TEHNICI DE COLORARE IN BIOLOGIA CELULARA

Colorarea este una dintre etapele principale in cursul efectuarii unui preparat microscopic. Prin colorare se urmareste cresterea contrastului dintre diferitele componente tisulare prin modificarea indicilor de refractie ai substratului morfologic cu ajutorul colorantilor . Colorarea are rolul de a evidentia componentele celulare sau tisulare in scopul studiului studiului citologic si histologic al acestora. Din acest motiv se utilizeaza coloranti care au afinitate pentru o anumita structura tisulara sau celulara.

 Tehnica de colorare depinde de natura fixatorului utilizat si de tesutul pe care dorim sa il examinam. Substantele folosite pentru colorare se numesc coloranti.
COLORANTUL HISTOLOGIC Este o substanta chimica colorata de obicei de natura organica care poate intra in celula atasandu-se la nielul componentelor celulare si permitand astel diferentierea lor optica. In molecula unui colorant se pot identifica una sau mai multe grupari cromofore - purtatoare de culoare grupari auxocrome capacitatea de a colora

CLASIFICAREA COLORANTILOR

1. Dupa natura lor a. Naturali i. vegetali : hematoxilina ,safranina , orceina , turnesolul ii. animali :carminul b. Sintetici : albastru de metil 2. Dupa caracterele chimice a. Acizi sunt de obicei saruri de acizi organici , unde gruparea auxocroma principala este incarcata electric negativ. El se ataseaza pe un substrat morfologic incarcat electric pozitiv b. Bazici gruparea auxocroma principala incarcata electric pozitiv , deci se a atasa pe un substrat morfologic negativ c. Neutri grupari auxocrome principale incarcate eletric pozitiv si negativ , ei fiind solutii apoase de coloranti bazici si acizi intr-o anumita proportie.

ETAPELE COLORARII
1. deparafinarea Se realizeaza cu solventi de tipul hidrocarburilor benzenice. Pentru aceasta se trec preparatele prin 3 bai succesive de 2-5 min. in functie de solubilitatea parafinei , de grosimea , de temperatura preparatului 2. hidratare eliminarea solventilor parafinei facand astfel posibila colorarea. In acest scop se trece sectiunea prin 3 bai succesive fiecare cu alcool etilic sau metilic in concentratii descrescande. Daca solutia de colorare este apoasa se trece in continuare sectiunea in apa distilata. 3. colorarea propriu-zisa - se face cu solutii colorante apoase sau alcoolice . 4. spalare daca sectiunile trebuie sa fie montate intr-un mediu anhidru , pentru indepartarea excesului de colorant si se efectueaza cu apa distilata 5. deshidratare obligatorie pentru majoritatea colorantilor histologici deoarece acestia sunt diluati fie in apa fie in alcool diluat. Se realizeaza cu alcool in concentratie crescanda. 6. clarificare - se face cu xilol fiind necesara pentru indepartarea alcoolului.

METODE DE COLORARE criterii de clasificare

1. Dupa starea materialului pot fi a. Vitale se coloreaza numai celulele vii cu organite in stare vie. Ea persista numai atata timp cat celulele supravietuiesc in vitro. b. Permanente pentru colorarea preparatelor permanente. 2. Dupa nr. de coloranti utilizati : a. Simple foloseste un singur colorant b. Combinate (policroma) se folosesc 2 sau mai multi coloranti 3. Dupa mecanism a. directa rezulta din simplu contact dintre colorant si substrat b. indirecta necesita prezenta unui mediator sau MORDANT , intre colorant si substrat. Acesta fixeaza colorantul de componentele celulare. Complexul format intre colorant si mordant se numeste LAC. 4.Dupa intensitatea colorarii a. progresive se lasa colorantul in contact cu substratul un timp scurt, timp in care se coloreaza numai structurile cu afinitate mare. b. regresive - prin actiunea prelungita a colorantului pana la obtinerea unei supracolorari (se realizeaza o colorare atat a structurilor cu afinitate cat si a celor fara).

In ultimul caz, se actioneaza apoi cu un agent chimic decolorant numit DIFERENTIATOR a carui actiune este oprita prin spalare in momentul in care au ramas colorate numai structurile pe care vrem sa le evidentiem, Prin utilizarea diferntiatorului se pot evidentia structuri care nu pot fii puse in evidenta prin colorarea cu metoda precedenta. Aceasta se explica prin faptul ca diferentiatorul este si mordant. Ex. Coloratia Nissl.

TEHNICA EFECTUARII SECTIUNILOR SI PREPARATELOR MICROSCOPICE PROVIZORII DE MATERIAL VEGETAL

Orice material biologic ce urmeaza a fi studiat le microscop, trebuie pregatit in prealabil pentru a putea fi cercetat. Efectuand sectiuni in diferite planuri ne putem da astfel seama, la analiza sectiunilor, de structura tridimensionala a tesutului respectiv. Majoritatea obiectelor vegetale trebuiesc studiate in sectiuni fine pentru a putea capata transparenta necesara examinarii la microscopul optic. Tipurile de sectionari efectuate asupra materialului biologic pot fi: Transversale Longitudinale Radiare (paralela cu raza) Tangentiale (perpendiculara pe raza)

Tipuri de sectiuni

 In cazul organelor plane, de ex. lamina frunzelor, sectiunile se fac paralel sau perpendicular fata de suprafata organului. Sectiunile se pot face cu un brici (sectiuni de mana) sau cu ajutoril microtomului. Materialul botanic studiat la microscop poate fi folosit in stare proaspata, uscat sau conservat. Materialele botanice trebuie sa prezinte o consistenta potrivita sectionarii asa cum sunt unele materiale in stare proaspata (vie). Obiectul de sectionat se tine intre degetul mare, cel aratator si degetul mijlociu al mainii stangi, iar cu cealalta mana se tine briciul. Pentru a evita tremuratul mainilor se aseaza ambele coate pe masa de lucru. Obiectul de sectionat trebuie sa prezinte in primul rand o suprafata de taiere neteda. Pentru aceasta se sectioneaza cu lama o portiune subtire de la suprafata obiectului. Se realizeaza mai multe sectiuni care se pun in cateva picaturi de apa pe lama de unde pot fi luate cu ajutorul unei pensete sau cu o pensula.

Colorarea sectiunilor
Colorarea este necesara deoarece in sectiunile necolorate, imaginile pe care le da microscopul sunt simple imagini de difractie ale luminii in diversele structuri ale tesuturilor, care nu permit identificarea componentelor tisulare sau celulare (nucleu, citoplasma organite). Peste sectiuni se pun 1-2 picaturi din colorantul respectiv, in care se mentin cateva minute, pana cand sectiunile incep sa capete culoarea corespunzatoare colorantului utilizat.