Laboratorio

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La membrana y el transporte celular
Objetivos
Al finalizar este laboratorio el estudiante podr: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Describir los componentes de las membranas biolgicas. Identificar factores que afectan la integridad de las membranas. Explicar cmo la difusin y la osmosis son importantes para las clulas. Mencionar factores que afectan la velocidad de difusin. Explicar qu son soluciones hipotnicas, hipertnicas e isotnicas. Explicar qu es osmolaridad en los tejidos.

INTRODUCCIN

as membranas celulares son barreras selectivas que separan las clulas y forman compartimientos intracelulares. Entre sus funciones estn: Regular el transporte de molculas que entran o salen de la clula o del organelo. Generar seales para modificar el metabolismo. Adherir clulas para formar tejidos.

La membrana celular est formada por una capa doble de fosfolpidos, protenas y carbohidratos. (Fig; 7.1). Cada fosfolpido est compuesto por glicerol, cidos grasos y fosfato, que en conjunto crean una barrera hidrofbica entre los compartimientos acuosos de la clula. Las protenas permiten el paso de molculas hidroflicas a travs de la membrana, determinan las funciones especficas de sta e incluyen bombas, canales, receptores, molculas de adhesin, transductores de energa y enzimas. Las protenas perifricas estn asociadas con las superficies, mientras que las integrales estn incrustadas en la membrana y pueden atravesar completamente la capa doble. La funcin de los carbohidratos adheridos a las protenas (glucoprotenas) o a los fosfolpidos (glucolpidos) es la de adhesin y comunicacin intercelular. El colesterol, que es un esteroide (lpido), determina la fluidez de la membrana.

Glicoprotena
Protena Protena perifrica Periferal

Canal de Transporte

Colesterol Fosfolpidos Protena Integral

Figura

7.1

Estructura bsica de la membrana.

TRANSPORTE CELULAR:

DIFUSIN Y OSMOSIS

Para que la clula funcione eficientemente, debe mantenerse en la misma un ambiente estable conocido como homeostasis. Para mantener este equilibrio existen mecanismos para el transporte selectivo de materiales hacia el interior o exterior de la clula. Las membranas de la clula son selectivamente permeables, permitiendo el paso de algunas sustancias o partculas (molculas, tomos, o iones), e impidiendo el paso de otras. Esta selectividad se debe a la capa doble de fosfolpidos de la membrana. La manera en que las molculas pasan por la membrana depende en parte de la polaridad de las mismas. Las molculas hidrofbicas, o no polares, pasan con relativa libertad a travs de la capa de lpidos, mientras que molculas hidroflicas, o polares, incluyendo el agua, y las molculas de mayor tamao, pasan a travs de canales formados por protenas transportadoras. La regulacin del transporte de las molculas, o la direccin en que se mueven depende de su gradiente de concentracin (diferencia en concentracin entre dos lugares). Las molculas se mueven constantemente debido a su energa cintica y se esparcen uniformemente en el espacio disponible. Este movimiento, llamado movimiento browniano, es la fuerza motriz de la difusin. Difusin se define como el movimiento natural de las partculas de un rea de mayor concentracin a un rea de menor concentracin hasta alcanzar un equilibrio dinmico, en el cual el movimiento neto de partculas es cero. La difusin no requiere gasto de energa por parte de la clula y por lo tanto es un movimiento pasivo. Cuando la clula transporta sustancias en contra de un gradiente de concentracin (de un rea de menor concentracin a un rea de mayor concentracin) se requiere energa (ATP) y sucede movimiento activo.

Membrana selectivamente permeable

Figura 7.2 Osmosis. Difusin de molculas de agua. Las molculas de agua pasan de un lugar de mayor concentracin a un lugar con menos concentracin de molculas hasta llegar a un equilibrio.
Soluto o molcula

El componente principal de la clula es el agua, que acta como solvente (el agente que disuelve) de solutos orgnicos e inorgnicos. El movimiento de agua a travs de una membrana selectivamente permeable se llama osmosis (difusin de agua) y sucede siempre del rea de mayor concentracin de agua (con menor concentracin de soluto) al rea de menor concentracin de agua (con mayor concentracin de soluto) (Figura 7.2). El agua se mover entonces, a favor de un gradiente de concentracin hacia el rea de mayor concentracin de soluto (donde hay una menor concentracin de molculas de agua libres). Cuando la clula contiene una concentracin de solutos mayor que su ambiente externo, se dice que la clula est en una solucin hipotnica, y como consecuencia, el agua entra a la clula causando que se expanda (Fig. 7.3a). Si la concentracin de solutos es mayor fuera de la clula, se dice que la clula est en una solucin hipertnica; la clula pierde agua y se encoge (Fig. 7.3c). Si las concentraciones de soluto son iguales en ambos lados de la membrana, se dice que la clula est en una solucin isotnica, donde el movimiento neto es cero (Figura 7.3b). Las clulas animales funcionan ptimamente en ambientes isotnicos. En las clulas vegetales, sin embargo, cuando la vacuola se llena de agua, sta ejerce presin contra la pared celular hasta llegar a un punto donde se impida que entre ms agua (presin de turgencia) y la clula se encuentra trgida (firme), lo cual es el estado ideal de estas clulas. Por otra parte, si la clula vegetal pierde agua, la clula sufre plasmlisis al separarse la membrana celular de la pared celular, lo cual suele ser letal para la clula (Figura 7.3c).

(a)

(b)

(c)

H2O

H2O

H2O

Solucin hipotnica
Figura 7.3

Solucin isotnica

Solucin hipertnica

Osmosis: transporte de agua a travs de una membrana permeable. La bolsa representa una clula y el agua en el envase representa su medioambiente. El soluto es sal (cloruro de sodio). (a) La concentracin de sal en el medioambiente es ms baja que la concentracin de sal en la clula. (b) La concentracin de sal es igual en la clula y en el medioambiente. (c) La concentracin de sal en el medioambiente es ms alta que la concentracin de sal en la clula.

EJERCICIO 7.1
PROPIEDADES DE LAS MEMBRANAS

En los ejercicios que siguen a continuacin se estudiar cmo algunos factores afectan el funcionamiento de las membranas celulares.

A. Efecto de la temperatura
En este ejercicio se usar la planta de remolacha (Beta vulgaris), cuyas clulas almacenan en la vacuola central el pigmento violeta betacianina.
M A T E R I A L E S

Por laboratorio: Agua destilada Bao de agua a 70 C Bao de agua a 37 C Por mesa: Gradilla para tubos de ensayo Dos vasos de 150 a 200 ml Una remolacha Seis tubos de ensayo Vaso con hielo Sacabocado Termmetro Regla

Hielo Nevera

Navaja Agarradera de tubo de ensayo Plato para calentar Aguja de diseccin Probetas o pipetas de 5 ml Marcador de cera Envase con hielo Plato para calentar u hornilla

P R O C E D I M I E N T O

1. Corte seis pedazos de remolacha (15 mm de largo) con un sacabocado y colquelos en tubos de ensayo rotulados del 1 al 6.

2. Aada 5 ml de agua al tubo 6 y colquelo en el congelador por 30 min. 3. Aada 5 ml de agua al tubo 5 y colquelo en el bao de hielo por 30 min. 4. Aada 5 ml de agua al tubo 1 y colquelo en un bao de agua caliente a 70 C durante 1 min. Despus de 20 min, remueva el pedazo de remolacha del tubo. 5. Deje que la temperatura del bao baje a 55 C y haga lo mismo con el tubo 2. 6. Repita el procedimiento de arriba con el tubo 3 a 37 C y con el tubo 4 a 20 C. 7. Compare la intensidad de color de las soluciones en los tubos. 8. Coloque los resultados (intensidad de color vs. temperatura) en la Tabla 7.1. Tabla 7.1 Tubo 1 2 3 4 5 6 Efecto de temperatura Intensidad de color (1 = menos intenso; 6 = ms intenso)

Temperatura 70 C 55 C 37 C 20 C En bao de hielo En congelador

9. Qu tubo mostr ms intensidad de color? 10. Qu indica la intensidad del color? 11. Cmo afectan las temperaturas altas a las membranas celulares? 12. Qu le pasa a las clulas en temperaturas bajas?

B. Efecto de solventes
En este ejercicio se observar cmo algunos solventes actan sobre las membranas. El instructor preparar este experimento.
M A T E R I A L E S

En la mesa del instructor: Soluciones de acetona y metanol 2 a 4 huevos de gallina 10 ml de aceite

Por mesa: Gradilla para tubos de ensayo Una remolacha

P R O C E D I M I E N T O

1. Rotule seis tubos de ensayo de 1 al 6. 2. Aada 5 ml de las siguientes soluciones a los tubos de ensayo: Tubo 1: Tubo 2: Tubo 3: Tubo 4: Tubo 5: Tubo 6: metanol 1 % metanol 25 % metanol 50 % acetona 1 % acetona 25 % acetona 50 % P R E C A U C I N
No b o t e p o r el f reg a d er o la a ce to n a , n i e l m eta n o l; d esc r telo s en e l en va s e ro tu la d o p a ra e s te p ro p si to .

3. Corte seis pedazos de remolacha de 15 mm y colquelos en los tubos de ensayo. 4. Luego de 30 min, remueva la remolacha y observe la intensidad de color para cada solucin. 5. Qu tubo mostr la mayor intensidad de color? 6. Rotule seis tubos adicionales y aada lo siguiente a cada uno: Tubo A: 1 ml de agua + 1 ml de acetona Tubo B: 1 ml de agua + 1 ml de metanol Tubo C: 1 ml de aceite + 1 ml de acetona Tubo D: 1 ml de aceite + 1 ml de metanol Tubo E: Un poco de clara de huevo + 1 ml de metanol Tubo F: Un poco de clara de huevo + 1 ml de acetona

7. Agite cada tubo suavemente y observe los resultados. En qu tubos se observaron reacciones?

8. Basado en lo que se observ en los tubos de ensayos (refirindose a los tubos 1 - 6 y A - F), cmo afecta la acetona a la membrana?

9. Cmo afecta el metanol a la membrana?

10. Qu indican los resultados sobre los componentes de la membrana?

EJERCICIO 7.2
TRANSPORTE CELULAR: DIFUSIN Y OSMOSIS

A. Difusin
A.1. Difusin de molculas en agua
En este ejercicio, se estudiar el movimiento browniano de las molculas y el efecto de la temperatura sobre dicho movimiento.
M A T E R I A L E S

Por mesa: Dos vasos de precipitacin (beakers) Agua fra

P R O C E D I M I E N T O

Agua a temperatura ambiente Colorante vegetal

1. 2. 3. 4.

Aada agua a temperatura ambiente a un vaso y al otro vaso aada agua fra. Deje los vasos reposar por 10-15 min para que no haya movimiento del agua. Aada cuidadosamente una gota de colorante a cada envase y observe la dispersin de la gota. Afect la temperatura la difusin del tinte? Explica tu observacin.

A.2. Difusin a travs de una membrana selectivamente permeable (dilisis)

En este ejercicio se usar una membrana de dilisis que posee poros de un tamao determinado y que acta como una membrana selectivamente permeable.
M A T E R I A L E S

Por mesa: Un vaso de precipitacin (beaker) de 500 ml Una bolsa de dilisis y cordn o bandas de goma Rejilla y tubos de ensayo pequeos Bao de mara y matraz pequeo con agua

Agarradera de tubo de ensayo Reactivo de Benedict Solucin de yodo Cilindro graduado

Por laboratorio: Solucin de glucosa 30 % y solucin de almidn 1 %. Se usarn aproximadamente 25 ml de cada una por mesa (150 ml de cada solucin por laboratorio).

P R O C E D I M I E N T O

1. Corte la bolsa de dilisis a 25 cm de largo y pngala en agua por unos minutos para abrirla. 2. Aada a la bolsa aproximadamente la mitad de la solucin de glucosa y la mitad de la solucin de almidn. 3. Cierre la bolsa con un cordn o con una banda de goma, de forma que luego pueda abrirla (Fig. 7.4 a). 4. Mezcle la solucin dentro de la bolsa y enjuague con agua la superficie externa de la bolsa; anote el color inicial de la solucin dentro de la bolsa. 5. Aada varias gotas de la solucin de yodo a un vaso (beaker) con 300 ml de agua hasta obtener un color dorado. 6. Coloque la bolsa de dilisis dentro del agua por 30 min (Figura 7.4 b).

(a)

(b)

Figura

7.4

7. Saque la bolsa del agua y colquela en un vaso (beaker) vaco. Anote el color de la solucin dentro de la bolsa y comprela con la solucin en el primer vaso. 8. Realice la prueba de Benedict para las dos soluciones contenidas en las bolsas. 9. Cuales son los resultados de este experimento para las pruebas de yodo y de Benedict? Explique. 10. Qu indican estos resultados? 11. Qu caracterstica tiene la membrana de dilisis que afecta los resultados?

B. Osmosis en clulas animales y vegetales

En los siguientes ejercicios se observar qu ocurre al poner clulas animales y vegetales en soluciones con concentraciones diferentes de solutos.

B.1. Clulas animales

Cuando los eritrocitos (clulas rojas) se encuentran en un ambiente hipotnico el agua les entra por difusin y sucede hemlisis (el rompimiento de una clula roja). Cuando la clula roja est en un ambiente hipertnico pierde agua, se encoge y sucede crenacin. En este experimento se observar el comportamiento de las clulas rojas de la sangre en soluciones hipotnicas e hipertnicas.

M A T E R I A L E S

( P A R T E S

B . 1

B . 2 )

Por mesa: Botellas con soluciones de sacarosa (0.1, 0.3, y 0.6 M) Botella con sangre de vaca (mantener en nevera) Elodea fresca Gradilla para tubos de ensayo Tubos de ensayo pequeos Goteros
P R O C E D I M I E N T O

Laminillas y cubreobjetos Agujas de diseccin Microscopio compuesto Lpiz de cera Papel toalla Papel de lente

1. Rotule tres tubos de ensayo: 0.1, 0.3 y 0.6 M. 2. Aada soluciones de sacarosa de diferentes osmolaridades (vea la parte C para la definicin de osmolaridad): Tubo 1: 3 ml de solucin de sacarosa 0.1 M Tubo 2: 3 ml de solucin de sacarosa 0.3 M Tubo 3: 3 ml de solucin de sacarosa 0.6 M 3. Aada 3 ml de sangre de vaca a cada tubo, y observe la apariencia de la mezcla. 4. Rotule y prepare cuatro laminillas: Laminilla 1: Gota de sangre de vaca, coloque el cubreobjeto y observe los eritrocitos bajo el microscopio. Laminilla 2: Gota de la mezcla del tubo 1 (0.1 M), coloque el cubreobjeto, observe bajo el microscopio y compare con laminilla 1. Laminilla 3: Gota de la mezcla del tubo 2 (0.3 M), coloque el cubreobjeto, observe bajo el microscopio y compare con laminilla 1. Laminilla 4: Gota de la mezcla del tubo 3 (0.6 M), coloque el cubreobjeto, observe bajo el microscopio y compare con laminilla 1. 5. Qu le pas a las clulas al entrar en contacto con cada una de las soluciones? Por qu?

6. Cules de las soluciones usadas fueron hipotnicas, hipertnicas e isotnicas para los eritrocitos?

7. En qu solucin sucedi hemlisis de los eritrocitos y por qu?

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8. Por qu ocurri la crenacin?

9. Qu indican los resultados acerca de la concentracin de solutos en el plasma sanguneo?

B. 2. Clulas vegetales
P R O C E D I M I E N T O

1. Rotule y prepare cuatro laminillas segn se indica a continuacin. Coloque un cubreobjetos y observe con el microscopio: Laminilla 1: Hoja de Elodea con una gota de agua de estanque. Laminilla 2: Gota de la solucin de sacarosa 0.1 M y una hoja de Elodea Laminilla 3: Gota de la solucin de sacarosa 0.3 M y una hoja de Elodea Laminilla 4: Gota de la solucin de sacarosa 0.6 M, una hoja de Elodea 2. Qu le pas a las clulas al entrar en contacto con cada una de las soluciones?

3. Cules de las soluciones fueron hipotnicas, hipertnicas e isotnicas con respecto a la clula? 4. Por qu ocurri plasmlisis en una de las soluciones?

5. Cul es la diferencia entre plasmlisis y crenacin?

6. Por qu no ocurre lisis (rompimiento de la clula) en la clula vegetal?

7. En qu tipo de solucin ocurri turgencia?

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C. Estimar la osmolaridad en las clulas vegetales

En los siguientes ejercicios se observar cmo soluciones con diferentes molaridades1 afectan el equilibrio y el funcionamiento de las clulas vegetales. La osmolaridad se expresa como moles de soluto por litro de solucin; mientras ms alta es la osmolaridad, mayor es la concentracin de soluto. Comparando la diferencia en el peso de las muestras de papa se determinar si las clulas adquieren o pierden agua en soluciones de diferentes molaridades y se determinar en qu osmolaridad las clulas vegetales se encuentran en homeostasis o equilibrio.
M A T E R I A L E S

Por mesa: Una papa mediana o grande Sacabocado Vasos desechables o beakers Papel toalla Pedazo de cartn Navaja
P R O C E D I M I E N T O

100 ml de solucin de sacarosa de 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 y 0.6 M Agua destilada (solucin 0.0 M) Balanza y papel para pesar

1. Rotule seis vasos para cada solucin de sacarosa (0.1 a 0.6 M) y un vaso para agua destilada (0.0 M). 2. Aada 100 ml de la solucin correspondiente a cada uno (Fig. 7.5a). 3. Con el sacabocado obtenga siete cilindros de papa (Fig. 7.5b) de aproximadamente 5 cm de largo. (a) (b)

Figura

7.5

Para ms informacin acerca de molaridad, ver el Apendice IV.

12

4. Pese los cilindros de papa, anote en la Tabla 7.2 el peso inicial para cada uno.y transfiralos inmediatamente a los vasos rotulados. 5. Deje los cilindros en los vasos durante 2 horas. 6. Saque los cilindros de los vasos y remueva el exceso de agua con papel toalla. Asegrese de mantener separados los cilindros correspondientes a cada vaso. 7. Anote si hubo cambios en textura y anote en la Tabla 7.2 el peso final de los cilindros. 8. Con los datos de la Tabla 7.2, calcule el cambio en peso para cada cilindro y prepare una grfica sealando los cambios en peso. peso final peso inicial peso inicial Nota: Seleccione una escala apropiada para el eje Y de la grfica (el cero ya est colocado en el centro del eje). El aumento en peso se grafica sobre el cero y la disminucin en peso se grafica debajo del cero. Tabla 7.2 Resultados del experimento. Molaridades de la soluciones 0.0 0.1 0.2 0.3 Peso final (g) Peso inicial (g) Cambio en peso (%)

Cambio en peso (%) =

X 100

0.4

0.5

0.6

Cambio en peso (%)

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

Osmolaridad

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9. Se observ diferencia en la textura de los cilindros antes y despus del experimento? Por qu?

10. Cul es la variable independiente en este experimento?

11. A qu molaridad de sacarosa se observa un cambio en la grfica (dnde la curva va de negativo a positivo o viceversa)?

12. Qu significan los resultados con respecto a la osmolaridad de la papa?

13. Variar este resultado con un cambio en temperatura?

INFORMACIN ADICIONAL Recursos del tema se pueden encontrar en: Solomon, Berg & Martin (2004). Biology, 7th Ed. Brooks Cole Publ. http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/D/Diffusi on.html http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=mcb.chapter. http://www.biology-online.org/9/3_movement_molecules.htm http://en.wikipedia.org/wiki/Cell_membrane

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LABORATORIO 7: LA MEMBRANA Y EL TRANSPORTE CELULAR

PLAN DE ENSEANZA PARA LOS INSTRUCTORES

Destrezas que el estudiante adquirir a partir de este laboratorio:

1. 2. 3. 4. 5. 6. Trabajo individual y grupal; debe enfatizarse la divisin ptima de tareas por grupos. Tcnicas de laboratorio y conceptos qumicos bsicos. Aplicaciones qumicas y matemticas a la biologa. Comunicacin escrita. Conceptos bsicos de la investigacin cientfica. Discusin oral.

Manejo del laboratorio:

El instructor debe introducir el tema y dar las instrucciones, asegurndose de mencionar los trminos que el estudiante debe conocer: Solvente, soluto, membrana selectivamente permeable, difusin, movimiento browniano, osmosis, solucin hipertnica, solucin hipotnica, solucin isotnica, osmolaridad, presin de turgencia y plasmlisis. Debe guiarse la introduccin para que el estudiante participe y conteste preguntas. Tambin debe repasarse el modelo de las membranas biolgicas y sus componentes principales. El orden de los ejercicios debe alterarse para optimizar el uso del tiempo; prepare el ejercicio 7.2.c primero, ya que requiere una incubacin de 2 horas. A cada estudiante se le asignar un informe corto, para entregarse la prxima semana, acerca de los resultados de Ejercicio 7.2c (incluyendo tablas y grficas).

Manejo del tiempo:

1. Introduccin ...............................................................................10 minutos 2. Preparar el ejercicio de osmolaridad de la papa (Ejercicio 7.2c) ............................................. 20 minutos 3. Preparar el ejercicio sobre el efecto de la temperatura en la remolacha (Ejercicio 7.1a) (Nota: El instructor preparar el Ejercicio 7.1 b) ... 15 minutos 4. Realizar el experimento de difusin en agua (Ejercicio 7.2 a.1).10 minutos 4. Comenzar el ejercicio de difusin de la membrana selectivamente permeable (Ejercicio 7.2 a.2) ............................................... 15 minutos 7. Observar las laminillas de sangre (Ejercicio 7.2 b.1) ....................... 15 minutos 8. Preparar la prueba de Benedict (Ejercicio 7.2 a.2) ........................ 10 minutos 9. Resultados del Ejercicio 7.2 a.2 ....................................................... 15 minutos 10. Resultados del ejercicio con remolacha (Ejercicio 7.1 a)..... 10 minutos 11. Observar laminillas de Elodea (Ejercicio 7.2 b.2) ...................... 15 minutos

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12. 13. 14. 15.

Recoger lo que se us para las pruebas del Ejercicio 7.2............ 10 minutos Prueba corta ................................................................................ 10 minutos Discutir los resultados de los Ejercicios 7.1 b, 7.2 a.2, y 7.2 b ... 15 minutos Recopilar los datos del Ejercicio 7.2c, recoger el laboratorio y discutir resultados .....................................................................10 minutos

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