ROLES crticos para objetivos no pRb de virus del papiloma humano tipo 16 E7 en Cervical Carcinognesis

1. 2. 3. 4. De Scott Balsitis 1 , Fred Dick 2 , 3 , Nicholas Dyson 3 , y Paul F. Lambert 1 +Afiliaciones de los autores 1. 1 McArdle Laboratorio de Investigacin del Cncer de la Universidad de la Escuela de Medicina de Wisconsin, Madison, Wisconsin;2 Departamento de Bioqumica de la Universidad de Western Ontario, London, Ontario, Canad, y3 del Massachusetts General Hospital Cancer Center, Charlestown, Massachusetts 1. Las solicitudes de separatas: Paul F. Lambert, Laboratorio McArdle de Investigacin del Cncer de la Universidad de Wisconsin Medical School, 1400 University Avenue, Madison, WI 53706. Telfono: 608-262-8533; Fax: 608262-2824, E-mail: lambert@oncology.wisc.edu . Siguiente seccin

Abstracto
Virus del papiloma humano de alto riesgo (VPH) codifican dos oncogenes, E6 y E7, expresaron en casi todos los cnceres de cuello uterino. In vivo , el VPH-16 E7 se ha demostrado que induce mltiples fenotipos en el contexto de ratones transgnicos, incluyendo el cncer de cuello de tero. E7 es una protena multifuncional conocido mejor por su capacidad para inactivar el supresor de tumor de pRb. Para determinar la importancia de PRB inactivacin por E7 en el cncer cervical, que perseguamos estudios con ratones modificados genticamente. Expresin E7 en el cuello uterino murino displasia estrgeno inducida tratada y cnceres invasivos como se inform anteriormente, pero dirigido Rb inactivacin en el epitelio cervical no era suficiente para inducir a la displasia cervical o neoplasia. Adems, E7 induce la formacin de cncer de cuello uterino, incluso cuando la interaccin E7-pRb fue interrumpido por el uso de un ratn knock-in que lleva un mutante E7 resistente Rb alelo. PRB inactivacin era necesaria pero no suficiente para E7 para superar los patrones de diferenciacin inducida-o ADN detencin del ciclo celular inducida por el dao-, y la expresin de los genes E2F-sensibles Mcm7 y ciclina E indican que otros reguladores E2F adems de pRb son objetivos importantes de E7. Juntos, estos datos indican que los objetivos no pRb de E7 desempean papeles crticos en la carcinognesis cervical. (Cancer Res. 2006; 12 (18): 9393-400)
virus del papiloma

cncer de cuello uterino

retinoblastoma

E7

E2F

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Introduccin
Los virus del papiloma humano (VPH) son virus pequeos de ADN y los agentes causantes de las verrugas epiteliales. Los llamados "virus del papiloma humano de alto riesgo" infectan el epitelio del tracto anogenital y se asocian con la aparicin de la displasia cervical, casi todos los casos de cncer de cuello uterino, muchos otros cnceres genitales, y un subconjunto de cnceres orales ( 1 - 3 ). De tipo VPH 16 cuentas para ~ 60% de todos los cnceres de cuello uterino, as como> 90% de los cnceres orales VPH-positivo ( 2 , 3 ). El genoma del VPH por lo general existe extracromosmicamente, pero muchos de los cnceres asociados al VPH contienen genomas de VPH integrado en el ADN del husped ( 4 ). Estos genomas integrados contienen invariablemente virales genes E6 y E7 intactas, y la integracin provoca su aumento de la expresin ( 5 ). Estos datos sugieren que E6 y E7 contribuyen al desarrollo de los cnceres cervicales. E7 se une a> 20 protenas celulares ( 6 ). El objetivo ms bien caracterizado de E7 es el supresor del tumor retinoblastoma, pRb. Interaccin entre E7 y pRb altera la capacidad de pRb para unirse factores de transcripcin E2F celulares, y esto inhibe la represin mediada por pRb de los genes E2F-sensibles ( 7 , 8 ) y los resultados en la degradacin proteasomal de pRb en clulas cultivadas ( 9 - 11 ). E7 puede modular la actividad de E2F por otros mecanismos; E7 tambin se dirige a las de p107 relacionadas con pRb y p130 para la degradacin de protenas, inhibe la quinasa dependiente de ciclina inhibidores (cdk) p21 y p27, y puede activar directamente tanto la ciclina A/cdk2 y E2F1 (12 - 14 ). Adems, E7 se une una amplia variedad de otras dianas celulares, a pesar de las consecuencias de estas interacciones son en gran parte poco clara ( 14 ). Muchos estudios han sugerido que la inactivacin de pRb es crtica para la funcin E7.pRb se ha conectado a todos los procesos interrumpidos por E7 in vivo , incluyendo la regulacin del ciclo celular, la diferenciacin, respuestas al dao de ADN, la sntesis de centrosoma, y la tumorignesis ( 15 - 18 ). Adems, la inactivacin de pRb es necesaria y suficiente para casi la totalidad de los efectos agudos de E7 en la piel de ratones transgnicos ( 17 , 19 ). Sin embargo, algunos estudios han indicado que los objetivos de E7 que no sea pRb tambin pueden ser importantes para los fenotipos de E7. Dos E7 mutantes deficientes en la unin a pRb pueden cooperar con E6 en la inmortalizacin de queratinocitos humanos primarios ( 20 ), y la capacidad de E7 para transactivar ciertos promotores E2F-respuesta puede depender de la unin a p107 en lugar de la unin a pRb como se muestra con la B- myb promotor ( 21 ). Adems, el E7 79-83 mutante exhibe una disminucin de la capacidad para transformar las clulas de rin de rata beb, aunque se une de manera eficiente y degrada de pRb ( 22 - 25 ). Otro mutante E7, E7CVQ68-70AAA , que tambin es capaz de unirse y desestabilizar pRb pero es deficiente en la inactivacin de p21, no logra superar la retirada del ciclo celular dependiente de la diferenciacin o de ADN detencin del ciclo celular inducida por dao en los queratinocitos humanos ( 24 , 26 ) . Adems, E7 puede contribuir a la transformacin de fibroblastos de embrin de rata a travs de la activacin de c-Jun independientemente de PRB inactivacin ( 27 ), y E7 induce anormalidades del centrosoma en clulas pRb-deficientes ( 28 ). Finalmente, E7 es capaz de producir algunos fenotipos en la piel murina independientemente de PRB inactivacin ( 17 , 19 ). De este modo, varios estudios indican que los efectos de E7 a objetivos distintos de pRb hacen importantes contribuciones a la funcin E7, aunque no ha surgido un consenso en cuanto a que los objetivos que afectan a fenotipos. VPH-16 E7 expresin por s sola es suficiente para inducir cnceres cervicales invasivos en ratones transgnicos tratados con dosis crnicas bajos de estrgenos ( 29 , 30 ). En el presente estudio, se evalu si PRB inactivacin por E7 es necesaria y / o suficiente para fenotipos de cuello uterino en ratones. Los resultados muestran que E7 contribuye de manera decisiva a la carcinognesis cervical independientemente de PRB inactivacin.Tambin se requieren objetivos no pRb de E7 para superar la diferenciacin o ADN detencin del ciclo celular inducida por el dao. Los patrones de expresin de los genes E2F-sensibles mcm7 y ciclina E mostraron que E7 modula sensible a E2F la expresin gnica a travs de mltiples vas en el cuello uterino, lo que sugiere que otros reguladores, adems de E2F de pRb son objetivos importantes de E7. Una observacin interesante final es que, cuando la interaccin E7-pRb fue abolida en el contexto de los ratones transgnicos E7, cnceres de cuello uterino surgieron en ausencia de los displsicas neoplasia intraepitelial cervical (NIC) que se observan lesiones de otro modo a lo largo

del cuello uterino en estrgeno tratado E7 ratones transgnicos en una de tipo salvaje (WT) de fondo Rb. Se discuten las implicaciones de estos hallazgos en trminos de la gnesis de los cnceres cervicales. Seccin anteriorSeccin siguiente

Materiales y Mtodos
Los ratones transgnicos. K14E7, K14CreRb Flox , y Rb ? L ratones se han descrito anteriormente ( 17 , 19 , 31 , 32 ). Todos los ratones fueron criados y mantenidos en la Asociacin Americana para la Acreditacin de aprobados-Care Laboratory Animal Fondo para el Centro de Cncer Laboratorio McArdle Cuidado Animal (Madison, WI). Todos Rbflox ratones fueron analizados como FVB retrocruzamiento 6 de un fondo 129-C57/BL6; todos Rb LxCxE ratones fueron analizados como FVB retrocruzamiento 2 de un fondo 129-C57/BL6. Todos los ratones fueron genotipados por PCR como se describe previamente ( 17 , 19 ). Una hora antes del sacrificio, todos los ratones se inyectaron ip con bromodesoxiuridina (BrdU; 10 l por g de peso corporal de 12,5 mg / ml solucin).Para los estudios de irradiacin, los ratones fueron expuestos a 0 o 12 Gy de radiacin ionizante de un 137 fuente de Cs 24 horas antes de la administracin de BrdU. El tratamiento con estrgeno y la carcinognesis cervical. Todos los anlisis se realizaron en ratones tratados con estrgenos como se ha descrito previamente ( 29 ).Cada ratn se le asign un diagnstico de acuerdo con la peor lesin cervical detectado.Los anlisis estadsticos de la incidencia de la displasia y el cncer invasivo se realizaron utilizando la prueba exacta de dos caras de Fisher. reas de seccin transversal de los cnceres invasivos se determinaron utilizando el software Zeiss Axiovision 3.1 en un microscopio Zeiss Axioskop (Thornwood, NY). reas cncer se compararon mediante una prueba de suma de rangos de Wilcoxon de dos lados. Inmunohistoqumicos y anlisis de inmunofluorescencia de la epidermis. Las tinciones inmunohistoqumicas se realizaron para BrdUrd, pRb, ciclina E, y Mcm7 como se describi previamente ( 29 ) con las siguientes modificaciones. Para BrdUrd, PRB, o tincin de ciclina E, adems desenmascaramiento se logr con 20 minutos de inmersin en HCl 2 N. Los anticuerpos primarios se diluyeron en tampn de bloqueo y se aplicaron durante 2,5 horas a temperatura ambiente: anti-pRb (01:50, clon G3-245; BD Pharmingen, San Diego, CA), anti-BrdU (01:40; Oncogene, Carpinteria, CA), anti-Mcm7 (1:200; LabVision Neomarkers, Fremont, CA), o anti-ciclina E (1:50, clon M-20; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). La cuantificacin de la prdida de pRb y la proliferacin celular. BrdU incorporacin en el ADN recin sintetizado se us como una medida de la proliferacin de queratinocitos contando secciones cervicales teidas con BrdU. Todos los ncleos de queratinocitos en ocho campos visuales fue evaluado como positivo (marrn) o negativo (azul) para la incorporacin de BrdU en tanto basal como capas suprabasales de la epidermis. A los efectos de contar, incluso las clulas ligeramente marrn se contaron como positivos. De tres a cinco ratones fueron contadas por genotipo, y los resultados se presentan como la media SD. Del mismo modo, para cuantificar la prdida de expresin de pRb, secciones de la epidermis se tieron para la pRb y se contaron.Debido a que las manchas pRb ms robusto en las clulas de la capa basal, slo los queratinocitos basales fueron contados en ocho campos visuales de ambos y el epitelio endocervical exocervical. De tres a cuatro ratones se contaron por genotipo. Los anlisis estadsticos de los resultados se realizaron mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon de dos lados. Seccin anteriorSeccin siguiente

Resultados
Rb inactivacin de cuello uterino murino. Para determinar si PRB inactivacin por E7 fue necesario que los fenotipos de cuello uterino, los ratones que expresan el VPH-16 E7 en el epitelio escamoso estratificado cervical ( K14E7 ratones;. Ref. 31 ) se acopla a ratones con una mutante Rb knock-in alelo, Rb LxCxE ( Rb ? L ), que contiene tres mutaciones de alanina en la pRb que interactan con E7, produciendo as una protena pRb mutante que no puede enlazar E7 ( 33 ). pRb ? L retiene la capacidad de unirse E2Fs, induce T 1 detencin en las clulas SAOS2 pRb-negativas, y es fosforilada y inactivado por complejos de ciclina D/CDK4 de manera similar con el WT pRb ( 34 ). pRb? L tambin reprime la expresin del gen de E2F-promotor que responde a construcciones, aunque de forma incremental menos eficazmente que WT pRb. A diferencia

PESO pRb, pRb ? L no puede enlazar protenas motivo que contienen celulares LXCXE y pRb ? L inducida-G 1 arresto no puede ser revertida mediante la expresin de VPH-16 o VPH-18 E7 ( 32 , 34 ). Para determinar si la inactivacin de pRb es suficiente para reproducir cualquiera de los fenotipos de E7, se utiliz un Rb alelo que contiene sitios loxP que rodean el tercer exn ( Rb Flox ) y se expres Cre usando la queratina 14 promotor humano de abrogar la expresin de pRb selectivamente en el epitelio escamoso estratificado . El unrecombinedRb flox alelo se comporta exactamente como el WT Rb alelos en todos los ensayos analizados. Despus de la recombinacin, el ahora frameshifted Rb flox alelo produce ninguna protena detectable e imita una lnea germinal Rb nulo alelo ( 17 , 35 ). Para verificar la prdida de expresin de pRb en K14CreRb flox / flox epidermis cervicales, pRb manchas de inmunohistoqumica fueron realizados en cualquiera de Rb flox / flox oK14CreRb flox / flox epidermis del cuello del tero de los ratones tratados con estrgenos, ya sea para 6 semanas o 6 meses. En ambos puntos de tiempo, la expresin de Cre dio como resultado una dramtica prdida de 99% de pRb detectable (intervalo de confianza del 95%, 99,0-100; . Fig. 1 Un ; datos no mostrados).

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Figura 1. Fenotipos cervicales tempranas.Secciones transversales histolgicas de epitelio cervical de ratones tratados durante 6 semanas con el estrgeno. Brown,tincin positiva; azul, . contratincin de hematoxilina La lnea de puntos, . Ubicacin de la membrana basal A, pRb inactivacin en el cuello uterino murino. tincin de pRb. B y C, la incorporacin de BrdU en el epitelio cervical. Etiquetas de tincin BrdUrd recin sintetizados ADN. B, la sntesis de ADN se limita a las dos capas de clulas ms bajas en el epitelio de control, pero la expresin de E7 induce la sntesis de ADN suprabasal. Rbdelecin en K14CreRb flox / flox cuello uterino falla para reproducir el efecto de E7. C, E7 falla para inducir la sntesis de ADN suprabasal en la presencia de la Rb ? L alelo. Patrn de tincin BrdU en K14E7Rb WT / PESO cuello uterino es indistinguible de K14E7Rb flox / flox cuello uterino (datos no presentados). Estudios de carcinognesis cervical. tratamiento de ratones con dosis bajas crnicas de estrgeno durante 6 meses los resultados en la displasia severa de cuello uterino o cncer cervical invasivo en el 100% de los tratados K14E7 ratones, mientras que poco a ninguna displasia y cncer de cuello uterino no se ven en los controles no transgnicos (30 ). Nos preguntamos si Rb inactivacin fue suficiente para reproducir este efecto carcinognico de E7 tratando Rb flox / flox , K14CreRb flox / flox o K14E7Rb flox / floxratones con estrgenos durante 6 meses y el examen de la aparicin de anormalidades cervicales (ver Materiales y Mtodos ). Como era de esperar, Rb Flox Flox / ratones no desarrollaron displasia o cncer de cuello uterino, mientras que K14E7Rb flox / floxratones siempre desarrollan CIN2 mltiple y lesiones CIN3 a menudo acompaada de carcinoma in situ (CIS), el cncer microinvasor (MIC), o cncer invasivo de gran tamao ( LIC; . Fig. 2 A ; Tabla 1 ). Todos los cnceres cervicales invasivos detectados fueron carcinomas de clulas escamosas.

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Figura 2. Los estudios de carcinognesis cervical. Secciones transversales histolgicas de epitelio cervical de ratones tratados con estrgeno durante 6 meses. Una, la expresin de E7 induce fenotipos cervicales graves, incluyendo el cncer. Control ( Rb flox / flox ) cerviz y pRb deficiente K14CreRbflox / flox cuello uterino no muestran displasia o cncer. B, Rb WT / PESO y Rb ? L /? L cuello uterino no se desarrollan displasia o cncer invasivo, pero ambos K14E7Rb ? L /? L y K14E7Rb WT / WT cuellos uterinos se desarrollan cnceres invasivos.C, pRb tincin inmunohistoqumica ( marrn ) de los cnceres invasivos deK14E7Rb WT / WT y K14Rb ? L /? L ratones. Arrows, ncleos de las clulas invasoras. Azul, counterstained con hematoxilina.
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Tabla 1. Resumen histopatologa cervical para Rb flox / flox ratones Sorprendentemente, el epitelio de cuello uterino de estrgeno tratados con pRbdeficientes K14CreRb flox / flox ratones eran visualmente indistinguible de la de la pRb-suficientes tratadas con estrgeno Rb flox / flox ratones ( Fig. 2. Un ; Tabla 1 ). Como controles, tambin examinamos tratadas con estrgeno K14E7K14CreRb WT / WTratones para controlar la posibilidad de que Cre tiene algn efecto inesperado sobre la carcinognesis independiente de Rb inactivacin. Estos ratones desarrollaron CIN2, CIN3, CIS, MIC, y lesiones LIC de manera similar a K14E7Rb peso / peso de los ratones, lo que indica que la protena Cre s mismo, no inhibe la formacin de cncer de cuello uterino (datos no mostrados). Para determinar si PRB inactivacin por E7 era necesario que los efectos cancergenos del E7 en el cuello uterino, las mujeres Rb WT / WT , K14E7Rb WT / WT , Rb ? L /? L yK14E7Rb ? L /? L ratones tambin fueron tratadas con estrgenos durante 6 meses.Como era de esperar, Rb WT / PESO epitelio mostr poca o ninguna displasia, mientras que K14E7Rb WT / PESO epitelio siempre desarroll mltiples CIN2 y / o lesiones CIN3 menudo con CIS adicional, MIC, o LIC ( Fig. 2. B ; Tabla 2 ). La nica diferencia que se observa entre el Rb WT / PESO y Rb ? L /? L epitelios fue la aparicin de reas ulceradas microscpicos en el epitelio cervical en algunos (~ 50%) de los Rb ? L /? L ratones, lo que indica que las Rb ? L /? L ratones puede haber disminuido la integridad epitelial y / o un defecto en la curacin de heridas (datos no mostrados). K14E7Rb ? L /? L ratones desarrollaron cnceres invasivos con una frecuencia similar a la observada en K14E7Rbpeso / peso de los ratones (4 de 12 frente a 5 de 14, respectivamente ; Tabla 2 ). Para determinar si haba alguna diferencia en el tamao de los cnceres invasivos enK14E7Rb ? L /? L frente K14E7Rb WT / WT ratones, se midi el rea de seccin transversal ms grande de cada cncer. El rea promedio de cncer en K14E7Rb WT / WT ratones (0,12 mm 2 ) fue mayor que en

los K14E7Rb ? L /? L ratones (0.067 mm 2 ), pero esta diferencia no fue estadsticamente significativa debido a la gran variacin dentro de cada genotipo y el nmero pequeo de los cnceres observados ( P = 0,1416). Por otra parte, no se observ ninguna diferencia consistente en la morfologa del tumor o el grado de diferenciacin de las clulas tumorales entre estos dos genotipos.
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Tabla 2. Resumen histopatologa cervical para Rb WT y Rb ? L ratones PRB inmunohistoqumica se realiz para determinar si la expresin de pRb se haba perdido en los K14E7Rb ? L /? L cnceres. tincin de pRb se observ en los ncleos de las clulas invasoras de los cuatro K14E7Rb ? L /? L cnceres, mientras que poco o ningn tincin pRb fue visto en K14E7Rb peso / peso cnceres, presumiblemente reflectantes de la capacidad de E7 para degradar la pRb ( . Fig. 2 C ) . Esto indica que las Rb ? L alelos no se perdieron durante la formacin de K14E7Rb ? L /? L cnceres. Por otra parte, el hecho de que los niveles de pRb se retienen en los K14E7Rb ? L /? Lcnceres confirma las observaciones anteriores que E7 no se puede obligar a la pRb mutante ? L protenas. Deteccin inmunohistoqumica de p16 INK4a se hizo tambin en todos los tipos de cncer para determinar si la funcin de pRb fue comprometida indirectamente por la prdida de p16 en las K14E7Rb ? L /? L cnceres. Todos los tipos de cncer, tanto en el K14E7Rb WT / PESO y K14E7Rb ? L /? L ratones mostraron niveles similares de tincin de p16, lo que indica que la prdida de p16 no sustituye PRB inactivacin por E7 en los K14E7Rb ? L /? L cnceres (datos no presentados). Combinados, estos estudios de carcinognesis cervical muestran que la inactivacin de pRb no es suficiente para inducir cnceres de cuello uterino en ratones tratados con estrgenos y que E7 es capaz de inducir la formacin de cncer de cuello uterino independientemente de PRB inactivacin en los K14E7Rb ? L /? L ratones, lo que indica que los efectos de E7 en objetivos distintos de pRb son crticas para la carcinognesis cervical. Fenotipos cervicales agudas. En trabajos anteriores, hemos demostraron que la inactivacin de pRb es necesario y suficiente para la mayora de los fenotipos de corto plazo de E7 en el epitelio cutneo de los ratones ( 17 , 19 ). Teniendo en cuenta los resultados sorprendentes descritos anteriormente, hemos examinado el epitelio de cuello uterino de ratones ms jvenes para determinar si la inactivacin de pRb es capaz de reproducir los efectos a corto plazo de E7 en el cuello uterino como en el epitelio cutneo. Para estos anlisis, los ratones fueron tratados con estrgeno durante 6 semanas para asegurar un estado-estro como en todos los ratones, evitando as variacin de fondo en el grado de hiperplasia epitelial debido al estro ciclismo. . La sntesis de ADN suprabasal Un sello distintivo de E7 es su capacidad para reprogramar las clulas suprabasales en el epitelio estratificado para apoyar la sntesis de ADN ( 36 - 38 ). Para determinar si la inactivacin de pRb es necesaria o suficiente para este efecto, inyectamos ratones con el anlogo de nucletido BrdUrd 1 hora antes del sacrificio para etiquetar el ADN recin sintetizado. Como se observa en los epitelios cutneo, la incorporacin de BrdU en E7negativo Rb WT / PESO , Rb flox / flox , o Rb ? L /? L epitelio de cuello uterino se limita principalmente a la capa de clulas basales, con unas pocas clulas BrdUrd-positivo tambin observados en la parabasales capa ( . Fig. 1B y C , cuantificado en la figura. 3 Un y B ). Como era de esperar, la expresin de E7 enRb WT / PESO o Rb flox / flox epitelios aument la frecuencia de incorporacin de BrdU en las clulas suprabasales, incluyendo las clulas de muchas capas por encima de la membrana basal ( P = 0,021; . Fig. 1 B y C , cuantificados en la figura. 3 Un y B ). Por el contrario, Rb inactivacin por Cre en K14CreRb flox / flox epitelio no indujo un aumento en la sntesis de ADN suprabasal en comparacin con los ratones de control ( Figs. 1 A y 3A ) y E7 no inducir la sntesis de ADN en suprabasal K14E7Rb ? L /? L epitelio ( las Figs. 1 C y 3 B ). Estas observaciones indican que la inactivacin de pRb es necesaria pero no suficiente para E7 para inducir la sntesis de ADN suprabasal.

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Figura 3. Efectos cuantitativos sobre la sntesis de ADN. Basales y clulas suprabasales de epitelios cervicales teidas con BrdU fueron contadas como BrdU positivo o negativo de BrdU, y la frecuencia de clulas BrdU-positivas se represent grficamente. Una, la incorporacin de BrdU en Rb floxratones. *, P <0,05, el cambio estadsticamente significativo en comparacin con Rb flox / flox . B, la incorporacin de BrdU en Rb WT y Rb ? L ratones. *, P <0,05, estadsticamente significativo aumento en la sntesis de ADN suprabasal enK14E7Rb WT / WT ratones en comparacin con todos los otros genotipos. C,E7 de expresin, pero no Rb inactivacin, impide ADN detencin del ciclo celular inducida por el dao-. Los ratones fueron expuestos a 0 o 12 Gy de radiacin ionizante 24 horas antes de la administracin de BrdU. BrdUrd frecuencia de tincin en las clulas basales se grafica. BrdUrd frecuencia de incorporacin se reduce significativamente en irradiado Rb flox / flox yK14CreRb flox / flox ratones frente a ratones no irradiado ( P <0,05). D, pRb inactivacin es necesaria para E7 para interrumpir la detencin inducida por dao de ADN. Los ratones se irradiaron y se analizaron como en ( C ).BrdUrd frecuencia de incorporacin se reduce significativamente en irradiadoRb WT / PESO , Rb ? L /? L , y K14E7Rb ? L /? L ratones en comparacin con ratones no irradiado ( P <0,05). Sorprendentemente, la expresin de E7 en los K14E7Rb flox / flox ratones tambin tuvo el efecto inesperado de reducir la frecuencia de incorporacin de BrdU en las clulas de la capa basal por ~ 40% ( P = 0,021; . Fig. 3 A ). Un efecto similar se produce por Rbinactivacin en los K14CreRb flox / flox ratones ( P = 0,021) o mediante la expresin de E7 en K14E7Rb WT / WT ratones ( P = 0,055; . Fig. 3 A y B ). Sin embargo, E7 no tuvo ningn efecto sobre la proliferacin de clulas basales en el K14E7Rb ? L /? L epitelio ( P= 0,56; . Fig. 3 B ). Este resultado contrario a la intuicin muestra que la inactivacin de pRb por Cre o E7 inhibe la proliferacin en los queratinocitos cervicales basales. La inhibicin de la respuesta al dao del ADN. expresin E7 es capaz de conducir la sntesis de ADN daado, lo que puede contribuir a la acumulacin de mutaciones y progresin a cncer ( 39 , 40 ). En la epidermis de la piel del ratn, la inactivacin de pRb es necesaria y suficiente para inhibir el ADN detencin del ciclo celular inducida por el dao-( 17 , 19 ). Para determinar si la inactivacin de pRb es suficiente para bloquear las respuestas dao del ADN en el cuello del tero, K14CreRb flox / flox ratones fueron expuestos a la radiacin ionizante de un 137 fuente de Cs, inyectados con BrdU 24 horas despus, y se sacrificaron 1 hora despus de la inyeccin. Como era de esperar, la irradiacin indujo una disminucin importante en la frecuencia de la sntesis de ADN en el epitelio cervical de Rb flox / flox ratones, pero la expresin de E7 impidi esta respuesta (. Fig. 3 C ). Por el contrario, Rb inactivacin en K14CreRb flox / flox epitelios no inhibi la respuesta al dao del ADN en el epitelio cervical ( . Fig. 3 C ). Por lo tanto, la inactivacin de pRb no es suficiente para explicar la capacidad de E7 para inhibir las respuestas dao del ADN en el cuello del tero. K14E7Rb ? L /? L y Rb ? L /? L ratones fueron irradiados para determinar si PRB inactivacin es necesario para E7 para interrumpir arresto daos inducidos por ADN. La irradiacin disminuy la frecuencia de incorporacin de BrdU en estos dos genotipos, lo que indica que la inactivacin de

pRb es necesario para E7 para interrumpir la respuesta de ADN inducida por el dao-detencin del ciclo celular ( . Fig. 3 D ). La induccin de los genes E2F-sensibles. En varios estudios, otros grupos han observado solapamiento funcional entre pRb y p107 de la protena con bolsillo relacionada. Estos estudios demostraron que la inactivacin de pRb solo era necesaria pero no suficiente para inducir fenotipos, incluyendo el aumento de la progresin del ciclo celular, la apoptosis, la resistencia a la senescencia, y retinoblastoma. Slo cuando la pRb y p107 fueron inactivadas fueron estos fenotipos observados ( 33 , 35 , 41 - 43 ).Debido a que la inactivacin de pRb tambin era necesaria pero no suficiente para mltiples fenotipos en nuestros ratones, la hiptesis de que la prdida de pRb en el cuello del tero se puede compensar funcionalmente por la accin de otros reguladores de E2F, lo que resulta en poco efecto de Rb inactivacin solo. Por el contrario, los efectos de E7 en una variedad de protenas de la va de E2F, incluyendo p107, p130, p21, p27, ciclina A, y E2F1, podran superar este efecto compensatorio ( 12 - 14 ). Si Rb prdida en K14CreRb flox / flox cuello uterino es compensado por la accin de otros organismos reguladores E2F que estn desactivados en K14E7 cuello uterino, una mayor expresin de los genes E2F-sensible debe considerarse en K14E7 cuello uterino que enK14CreRb flox / flox cuello uterino. Para probar esto, buscamos la expresin de protenas a partir de dos genes E2F-responsivos, Mcm7 y ciclina E, mediante tcnicas de inmunohistoqumica. Estos tambin fueron elegidos porque ambos Mcm7 y ciclina E se reportan biomarcadores para la deteccin y el diagnstico de las anomalas cervicales (29 ). Muy poco ciclina E se detect en Rb flox / flox cuello uterino, pero la tincin de ciclina E fue en gran medida hasta reguladas en K14E7Rb flox / flox cuello uterino, tanto basales y clulas suprabasales ( . Fig. 4 A ). Por el contrario, la prdida de pRb en K14CreRb flox / flox cuello uterino no detectable inducir la ciclina E. Este resultado muestra que E7 induce la ciclina E en mayor medida de lo que puede ser explicado por la pRb inactivacin solo.

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Figura 4. . Expresin de los genes E2F-respuesta A, secciones cervicales se tieron para la ciclina E.Brown, tincin positiva; azul, . contratincin de hematoxilina lnea de puntos, . ubicacin de la membrana basal B, secciones transversales del cuello del tero de los genotipos indicados se tieron para Mcm7. K14E7Rb WT / PESO cuello uterino era idntica aK14E7Rb Flox / Flox , por lo que no se muestra. Tincin Mcm7 en Rb flox / flox cuello uterino fue robusto en casi todas las clulas basales y en muchas de las clulas parabasales inmediatamente por encima de la capa basal.Como las clulas diferenciadas ms all y se convirti en reposo, la tincin Mcm7 disminuy rpidamente ( . Figura 4 B ). En K14E7Rb flox / flox y K14E7Rb WT / PESOcuello uterino, fuerte tincin Mcm7 se observ en todas las capas de clulas suprabasales. Curiosamente, sin embargo, E7 tambin aument la frecuencia de tincin negativa clulas basales, consistente con E7 haber causado una reduccin en el ndice de proliferacin en este compartimiento como marcado por la incorporacin de BrdU ( .

Fig. 4 B ). En K14CreRb flox / flox cuello uterino, se observ un fenotipo intermedio.Tincin Mcm7 se aument claramente en clulas suprabasales en comparacin con Rbflox / flox ratones, y no se observaron clulas basales Mcm7-negativos espordicos. Sin embargo, la intensidad de la tincin suprabasal fue disminuido constantemente en comparacin con K14E7Rb flox / flox ratones en las capas de clulas epiteliales superiores ( . Fig. 4 B ). Esto sugiere que la induccin por Mcm7 E7 puede resultar en gran parte de la inactivacin de pRb, en contraste con el resultado con la ciclina E. Para probar esta nueva, hemos examinado la tincin Mcm7 en K14E7Rb ? L /? L cuello uterino.En Rb ? L /? L epitelio, tincin Mcm7 era muy similar a la observada en Rb WT / PESO oRb flox / flox epitelio ( . Fig. 4 B ). K14E7Rb ? L /? L cuello uterino mostr mucho mayor suprabasal tincin Mcm7 que la observada sin E7, aunque la intensidad de coloracin en las capas superiores era todava menor que en K14E7Rb WT / PESO ( . Figura 4 B ). Esto indica que puede inducir la expresin de E7 Mcm7 tanto a travs de la inactivacin de pRb y por otro mecanismo. En suma, la Mcm7 y los datos de expresin de ciclina E muestran que diferentes promotores sensible a E2F se pueden activar por diferentes mecanismos y que E7 se activa sensible a E2F la expresin gnica tanto a travs de la inactivacin de pRb y a travs de otro mecanismo. Cncer de cuello uterino en ausencia de CIN. Otra observacin sorprendente fue hecho en el curso de estos estudios. En los K14E7Rb ? L /? L ratones tratados con estrgenos durante 6 meses, se observ cnceres cervicales invasivos en ausencia de displasia no invasiva CIN o lesiones de la CEI, que se cree comnmente para ser los precursores de cncer invasivo. Aunque cuatro de los 12 K14E7Rb ? L /? L ratones desarrollaron cnceres invasivos, que no detect ninguna CIN2, CIN3 o lesiones de la CEI en ninguno de los ratones, a pesar de analizar cada dcima seccin 5 mmol / L a travs de todo el espesor de cada cuello uterino ( . Fig. 5 ; Tabla 2 ). Adems, no se encontraron pruebas para la displasia proximal de los tumores. No se displasias se pudo observar ya sea en las regiones vecinas directamente los cnceres invasivos en secciones, en la que los cnceres estaban presentes, o en secciones en serie que rodean a los cnceres ( Fig. 5. ; datos no presentados). En contraste, el 100% deK14E7Rb peso / peso de los ratones tratados con estrgeno durante 6 meses desarrollado mltiples CIN2 y CIN3 lesiones en el cuello uterino, incluyendo aquellos ratones que desarrollaron carcinoma invasivo ( Fig. 5. ; Tabla 2 ). As, mientras que los cnceres de cuello uterino en la K14E7Rb WT / PESO ratones suscitaron en el marco de epitelio altamente displsicos, los cnceres en los K14E7Rb ? L /? L ratones suscitaron en el marco de lo contrario epitelio histolgicamente normal. Las implicaciones de este hallazgo se discuten a continuacin.

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Figura 5. La ausencia de lesiones CIN enK14E7Rb ? L /? L cuello uterino.Secciones representativas deK14E7Rb WT / PESO y K14E7Rb ? L /? L cuellos uterinos. Arrows,sitios de invasin del cncer en la dermis. En K14E7Rb WT / PESOcuello uterino, cncer surge de epitelio que contiene muchos cambios displsicos ( puntas de flecha ), mientras que enK14E7Rb ? L /? L cuello uterino, el cncer se observ sin cambios displsicos en el epitelio cervical en otros lugares. Seccin anteriorSeccin siguiente

Discusin
En este estudio, se realiz el primer anlisis gentico de los mecanismos moleculares de la funcin de E7 en cuello del tero intacto. Nuestro anlisis indica que los efectos de E7 a objetivos distintos de pRb son fundamentales, tanto para los de corto plazo y tumorignicos consecuencias de la expresin de E7 y que los cnceres del cuello del tero pueden desarrollar de forma independiente de las lesiones CIN. PRB inactivacin en la displasia cervical y neoplasia. Tal como se describe anteriormente ( 30 ), vimos que, despus de 6 meses de tratamiento con estrgenos, el 100% de K14E7 ratones desarrollaron numerosas CIN2 y CIN3 lesiones y muchos tipos de cncer desarrollados CIS y / o invasivos ( Fig. 2 ; las Tablas 1 y 2 ).Sorprendentemente, Rb delecin en el cuello del tero de tratado con estrgenosK14CreRb flox / flox no indujo ninguna CIN2, CIN3, CIS, o lesiones invasivas ( Fig. 2. A ;Tabla 1 ). Por lo tanto, la inactivacin de pRb por s sola no puede explicar la capacidad de E7 para inducir la displasia cervical o cncer invasivo. Se observaron cnceres invasivos en K14E7Rb ? L /? L cuello uterino a una frecuencia similar a la observada en K14E7Rb WT / PESO cuello uterino ( Tabla 2 ), y no hubo diferencias consistentes en tamao de cncer o la morfologa entre estos genotipos ( Fig. 2. ; datos no presentados ). expresin de pRb se mantuvo en los K14E7Rb ? L /? Lcnceres, que muestra que la carcinognesis en estos ratones no requera la prdida mutacional de los Rb ? L alelos ( . Fig. 2 C ). Adems, la tincin inmunohistoqumica para p16 INK4a detect p16 en todos los tipos de cncer en tanto K14E7Rb WT / PESO yK14E7Rb ? L /? L ratones (datos no presentados), lo que indica que la funcin de pRb no se ha visto comprometida indirectamente en estos tipos de cncer a travs de la prdida de expresin de p16. Estos datos no implican que la inactivacin de pRb es prescindible para la carcinognesis cervical debido a defectos parciales en funcin de pRb en el mutante Rb ? L alelo potencialmente cooperan con los efectos del E7 en otros objetivos de inducir cncer en K14E7Rb ? L /? L cuello uterino. Esta probabilidad se ve reforzada por tanto in vivo y in vitro observaciones. In vivo , se observ que Rb ? L /? L ratones desarrollan a menudo ulceraciones del epitelio cervical y vaginal en los ratones tratados con estrgenos, lo que implica que el Rb ? L /? L cuello uterino puede haber reducido la integridad epitelial, la curacin de heridas defectuosa, o algn otro defecto. in vitro , pRb? L exhibi funcin de represin de la transcripcin disminuido en comparacin con el WT pRb, lo que demuestra que este alelo mutante es defectuoso en algunos aspectos de la funcin pRb, probablemente debido a la falta de obligar LxCxE motivo- que contiene protenas celulares ( 34 ). Ms recientemente Rb ? L /? L se encontraron fibroblastos de embrin de ratn para exhibir aneuploida asociado con la metilacin del centrmero defectuoso y cromosomas mitticos rezagados ( 32 ). Por lo tanto, sigue siendo razonable la hiptesis de que los defectos en al menos algunas funciones de pRb contribuyen a la carcinognesis cervical. En cualquier caso, nuestros datos con los ratones nulos Rb condicionales muestran claramente que otras actividades moleculares de E7 hacen contribuciones importantes a la carcinognesis cervical. PRB en fenotipos cervicales agudas. En trabajos anteriores, hemos demostrado que la inactivacin de pRb es necesario y suficiente para la mayora de los efectos a corto plazo del E7 en la piel murina y el epitelio del odo ( 17 , 19 ). En contraste, nuestro anlisis de K14E7Rb ? L /? L y K14CreRb flox / flox ratones demostr que la inactivacin de pRb es necesaria pero no suficiente para inducir la sntesis de ADN suprabasal y para bloquear el ADN detencin del ciclo celular inducida por dao en el epitelio cervical ( las Figs. 1 y 3 ). Por lo tanto, las consecuencias de Rb inactivacin son muy diferentes en el cuello uterino que en los epitelios cutneo, lo que indica que los mecanismos de la funcin E7 pueden diferir en uno frente a otro tejido epitelial. Esto puede ser importante a la carcinognesis humana porque el VPH-16 se asocia con cnceres en mltiples tejidos epiteliales ( 3 , 44 ). Los estudios futuros de la funcin E7 en otros sitios fisiolgicamente relevantes, tales como la cavidad oral, determinarn si los mecanismos de la funcin E7 tambin varan entre los diferentes epitelios mucosos. Mltiples mecanismos de regulacin de la E2F por E7. Anlisis de la sensible a E2Fciclina E y mcm7 genes mostraron que E7 induce genes sensible a E2F a travs de mltiples mecanismos, de tal manera que la induccin completa de los genes E2F-respuesta requiere tanto la inactivacin de pRb y alguna otra actividad o actividades de E7 ( . Fig. 4 ). Adems, Mcm7 fue inducida en K14CreRb flox / flox cuello uterino, pero no era la ciclina E ( . Fig. 4 ), lo que implica que los diferentes genes E2F-sensibles pueden ser regulados diferencialmente, lo que puede explicar por qu los mltiples mecanismos de activacin de E2F son necesarios para la funcin E7

completo. Otros componentes de la va de E2F obligado por E7 in vitro incluyen la p107, p130, p21, p27, ciclina A/cdk2, y en s E2F1 ( 12 - 14 ), haciendo que estas excelentes candidatos para futuros estudios de la funcin E7. Ms especficamente, los estudios publicados de la funcin de p107 p107 sugieren que pueden ser de particular importancia. La observacin de que es necesaria pero no suficiente para muchos fenotipos cervicales PRB inactivacin recuerda mucho de los estudios que han demostrado que p107 pueden compensar funcionalmente la prdida de PRB en algunas circunstancias. Estos estudios identificaron mltiples fenotipos, que no se producen despus de la pRb o la inactivacin de p107 solo, pero se observan slo cuando ambos genes se inactivan de forma simultnea ( 35 , 41 - 43 ). Si p107 est de manera similar compensando la prdida de pRb en K14CreRb flox / flox cuello uterino, a continuacin, mediada-E7 inactivacin de p107 podra explicar por qu la pRb inactivacin no es suficiente para inducir fenotipos en el cuello uterino. Desafortunadamente,K14CreRb flox / flox p107 - / - ratones no sobreviven a la edad adulta (SB y PFL; datos no presentados; ref. 45 ), sern necesarios por lo que ms refinados estudios en modelos de ratn para poner a prueba esta hiptesis. Carcinognesis cervical en ausencia de CIN detectable. Al llevar a cabo este estudio, se hizo la observacin inesperada de que los cnceres cervicales pueden desarrollarse en ausencia de cualquier detectable, coexistiendo CIN o lesiones de la CEI.En concreto, mientras que los cnceres en K14E7Rb WT / WT ratones siempre desarrolladas en el contexto de un epitelio severamente displsicas, cnceres enK14E7Rb ? L /? L ratones desarrollaron en ausencia de detectable, CIN2 coexistentes, CIN3 o lesiones de la CEI ( Fig. 5. ; Tabla 2 ). Es importante destacar que la incidencia y el tamao de los cnceres invasivos fueron similares en K14E7Rb ? L /? L y K14E7Rb WT / WT ratones, con el argumento de que la velocidad a la que se presentaron los cnceres es similar. Estos resultados inesperados indican que la displasia de cuello uterino profuso y la formacin de cncer de cuello uterino visto en ratones K14E7 en el fondo PESO Rb son eventos separables. Aunque la displasia cervical y cncer cervical estn asociados con la infeccin por el VPH ( 46 , 47 ) y la probabilidad de que ambas aumentan con el tiempo ( 47 ), no hay evidencia directa de que las lesiones displsicas clnicamente aparentes son intermediarios obligados a cncer de cuello uterino. Nuestros datos de los modelos de ratn argumentaran lo contrario. Eso cncer maligno puede surgir sin enfermedad benigna abierta no tiene precedentes; en los estudios de carcinognesis qumica, carcinomas invasivos de la piel desarrollados en ratones sin p53 sin desarrollo previo de papilomas de piel benignos detectables ( 48 ). Queda por determinar en uno u otro modelo de cmo surgen estos tipos de cncer. Una hiptesis es que, en los K14E7Rb ? L /? L ratones, conversin maligna surge con tanta rapidez como para oscurecer la preexistencia de lesiones displsicas. Sin embargo, el hecho de que la incidencia y el tamao de los cnceres en los K14E7Rb ? L /? L ratones no son mayores que la observada en K14E7Rb WT / PESO ratones argumenta en contra de esta posibilidad. Por otra parte, los tipos de cncer que se presentan en losK14E7Rb ? L /? L ratones no son lo suficientemente grandes como para oscurecer la capacidad de ver las enfermedades displsicas subyacente en el cuello del tero en otras partes, sin embargo, como la displasia no era evidente en estos ratones. Una hiptesis alternativa de que estamos a favor es que tanto la displasia profusa y los tumores malignos estocsticos observados en los K14E7Rb WT / WT ratones surgen de una clula progenitora comn del tumor. Sin embargo, diferentes linajes derivados desarrollan a partir de este progenitor comn, algunos de los cuales conducen a la displasia, mientras que otros llevan a cncer franco sin precursor de enfermedad benigna clnicamente aparente. Aqu, uno tiene que sostener, adems, que los defectos en la funcin de Rb causadas por la interaccin de E7 con el WT pRb (y por lo tanto ausente en el K14E7Rb ? L /? L ratones) contribuir preferentemente a los linajes que causan displasias que son incapaces o poco probable que progresar a malignidad franca. Esta hiptesis es consistente con la observacin de que la eliminacin de las lesiones displsicas en las mujeres reduce significativamente el riesgo de cncer posterior, asumiendo que las clulas de derivados que pueden causar cnceres francas a residen proximal a la displasia; esto es una prediccin razonable dada la naturaleza focal de VPH infecciones en el cuello uterino. Hay varias implicaciones importantes para la hiptesis favorecida. En primer lugar es que los tratamientos mostrados para eliminar lesiones displsicas pueden o no pueden afectar los cnceres francas, dependiendo de si la terapia se dirige a una caracterstica compartida tanto por

el maligno, as como linajes tumorales displsicas o una caracterstica distinta slo a este ltimo. Asimismo, las alteraciones genticas / epigentica que se encuentran en lesiones displsicas pueden o pueden no ser predictivos de alteraciones que contribuyen al cncer franco, dependiendo de si el cambio surgi en una etapa temprana en la gnesis de la clula progenitora comn o en una etapa posterior en la gnesis del linaje derivado que dio lugar especficamente a la displasia. Se necesita ms investigacin para determinar si esta hiptesis, que se deriva de nuestro estudio de los cnceres asociados al VPH en un modelo de ratn, es relevante para la comprensin de la gnesis del cncer de cuello de tero humano. Seccin anteriorSeccin siguiente

Agradecimientos
Conceder una ayuda: NIH subvenciones CA64402, CA098428, y CA22443; NIH subvencin T32 GM00721 (S. Balsitis), y la Universidad de Wisconsin Centro Integral del Cncer de subvencin P30 CA014520. F. Dick es un cientfico investigador de la Sociedad Canadiense del Cncer a travs de un premio otorgado por el Instituto Nacional del Cncer de Canad. Los gastos de publicacin de este artculo fueron sufragados en parte por el pago de cargos por pgina. Este artculo debe ser, por tanto, por la presente marcado anuncio de conformidad con 18 USC Seccin 1734 exclusivamente para indicar este hecho. Damos las gracias a la instalacin de la Universidad de Wisconsin Centro Integral del Cncer de la histologa (Madison, WI) para el apoyo histolgico de expertos y Ruth Sullivan para obtener ayuda con la histopatologa. Seccin anteriorSeccin siguiente

Notas al pie
Recibido 15 de marzo 2006. Revisin recibida 27 de junio 2006. Aceptado 31 de julio 2006. 2006 Asociacin Americana para la Investigacin del Cncer. Seccin anterior

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Oncoprotena E7 del virus del papiloma humano Novela Tipo 108 A falta de la E6 Gene Induce Displasia en cultivos organotpicos de queratinocitosJ. . Virol 01 de abril 2009 83 : 2907 - 2916 Abstracto Texto completo Texto completo (PDF) Requisitos para los Receptores de Estrgeno {alpha} en un modelo de ratn para el Virus del Papiloma Humano-Associated Cncer Cervical. Cancer Res. 01 de diciembre 2008 68 : 9928 - 9934 Abstracto Texto completo Texto completo (PDF) Papel de Funciones Rb-dependientes e independientes de Rb-Virus del Papiloma E7 oncogenes en cabeza y cuello. Cancer Res. 15 de diciembre 2007 67 : 11585 - 11593 Abstracto Texto completo Texto completo (PDF)

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