après les AAs Méthionine
Composition en acide aminés, séquence 4.7

Méthode des peptide de recouvrements
F W M G A K L P M D G R C A Q
Trypsine : C-A-Q / L-P-M-D-G-R / F-W-M-G-A-K

CNBr : F-W-M / G-A-K-L-P-M / D-G-R-C-A-Q
Reconstitution de la séquence complète du peptide
L-P-M-D-G-R
G-A-K-L-P-M
F-W-M-G-A-K D-G-R-C-A-Q
F-W-M C-A-Q
Octobre 2008
Clivage et étude de la séquence 4.8
848.48513
1026.61519
1268.71465
1281.60208
1297.79948
1409.74764
1487.85573 Cartographie
par
1491.74501
1495.7968
spectrométrie
1505.74487
1566.73863
de masse
1768.91273
1814.9665
1821.01482
1830.96716
1857.98773
2096.12865
2270.15522
Méthodes biophysiques de détection des peptides 4.8

Spectrométrie de masse
30000
Source
748.34
Vide + champ électrique
détecteur
25000
d’ionisation mesure du temps de vol
20000
1606.74
1853.94
1271.48
15000 1502.49
1981.85
684.27
10000 1378.73 1885.17
650.25
672.21
603.24 735.38 1815.69
941.36 1518.39 2003.63
1231.37 1906.6
2110.34
5000 884.32
0
600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200
Concentration, purification 4.9
¾ Lyophilisation: sublimation de l’eau

Æ concentration
¾ Filtration et ultrafiltration:
Æ concentration, purification
1) Filtration avec des petites

capsules qui sont montées sur
des seringues (type Millipore).
2) Ultrafiltration: Il s'agit de
filtrer sous pression d'air un
liquide à travers une membrane
avec des pores tellement petits
que les macromolécules seront
retenus sur la membrane.
Octobre 2008
• Purification = séparation de constituants (peptides et protéines) les uns par

rapport aux autres (selon différents critères biochimiques: poids, solubilité…)
• Concentration : Augmentation de la concentration de constituants (peptides et
protéines) par réduction du volume de tampon.
Méthode pour les peptides et protéines Purification Concentration
Lyophilisation Elimination du tampon (sublimation) NON OUI
Ultrafiltration Elimination des sels et tampons NON OUI
(seuil de coupure < taille peptide)
Filtration (sur Séparation des peptides et OUI OUI pour la
membrane) protéines selon taille des pores partie retenue
(seuil de coupure)
Chromatographies Séparation selon différents OUI NON la plus
(Gel-Filtration, ionique, critères biochimiques part du temps
affinité..)
Dialyse Séparation des peptides et OUI NON
protéines selon taille des pores Mais selon
(seuil de coupure) choix du seuil
Précipitation Séparation soluble/précipité OUI OUI (Culot)

(surnageant/culot)
Centrifugation Séparation selon coefficient de OUI OUI (Culot)
sédimentation (surnageant/culot)
Peptides: 5.1
Aspartame
5.2
Le glutathion ou γ glutamyl-cystéyl-glycine (GSH)
α β γ
HOOC-CH-CH2-CH2-CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOH
⏐ ⏐
NH2 CH2-SH
Glu (E) Cys (C) Gly (G)
Peptides:
5.3
5.4
Ocytocine CYIQNCPLG
Vasopressine CYFQNCPRG
Octobre 2008
Protéines: 6.1
Collagène
Structure primaire
composée principalement
de glycine (1AA/3)
G X Y - G X Y - G X Y ...
X et Y: Proline (1AA/8) et
de l’hydroxyproline
(3- 4-Hyp) (1AA/10).
Æ hélice gauche
s'organise dans une

structure quaternaire en
une super-hélice de pas
droit
Protéines: Immunoglobine G 6.2
Purification par chromatographie d’exclusion 6.3
Octobre 2008
Chromatographie d’exclusion 6.3
Eluant ¾ Volume total colonne

¾ Volume mort (colonne-billes)
¾ Vol élution
Petite
Résine
Protéines: 6.4
Protéines: 6.5
Le précurseur de la protéine amyloïde
Octobre 2008
Protéines: la protéine prion (PrP) 6.6
Structure générale de la PrP

Sites de
liaison au ité
fin
Cuivre af Pont disulfure
S S
Ancre GPI
N-glycannes
1 23 51 90 96 180 183 199 215 231 253
B A B A A
Octapeptides 111/112
signal signal
Sites de clivage
6.6
Alignements des séquences protéiques des PrP humaine et bovine
10 20 30- 40
Hum --MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGG-WNTGGSRYPGQGSPGGNR
Bov MVKSHI,S,I,,,,,,M,,,V,,,,,,,,,,,G,,,,,,,,,,,,,,,,,,
50 -------- 60 70 80 - 90
YPPQGGG--------GWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHG-GGWGQGGGTHS
,,,,,,,GWGQPHGG,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,G,,,,,,,-T,G
100 10 120 130 140

QWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYED
,,,,,,,,,,,,,,V,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,L,,,,,,,,,
150 160 170 180 190

RYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGEN231
,,,,,,,,,,,,,,,,,,V,Q,,,,,,,,,,,,,,,V,E,,,,,,,,,,,242
200 210 220 230 240 250

FTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG
,,,,,I,,,,,,,,,,,,,,,Q,,,,,,,,,A,VI,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,
Biochimie et biologie
moléculaire
Pour les sciences de la vie

et de la santé
Ed. Bernard Sablonnière
Omniscience
Octobre 2008
pKa,
pKa, Sym Sym pH
3 let Nom Formule pKb R Classe Hydro
Nom Formule pKb pHi R Classe Hydro 3 let. 1 let. i
1 let. pKr
pKr
Phényl- 2,20
~ non
Alanine 2,35 alanine Phe F 9,31 aromat -phobe
Ala non 5,5 polaire
9,87 ~6 -phobe /
A polaire
/
Proline 1,95
Arginine 1,82 ~ non
Arg polaire Pro P 10,64
8,99 ~ 11 basique -phile 6,5 polaire
R chargé /
12,48
Sérine 2,19 polaire

Acide 1,99 Ser S 9,21 ~6 non phosph
Asp polaire
Aspartique 9,90 ~3 acide -phile / chargé
D chargé
3,90
Thréonine 2,09 polaire

Asparagine 2,14 polaire Thr T 9,10 ~6 non phosph
Asn
8,72 ~ 5,5 non -phile / chargé
N
/ chargé
Trypto- 2,46 ~6
Cystéine 1,93 polaire non
Cys phane Trp W 9,41 aromat -phobe
8,37 ~5 non soufré polaire
C /
10,70 chargé
Acide 2,10 Tyrosine 2,20 polaire

Glu polaire aromat
Glutamique 9,47 ~3 acide -phile Tyr Y 9,21 ~6 non
E chargé phosph
4,07 10,46 chargé
Glutamine 2,17 polaire 2,29

Gln Valine
8,72 ~6 non -phile 9,74 non
Q Val V ~6 ramifié -phobe
/ chargé / polaire
Glycine 2,35
Gly non
9,78 ~6
G
/
polaire Les AA peuvent être classés de multiples façons comme rapporté ci-dessous :
Histidine
1,80
His polaire
9,33 ~ 7,5 basique
H chargé
6,04
3. Soufré : C, M
Isoleucine 2,32
Ile non
9,74 ~6 ramifié -phobe
I polaire
/
Leucine 2,33 6. Aromatique avec absorption significative à 280 nm : F, W, Y
Leu non
L
9,74 ~6
polaire
ramifié -phobe 7. Aliphatique : G, A, V, L, I, P*
/
Lysine 2,16 9. Forme des ponts disulfures (covalents) : C
Lys polaire
K
9,06 ~ 10
chargé
basique -phile 10. Cyclique : P (amine secondaire)
10,54
11. Essentiel: H, L, T, K, W, F, V, M, I (His, Leu, Thr, Lys, Trp, Phe, Val, Met,
Méthionine 2,13 Ile)
Met non
9,28 ~6 soufré -phobe
M polaire
/
* Remarque: AA entre parenthèse qui possède la propriété indiquée que de façon
limitée.
Octobre 2008
S. Lehmann Faculté de Médecine Montpellier-Nîmes
NH2-CH2-COO(-)
NH3(+)-CH2-COOH
pHi=(pKa+pKb)/2
Octobre 2008
pHi=(pKa+pKR)/2
Octobre 2008
pHi=(pKb+pKR)/2
Octobre 2008
Electrophorèse 3.4.3
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
kDa
100-
80-
60-
40-
20-
Non dénaturant Dénaturant Dénaturant+Réducteur
Octobre 2008
• Purification = séparation de constituants (peptides et protéines) les uns par

rapport aux autres (selon différents critères biochimiques: poids, solubilité…)
• Concentration : Augmentation de la concentration de constituants (peptides et
protéines) par réduction du volume de tampon.
Méthode pour les peptides et protéines Purification Concentration
Lyophilisation Elimination du tampon (sublimation) NON OUI
Ultrafiltration Elimination des sels et tampons NON OUI
(seuil de coupure < taille peptide)
Filtration (sur Séparation des peptides et OUI OUI pour la
membrane) protéines selon taille des pores partie retenue
(seuil de coupure)
Chromatographies Séparation selon différents OUI NON la plus
(Gel-Filtration, ionique, critères biochimiques part du temps
affinité..)
Dialyse Séparation des peptides et OUI NON
protéines selon taille des pores Mais selon
(seuil de coupure) choix du seuil
Précipitation Séparation soluble/précipité OUI OUI (Culot)

(surnageant/culot)
Centrifugation Séparation selon coefficient de OUI OUI (Culot)
sédimentation (surnageant/culot)
Octobre 2008
Protéines: la protéine prion (PrP) 6.6
Structure générale de la PrP

Sites de
liaison au n ité
f i
Cuivre af Pont disulfure
S S
Ancre GPI
N-glycannes
1 23 51 90 96 180 183 199 215 231 253
B A B A A
Octapeptides 111/112
signal signal
Sites de clivage
Octobre 2008

Biochimie Protides

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PCEM 1 Biochimie : Protides Année Universitaire 2008-2009

Prof. Sylvain Lehmann 1.1

COURS PROTIDES (9h)

POLY: www.med.univ-montp1.fr Æ (rubrique enseignement)

Place des protides Définition : Les protides

Rôles et fonctions : 1.2

Octobre 2008 Lipcom

Structure générale des AA 2.1

Structure générale et noenclature des AA 2.1

Octobre 2008 Lipcom

Sérine 2,19 polaire

Thréonine 2,09 polaire

Acide 2,10 Tyrosine 2,20 polaire

Glutamine 2,17 polaire 2,29

Classification des acides aminés 2.2

Acides aminés à chaîne latérale non polaire (9)

Acides aminés à chaîne latérale non polaire (9) 2.3

Octobre 2008 Lipcom

Acides aminés à chaîne latérale non polaire (9) 2.3

AA à chaînes latérales polaires non chargées (6) 2.4

AA à chaînes latérales polaires non chargées (6) 2.4

Octobre 2008 Lipcom

AA à chaînes latérales polaires chargées (5) 2.5

Classification des acides aminés

Æ Utilisation du rapport des absorbances

Octobre 2008 Lipcom

¾ Absorption à 280 nm: AA aromatiques

Une solution contenant 1 mg de protéines/mL à une

Les avantages de cette méthode sont sa relativement bonne sensibilité

¾ Absorption à 280 nm: AA aromatiques

Loi de Beer- Lambert ε: coefficient d'extinction molaire

A est proportionnelle à la concentration C

Propriétés oxydo-réductrices, dosage protéines 2.7.3

Souvent problème avec interférents comme le saccharose, le tris, le

Octobre 2008 Lipcom

Propriétés ioniques des AA 2.7.4

Cationique Zwitterionique Anionique

Il se comportent en solution physiologique comme des

Propriétés ioniques des AA Ka [AH]

Ou log (1 / [H+]) = log (1 / Ka) + log ([A-] / [AH])

Or, de même que pH= log (1 / [H+])

le pKa = log (1 / Ka)

Ainsi pH = pKa + log10 ([A-] / [AH])

pH = pKa + log COO-/COOH

si (NH2) = (NH3+) pH= pKb + log (1) = pKb

donc : pKb = pH de 1/2 dissociation

Propriétés ioniques des AA 2.7.4

NOTE: (COO-) + (COOH) = 100% = (NH3+) + (NH2)

Octobre 2008 Lipcom

Propriétés ioniques des AA 2.7.4

Un acide aminé simple, mono-aminé et mono-carboxylique

tel que la glycine (G) : NH2-CH2-COOH

Il peut donner deux protons durant

PKa dissociation fonction acide -COOH

Propriétés ioniques des AA 2.7.4

Propriétés ioniques des AA 2.7.4

CHARGE GLOBALE DE CET ACIDE AMINÉ

pH 0-1 pKa pHi pKb 12

Octobre 2008 Lipcom

Propriétés ioniques des AA 2.7.4

Propriétés ioniques des AA 2.7.4

Note, pHi=(pKa+pKb)/2 = (2,3 + 9,7)/2 = 6

On sera en présence de deux formes de Valine: