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Estudio Cromatogrfico de Fenoles en Araz

DETERMINACIN DEL PERFIL DE COMPUESTOS FENLICOS EN ARAZ (Eugenia stipitata ) DETERMINATION OF PROFILE OF PHENOLIC COMPOUNDS IN ARAZ (Eugenia stipitata)
EDNA A. ARIZA Directora: Luz Patricia Restrepo

Grupo de investigacin Estudi de los Cambios Qumicos y Bioqumicos de Alimentos Frescos y Procesados. Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Bogot D. C., Colombia
Recibido Enero 20, 2012; E-mail: eaarizac@unal.edu.co

Resumen: En este proyecto se realiz el estudio de los compuestos fenlicos presentes en la pulpa y la corteza del araz en cuatro diferentes estados de maduracin (verde, pintn, maduro y sobremaduro) provenientes de la regin amaznica utilizando cromatografa liquida de alta resolucin. Se identificaron cidos fenolicos como el clorognico, glico y cafeco, encontrndose contenido de estos fenoles responsables de que el mayor la actividad

antioxidante del araz est en la corteza de este fruto, pero su concentracin disminuye durante la etapa de senescencia, sin embargo, en la pulpa la concentracin de cidos fenolicos aumenta con la maduracin. Adicionalmente se evalo la concentracin de aminocidos libres totales presente en la pulpa del araz, importante resultando ser esta parte del fruto una fuente de aminocidos libres para la dieta, donde la

concentracin aumenta con la maduracin del fruto y disminuye en la senescencia.

2 ! Abstract:

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In this project were studied of phenolic compounds present in the mesocarp and epicarp of araz in four different states of maturation (green, good looking, ripe and overripe) using high resolution liquid chromatography. Phenolic acids were identified as chlorogenic, gallic and caffeic, finding that the highest content of phenols is araz in the cortex, but its concentration decreases during the senescence stage, however, in the pulp phenolic acid concentration increases during ripening.. Additionally was evaluated the concentration of total free amino acids present in pulp araz, that part of the fruit is important source of free amino acids in the diet, where the concentration increases with fruit ripening and senescence decreases

1. INTRODUCCIN El araz (Eugenia stipitata) es cultivada en los pases de Per, Brasil, Ecuador, Colombia, Bolivia y Costa Rica. En Colombia, aunque no en grandes cultivos, se encuentra distribuida en los departamentos de Meta, Caquet, Putumayo y Amazonas, as como se encuentran algunos reportes en Cundinamarca y el eje cafetero. (Minagricultura) Estudios anteriores muestran el Araz como una fuente importante de vitamina C y compuestos fenlicos, proyectndose como un fruto benfico con un excelente potencial antioxidante. Sin embargo no hay estudios de la identidad qumica de dichos antioxidantes. Los compuestos antioxidantes, presentes en forma natural en los alimentos, cada da cobran mayor importancia debido al papel que desempean en la salud puesto que previenen y eliminan aquellas sustancias potencialmente nocivas y generadoras de desrdenes y enfermedades en el ser humano ( Vargas et al 2005). La proteccin que las frutas y los vegetales brindan contra las enfermedades degenerativas como cncer, enfermedades cardiovasculares, cerebrovasculares y sus propiedades antimutagnicas y antienvejecimiento ha sido atribuida a su alto contenido de diversos antioxidantes

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! Entre los antioxidantes ms conocidos presentes en vegetales y frutas figuran los tocoferoles, el acido ascrbico, los flavonoides, antocianinas, carotenoides, cidos fenlicos (cafeico, glico, clorognico). Los fenoles, adems de poseer propiedades antioxidantes al neutralizar los radicales libres estn relacionados con las caractersticas sensoriales como aroma y sabor. La composicin de fenoles de las frutas varia ampliamente entre los diferentes cultivos de frutas y verduras, tipo de suelo del cultivo, estado de maduracin e incluso la fertilizacin. (Waterman et al. 1994) La tcnica de cromatografa lquida de alta resolucin puede ser usada como herramienta para identificar la naturaleza qumica de los compuestos fenlicos presentes en el araz. Tambin es posible cuantificar los fenoles en los diferentes estados de maduracin presentes tanto en la pulpa como en la corteza de araz. Algunas frutas tropicales aportan entre 10 y 26% de los requerimientos mnimos diarios de muchos de los aminocidos esenciales/100 g de fruta fresca. Tambin se ha encontrado que en determinadas condiciones fisiolgicas o patolgicas algunos aminocidos se hacen esenciales. Glutamina y arginina, como compuestos fisiolgica- mente activos en la proteccin gastrointestinal. (Medina et al. 2004)

2. PARTE EXPERIMENTAL

2.1 Materiales. Frutos de araz Se utilizaron muestras comerciales adquiridas en plazas de mercado locales. De acuerdo al color de la corteza (ver tabla 1), se seleccionaron los frutos en diferentes estados de maduracin (verde, pintn, maduro y sobremaduro), stos se limpiaron para eliminarles partculas extraas y polvo de la superficie. Posteriormente se efectu una desinfeccin en hipoclorito de sodio al 0.1% durante 20 min. (Meja et al. 2006) Una vez limpios y desinfectados los frutos de araz, se sometieron a pelado y separacin de semillas de forma manual. La pulpa y la corteza obtenida se homogenizaron de forma

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! separada. Luego, se liofilizaron cada una de las partes, para aumentar su vida til y se almacenaron en bolsas de polietileno de baja densidad. Tabla 1. Escala de color del fruto de araz durante su desarrollo y maduracin (Hernndez et al. 2007)
Estado Verde Pintn Maduro Sobremaduro Color Verde mate Verde- amarillo Amarillo Amarillo oro Descripcin Color verde claro, le fruto no presenta brillo Color verde con 50% de color amarillo Color amarillo en el 100% de la superficie del fruto Color amarillo oscuro, fruto blando.

Figura 1. Color de la corteza de araz segn estado de maduracin. (1) Verde (2) pintn (3) maduro y (4) sobremaduro (Hernndez et al. 2007)

Estndares y Reactivos Los estndares de fenoles (cido glico, cido clorognico y cido cafeico) y

aminocidos empleados son marca Sigma -Aldrich con una pureza del 99.9%. Para la determinacin de aminocidos libres en pulpa de araz se empleo el Kit de aminocidos libres Agilent ZORBAX Eclipse AAA. El acetonitrilo y metanol empleados son grado HPLC marca Merck y el Agua tipo mQ se obtuvo de un sistema MILLIPORESinergy UV.

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! 2.2. Extraccin, identificacin y cuantificacin de los compuestos fenlicos Para este anlisis se pesaron 200 mg de muestra (liofilizada) en un tubo plstico cnico, se adiciono 2 mL de una solucin de metanol acidulado ( 80-19-1, metanol-agua mQHCl), se agit a temperatura ambiente en un vortex durante 1min y luego se sonico durante 1h a 40C. Se centrifug a 6000 rpm por 15min. El sobrenadante obtenido se filtr a travs de membranas PVDF de 13 mm de dimetro y 0,22 !m de tamao de poro y se inyect en el cromatgrafo para identificar y cuantificar los compuestos fenlicos. El mtodos cromatogrfico de compuestos fenlicos de desarrollo en un cromatgrafo lquido Agilent Technologies 1260 con bomba cuaternaria de presin mxima de 600 bares, inyector automtico estndar 1260 Infinity para viales de (2 ml), volumen de inyeccin de 5!L, la separacin de fenoles se obtuvo en una columna Agilent Zorbax AAA (150 x 4,6 mm, 5!m) en compartimiento termostatizado 1260 Infinity y detector de arreglo de diodos (DAD) 1260 Infinity. El gradiente empleado se describe en las tabla 2. Las dems condiciones cromatograficas se observan en la tabla 3
Tabla 2. Gradiente de elucin Fenoles Tiempo (min) 0 4 7 20 (% )Agua mQ pH 2.5 95 85 80 95 (% )ACN 5 15 20 5

Tabla 3. Condiciones cromatografcas de bomba y DAD Mtodo Flujo T columna Longitud de onda !1 = 320 Fenoles 1 mL/min 35C !2 = 280 !3= 220

La identificacin y cuantificacin de los compuestos fenlicos se realiz con patrones de cidos cafeico, clorognico y glico. La identificacin de los compuestos fenlicos fue realizada por comparacin con los patrones del tiempo de retencin y las longitudes de

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! onda de mxima absorcin ("1, "2 y "3) de los espectros UV-VIS. La cuantificacin se obtuvo mediante interpolacin en curvas de calibracin realizadas con los patrones. 2.3. Extraccin, identificacin y cuantificacin de los aminocidos libres Para este anlisis se pesaron 250 mg de muestra de pulpa (liofilizada) en un tubo plstico cnico, se adiciono 5 mL agua mQ, se agit a temperatura ambiente en un vortex durante 1min, se snico durante 20 min a 90C, terminado el tiempo se deja enfriar hasta alcanzar temperatura ambiente (Wang et al. 2010). Se centrifug a 6000 rpm por 15 min. El sobrenadante obtenido se filtr a travs de membranas PVDF de 13 mm de dimetro y 0,22 !m de tamao de poro y se inyect en el cromatgrafo para identificar y cuantificar los aminocidos libres. Para la deteccin e identificacin de aminocidos se requiere una derivatizacin pre-columna con OPA (o-ftaldehido) para aminocidos primarios y con FMOC (9-Fluorenilmetil cloroformato) para aminocidos secundarios. Esta derivatizacion del extracto de aminocidos se realiz en el inyector automtico estndar 1260 Infinity del cromatgrafo lquido Agilent Technologies 1260, mediante un programa de inyeccin. La separacin de aminocidos se obtuvo en una columna Agilent Zorbax AAA (150 x 4,6 mm, 5!m. El gradiente empleado se describe en las tabla 4. Las dems condiciones cromatograficas se observan en la tabla 5.
Tabla 4 Gradiente de elucin de aminocidos Tiempo (min) 0 1.9 18.1 18.6 22.3 26 %A 100 100 43 0 0 100 %B 0 0 57 100 100 0

* Fase mvil aminocidos: (A) Buffer de fosfato a pH 7.8; (B) ACN/MeOH/Agua (45/45/10)

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Tabla 5 Condiciones cromatografcas de bomba y DAD Mtodo Aminocidos Flujo 2 mL/min T columna 40C Longitud de onda !1 = 338 !1 = 262

La cuantificacin de cada uno de los aminocidos libres presentes en la pulpa de araz se realizo mediante interpolacin en curvas de calibracin realizadas con los patrones.
! "#$!!%&'()*)*!+,!+-./*! ! Para la determinacin de fenoles todas las medidas fueron realizadas por triplicado, se

empleo el promedio como medida de centralizacin. Para evaluar las diferencias especificas entre los valores de cada uno los parmetros evaluados se uso la prueba de diferencias mnimas significativas de Fisher (LSD) con un nivel de significancia de # = 0,05. Grficamente, letras diferentes indican diferencias significativas en los valores de las medidas realizadas.

3. RESULTADOS Y DISCUSIN 3.1 0+,&.)1)2-2)3&!4!25-&.)1)2-2)3&!+,!(/*!2/675,*./*!!1,&/()2/*!,&!(-!2/8.,9-!4! 75(7-!+,(!185./!-8-9'!!,&!+)1,8,&.,*!,*.-+/*!+,!!6-+58-2)3& La identificacin preliminar de los compuestos fenolicos presentes en la pulpa y la corteza del fruto de araz en diferentes estados de maduracin fue realizada mediante la tcnica cromatografa liquida de alta eficiencia con detector de arreglo de diodos (HPLC-DAD). En las graficas 1 y 2 se pueden observar los perfiles cromatograficos a 320, 280 y 220 nm de los extractos metanolicos de los compuestos antioxidantes obtenidos del fruto de araz en corteza y pulpa respectivamente, en los estados verde (a), pintn (b), maduro (c) y senescente (d).

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Grfica 1. Perfiles cromatograficos HPLC-DAD a 320, 280 y 2200 nm de los compuestos fenolicos extrados de la corteza del fruto de araz en los estados de madurez verde (a), pintn (b), maduro (c) y sobremaduro (d).

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Grfica 2. Perfiles cromatograficos HPLC-DAD a 320, 280 y 220 nm de los compuestos fenolicos extrados de la pulpa del fruto de araz en los estados de madurez verde (a), pintn (b), maduro (c) y sobremaduro (d).

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! Para confirmar la identidad de los compuestos, se realizo el anlisis comparativo espectral UV-VIS con los compuestos patrones de cada uno de los picos. Tal como se observa en la grafica 3. Se observo que los picos de las muestras presentan los mismos mximos de absorcin y la misma forma del espectro que los patrones correspondientes, permitiendo confirmar las identidad de los picos de acido glico, cafeico y clorognico.

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Grfica 3. Espectros de absorcin UV-VIS entre 200 y 400 nm de los compuestos fenolicos identificados preliminarmente por la tcnica HPLC-DAD en la corteza y pulpa del fruto araz. Los cidos fenlicos identificados fueron acido glico (a), clorognico (b), cafeico (c).

Una vez identificados los cidos fenlicos presentes en la pulpa y la corteza de araz, estos se cuantificaron mediante interpolacin en curvas de calibracin realizadas con los patrones. La curvas para cada acido fenlico se observa en la tabla 6.
Tabla 6. Ecuaciones de las curvas de calibracin empleadas para la cuantificacin cromatografca de los compuestos fenlicos Compuesto cido Galico cido Clorognico cido Cafeico Longitud de Onda 220nm 320nm 320nm Curva de calibracin Y=29.30213X + 0.440870 Y=14.31127X - 0.158712 446 Y=18.60603X 109+ 0.908907 R
2

0.99999 0.99998 0.99997

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Grafica 4. Cuantificacin del los cidos fenolicos por HPLC-DAD extrados del araz en diferentes estados de maduracin. (A) Corteza y (B) pulpa . V: Verde; P: Pintn; M: Maduro; SM: Sobremaduro

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! Se observo que el acido clorognico en la corteza logra un mximo en el estado pintn pero luego empieza decrecer, por el contrario este cido en la pulpa aumenta su concentracin conforme avanza la maduracin del fruto. La concentracin del cido cafeico disminuye durante la etapa de senescencia, mientras que la concentracin del acido glico tuvo una tendencia a aumentar durante la maduracin, tanto en la corteza como en la pulpa. Tambin se puede observar que el acido clorognico es el compuesto fenlico que presenta la mayor concentracin, cerca de 500g/g en el estado pintn y 500g/g en el estado maduro en la corteza y aproximadamente 115 g/g en el estado sobremaduro y 75g/g en el estado maduro en la pulpa, siendo este el compuesto que podra presentar la mayor contribucin a la capacidad antioxidante en el fruto de araz, seguido por el acido glico. Cabe resaltar que el acido clorognico el acido fenlico mas abundante en plantas y tambin el antioxidante ms activo de este grupo de compuestos. (Durn et al. 1993)

Tabla 7. Contenido total de fenoles en fruto de araz en base seca y en diferentes estados de maduracin FENOLES TOTALES ( g/g) PARTE Corteza Pulpa VERDE 289 83 PINTON 557 92 MADURO 446 109 SOBREMADURO 290 163

El mayor contenido de cidos fenlicos se obtiene en la corteza de araz

donde la

relacin en contendido con la pulpa es casi siempre el triple como se observa en la tabla 7. Al ser la pulpa la parte consumida del fruto de araz, se puede concluir que el estado de madurez ptimo de consumo del fruto para aprovechar su mximo potencial antioxidante como alimento funcional es desde el estado maduro, lo cual es producto de la sntesis de los compuestos fenlicos durante la etapa de crecimiento y desarrollo del fruto. En la corteza se observo una disminucin del contenido de compuestos fenlicos totales en la etapa de senescencia debido a la oxidacin de los compuestos fenlicos a su forma de quinonas, lo que ocasiona en esta parte del fruto una disminucin en su calidad nutricional y funcional. Este decrecimiento se da en la corteza, puesto que esta parte del

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! fruto est expuesta al dao mecnico y a las condiciones ambientales que favorecen la oxidacin enzimtica de los fenoles. En otros trabajos (Vargas et al. 2005) la medida de los compuestos fenlicos se hizo usando el reactivo de Folin-Ciocalteu y lectura espectrofotomtrica a 765 nm, por lo que se cuantificaron todos lo compuestos fenlicos totales libres presentes en el araz y no solo los cidos fenlicos; clorognico, cafeico y glico como se hizo en este estudio, en este se encuentra una disminucin del contenido de los compuestos fenlicos durante la maduracin. Sin embargo la contribucin que hace el araz en compuestos de carcter fenlico es buena al efectuar la comparacin expresando el contenido de compuestos fenlicos como mg cido glico/g pulpa en la madurez sensorial del araz (4,1 B.S. 0,64 B.H.), contra los contenidos en diversos vegetales como con crowberry (Empetrum nigrum) (50,8mg cido glico/g materia seca) y arveja (Pisum sativum) (0,4 mg cido glico/g materia seca) (Khknen et al. 1999).

7.2 !:5-&.)1)2-2)3&!+,!-6)&/'2)+/*!();8,*!,&!(-!75(7-!+,(!185./!-8-9'!!,&!+)1,8,&.,*! ,*.-+/*!+,!!6-+58-2)3&

Un total de 16 aminocidos libres fueron identificados y cuantificados en la pulpa de araz en sus cuatro estados de maduracin tal como se observa en las graficas 5 y 6. . El fruto de araz se caracteriz por un elevado contenido en acido glutmico, acido asprtico, glutamina, serina y alanina como se observa en la tabla 8. Los aminocidos como valina y lisina a la dieta. Estudios de aminocidos libres (Ovalles, et al. 2002) reportan un total de 11 aminocidos libres en el agua de coco. Los aminocidos libres encontrados en mayor proporcin (>5mg/500mL) en el agua de coco, por unidad, fueron: serina, glicina, histidina, tirosina, fenilalanina, isoleucina y leucina. En otro estudio realizado (Wang L. et al. 2010) los resultados revelaron que la teanina es el aminocido ms abundantes en el t y la flor de t cerca del 50% del total de aminocidos, seguido por la histidina. Adems el t verde (5802 g/g) contiene a una mayor cantidad de aminocidos que los t negro (2420 g/g) y resultan ser los ms significativos dentro de los aminocidos esenciales. Resultando ser la pulpa de araz una fuente adicional de aminocidos libres

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! el te oolong (1538 g/g t chino tradicional). Sin embargo la flor del t contiene mucho ms aminocidos libres (8089g/g alredor de 0.81%).

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Grfica 5. Perfiles cromatograficos HPLC-DAD a 338, y 262 nm de los aminocidos libres extrados de la pulpa del fruto de araz en los estados de madurez verde (a) y pintn (b).

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Grfica 6. Perfiles cromatograficos HPLC-DAD a 338, y 262 nm de los aminocidos libres extrados de la pulpa del fruto de araz en los estados de madurez maduro (c) y sobremaduro (d).

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Tabla 8. Contenido de cada aminocido en cada estado de madurez de la pulpa de araz % Aminocido AA ASP GLU SER GLN HIS GLY THR ARG ALA VAL MET PHE ILE LEU LYS PRO Verde 0,11 0,82 0,08 0,08 0,03 0,03 0,02 0,01 0,24 0,03 0,01 0,02 0,02 0,01 0,03 0,01 Pintn 0,10 1,39 0,03 0,05 0,03 0,03 0,00 0,02 0,21 0,02 0,01 0,01 0,01 0,01 0,02 0,01 Maduro 0,09 1,14 0,09 0,08 0,03 0,03 0,03 0,02 0,21 0,02 0,02 0,01 0,02 0,01 0,03 0,01 Sobremaduro 0,06 0,99 0,03 0,06 0,02 0,01 0,02 0,01 0,00 0,00 0,03 0,00 0,01 0,02 0,02 0,01

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Luego de hallar la concentracin de cada uno de los aminocidos, se sumo para hallar el contenido total de aminocido libres presentes en la pulpa de araz en los diferentes estados de maduracin. En la grafica 7 se observa que la concentracin de aminocidos aumenta con la maduracin del fruto y disminuye en la senescencia de este.

Grafica 7. Concentracin de aminocidos libres en pulpa de araz

17 ! 4. CONCLUSIONES

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El acido clorognico es el principal compuestos fenlico del fruto de araz tanto en su corteza como en la pulpa indicando que este compuesto, podra contribuir significativamente a la capacidad antioxidante del fruto de araz. El fruto de araz en el estado maduro presento altas concentraciones de cidos

fenlicos tanto en la pulpa como en la corteza, siendo este el estado de madurez optimo de consumo del fruto para aprovechar su mximo potencial antioxidante como alimento funcional. El contenido de aminocidos libres en la pulpa de araz resulta ser importante e interesante como otro beneficio adicional de este fruto adems del contendido de antioxidantes fenlicos. 5. BIBLIOGRAFA

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