NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4574
2007-03-21

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS Y ALIMENTOS PARA ANIMALES. MTODO HORIZONTAL PARA LA DETECCIN DE SALMONELLA SPP

E:

MICROBIOLOGY OF FOOD AND ANIMAL FEEDING STUFFS. GENERAL GUIDANCE ON METHODS FOR THE DETECTION OF SALMONELLA SPP

CORRESPONDENCIA:

esta norma es una adopcin modificada (MOD) de la norma ISO 6579:2002 mtodo horizontal, mtodo de anlisis, microbiologa, anlisis microbiolgico, deteccin, Salmonella, alimentacin animal.

DESCRIPTORES:

I.C.S.: 07.100.30
Editada por el Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin (ICONTEC) Apartado 14237 Bogot, D.C. - Tel. (571) 6078888 - Fax (571) 2221435

Prohibida su reproduccin

Primera actualizacin Editada 2007-03-28

PRLOGO

El Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin, ICONTEC, es el organismo nacional de normalizacin, segn el Decreto 2269 de 1993. ICONTEC es una entidad de carcter privado, sin nimo de lucro, cuya Misin es fundamental para brindar soporte y desarrollo al productor y proteccin al consumidor. Colabora con el sector gubernamental y apoya al sector privado del pas, para lograr ventajas competitivas en los mercados interno y externo. La representacin de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalizacin Tcnica est garantizada por los Comits Tcnicos y el perodo de Consulta Pblica, este ltimo caracterizado por la participacin del pblico en general. La NTC 4574 (Primera actualizacin) fue ratificada por el Consejo Directivo de 2007-03-21. Esta norma est sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en todo momento a las necesidades y exigencias actuales. A continuacin se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a travs de su participacin en el Comit Tcnico 25 Microbiologa. ACEGRASAS S.A. ALGARRA S.A. ALIMENTOS POLAR S.A. ALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS. S.A. ARCHIVO DE BOGOT ASEBIOL LABORATORIO LTDA. ASINAL LTDA ASOCIACIN COLOMBIANA DE CIENCIA Y TECNOLOGA ASOCIACIN DE MICROBILOGOS JAVERIANOS BIANLISIS BIOCONTROL LTDA. BIOMERIEUX COLOMBIA BIOQUILAB LTDA. CALIDAD INDUSTRIAL LTDA. CARULLA VIVERO S.A. CERCAL LTDA. COLFRIGOS S.A. COLOMBINA S.A. COMPAA NACIONAL DE CHOCOLATES S.A. CORPORACIN PARA EL AVANCE DE LA MICROBIOLOGA Y LA MICROSCOPA MICROS COSMTICA CCYTEC. CREPES & WAFLES S.A. DU PONT QUALICON ENZIPAN DE COLOMBIA LTDA FABRICA DE ESPECIAS Y CONDIMENTOS EL REY S.A. FRIGORFICOS COLOMBIANOS S.A. INDEPENDIENTE. INDUSTRIA PRODUCTORA DE ACEITES RENOVABLES IVONNE BERNIER LABORATORIO LTDA. JOHNSON DIVERSEY KOYOMAD S.A. LABCONTROL E.U. LABFARVE LABORATORIO DE FARMACOLOGA VEGETAL LABORATORIO DE GENTICA Y BIOLOGA MOLECULAR LABORATORIO EMICAL LTDA. LABORATORIO GRAM LABORATORIO MICROLAB LTDA. LARKIN LESNIAK E.U MERCADEO DE ALIMENTOS DE COLOMBIA S.A. MERCK S.A. MICROBILOGOS ASOCIADOS LTDA. NULAB LTDA. QUIK LTDA. QUMICOS Y REACTIVOS LTDA. QUIMIREL

SUIZO S.A. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES UNIVERSIDAD MANUELA BELTRN Adems de las anteriores, en Consulta Pblica el Proyecto se puso a consideracin de las siguientes empresas: ACEITES Y GRASAS VEGETALES S.A. V AQUALAB ASOCIACIN COLOMBIANA DE MICROBIOLOGA AVESCO S.A. BAVARIA S.A. BIOTRENDS LABORATORIOS CENICAA CENTROAGUAS S.A. E.S.P. CERVECERA LEONA S.A. CONGELAGRO CONSULTORAS MICROBIOLGICAS COOPERATIVA DE GANADEROS DE CARTAGENA LTDA. EMPRESA DE ACUEDUCTO Y ALCANTARILLADO DE BOGOT FRIGORFICO GUADALUPE S.A. HOSPITAL DEPARTAMENTAL DE VILLAVICENCIO INGENIO PICHICHI S.A. INGENIO RIOPAILA INSTITUTO COLOMBIANO AGROPECUARIO ICA INSTITUTO NACIONAL DE SALUD INVIMA INSTITUTO NACIONAL DE VIGILANCIA MDICA LABORATORIO MICROBIOLGICO SIS LABORATOTORIO MICROBIOLGICO DE BARRANQUILLA LEVAPN S.A. LLOREDA GRASAS S.A. MEDIIMPLANTES LTDA. MINISTERIO DE PROTECCIN SOCIAL NESTL DE COLOMBIA S.A. PASIFLORA COLOMBIANA S.A. PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA PRODUCTORA DE CONCENTRADOS Y JUGOS DE FRUTA PURIFICACIN Y ANLISIS DE FLUIDOS LTDA. QUIOS LTDA. REPRESENTACIONES BIOTECNOLGICAS LTDA. RICA RONDO, INDUSTRIA NACIONAL DE ALIMENTOS S.A. SCHERING COLOMBIANA S.A. TECNIMICRO LABORATORIO DE ANLISIS UNIDAD ADMINISTRATIVA DE SALUD PBLICA UNIVERSIDAD CATLICA INGECAL VIKINGOS S.A.

ICONTEC cuenta con un Centro de Informacin que pone a disposicin de los interesados normas internacionales, regionales y nacionales y otros documentos relacionados. DIRECCIN DE NORMALIZACIN

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NTC 4574 (Primera actualizacin)

CONTENIDO Pgina 1. 2. 3. 4. 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 5. 5.1 5.2 5.3 6. 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 OBJETO .......................................................................................................................1 REFERENCIAS NORMATIVAS ...................................................................................1 DEFINICIN .................................................................................................................2 PRINCIPIO....................................................................................................................2 GENERALIDADES.......................................................................................................2 PREENRIQUECIMIENTO EN MEDIO LQUIDO NO SELECTIVO ..............................2 ENRIQUECIMIENTO EN MEDIO LQUIDO SELECTIVO .............................................. SIEMBRA EN MEDIO SELECTIVO .............................................................................2 CONFIRMACIN..........................................................................................................3 MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y ANTISUEROS ..............................................3 GENERALIDADES.......................................................................................................3 MEDIOS DE CULTIVOS Y REACTIVOS .....................................................................3 SUEROS .......................................................................................................................5 EQUIPOS Y MATERIAL DE VIDRIO PARA LABORATORIO ...................................5 EQUIPO PARA ESTERILIZACIN EN SECO (HORNO) O ESTERILIZACIN EN HMEDO (AUTOCLAVE) ......................................................................................5 INCUBADORA .............................................................................................................5 MEDIDOR DE pH .........................................................................................................5 FRASCOS PARA CULTIVO ........................................................................................5 TUBOS PARA CULTIVO..............................................................................................5

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Pgina 6.6 6.7 6.8 7. 8. 9. 9.1 9.2 9.3 9.4 9.5 10. 11. 12. PIPETAS GRADUADAS ..............................................................................................5 CAJAS DE PETRI ........................................................................................................6 BAO DE AGUA..........................................................................................................6 MUESTREO..................................................................................................................6 PREPARACIN DE LA MUESTRA PARA ENSAYO .................................................6 PROCEDIMIENTO........................................................................................................6 MUESTRA PARA ENSAYO Y SUSPENSIONES INICIALES .....................................6 PREENRIQUECIMIENTO NO SELECTIVO.................................................................7 ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO...............................................................................7 SIEMBRA EN MEDIO SELECTIVO .............................................................................7 CONFIRMACIN..........................................................................................................8 EXPRESIN DE RESULTADOS ...............................................................................13 INFORME DE ENSAYO .............................................................................................13 ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD .......................................................................13

ANEXOS ANEXO A (Normativo) DIAGRAMA DE PROCEDIMIENTO.......................................................................................14 ANEXO B (Normativo) COMPOSICIN Y PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS..................15 ANEXO C (Informativo) COMPARACIN ENTRE EL MTODO DE LA ISO 6579:2002 Y LA AOAC VERSIN 2005....24

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Pgina ANEXO D (Informativo) RESULTADOS DE LA PRUEBA INTERLABORATORIOS ..................................................25 ANEXO E (informativo) CUADRO COMPARATIVO RESPECTO DE LAS MODIFICACIONES REALIZADAS A LA NTC 4574 (primera actualizacin) Y SU DOCUMENTO DE REFERENCIA LA ISO 6579 ................................................................................................................................27 TABLAS Tabla 1. Interpretacin de las pruebas bioqumicas .........................................................11 Tabla 2. Interpretacin de las pruebas de confirmacin ..................................................12 Tabla C.1. Resultados de los anlisis de los datos obtenidos con muestras de cuajada de queso fresco...........................................................................................................25 Tabla C.2. Resultados de los anlisis de los datos obtenidos con muestras de huevo deshidratado en polvo.........................................................................................26 Tabla C.3. Resultados de los anlisis de los datos obtenidos con muestras de carne cruda de pollo .......................................................................................................26 Tabla C.4. Resultados de los anlisis de los datos obtenidos con materiales de referencia .........................................................................................................................26

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MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS Y DE ALIMENTOS PARA ANIMALES. MTODO HORIZONTAL PARA LA DETECCIN DE SALMONELLA SPP.

ADVERTENCIA Para proteger la salud del personal de laboratorio, es esencial que los ensayos de laboratorio para detectar Salmonella spp. sean nicamente ejecutados en laboratorios apropiadamente equipados, bajo la supervisin de un microbilogo, un microbilogo experimentado, o ambos, y que se tenga un gran cuidado en la disposicin de todos los materiales incubados.

1.

OBJETO

Esta norma describe los mtodos horizontales para la deteccin de Salmonella spp. Sujeta a las limitaciones indicadas al comienzo de esta norma, se aplica a productos para consumo humano y para alimentacin animal, las muestras ambientales en el rea de la produccin y manipulacin de alimentos. La temperatura de incubacin (35 C 2 C) se acordar entre las partes involucradas y se debe especificar en el reporte del ensayo. 2. REFERENCIAS NORMATIVAS

Los siguientes documentos normativos referenciados son indispensables para la aplicacin de este documento normativo. Para referencias fechadas, se aplica nicamente la edicin citada. Para referencias no fechadas, se aplica la ltima edicin del documento normativo referenciado. (incluida cualquier correccin). NTC 4092, Microbiologa de alimentos y de alimentos para animales. Reglas generales para los anlisis microbiolgicos. (ISO 7218). NTC 4491-1, Microbiologa de alimentos y de alimentos para animales. Preparacin de muestras para ensayo, suspensiones iniciales y diluciones decimales para los anlisis microbiolgicos. Parte 1. Reglas generales para la preparacin de la suspensin inicial y de diluciones decimales. (ISO 6887). NTC 5395, Agua para uso en anlisis de laboratorio. Especificacin y mtodos de anlisis. GTC 78, Microbiologa de alimentos y alimentos para animales. gua para la preparacin y produccin de medios de cultivo. Gua general para el aseguramiento de la calidad para la preparacin de los medios de cultivo en el laboratorio. 1 de 33

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3. DEFINICIN

NTC 4574 (Primera actualizacin)

Para los propsitos de esta norma se aplican las siguientes definiciones. 3.1 Salmonella spp. Bacteria gram negativa que forma colonias tpicas sobre un medio selectivo, el cual exhibe caractersticas bioqumicas y serolgicas descritas en la presente norma. 3.2 Deteccin de Salmonella spp. Determinacin de la presencia o ausencia de Salmonella spp., en una muestra particular de producto, cuando los ensayos son realizados de acuerdo con la presente norma. 4. 4.1 PRINCIPIO GENERALIDADES

Para la deteccin de Salmonella spp. se necesitan cuatro etapas sucesivas (vase tambin el Anexo A).
NOTA Salmonella spp. puede estar presente en bajas concentraciones y est frecuentemente acompaada por otros microorganismos. Por tanto, es necesario un preenriquecimiento no selectivo y posteriormente realizar un enriquecimiento selectivo. NOTA La determinacin de Salmonella puede realizarse tambin por los siguientes mtodos: siembra en membranas hidrofbicas, PCR, inmunofluorescencia (VIDAS) o cualquier otro mtodo bsqueda.

4.2

PREENRIQUECIMIENTO EN MEDIO LQUIDO NO SELECTIVO

Se inocula en solucin buferada, agua peptonada tamponada o caldo lactosado con la muestra para ensayo, y se incuba a 37 C 1 C por 18 h +/2 h. Para ciertos productos alimenticios es necesario emplear otros procedimientos de preenriquecimiento. Vase el numeral 9.1.2. 4.3 ENRIQUECIMIENTO EN MEDIO LQUIDO SELECTIVO

Se inocula 0,1 ml del medio de preenriquecimiento (vase numeral 4.2) en 10 ml del medio Rappaport Vassiliadis/medio verde malaquita (medio RVS) (o medio selenito segn AOAC 967.25 p. 109) y 1,0 ml del medio de preenriquecimiento (vase el numeral 4.2) en el medio Tetrationate Mueller Kauffmann (medio MKTTn). El caldo RVS se incuba a 41,5 C 1,0 C durante 24 h 3 h y el caldo MKTTn se incuba a 37 C 1 C durante 24 h 3 h. 4.4 SIEMBRA EN MEDIO SELECTIVO

A partir de los caldos de enriquecimiento lquido obtenidos en el numeral 4.3, se inoculan como mnimo dos medios selectivos slidos: Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD),

y cualquier otro medio selectivo complementario al XLD y que sea especialmente adecuado para el aislamiento de cepas de Salmonella lactosa positivas y Salmonella typhi y paratyphi; el medio se deja a la eleccin del laboratorio: 2

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EJEMPLO agar Rambach gar Hektoen agar McConkey agar bismuto sulfito agar Salmonella -Shigella(SS) agar verde brillante

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agares cromognicos selectivos o diferenciales para Salmonella

El agar XLD se incuba a 37 C 1 C y se examina despus de 24 h 3 h. El segundo agar selectivo se incuba a 37 C 1 C, y se examina despus de 24 h 3 h o segn las indicaciones del fabricante del medio de cultivo, si es necesario, despus de 48 h para verificar la presencia de colonias las cuales, a partir de sus caractersticas, se consideran presuntivas de ser Salmonella spp. 4.5 CONFIRMACIN

Se subcultivan las colonias de Salmonella spp. presuntivas aisladas como se describe en el numeral 4.4, y se confirman mediante ensayos bioqumicos y serolgicos apropiados. 5. 5.1 MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y ANTISUEROS GENERALIDADES

Para la prctica actual de laboratorio vase la NTC 4092 (ISO 7218).

NOTA Se pueden emplear reactivos listos para usar, preparados comercialmente.

5.2

MEDIOS DE CULTIVOS Y REACTIVOS

NOTA Debido al gran nmero de medios de cultivo y de reactivos, se considera preferible, para la claridad del texto, dar su composicin y preparacin en el Anexo B.

5.2.1

Medio de preenriquecimiento no selectivo: Solucin buffer, agua peptonada tamponada o caldo lactosado

Vase el numeral B.1. 5.2.2 Primer medio de enriquecimiento selectivo: Rappaport. Vassiliadis/medio verde malaquita (medio RVS)

Vase el numeral B.2. 5.2.3 Segundo medio de enriquecimiento selectivo Tetrationate Mueller Kauffmann (medio MKTTn).

Vase el numeral B.3.

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5.2.4

NTC 4574 (Primera actualizacin)

Medios slidos selectivos en placa para aislamiento

5.2.4.1 Primer medio Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (agar XLD). Vase el Anexo B.4. 5.2.4.2 Segundo medio La eleccin del segundo medio se deja a criterio del laboratorio de anlisis. Es conveniente seguir de manera precisa las instrucciones del fabricante en lo referente a su preparacin. agar Rambach agar Hektoen agar McConkey agar bismuto sulfito agar Salmonella Shigella (SS) agar verde brillante agares cromognicos selectivos o diferenciales para Salmonella.

Vase el literal B.5. 5.2.5 Agar Nutritivo

Vase el literal B.6 5.2.6 Tres azcares / Agar hierro (Agar TSI)

Vase el literal B.7. 5.2.7 Caldo Urea (Christensen)

Vase el literal B.8. 5.2.8 Medio de la descarboxilacin de L-Lisina (LIA)

Vase el literal B.9. 5.2.9 Reactivo para la reaccin Voges- Proskauer (VP)

Vase el literal B.10. 5.2.10 Reactivos para la reaccin de Indol Vase el literal B.11. 5.2.11 Agar nutritivo semislido (movilidad). Vase el literal B.12. 4

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5.2.12 Disolucin salina fisiolgica Vase el literal B.13. 5.2.13 Caldo selenito cistina Vase el literal B.14. 5.3 SUEROS

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Se encuentran disponibles comercialmente varios tipos de sueros que contienen anticuerpos frente a uno o varios antgenos O; es decir, antisueros que contienen uno o ms grupos O (denominados sueros anti O monovalentes o polivalentes), suero anti Vi, y antisueros que contienen anticuerpos frente a uno o varios factores H (denominados sueros anti H monovalentes o polivalentes). Conviene hacer todos los esfuerzos para asegurarse que los antisueros empleados son adecuados para la deteccin de todos los serotipos de Salmonella. Con este objetivo se pueden emplear slo antisueros preparados por un suministrador competente reconocido (por ejemplo, por un organismo de vigilancia gubernamental). 6. EQUIPOS Y MATERIAL DE VIDRIO PARA LABORATORIO

NOTA Si el material desechable tiene especificaciones adecuadas, es una alternativa aceptable frente al material de vidrio reutilizable.

Equipo usual de laboratorio microbiolgico (vase la NTC 4092) y, en particular, lo siguiente. 6.1 EQUIPO PARA ESTERILIZACIN EN SECO (HORNO) O ESTERILIZACIN EN HMEDO (AUTOCLAVE)

Vase la NTC 4092 (ISO 7218). 6.2 INCUBADORA

Con capacidad de funcionar a 41,5 oC 1 oC y capaz de operar entre 37 C 1 C. 6.3 MEDIDOR DE pH

Con precisin de calibracin de 0,1 unidades de pH a 25 C. 6.4

NOTA

FRASCOS PARA CULTIVO

Pueden usarse frascos para cultivo con tapa rosca metlica o plstica no txica.

6.5

TUBOS PARA CULTIVO

De 15 mm de dimetro y de 160 mm de longitud. 6.6 PIPETAS GRADUADAS O PIPETAS AUTOMTICAS

De capacidades nominales de 10 ml y de 1 ml, graduadas respectivamente en divisiones de 0,5 ml y 0,1 ml respectivamente. 5

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6.7 CAJAS DE PETRI

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De tamao pequeo (de 90 mm a 100 mm de dimetro) o de tamao grande (de 140 mm de dimetro).
NOTA se pueden utilizar cajas de vidrio o de material desechable.

6.8

BAO DE AGUA

En caso de incubar en bao de agua, mantenerlo a una temperatura entre 41,5 C 1,0 C a 37 C 1 C.
NOTA Se recomienda emplear un bao que contenga un agente antibacteriano debido a la baja dosis infectiva de Salmonella.

7.

MUESTREO

Es importante que el laboratorio reciba una muestra representativa y adecuada para su correspondiente anlisis y que no haya sufrido daos o cambios durante el transporte o el almacenamiento. El muestreo no hace parte del mtodo especificado en esta norma. Debe verse la norma especfica para el producto que interese. Si no hay norma especfica, se recomienda que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre este aspecto. 8. PREPARACIN DE LA MUESTRA PARA ENSAYO

La muestra para ensayo se prepara de acuerdo con la norma especfica del producto que interese. Si no hay norma especfica, se recomienda que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre este aspecto. 9. PROCEDIMIENTO

(Vase el diagrama del Anexo A (Normativo)). 9.1 MUESTRA PARA ENSAYO Y SUSPENSIONES INICIALES

9.1.1 Vase la NTC 4491-1 (ISO 6887-1) y la norma especfica que trate del producto en particular. Vase la norma ISO 8261 para leches y productos lcteos. Para la preparacin de la suspensin inicial, se usa como diluyente el medio de preenriquecimiento especificado en el numeral 5.2.1 y el numeral 4.2 (agua peptonada tamponada). En general se prepara la suspensin inicial adicionando una muestra para ensayo de 25 g a 225 ml de medio de preenriquecimiento (vase el numeral 5.2.1), el cual est en proporcin de la muestra para ensayo al medio de preenriquecimiento especificado en este mtodo. Si la muestra para ensayo prescrita es diferente de 25 g, se usa la cantidad necesaria al medio de preenriquecimiento para producir aproximadamente una dilucin 1/10 (masa a volumen).

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NOTA Para reducir la carga de trabajo cuando ms de 25 g de la muestra para ensayo de un lote especfico de alimentos ha sido analizado y cuando hay evidencia disponible de que su mezcla (juntando las porciones de muestras para ensayo) no afecta el resultado del producto en particular, las muestras para ensayo pueden ser compuestas. Por ejemplo, si 10 porciones de ensayo de 25 g se van a analizar, se combinan las 10 unidades para formar una muestra para ensayo compuesta de 250 g y se adicionan 2,25 L de caldo de preenriquecimiento. Alternativamente, se pueden combinar porciones de caldos de preenriquecimiento de 0.1 ml ( en 10 ml de medio RVS) y 1 ml ( en 10 ml de medio tetrationate Mueller Kauffmann) de los caldos de preenriquecimiento provenientes de 10 porciones de muestras para ensayo separadas (vase el numeral 9.3.1) para enriquecerlas en 100 ml de los medios de enriquecimiento selectivos.

9.1.2

Preparaciones especficas de la suspensin inicial para ciertos productos alimenticios

NOTA Para preparaciones especficas de la suspensin inicial para ciertos productos alimenticios aplicables a la determinacin de Salmonella o cualquier microorganismo se describen en las NTC 4491-1, NTC 4491-2, NTC 4491-3 y NTC 4491-4 e ISO 8261. Si algn producto no est referenciado en estas normas o no existe una norma especfica de producto, se recomienda que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre este aspecto.

9.1.2.1 Cacao y productos que contienen cacao (por ejemplo ms del 20 %) Se aaden, al agua peptonada tamponada (vase el numeral 5.2.1), preferiblemente 50 g/l de casena (evitar el empleo de casena cida), o 100 g/l de leche desnatada en polvo estril y se aaden despus de unas 2 h de incubacin, 0,018 g/l de verde brillante si es probable que el producto alimenticio est muy contaminado con flora Gram positiva. 9.1.2.2 Productos alimenticios cidos y acidificantes Se ha de asegurar que el pH no baja de 4,5 durante el preenriquecimiento.
NOTA El pH de los productos alimenticios cidos y acidificantes es ms estable si se emplea agua peptonada tamponada a doble concentracin.

9.2

PREENRIQUECIMIENTO NO SELECTIVO

Se incuba la suspensin inicial a 37 C 1 oC durante 18 h 2 h. 9.3 ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO

9.3.1 Se transfieren 0,1 ml del medio de cultivo obtenido en el numeral 9.2, a un tubo que contenga 10 ml del medio RVS (vase el numeral 5.2.2); se transfieren 1 ml del medio de cultivo obtenido en el numeral 9.2 a un recipiente que contenga 10 ml del medio tetrationate Mueller Kauffmann (vase el numeral 5.2.3).
NOTA En el caso de utilizar el medio de cultivo selenito como medio de enriquecimiento, se transfieren 1.0 ml del cultivo obtenido en el numeral 9.2, a un tubo que contenga 10 ml de caldo selenito (vase numeral 5.2.2). Se incuba a 35 1 C durante 24 h 2 h.

9.3.2 Se incuban los dos medios inoculados (vase el numeral 9.3.1) durante 24 h 3 h como sigue: Se incuba el caldo RVS sembrado (vase el numeral 9.3.1) a 41,5 C 1 C y el caldo tetrationate Mueller Kauffmann sembrado a 37 C 1 C. Hay que tener cuidado de que no se supere la mxima temperatura de incubacin permitida (42,5 C). 9.4 SIEMBRA EN MEDIO SELECTIVO

9.4.1 Tras incubar durante 24 h 3 h, utilizando el cultivo obtenido en el caldo RVS (9.3.2), se siembra mediante un asa la superficie de una placa de Petri que contenga el primer medio en placa selectivo (agar XLD), de tal forma que se obtengan colonias aisladas. 7

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Se procede de la misma manera con el segundo medio selectivo (vase el numeral 5.2.4.2) empleando un asa estril y cajas de Petri. 9.4.2 Tras incubar durante 24 h 3 h, utilizando el cultivo obtenido en caldo tetrationate Mueller Kauffmann (vase el numeral 9.3.2), se repite el procedimiento descrito en el numeral 9.4.1 con los dos medios selectivos en placa. 9.4.3 Se invierten las placas (vanse los numerales 9.4.1 y 9.4.2) dndoles la vuelta y se colocan en la incubadora a 35 C 2 oC para el primer medio. Para el segundo medio en placa (vase el numeral 5.2.4.2), deben seguirse las instrucciones del fabricante. 9.4.4 Despus del perodo de incubacin durante 24 h 3 h, se examinan las cajas (vase el numeral 9.4.3) para la presencia de colonias tpicas de Salmonella y de colonias atpicas que pueden ser Salmonella (vase la Nota 7). Se marca su posicin en la parte inferior de la placa. Las colonias tpicas de Salmonella que crecen en el agar XLD tienen un centro negro y una zona ligeramente transparente de color rojizo debido al cambio del indicador.
NOTA Las variantes de Salmonella H2S negativas (por ejemplo S. paratyphi A) que crece en agar XLD son rosas con un centro rosa ms oscuro. Las Salmonella lactosa positivas que crecen en agar XLD son amarillas con o sin ennegrecimiento. Cualquier colonia sospechosa debe estar sujeta a confirmacin (vase el numeral 9.5); el reconocimiento de las colonias de Salmonella es en gran parte obra de la experiencia, y su apariencia puede variar algo. No slo de especie a especie, sino tambin de lote a lote de medio. Con relacin a esto, la aglutinacin, en esta etapa, de colonias con antisuero de Salmonella polivalente puede facilitar el reconocimiento de las colonias sospechosas.

El segundo medio slido selectivo se incuba a la temperatura adecuada y se realiza la lectura despus del tiempo recomendado por el fabricante para comprobar la presencia de colonias que, por sus caractersticas, se consideran Salmonella presuntivas. 9.5 9.5.1 CONFIRMACIN Generalidades

Para las pruebas de confirmacin pueden utilizarse los sistemas de identificacin que estn disponibles en el comercio para el anlisis bioqumico de Salmonella si demuestran ser fiables. El empleo de los kits de identificacin se refiere a la confirmacin bioqumica de las colonias. Es conveniente que estos kits se empleen siguiendo las instrucciones del fabricante.
NOTA El reconocimiento de las colonias de Salmonella es en gran parte una cuestin de experiencia y, su aspecto puede variar algo, no solo de serovariedad a serovariedad, sino tambin de lote a lote del medio de cultivo selectivo utilizado.

9.5.2

Seleccin de colonias para su confirmacin

Para confirmacin se toma al menos una colonia considerada como tpica o sospechosa de cada placa de cada medio selectivo (vase el numeral 9.4), y luego otras cuatro colonias si la primera es negativa. Se recomienda que se identifiquen al menos 5 (cinco) colonias en el caso de estudios epidemiolgicos. Si en una placa hubiera menos de 5 (cinco) colonias tpicas o sospechosas, se toman para confirmacin todas las colonias tpicas o sospechosas. Se reaslan las colonias seleccionadas en la superficie de placas de agar nutritivo previamente secado de manera que permita el desarrollo de las colonias bien aisladas. Se incuban las placas sembradas a 37 C 1 C durante 24 h 3 h. 8

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Una vez realizado el subcultivo en medio nutritivo, se emplean cultivos puros para la confirmacin bioqumica y serolgica, se somete a pruebas bioqumicas como son los medios TSI, LIA, Urea, VP, indol, motilidad. 9.5.3 Confirmacin bioqumica

9.5.3.1 Generalidades Se siembran mediante una asa bacteriolgica los medios especificados en los numerales 9.5.3.2 a 9.5.3.7 con cada uno de los cultivos obtenidos de las colonias seleccionadas en el numeral 9.5.2. 9.5.3.2 Agar TSI (numeral 5.2.6) Se siembra en estra la superficie inclinada del agar y la parte profunda por puncin. Se incuba a 37 C 1 C durante 24 h 3 h. Se interpretan los cambios del medio de la siguiente manera: a) Profundidad b) Amarillo Rojo o sin cambio Negro Burbujas o fisuras glucosa positivo (utilizacin de la glucosa) glucosa negativo (no utilizacin de la glucosa) formacin de sulfuro de hidrgeno formacin de gas a partir de la glucosa

Parte inclinada Amarillo sacarosa) Rojo o sin cambio y/o sacarosa) lactosa y/o sacarosa positivo (utilizacin de la lactosa y/o lactosa y/o sacarosa negativo(no utilizacin de la lactosa

Los cultivos tpicos de Salmonella muestran la parte inclinada alcalina (roja) y la parte profunda cida(amarilla) con formacin de gas (burbujas) y (en aproximadamente el 90 % de los casos) formacin de sulfuro de hidrgeno (ennegrecimiento del agar) (vase el numeral 9.5.3.7). Cuando se asla una Salmonella lactosa positivo (vase numeral 4.4), la parte inclinada del TSI es amarilla. Por esto la confirmacin preliminar de los cultivos de Salmonella no debe estar basada slo en los resultados de las pruebas del TSI (vase el numeral 9.5.3) 9.5.3.3 Caldo urea (vase el numeral 5.2.7). Se siembra con un asa bacteriolgica el inculo. Se incuba a 37 C 1 C durante 24 h 3 h y se examina de vez en cuando. Si la reaccin es positiva, la descomposicin de la urea libera amonio, que cambia el color del rojo de fenol a rosa y luego a cereza oscuro. La reaccin es a menudo visible al cabo de 2 h a 4 h.

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NTC 4574 (Primera actualizacin)

9.5.3.4 Medio para la descarboxilacin de la L-lisina (vase el numeral 5.2.8) Se siembra justo por debajo de las superficie del medio lquido. Se incuba a 37 C 1 C durante 24 h 3 h. La turbidez y un color morado despus de la incubacin indican una reaccin positiva. Un color amarillo indica una reaccin negativa. 9.5.3.5 Medio para reaccin de Voges-Proskauer (VP) (vase el numeral 5.2.9) Se suspende el contenido de un asa de la colonia sospechosa en un tubo estril que contenga 3 ml de medio VP. Se incuba a 37 C 1 C durante 24 h 3 h. Despus de la incubacin, se aaden dos gotas de la disolucin de creatina, tres gotas de la disolucin etanlica del n-naftol y luego dos gotas de la disolucin de hidrxido potsico; se agita despus de la adicin de cada reactivo. La formacin de un color rosa a rojo brillante en 15 min indica una reaccin positiva. 9.5.3.6 Medio para la reaccin del indol (vase el numeral 5.2.10) Se siembra con la colonia sospechosa un tubo que contenga 5 ml de medio SIM (movilidad). Se incuba a 37 C 1 C durante 24 h 3 h. Despus de la incubacin se aade 1 ml del reactivo de Kovacs. La formacin de un anillo rojo indica una reaccin positiva. Un anillo amarillo-marrn indica una reaccin negativa. 9.5.3.7 Interpretacin de las pruebas bioqumicas Salmonella muestra generalmente las reacciones indicadas en la Tabla 1.

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NTC 4574 (Primera actualizacin)

Tabla 1. Interpretacin de las pruebas bioqumicas Cepa de Salmonella S. paratyphi A S. paratyphi B S. paratyphi C ReacReacReacb % %b %b cin cin cin + + 100 100 100 0 10 0 0 0 0 + + + + -

Prueba (9.5.3.2 a 9.5.3.7)

S.typhi Reacb % cin 100 0 2 0 97 0 98 0 0

Otras cepas Reac%b cin + + + + 100 92 1 1 92 1 95 0 14

cido de glucosa en + TSI Gas de glucosa en d TSI cido de lactosa en TSI cido de sacarosa en TSI Produccin de sulfuro + de hidrgeno en TSI Hidrlisis de urea Descarboxilacin de + la lisina Reaccin de VP Produccin de Indol a De la referencia [5]
b

Estos porcentajes indican que no todos los aislamientos de serotipos de Salmonella dan las reacciones marcadas como + +o -. Estos porcentajes pueden variar dentro de un mismo serotip y entre un serotipo y otro de los causantes de toxi-infecciones alimentarias de diferentes procedencias. Los porcentajes no son conocidos segn la literatura disponible. Salmonella Typhi no produce gas. Las Salmonella enterica subespecie arizonae dan una reaccin de lactosa positiva o negativa pero son siempre -galactosidasa positivo. Para el estudio de estas cepas puede ser til realizar pruebas complementarias.

9.5.4

Confirmacin serolgica y serotipo

9.5.4.1 Generalidades La deteccin de la presencia de los antgenos de Salmonella O, Vi, y H se realiza a partir de las colonias puras (vase el numeral 9.5.2) mediante aglutinacin en portaobjetos con los sueros adecuados y, despus de que las cepas autoaglutinantes hayan sido eliminadas. Se utilizan los antisueros segn las instrucciones del fabricante si difieren de las descritas a continuacin. 9.5.4.2 Eliminacin de las cepas autoaglutinables Se sita una gota de la disolucin salina (vase el numeral 5.2.12) en un portaobjetos de vidrio perfectamente limpio. Se dispersa parte de la colonia a probar en la gota, con un asa de manera que se obtenga una suspensin homognea y turbia.
NOTA Tambin es posible dispersar parte de la colonia a analizar en una gota de agua, y luego mezclar esta disolucin con una gota de la disolucin salina (vase el numeral 5.2.12).

Se hace oscilar el portaobjetos de 30 s a 60 s. Se observa el resultado sobre un fondo oscuro, preferiblemente con la ayuda de una lupa. Si las bacterias se agrupan en unidades ms o menos distintas, se considera la cepa como autoaglutinable y no debe someterse a las siguientes pruebas, porque la deteccin de antgenos no es posible. 11

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NTC 4574 (Primera actualizacin)

9.5.4.3 Comprobacin de los antgenos O Empleando una colonia pura no aglutinable, se procede segn el numeral 9.5.4.2, empleando una gota de suero anti O, en lugar de la disolucin salina. Si se produce aglutinacin, la reaccin se considera positiva. Se usa el suero poli y monovalente uno despus del otro. 9.5.4.4 Comprobacin de los antgenos Vi Empleando una colonia pura no aglutinable, se procede segn el numeral 9.5.4.2, empleando una gota de suero anti Vi, en lugar de la disolucin salina. Si se produce aglutinacin, la reaccin se considera positiva. 9.5.4.5 Comprobacin de los antgenos H Se inocula el agar nutritivo semislido con una colonia pura no autoaglutinable. Se incuba el medio a 37 C 1 C durante 24 h 3 h. Se usa ese cultivo para el examen de los antgenos H, procediendo segn el numeral 9.5.4.2, empleando una gota de suero anti H, en lugar de la disolucin salina. Si se produce aglutinacin, la reaccin se considera positiva. 9.5.5 Interpretacin de las reacciones bioqumicas y serolgicas

La Tabla 2 da las interpretaciones de las pruebas de confirmacin (vanse los numerales 9.5.3 y 9.5.4) realizadas en las colonias seleccionadas (vase el numeral 9.5.2).
Tabla 2. Interpretacin de las pruebas de confirmacin Reacciones bioqumicas Tpicas Tpicas Tpicas Reacciones no tpicas Reacciones no tpicas Auto aglutinacin No No Si No / si No / si Reacciones serolgicas Antgeno O, Vi y H positivo Todas las reacciones negativas No analizado (vase el numeral 9.5.4.2) Antgeno O, Vi y H positivo Todas las reacciones negativas Interpretacin Cepa considerada como Salmonella Puede ser Salmonella No se considera que sea Salmonella

9.5.6

Confirmacin definitiva

Las cepas que se consideran que son Salmonella o pueden ser Salmonella (vase la Tabla 2), deben enviarse a un centro de referencia de Salmonella reconocido para el tipificado definitivo. Este envo debe acompaarse de toda a informacin posible referente a la cepa(s) y si se trata de un brote o de un alimento aislado.

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10. EXPRESIN DE RESULTADOS

NTC 4574 (Primera actualizacin)

De acuerdo con los resultados de la interpretacin, se indica la presencia o ausencia de Salmonella en una porcin de x g de producto (vase la NTC 4092). Vase el Anexo C para los datos de precisin obtenidos del anlisis interlaboratorios. 11. INFORME DE ENSAYO

El informe de ensayo debe especificar: toda la informacin necesaria para la completa identificacin de la muestra; el mtodo de muestreo utilizado, si se conoce; el mtodo de ensayo utilizado, con referencia a esta parte de la norma; todos los detalles operativos no especificados en esta parte de la norma, o considerado como opcional, cualquier incidente detallado que pueda haber influenciado los resultados del ensayo; el resultado obtenido.

El informe del anlisis debe tambin hacer constar si se obtuvo un resultado positivo exclusivamente con un medio en placa (vase el numeral 5.2.4) no especificado en la presente norma. 12. ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD

Se debe verificar la capacidad del laboratorio de detectar la Salmonella con los mtodos y los medios descritos en esta norma e introducir una muestra de referencia en los recipientes de control del medio de preenriquecimiento (vase el numeral 5.2.1). Se prosigue con los recipientes de control como para los ensayos de cultivo.

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NTC 4574 (Primera actualizacin)

ANEXO A (Normativo)

DIAGRAMA DE PROCEDIMIENTO

Muestra 25 g

PRE-ENRIQUECIMIENTO NO SELECTIVO 225 ml de agua peptonada o caldo lactosado Incubacin a 35C 2C - 18 h 2 h

Rapport Vassiliadis Incubar 41,5C 0,5C 24 h 3 h

ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO

Caldo de Muller-Kauffman tetratronato novobiocina (MKTTn) 37C 1C 24 h 3 h

SIEMBRA EN MEDIOS SELECTIVOS

Rambach

Hektoen

McConkey

XLD

Bismuto sulfito

SalmonellaShiguella

Verde Brillante

Incubacin a 35C 2C 24 h 3 h

Colonias caractersticas PRUEBAS BIOQUMICAS

Reaccin de Voges-Proskauer

TSI

Lisina

Urea

Produccin de Indol

SEROLOGIA

Antisuero Polivalente Antisuero monovalente

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NTC 4574 (Primera actualizacin)

ANEXO B (Normativo)

COMPOSICIN Y PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS B.1 MEDIO DE PREENRIQUECIMIENTO NO SELECTIVO

B.1.1 Solucin buferizada B.1.1.1 Composicin

Fosfato dibsico de sodio anhidro cido ctrico saturado Agua 9.23 g -1 000 ml

B.1.1.2 Preparacin Disolver 9,23 g de fosfato dibsico de sodio anhidro en 800 ml de agua, ajustar la solucin con cido ctrico saturado a un pH de 4 + 0,1 aforar con agua a 1000 ml y mezclar. Esterilizar a 121 C durante 20 min. B.1.2 Agua peptonada B.1.2.1 Composicin
Peptona Cloruro de sodio Hidrofosfato disodico .dodecahidratado(Na2HPO412H2O) Fosfato dihidrgeno potasico (KH2 PO4) Agua 10,0 g 5,0 g 9,0 g 1,5 g 1 000 ml

B.1.2.2 Preparacin Disolver los componentes en agua, mezclar bien y calentar si es necesario. Ajustar el pH de tal modo que despus del tratamiento en autoclave, sea de 7,0. Esterilizar a 121 C durante 20 min. B.1.2 Caldo lactosado B.1.2.1 Composicin
Peptona de gelatina Extracto de carne Lactosa 5,0 g 3,0 g 5,0 g

B.1.2.2 Preparacin Disolver 13 gr por litro mezclar bien y distribuir en frascos de 250 ml. Ajustar el pH de tal modo que despus del tratamiento en autoclave, sea de 6,9 . Esterilizar a 121 C durante 15 min. B.2 RAPPAPORT-VASSILIADIS VERDE MALAQUITA

B.2.1 Solucin A

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B.2.1.1 Composicin

NTC 4574 (Primera actualizacin)

Triptona Cloruro de sodio Fosfato dipotsico (KH2 PO4) Agua

5,0 g 8,0 g 1,6 g 1 000 ml

B.2.1.2 Preparacin Debe ser preparada diariamente. Disolver los componentes en agua a 70 C. B.2.2 Solucin B B.2.2.1 Composicin
Oxalato verde malaquita Agua 0,4 g 100 ml

B.2.2.2 Preparacin Disolver el oxalato verde malaquita en agua y mantenerlo en frasco oscuro y a una temperatura fresca. B.2.3 Medio completo B.2.3.1 Composicin
Solucin A Solucin B 1000 ml 10 ml

B.2.3.2 Preparacin Mezclar 1 000 ml de solucin A con 10 ml de solucin B ajustar el pH de tal modo que despus del tratamiento en autoclave, sea de 5,2. Distribuir en tubos en cantidades de 10 ml y esterilizar en autoclave a 115 C por 15 min. Mantener el medio en refrigeracin. B.3 CALDO MULLER-KAUFFMANN TETRATIONATE NOVOBIOCINA (MKTTn)

B.3.1 Medio base B.3.1.1 Composicin medio base

Extracto de carne Digerido enzimtico de casena Cloruro de sodio (NaCl) Carbonato de calcio (CaCO3) Tiosulfato de sodio pentahidratado Bilis de buey para uso bacteriolgico Verde brillante Agua 4,3 g 8,6 g 2,6 g 38,7 g 47,8 g 4,78 g 9,6 g 1000 ml

B.3.1.2 Preparacin Se disuelven los componentes bsicos deshidratados o el medio completo deshidratado en el agua mediante ebullicin durante 5 min.. 16

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NTC 4574 (Primera actualizacin)

Se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que sea de 8,2 0,2 a 25 C. Se mezcla el medio completamente. El medio base puede ser almacenado durante 4 semanas a 3 C 0,2 C. B.3.2 Disolucin de yodo-yoduro B.3.2.1 Composicin
Yodo Yoduro potsico (KI) Agua 20,0 g 25,0 g 100 ml

B.3.2.2 Preparacin Se disuelve completamente el yoduro potsico en 10 ml de agua, luego se aade el yodo y se diluye hasta 100 ml con agua estril. No calentar. Se almacena la disolucin preparada en la oscuridad a temperatura ambiente en un recipiente hermticamente cerrado. B.3.3 Disolucin de novobiocina B.3.3.1 Composicin
Sal sdica de novobiocina Agua 0,04 g 5 ml

B.3.3.2 Preparacin Se disuelve la sal sdica de novobiocina en el agua y se esteriliza por filtracin. Se puede almacenar hasta 4 semanas a 3 C 0,2 C. B.4 AGAR XLD (XILOSA, LISINA DESOXICOLATO)

B.4.1 Composicin
Extracto de levadura en polvo Cloruro sdico Xilosa Lactosa Sacarosa Hidrocloruro de L-lisina Tiosulfato sdico Citrato amnico de hierro Rojo de fenol Desoxicolato sdico Agar Agua 3g 5g 3,75 g 7,5 g 7,5 g 5g 6,8 g 0,8 g 0,08g 1,0 g de 9 g a 18 g 1000 ml

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B.4.2 Preparacin

NTC 4574 (Primera actualizacin)

Disolver los componentes bsicos deshidratados o el medio base en el agua mediante calentamiento, con agitacin frecuente, hasta que el medio comience a hervir. Evitar el sobrecalentamiento. Se ajusta pH de manera que despus de la esterilizacin sea de 7,4 0,2 a 25 C. B.5 FENOL ROJO/ AGAR VERDE BRILLANTE(EDEL Y KAMPELMACHER)

B.5.1 Base B.5.1.1 Composicin

Extracto de carne Peptona Extracto de levadura Disodio hidrogeno fosfato Na2HPO4 Sodio dihidrogeno fosfato NaH2PO4 Agar Agua 1) Depende de la fuerza del gel 5,0 g 10,0 g 3,0 g 1,0 g 0,6 g 12 g a 18 g 1) 900 ml

B.5.1.2 Preparacin Disolver los componentes y calentar si es necesario, ajustar el pH a 7,0, transferir a tubos y esterilizar en autoclave a 121 C por 15 min. B.5.2 Caldo carbohidrato rojo de fenol B.5.2.1 Composicin
Lactosa Sucrosa Rojo de fenol Agua hasta completar volumen 10,0 g 10,0 g 0,09 g 100 ml

B.5.2.2 Preparacin Disolver los componentes en 50 ml de agua, luego llevar a 100 ml, calentar en un bao de agua a 70 C por 20 min. Enfriar a 55 C 1 C y usar inmediatamente. B.5.3 Solucin de verde brillante B.5.3.1 Composicin
Verde brillante Agua 0,5 100 ml

B.5.3.2 Preparacin Aadir el verde brillante al agua, almacenar la solucin en un sitio oscuro.

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B.5.4 Medio completo B.5.4.1 Composicin

NTC 4574 (Primera actualizacin)

Base Caldo carbohidrato rojo de fenol Solucin de verde brillante

900 ml 100 ml 1 ml

B.5.4.2 Preparacin Aadir en condiciones aspticas la solucin de verde brillante a el caldo carbohidrato rojo de fenol, enfriar a 55 C 1 C y aadir esto a la base. B.6 AGAR NUTRITIVO

B.6.1 Composicin
Extracto de carne Peptona Agar Agua 1) Depende de la fuerza del gel 3,0 g 5,0 g 12 g a 18 g 1) 1000 ml

B.6.2 Preparacin Disolver los componentes en agua, mezclar bien y calentar si es necesario. Ajustar el pH de tal modo que despus del tratamiento en autoclave, sea de 7,0. Esterilizar a 121 C durante 20 min. B.7 TRES AZCARES / AGAR HIERRO (AGAR TSI)

B.7.1 Composicin
Extracto de carne Extracto de levadura Peptona Cloruro de sodio Lactosa Sacarosa Glucosa Citrato frrico(III) Triosulfato de sodio Rojo fenol Agar Agua 1) Depende de la fuerza del gel 3,0 g 3,0 g 20,0 g 5,0 g 10,0 g 10,0 g 1,0 g 0,3 g 0,3 g 0,024 g 12 g a 18 g 1) 1 000 ml

B.7.2 Preparacin Disolver los componentes en agua, mezclar bien y calentar si es necesario. Ajustar el pH de tal modo que despus del tratamiento en autoclave, sea de 7,4. Distribuir en tubos en cantidades de 10 ml y esterilizar a 121 C durante 10 min.

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B.8 CALDO UREA (CHRISTENSEN)

NTC 4574 (Primera actualizacin)

B.8.1 Base B.8.1.1 Composicin

Peptona Glucosa Cloruro de sodio Fosfato dihidrgeno potasico (KH2 PO4) Rojo fenol Agua 1,0 g 1,0 g 5,0 g 2,0 g 0,012 g 1 000 ml

B.8.1.2 Preparacin Disolver los componentes en agua, mezclar bien y calentar si es necesario. Ajustar el pH de tal modo que despus del tratamiento en autoclave, sea de 6,8. Esterilizar a 121 C durante 20 min. B.8.2 Solucin de urea B.8.2.1 Composicin
Urea Agua 400 g 1 000 ml

B.8.2.2 Preparacin Disolver la urea en agua, esterilizar por filtracin y chequear. B.8.3 Medio completo B.8.3.1 Composicin
Base Solucin de urea 950 ml 50 ml

B.8.3.2 Preparacin Aadir en condiciones aspticas la solucin de urea sobre la base, enfriar a 45 C 1 C. Distribuir en tubos en cantidades de 10 ml. B.9 L-LISINA DESCARBOXILADA

B.9.1 Composicin
L-lisina monohidroxiclorada Extracto de levadura Glucosa Prpura de bromocresol Agua 5,0 g 3,0 g 1,0 g 0,015 g 1 000 ml

B.9.2 Preparacin Disolver los componentes en agua, mezclar bien y calentar si es necesario. Ajustar el pH de tal modo que despus del tratamiento en autoclave, sea de 6,8. Distribuir en tubos en cantidades de 5 ml. Esterilizar a 121 C durante 10 min. 20

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B.10

NTC 4574 (Primera actualizacin)

REACTIVOS PARA LA REACCIN DE VOGES PROSKAUER (VP)

B.10.1 Medio VP B.10.1.1 Composicin

Peptona Glucosa Hidrgeno fosfato dipotsico Agua 7g 5g 5g 1 000 ml

B.10.1.2 Preparacin Se disuelven los componentes en el agua, calentando si fuera necesario. Se ajusta el pH, de manera que despus de la esterilizacin sea de 6,9 0,2 a 25 C si es necesario. Se reparte el medio en tubos en cantidades de 3 ml. Esterilizar a 121 C durante 20 min. B.10.2 Disolucin de creatina (N-amidinosarcosina) B.10.2.1 Composicin
Monohidrato de creatina Agua 0,5 g 100 ml

B.10.2.2 Preparacin Se disuelve el monohidrato de creatina en agua. B.10.3 1-Naftol, disolucin etanlica B.10.3.1 Composicin
1-naftol Etanol, 96 % (fraccin volumen) 6g 100 ml

B.10.3.2 Preparacin Se disuelve el 1-naftol en el etanol. B.10.4 Disolucin de hidrxido de potasio B.10.4.1 Composicin
Hidrxido de potasio Agua 40 g 100 ml

B.10.4.2 Preparacin Se disuelve el hidrxido de potasio en el agua.

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B.11

NTC 4574 (Primera actualizacin)

REACTIVOS PARA LA REACCIN DEL INDOL

B.11.1 Medio triptona/triptfano B.11.1.1 Composicin

Triptona Cloruro de sodio (NaCl) DL-Triptfano Agua 10 g 5g 1g 1 000 ml

B.11.1.2 Preparacin Se disuelven los componentes en agua hirviendo. Se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que despus de la esterilizacin sea de 7,5 0,2 a 25 C. Se reparte el medio, en cantidades de 5 ml, en los tubos. Esterilizar a 121 C durante 20 min. B.11.2 Reactivo de kovacs B.11.2.1Composicin
4 dimetil amino benzaldehido Acido clorhdrico p = 1,18 g/ml a 1,19 g/ml 2 metil - 2 butanol 5g 25 ml 75 ml

B.11.2.2 Preparacin Se mezclan los componentes. B.12 AGAR NUTRITIVO SEMISLIDO

B.12.1 Composicin
Extracto de carne Peptona Agar Agua 1) Depende de la fuerza del gel 3,0 g 5,0 g De 4 g a 9 g 1 1 000 ml

B.12.2 Preparacin Se disuelven los componentes en el agua, calentando si fuera necesario. Se ajusta el pH, si fuera necesario de manera que despus de la esterilizacin sea de 7,0 0,2 a 25 C. Se reparte el medio en matraces de capacidad adecuada. Esterilizar a 121 C durante 20 min. B.12.3 Preparacin de las placas de agar Se vierten unos 5 ml del medio recin preparado en tubos. No hay que dejar que el medio se seque. B.13 DISOLUCIN SALINA FISIOLGICA

B.13.1 Composicin
Cloruro de sodio (NaCl) Agua 8,5 g 1 000 ml

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B.13.2 Preparacin

NTC 4574 (Primera actualizacin)

Se disuelve el cloruro de sodio en agua. Se ajusta el pH, si fuera necesario, de manera que despus de la esterilizacin sea de 7,0 0,2 a 25 C. Se reparten cantidades de la disolucin en matraces o tubos de manera que contengan de 90 ml a 100 ml despus de la esterilizacin. Esterilizar a 121 C durante 20 min. B.14 SELENITO CISTINA

B.4.1 Base B.14.1.1 Composicin

Triptona Lactosa Hidrofosfato disodico dodecahidratado(Na2HPO412H2O) Sodio selenito hidrogenado Agua 5,0 g 4,0 g 10,0 g 4,0 g 1 000 ml

B.14.1.2 Preparacin Disolver primero los tres componentes tribsicos en agua, llevar a ebullicin por 5 min. Despus de enfriar aadir sodio selenito hidrogenado y ajustar el pH a 7,0 B.14.2 Solucin de L-Cistina B.14.2.1 Composicin
L-Cistina Solucin de hidrxido de sodio 1 mol/l Agua estril hasta completar volumen 0,1 g 15 ml 100 ml

B.14.2.2 Preparacin Colocar los componentes en un erlenmeyer estril, llevar a 100 ml con agua estril y no autoclavar. B.14.3 Medio completo B.4.3.1 Composicin
Base Solucin de L-Cistina 1000 ml 10 ml

B.14.3.2 Preparacin Enfriar la base y aadir la solucin de L-Cistina, aspticamente, ajustar el pH a 7,0. Distribuir en tubos aspticamente. Preparar la solucin diariamente.

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NTC 4574 (Primera actualizacin)

ANEXO C (Normativo)

COMPARACIN ENTRE EL MTODO DE LA ISO 6579:2002 Y LA AOAC VERSIN 2005

AOAC 995.20 ALIMENTOS ALTAMENTE CONTAMINADOS 10 ml de caldo RVS como 10 ml de caldo RVS como preenriquecimiento. preenriquecimiento. 0.1 ml de muestra 0.1 ml de muestra Se incuba a 41,5 C 1 durante 24 h Se incuba a 42 C 0,2 durante 24 h 2 h. 3 h. 10 ml de caldo Tetrationato como 10 ml de caldo Tetrationato como preenriquecimiento. preenriquecimiento. 1.0 ml de la muestra 1.0 ml de muestra Se incuba a 37 1 C durante 24 h 3 Se incuba a 43 0,2 durante 24 h 2 h. h. ISO 6579:2002 AOAC 967.26 ALIMENTOS PROCESADOS

10 ml de caldo selenito cistina como preenriquecimiento. 1 ml de muestra Se incuba a 35 1 C durante 24 h 2 h. 10 ml de caldo Tetrationato como preenriquecimiento. 1.0 ml de muestra Se incuba a 35 1 C durante 24 h 2 h.

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ANEXO D (Informativo)

RESULTADOS DE LA PRUEBA INTERLABORATORIOS En el ao 2000 AFSSA Ploufragan en Europa, y Biocontrol Systems en Estados Unidos, organizaron un anlisis colaborativo internacional en el marco del proyecto europeo SMT CT 96 2098 [6]. Once laboratorios de nueve pases europeos y 10 laboratorios de Estados Unidos participaron en este estudio que tuvo lugar sobre cuajada de queso fresco, huevo deshidratado en polvo, carne cruda de pollo y un material de referencia. Cada una de las muestras de alimentos se analiz a dos niveles diferentes de contaminacin, junto con un control negativo. Las Tablas C.1 a C.4 dan las los valores del rendimiento por tipo de muestra segn este anlisis colaborativo. Los resultados obtenidos por algunos laboratorios han sido excluidos de los clculos exclusivamente por razones tcnicas identificadas claramente (desviaciones del protocolo).
Tabla C.1. Resultados de los anlisis de los datos obtenidos con muestras de cuajada de queso fresco Cuajada de queso fresco (nivel de contaminacin alto)

Cuajada de queso fresco (blanco)

Cuajada de queso fresco (nivel de contaminacin bajo)

Nmero de laboratorios que enviaron los resultados Nmero de muestras por laboratorio Nmero de laboratorios excluidos Nmero de laboratorios retenidos despus de exclusin Nmero de muestras aceptadas Fiabilidad (especificidad), % Fiabilidad (sensibilidad), % Conformidad, % Concordancia, %

23 5 2 21 105 100 100 100

23 5 2 21 105 74,3 83,8 60,5

23 5 2 21 105 83,8 95,2 71,7

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Tabla C.2. Resultados de los anlisis de los datos obtenidos con muestras de huevo deshidratado en polvo Huevo deshidratado en polvo (blanco) Huevo deshidratado en polvo (nivel de contaminacin bajo) Huevo deshidratado en polvo (nivel de contaminacin alto)

Nmero de laboratorios que enviaron los resultados Nmero de muestras por laboratorio Nmero de laboratorios excluidos Nmero de laboratorios retenidos despus de exclusin Nmero de muestras aceptadas Fiabilidad (especificidad), % Fiabilidad (sensibilidad), % Conformidad, % Concordancia, %

26 5 5 21 105 100 100 100

26 5 5 21 105 98,1 96,2 96,2

26 5 5 21 104 99 98,1 98,1

Tabla C.3. Resultados de los anlisis de los datos obtenidos con muestras de carne cruda de pollo Carne cruda de pollo (blanco) Carne cruda de pollo Carne cruda de pollo (nivel de (nivel de contaminacin bajo) contaminacin alto)

Nmero de laboratorios que enviaron los resultados Nmero de muestras por laboratorio Nmero de laboratorios excluidos Nmero de laboratorios retenidos despus de exclusin Nmero de muestras aceptadas Fiabilidad (especificidad), % Fiabilidad (sensibilidad), % Conformidad, % Concordancia, %

25 5 5 20 100 100 100 100

25 5 5 20 99 98 96,9 96

25 5 5 20 100 100 100 100

Tabla C.4. Resultados de los anlisis de los datos obtenidos con materiales de referencia Material de referencia (cpsulas conteniendo unas 5 ufc de S. Typhimurium)

Nmero de laboratorios que enviaron los resultados Nmero de muestras por laboratorio Nmero de laboratorios excluidos Nmero de laboratorios retenidos despus de exclusin Nmero de muestras aceptadas Fiabilidad (especificidad), % Fiabilidad (sensibilidad), % Conformidad, % Concordancia, %

26 5 1 25 125 94,4 88,8 89,1

26

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ANEXO E (Informativo)

CUADRO COMPARATIVO RESPECTO DE LAS MODIFICACIONES REALIZADAS A LA NTC 4574 (Primera actualizacin) Y SU DOCUMENTO DE REFERENCIA LA ISO 6579
Documento de referencia ISO 6579:2002 1. OBJETO 1. OBJETO Esta norma describe los mtodos Esta norma internacional describe un horizontales para la deteccin de mtodo horizontal para la deteccin de Salmonella spp. Salmonella, incluyendo Salmonella Sujeta a las limitaciones indicadas al typhi y Salmonella paratyphi. comienzo de esta norma, se aplica a Sujeta a las limitaciones discutidas en productos para consumo humano y la introduccin esta norma internacional para alimentacin animal. es aplicable a: los productos para consumo La temperatura de incubacin (35 C humano animal; 2 C) se acordar entre las partes las muestras ambientales en el involucradas y se debe especificar en rea de la produccin y el reporte del ensayo. manipulacin de alimentos. 2. REFERENCIAS 2. REFERENCIAS NORMATIVAS NORMATIVAS NTC 5395, Agua para uso en anlisis de laboratorio. Especificacin y mtodos de anlisis. 4 PRINCIPIO 4. PRINCIPIO 4.1 GENERALIDADES 4.1 GENERALIDADES Para la deteccin de Salmonella spp. se La deteccin de Salmonella necesita necesitan cuatro etapas sucesivas cuatro etapas sucesivas (vase (vase tambin el Anexo A). tambin el anexo A). NTC 4574 (primera actualizacin) NOTA Salmonella spp. puede estar presente en bajas concentraciones y est frecuentemente acompaada por otros microorganismos. Por tanto, es necesario un preenriquecimiento no selectivo y posteriormente realizar un enriquecimiento selectivo. NOTA La determinacin de Salmonella puede realizarse tambin por los siguientes mtodos: siembra en membranas hidrofbicas, PCR, inmunofluorescencia (VIDAS) o cualquier otro mtodo bsqueda. 4.2 PREENRIQUECIMIENTO EN MEDIO LQUIDO NO SELECTIVO Se inocula en solucin buferada, agua peptonada tamponada o caldo lactosado con la muestra para ensayo, y se incuba a 37 C 1 C por 18 h +/2 h. Para ciertos productos alimenticios es necesario emplear otros procedimientos de preenriquecimiento. Vase el numeral 9.1.2. NOTA Las Salmonella pueden estar presentes en nmeros pequeos y, a menudo estn acompaadas de nmeros considerablemente mayores de otras Enterobacteriaceae o de otras familias. Adems, el preenriquecimiento es necesario para permitir la deteccin de nmeros bajos de Salmonella o de Salmonella lesionadas.

Sustentacin Se modifica el objeto debido a que se considera que al nombrar Salmonella spp, no es necesario mencionar que aplica para Salmonella typhi y Salmonella paratyphi, tambin. Adicionalmente es importante aclarar que la temperatura de incubacin se acordar entre las partes dependiendo del tipo de muestras que se estn procesando.

Se incluy la referencia normativa respecto a los requisitos que debe cumplir el agua para uso en anlisis de laboratorio. Se modifica la redaccin de la nota, porque se tiende a interpretaciones respecto a microorganismos lesionados. Adicionalmente se incluye una nota respecto al uso de mtodos alternos que son utilizados para la deteccin de ste microorganismo que estn referenciados en otros estndares internacionales tales como la AOAC.

Se divide el numeral en dos partes, generalidades y preenriquecimiento en medio lquido no selectivo. En generalidades se aclara que etapas son contempladas para la Se agua peptonada tamponada con la deteccin de Salmonella y dos notas muestra para ensayo, y se incuba a 37 respecto a muestras con concentraciones bajas y recomendaciones para uso de C 1 C por 18 h +/2 h. Para ciertos productos alimenticios es tcnicas alternativas a la tcnica propuesta en el documento. necesario emplear otros procedimientos de preSe adiciona como medio de enriquecimiento. Vase el numeral preenriquecimiento la solucin buferada y el 9.1.2. caldo lactosado, como medios alternativos Para grandes cantidades, es que tienen la misma funcin que el agua conveniente calentar el agua peptonada tamponada a 37 C 1 C peptonada tamponada. El prrafo respecto al calentamiento antes de antes de ser sembrada con la porcin sembrar la porcin para anlisis se retira para anlisis. porque este procedimiento se da en la preparacin de la muestra dependiendo del producto.

4.2 PRE-ENRIQUECIMIENTO EN MEDIO LQUIDO NO SELECTIVO

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NTC 4574 (primera actualizacin) 4.3 ENRIQUECIMIENTO EN MEDIO LQUIDO SELECTIVO Se inocula 0,1 ml del medio de preenriquecimiento (vase numeral 4.2) en 10 ml del medio Rappaport Vassiliadis/medio verde malaquita (medio RVS) (o medio selenito segn AOAC 967.25 p. 109) y 1,0 ml del medio de preenriquecimiento (vase el numeral 4.2) en el medio Tetrationate Mueller Kauffmann (medio MKTTn). El caldo RVS se incuba a 41,5 C 1,0 C durante 24 h 3 h y el caldo MKTTn se incuba a 37 C 1 C durante 24 h 3 h. 4.4 SIEMBRA EN MEDIO SELECTIVO A partir de los caldos de enriquecimiento lquido obtenidos en el numeral 4.3, se inoculan como mnimo dos medios selectivos slidos: -Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) Y cualquier otro medio selectivo complementario al XLD y que sea especialmente adecuado para el aislamiento de cepas de Salmonella lactosa positivas y Salmonella typhi y paratyphi; el medio se deja a la eleccin del laboratorio: EJEMPLO agar Rambach Agar Hektoen agar McConkey agar bismuto sulfito agar Salmonella Shigella(SS) agar verde brillante

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Sustentacin

4.3 ENRIQUECIMIENTO EN MEDIO Se adiciona el medio de cultivo LQUIDO SELECTIVO selenito recomendado por el mtodo de la AOAC y que es ampliamente Se siembra el medio Rappaport- utilizado en los laboratorios Vassiliadis (caldo RVS) y el caldo colombianos. Adicionalmente se Muller-Kauffmann tetrationato (caldo aclara a que temperaturas y durante MKTTn) con el cultivo obtenido en el cuanto tiempo debe realizarse la numeral 4.2. incubacin.

4.4

SIEMBRA EN PLACA E IDENTIFICACIN Se siembran dos medios slidos selectivos a partir de los cultivos obtenidos en el numeral 4.3. agar xilosa lisina desoxicolato (agar XLD); cualquier otro medio selectivo complementario al XLD y que sea especialmente adecuado para el aislamiento de cepas de Salmonella lactosa positivas y, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi; el medio se deja a la eleccin del laboratorio.

Se modifica el numeral para incluir como medio principal el XLD y una lista de los posibles medios de cultivo que pueden ser utilizados como alternativa no como una nota como est en el documento de referencia.

El agar XLD se incuba a 37 C 1 C y se examina despus de 24 h 3 h. El segundo agar selectivo se incuba segn las recomendaciones del fabricante.

NOTA Para informacin, el agar verde brillante, agar sulfito de El agar XLD se incuba a 37 C 1 bismuto, etc., podran ser utilizados C y se examina despus de 24 h como el segundo medio en placa. 3 h. El segundo agar selectivo se incuba a 37 C 1 C, y se examina despus de 24 h 3 h o segn las indicaciones del fabricante del medio de cultivo, si es necesario, despus de 48 h para verificar la presencia de colonias las cuales, a partir de sus caractersticas, se consideran presuntivas de ser Salmonella spp. 4.5 CONFIRMACIN 4.5 CONFIRMACIN DE En Colombia se entiende que IDENTIDAD confirmacin se refiere a la identificacin del microorganismo e identidad se refiere cuando se esta hablando de una persona; por lo tanto se elimina.

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NTC 4574 (primera actualizacin) 5.1 GENERALIDADES 5.1

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Sustentacin

Para la prctica actual de Para la prctica actual laboratorio vase la NTC 4092 (ISO laboratorio vase la ISO 7218. 7218).

Se adiciona la nota respecto al uso de mtodos rpidos y reactivos listos de para uso, debido a que en el mercado estn disponibles con tcnicas validadas.

NOTA 1 Se pueden emplear reactivos listos para usar, preparados comercialmente. 5.2.1 Medio de pre5.2.1 Medio de preenriquecimiento no selectivo: enriquecimiento no selectivo: agua peptonada tamponada. Solucin buffer, agua peptonada tamponada o caldo lactosado Vase el numeral B.1. Vase el numeral B.1.
5.2.4.2 Segundo medio La eleccin del segundo medio se deja a criterio del laboratorio de anlisis. Es conveniente seguir de manera precisa las instrucciones del fabricante en lo referente a su preparacin. agar Rambach agar Hektoen agar McConkey agar bismuto sulfito agar Salmonella Shigella (SS) agar verde brillante. Vase numeral B.5. 5.2.4.2 Segundo medio

Se adiciona como medio de preenriquecimiento la solucin buferada y el caldo lactosado, como medios alternativos que tienen la misma funcin que el agua peptonada tamponada. Se adiciona el listado para seleccionar el segundo medio.

La eleccin del segundo medio se deja a criterio del laboratorio de anlisis. Es conveniente seguir de manera precisa las instrucciones del fabricante en lo referente a su preparacin.

5.2.9 Reactivo para la deteccin de la -galactosidasa (o discos de papel listos para su uso y empleados segn las instrucciones del fabricante). Vase el numeral B. 9.

5.2.11 Agar nutritivo semislido (movilidad) Vase el numeral B.12. 6.7 CAJAS DE PETRI De tamao pequeo (de 90 mm a 100 mm de dimetro) o de tamao grande (de 140 mm de dimetro).

5.2.11 Agar nutritivo semislido Vase el numeral B.12.

Este numeral se elimina de la norma, debido a que actualmente en los laboratorios no se cuenta con los reactivos para realizar esta prueba. Se considera que las otras bioqumicas mencionadas en el documento, sirven para identificar una Salmonella, sin necesidad de realizar la deteccin por medio de la - galactosidasa. Se adiciona movilidad para aclarar el uso del mismo.

6.7 CAJAS DE PETRI Se incluye la nota para aclarar que De tamao pequeo (de 90 mm a pueden utilizarse tanto cajas de 100 mm de dimetro) o de tamao vidrio, como desechables. grande (de 140 mm de dimetro).

NOTA se pueden utilizar cajas de vidrio o de material desechable. 6.8 BAO DE AGUA En caso de incubar en bao de agua, mantenerlo a una temperatura entre 41,5 C 1,0 C a 37 C 1 C. NOTA Se recomienda emplear un bao que contenga un agente antibacteriano debido a la baja dosis infectiva de Salmonella.

NOTA se pueden utilizar cajas de vidrio o de material desechable. 6.4 BAO DE AGUA En caso de incubar en bao de agua, mantenerlo a una temperatura entre 41,5 C 1,0 C a 37 C 1 C.

En la norma se decide dejar como alternativa para incubar las muestras tanto la incubadora, como un bao de agua, introduciendo las dos temperaturas de incubacin en este caso, pero el laboratorio tiene la libertad de decidir, mientras que cuente con una tcnica validada y unificar el equipo en un solo numeral.

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NTC 4574 (primera actualizacin) 9.1 MUESTRA PARA ENSAYO Y SUSPENSIONES INICIALES ... NOTA 5Para reducir la carga de trabajo cuando ms de 25 g de la muestra para ensayo de un lote especfico de alimentos ha sido analizado y cuando hay evidencia disponible de que su mezcla (juntando las porciones de muestras para ensayo) no afecta el resultado del producto en particular, las muestras para ensayo pueden ser compuestas. Por ejemplo, si 10 porciones de ensayo de 25 g se van a analizar, se combinan las 10 unidades para formar una muestra para ensayo compuesta de 250 g y se adicionan 2,25 l de caldo de pre-enriquecimiento. Alternativamente, se pueden combinar porciones de caldos de preenriquecimiento de 0.1 ml ( en 10 ml de medio RVS) y 1 ml ( en 10 ml de medio tetrationate Mueller Kauffmann) de los caldos de pre-enriquecimiento provenientes de 10 porciones de muestras para ensayo separadas (vase el numeral 9.3.1) para enriquecerlas en 100 ml de los medios de enriquecimiento selectivos. 9.1.2 Preparaciones especficas de la suspensin inicial para ciertos productos alimenticios

Documento de referencia ISO 6579:2002

Sustentacin

9.1 Muestra para ensayo y Se decide dejar el prrafo como nota suspensiones iniciales y no como requisito en dado caso Con el fin de reducir la carga de que esta situacin se presente. trabajo cuando haya de analizarse ms de una porcin para anlisis de 25 g de un determinado lote de alimento y, cuando exista evidencia de que su mezcla (juntando las porciones para anlisis) no afecta al resultado de ese alimento en particular, las porciones de anlisis pueden ser mezcladas. Por ejemplo, si deben analizarse 10 porciones de anlisis de 25 g, se combinan las 10 unidades para constituir una porcin para anlisis compuesta de 250 g y se aaden 2,25 l de caldo de preenriquecimiento. Una alternativa sera reunir las porciones de 0,1 ml (en 10 ml de caldo RVS) y 1 ml (en 10 ml de caldo MKTTn) de los caldos de pre-enriquecimiento provenientes de 10 porciones para anlisis separadas (vase el numeral 9.3.1) para enriquecerlas en 100 ml de los medios de enriquecimiento selectivos.

9.1.2 Preparaciones especficas de la suspensin inicial para ciertos productos alimenticios

NOTA 6 Para preparaciones especficas de la suspensin inicial para ciertos productos alimenticios aplicables a la determinacin de Salmonella o cualquier microorganismo se describen en las NTC 4491-1, NTC 4491-2, NTC 4491-3 y NTC 4491-4 e ISO 8261. Si algn producto no est referenciado en estas normas o no existe una norma especfica de producto, se recomienda que las partes interesadas lleguen a un acuerdo sobre este aspecto.

NOTA Las siguientes preparaciones especficas se refieren slo al caso de Salmonella. Las preparaciones especficas aplicables a la determinacin de cualquier microorganismo se describen en las normas internacionales ISO 6887-2, ISO 6887-3, ISO 6887-4 e ISO 8261.

Se cambian las referencias normativas por las NTC colombianas que han sido adoptadas en el comit tcnico. Adicionalmente se aclara que si algn producto que se vaya a analizar no est contemplado dentro de estas normas, se debe consultar la norma de producto y si no la hay, se debe establecer un acuerdo entre las partes interesadas para su anlisis.

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NTC 4574 (primera actualizacin) 9.3.1 Se transfieren 0,1 ml del medio de cultivo obtenido en el numeral 9.2, a un tubo que contenga 10 ml del medio RVS (vase el numeral 5.2.2); se transfieren 1 ml del medio de cultivo obtenido en el numeral 9.2 a un recipiente que contenga 10 ml del medio tetrationate Mueller Kauffmann (vase el numeral 5.2.3).

Documento de referencia ISO 6579:2002 9.3.1 Se transfieren 0,1 ml del medio de cultivo obtenido en el numeral 9.2, a un tubo que contenga 10 ml del medio RVS (vase el numeral 5.2.2); se transfieren 1 ml del medio de cultivo obtenido en el numeral 9.2 a un recipiente que contenga 10 ml del medio tetrationate Mueller Kauffmann (vase el numeral 5.2.3).

Sustentacin

Se incluye una nota para aclarar que se debe hacer con la muestra en caso de usar el caldo de cultivo selenito.

NOTA En el caso de utilizar el medio de cultivo selenito como medio de enriquecimiento, se transfieren 1.0 ml del cultivo obtenido en el numeral 9.2, a un tubo que contenga 10 ml de caldo selenito (vase numeral 5.2.2). Se incuba a 35 1 C durante 24 h 2 h.
9.5.3.5 Deteccin de la - Vase explicacin de su eliminacin galactosidasa (5.2..9). Se suspende en el numeral 5.2.9. el contenido de un asa de la colonia sospechosa en un tubo que contenga 0,25 ml de la disolucin salina (5.3.13). Se aade una gota de tolueno y se agita el tubo. Se coloca el tubo en un bao de agua (6.6) regulado a 37C y se deja durante algunos minutos (5 min aproximadamente). Se aaden 5 ml del reactivo para la deteccin de la galactosidasa y se mezcla. Se vuelve a colocar el tubo en el bao de agua regulado a 37 C y se deja durante 24 h 3 h, examinando el tubo de vez en cuando. ANEXO C Se introduce un anexo informativo realizando una comparacin entre la (normativo) tcnica analtica propuesta en el documento de referencia y el mtodo COMPARACIN ENTRE EL propuesto en la AOAC para la MTODO DE LA ISO 6579:2002 Y LA deteccin de Salmonella. AOAC VERSIN 2005

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BIBLIOGRAFIA

[1] [2] [3] [4]

Manual Tcnico Divisin de Insumos pecuarios. Laboratorio Nacional de Insumos pecuarios 1996 Instituto Nacional de Salud, Anlisis Microbiolgico de Alimentos. Manual de procedimientos. Red Nacional de Laboratorios, Septiembre de 1990 Manual operativo de anlisis microbiolgicos para alimentos. Gilma Janeth Luna, Fondo Editorial. Fundacin Universidad de Bogot Jorge Tadeo Lozano. AOAC INTERNATIONAL Official Methods of Analysis 18th Ed 2005, AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD, USA, Method 967.25 Salmonella in Foods. p 109111. Chapter 17. AOAC INTERNATIONAL Official Methods of Analysis 18th Ed 2005, AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD, USA, Method 967.26 Salmonella in Foods. p 111112. Chapter 17.

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DOCUMENTO DE REFERENCIA

NTC 4574 (Primera actualizacin)

INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Microbiology. General Guidance on Methods for the Detection of Salmonella. Geneve, 2002 (ISO6579:2002).

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