TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN DAN GENOM Bagaimana anda mengidentifikasi dan mengklone gen yang diinginkan Memotong dan

menempel bagian dari DNA yang berbeda untuk menghasilkan DNA rekombinan sudah menjadi teknik yang biasa dilakukan dalam biologi molekuler. Jenis eksperimen dengan kloning menggambarkan mengenai kloning fragmen DNA berdasarkan daerah pemotongan enzim restriksi, bukan mengkloning pada gen tunggal atau bagian DNA tertentu yang diinginkan. Misalnya, jika kita menginginkan mengkloning gen insulin dengan mengambil DNA dari pancreas, memotongnya dengan enzim, kemudian DNA dicerna menjadi plasmid, anda akan mendapatkan ratusan ribu plasmid rekombinan dan bukan hanya rekombinan plasmid yang berisi gen insulin. Ahli biologi molekuler menyebut pendekatan ini dengan hotgun! kloning, karena banyak fragmen secara acak dikloning sekaligus dan tidak ada gen indi"idu secara khusus yang ditargetkan untuk kloning. #agaimana anda akan tahu mana rekombinan plasmid yang mengandung gen insulin$ %erlebih lagi, jika gen insulin tidak memiliki daerah restriksi untuk enzim restriksi yang digunakan, anda mungkin tidak memiliki plasmid rekombinan yang mengandung insulin. #ahkan jika anda tidak membuat plasmid dengan gen insulin bagaimana anda akan memisahkan ini dari plasmid rekombinan lainnya$ Jadi, bagaimana anda akan menemukan gen tertentu yang dipilih dan dilakukan klone hanya pada urutan DNA yang akan dipelajari$ &ertanyaan ini sering tidak dapat dija'ab dengan pendekatan kloning menggunakan perpustakaan DNA. Membuat pe pustakaan DNA! Membangun koleksi gen kloning #anyak strategi kloning dimulai dengan menyusun DNA perpustakaan ( koleksi fragmen DNA kloning dari organisme tertentu yang terkandung dalam bakteri atau "irus sebagai tuan rumah. &erpustakaan dapat disimpan untuk jangka 'aktu yang relatif lama dan )disaring) untuk memilih gen. Jenis perpustakaan yang biasanya digunakan untuk kloning, DNA perpustakaan genom dan perpustakaan DNA komplementer *cDNA perpustakaan+. ,ambar -.. pada halaman berikutnya menunjukkan bagaimana perpustakaan genom dan cDNA perpustakaan dibangun.

,ambar -../ &erbandingan sebuah perpustakaan DNA genom manusia dengan sebuah cDNA

Genomi" dibandingkan "DNA pe pustakaan Dalam perpustakaan genom, kromosom DNA dari jaringan yang diinginkan diisolasi kemudian dicerna dengan enzim restriksi. &roses ini menghasilkan fragmen DNA yang mencakup genom seluruh organisme. ebuah plasmid #A0, 1A0, atau "ector bakteriofage dicerna dengan enzim yang sama, DNA ligase digunakan dalam mengikat genoming DNA dan "ector DNA secara acak. ecara teori, semua fragmen DNA dalam genom akan dikloning ke "ector. 2ektor rekombinan kemudian digunakan untuk mengubah bakteri, dan masing(masing klon sel bakteri akan berisi "ektor rekombinan dengan plasmid yang mengandung fragmen DNA genomik. &ertimbangkan setiap klon adalah )buku) dalam )perpustakaan! dari fragmen DNA. alah satu kelemahan dari perpustakaan jenis ini untuk gen eucariotik adalah bah'a non ( protein ( coding ini pada DNA, yang disebut intron, diklon menjadi ekson. 3arena sebagian besar DNA dalam organisme eukariotik terdiri dari intron, banyak klon dalam pustaka genom akan berisi potongan ( non ( protein coding DNA.

Dalam perpustakaan cDNA, m4NA dari jaringan bunga diisolasi dan digunakan untuk membuat perpustakaan. Namun m4NA tidak dapat dipotong langsung dengan enzim restriksi, sehingga harus dikon"ersi ke molekul DNA beruntai ganda. ebuah enzim yang disebut re"erse transcriptase *4%+ digunakan untuk mengkatalisis sintesis DNA beruntai tunggal dari m4NA. 5nzim ini adalah pasangan dari "irus yang disebut retro"irus ( dinamakan demikian karena mereka adalah pengecualian untuk aliran biasa informasi genetik. Alih(alih memiliki genom DNA yang dapat digunakan untuk membuat 4NA, retro"irus memiliki genom 4NA. etelah menginfeksi sel inang, mereka menggunakan 4% untuk mengubah 4NA menjadi DNA, sehingga mereka dapat direplikasi. 672, agen penyebab de A7D , adalah retro"irus. eperti yang akan kita bahas, retro"irus juga memiliki replikasi penting dalam bioteknologi sebagai terapi gen "ektor *#ab 88+. 3arena 4% mensintesis DNA yang daftar salinan dari m4NA, hal itu disebut DNA komplementer *cDNA+. m4NA yang terdegradasi oleh pengobatan dengan larutan alkali atau pencerna enzimatis/ maka DNA polimerase digunakan untuk mensintesis untai kedua untuk membuat double(stranded cDNA 3arena urutan cDNA tidak perlu memiliki situs yang mudah di setiap akhir, pendek, double(stranded urutan DNA yang disebut urutan linker ditambahkan ke akhir cDNA. 9inker mengandung situs restriksi. 9inker yang berbeda untuk situs yang berbeda pembatasan tersedia secara komersial. Dengan menambahkan linker, cDNA sekarang dapat diikat ke situs pembatasan nyaman dalam "ektor pilihan, sering plasmid. &lasmid rekombinan ini kemudian digunakan untuk mengubah bakteri. 3euntungan utama perpustakaan cDNA daripada perpustakaan genom adalah karena perpustakaan cDNA merupakan koleksi gen aktif yang diekspresikan dalam sel atau jaringan dari m4NA yang diisolasi. elain itu, intron tidak dikloning di perpustakaan cDNA. ebaliknya, ketika DNA genom dikloning, mengandung intron dan ekson yang dimasukkan ke dalam bakteri, sel(sel tidak bisa menuliskan sambungan m4NA dari DNA dan menghapus intron. :ntuk alasan ini, perpustakaan cDNA biasanya lebih disukai daripada perpustakaan genom ketika mencoba untuk mengkloning dan mengekspresikan gen yang diinginkan. 3euntungan lain dari perpustakaan cDNA adalah dapat dibuat dan dipilih untuk mengisolasi gen terutama yang diekspresikan hanya dalam kondisi tertentu dalam jaringan. ebagai contoh, jika gen diekspresikan hanya dalam jaringan yang dirangsang oleh hormon, peneliti membuat perpustakaan dari sel hormon yang dirangsang untuk meningkatkan kemungkinan hormon kloning gen sensitif. &erpustakaan telah menjadi aspek biologi

molekuler dimana banyak perusahaan menjual perpustakaan yang dibuat dari berbagai jaringan dari spesies yang berbeda. alah satu kelemahan perpustakaan cDNA adalah sulit untuk membuat dan memilih jika jumlah sumber jaringan berlimpah m4NA untuk gen tidak tersedia. %api seperti yang akan dipelajari, teknik yang disebut Polymerase Chain Reaction *&04+ sering dapat memecahkan masalah ini. Library Screening etelah pustaka genom atau perpustakaan cDNA dibuat, harus disaring untuk mengidentifikasi gen yang menarik. alah satu teknik perpustakaan skrining yang paling umum disebut hibridisasi koloni *,ambar -.;+. Dalam hibridisasi koloni, koloni bakteri dari perpustakaan yang mengandung DNA rekombinan ditumbuhkan pada plate agar. Nilon atau membran nitroselulosa ditempatkan di atas plate, dan beberapa sel bakteri menempel pada membran di lokasi yang sama di mana mereka ditemukan pada plate. Jika "ektor bakteriofag digunakan, fag ditransfer ke nilon. Nilon diperlakukan dengan larutan alkali untuk melisiskan bakteri dan denaturasi DNA nya, yang mengikat nilon sebagai molekul untai tunggal. #iasanya, nilon ini kemudian diinkubasi dengan probe DNA, fragmen DNA beruntai tunggal melengkapi gen yang diinginkan karena dapat berpasangan dengan ikatan hidrogen pada DNA target yang akan di kloning. &robe dilabeli menggunakan nukleotida radioaktif atau, lebih umum, pe'arna fluorescent atau senya'a lain yang dapat digunakan untuk mengkatalisis reaksi(pelepasan cahaya disebut chemiluminescence. <at 'arna ini memungkinkan untuk melacak probe untuk menentukan di mana ia mengikat. &robe mengikat urutan komplementer pada nilon ( sebuah proses yang disebut hibridisasi.

,ambar -.; 3oloni 6ibridisasi= &erpustakaan skrining dengan DNA &robe untuk mengidentifikasi kloning gen yang diinginkan. Nilon tersebut kemudian dicuci untuk menghilangkan kelebihan probe terikat dan terkena film fotografi dalam proses yang disebut autoradiografi. Di mana saja probe telah terikat pada filter, radioakti"itas dari probe radioaktif atau dirilis cahaya *fluoresensi atau chemiluminescence+ dari probe non radioaktif memperlihatkan butir perak dalam film. %ergantung pada banyaknya gen yang diinginkan, mungkin ada hanya beberapa koloni *atau plak+ pada filter yang berhibridisasi dengan probe. >ilm dikembangkan untuk membuat catatan permanen, disebut autoradiogram *atau autoradiograf+, yang kemudian dibandingkan dengan pelat asli koloni bakteri untuk mengidentifikasi koloni berisi plasmid rekombinan dengan gen yang diinginkan. 3oloni ini sekarang dapat tumbuh pada skala yang lebih besar

untuk mengisolasi DNA kloning.

ering kali, ketika hibridisasi dilakukan dengan

menggunakan probe neon atau chemiluminescent, instrumen pencitraan digital dapat digunakan untuk mendeteksi mengikat probe dan kemudian foto selaras dengan lempeng bakteri untuk mengidentifikasi koloni menarik. &erpustakaan screening jarang menyebabkan isolasi klon yang mengandung gen full( length. 6al ini lebih umum untuk mendapatkan klon dengan potongan(potongan kecil dari gen yang diinginkan *salah satu alasan mengapa hal ini terjadi dengan cDNA perpustakaan karena mungkin sulit untuk mengisolasi full(length m4NA atau mensintesis full(length cDNA untuk gen yang diinginkan+. 3etika potongan(potongan kecil gen dikloning, para ilmu'an mengurutkan potongan(potongan ini dan mencari urutan tumpang tindih. %umpang %indih fragmen DNA kemudian dapat disatukan seperti teka(teki dalam upaya untuk merekonstruksi gen full(length. 6al ini sering membutuhkan skrining perpustakaan beberapa kali, dengan sejumlah besar bakteri yang berlapis dan digunakan untuk hibridisasi koloni. Mencari start dan kodon stop di bagian se?uen adalah salah satu cara untuk memprediksi apakah seluruh gen telah disatukan. Melalui proses ini, fragmen tumpang tindih dapat disatukan untuk merakit seluruh gen. #olyme ase $%ain Rea"tion Meskipun perpustakaan sangat efektif dan biasanya digunakan untuk kloning dan mengidentifikasi gen yang diinginkan, rantai reaksi polimerase *&04+ adalah pendekatan yang jauh lebih cepat daripada menciptakan kloning dan skrining perpustakaan. &04 merupakan teknik yang sering menjadi pilihan ketika kloning gen tetapi juga memiliki banyak aplikasi lainnya. Dikembangkan pada pertengahan 8@AB(an oleh 3ary Mullis, &04 ternyata teknik re"olusioner yang telah berdampak pada banyak bidang biologi molekuler. &ada tahun 8@@-, Mullis memenangkan hadiah Nobel 3imia untuk penemuan ini. &04 adalah teknik untuk membuat salinan atau memperkuat urutan DNA tertentu dalam 'aktu singkat. 3onsep di balik reaksi &04 adalah sangat sederhana. %arget DNA harus diperkuat ditambahkan ke tabung berdinding tipis dan dicampur dengan asam deoksiribonukleat *dA%&, d0%&, d,%&, d%%&+, buffer, dan DNA polimerase. atu set pasangan primer ditambahkan ke campuran. &rimer adalah oligonukleotida DNA berantai(tunggal pendek yang biasanya sekitar CB sampai -B panjang nukleotida. &rimer ini melengkapi nukleotida yang mengapit ujung berla'anan dari DNA target yang akan diperkuat *,ambar -.D+.

,ambar -.6 Polymerase Chain Reaction

%abung reaksi kemudian ditempatkan dalam thermal cycler. Dalam arti yang paling sederhana, sebuah pengendara sepeda termal adalah blok pemanas canggih yang mampu dengan cepat perubahan suhu selama inter"al 'aktu yang sangat singkat. %he thermal cycler mengambil sampel melalui serangkaian reaksi yang disebut siklus &04 *,ambar -.D+. setiap siklus terdiri dari tiga tahap. &ada tahap pertama, yang disebut denaturasi, tabung reaksi dipanaskan sekitar @.B0 untuk @DB0, menyebabkan pemisahan dari DNA target ke dalam alur tunggal. &ada tahap kedua, yang disebut hibridisasi *atau annealing+, tabung kemudian didinginkan sedikit antara ;;B0 dan D;B0, yang memungkinkan primer untuk ikatan hidrogen untuk basa komplementer pada ujung(ujung urutan target. elama perpanjangan *atau

elongasi+, tahap terakhir dari siklus &04, suhu biasanya sedikit terangkat *sekitar EB B0 sampai E;B0+, dan salinan DNA polimerase target DNA dengan cara mengikat ujung - Fdari primer masing(masing dan menggunakan primer sebagai template. DNA polimerase menambahkan nukleotida ke ujung - Fdari masing(masing primer untuk mensintesis untai komplementer. Di akhir dari satu siklus lengkap, sejumlah DNA target telah digandakan. &engulangan suhu pada ketiga tahap ini tergantung pada jumlah dari siklus yang ditentukan oleh peneliti, biasanya CB(-B siklus. 3euntungan utama dari &04 adalah kemampuan untuk memperbanyak hingga jutaan salinan dari DNA target dari jumlah yang yang sangat sedikit pada materi a'al pada 'aktu yang singkat. 3arena target DNA digandakan pada setiap siklus &04, setelah CB siklus &04, kira(kira 8 juta kopi *C CB+ dari target DNA akan dihasilkan dari reaksi yang dimulai dengan satu molekul target DNA. atu kunci dari &04 adalah tipe dari DNA polimerase yang digunakan pada reaksi. &emanasan yang diulang dan pendinginan yang dibutuhkan untuk &04 akan mendenaturasi dan menghancurkan sebagian besar DNA polimerase setelah beberapa siklus. #ebeapa bahan dari &04 yang cocok untuk DNA polimerase telah tersedia. alah satu enzim dan paling populer untuk &04 dikenal dengan nama Taq DNA polimerase. Taq diisolasi dari domain Archaea, Thermus aquaticus, spesies yang dapat hidup di mata air panas. 3arena T. aquaticus dapat beradaptasi untuk dapat dapat hidup pada air panas *pertama kali ditemukan di mata air panas di 1ello'stone National &ark+, telah menge"olusi DNA polimerase yang dapat tahan pada suhu tinggi. 3arena %a? stabil pada suhu tinggi, ia dapat tahan pada perubahan suhu yang penting untuk &04 tanpa terdenaturasi. %hermosable polymerase seperti %a? diutuhkan untuk &04. Ada banyak "ariasi dan perbedaan penerapan pada teknologi &04. ebagai contoh, real(time atau kuantitatif &04 *?&04+, digunakan penyiklus suhu khusus yang memberikan peneliti untuk mengukur reaksi amplifikasi sesuai yang diinginkan peneliti. 3ita akan mendiskusikan ?&04 nanti pada bab ini. &etunjuk tepat pada &04 dapat dilihat pada 0old pring 6arbor DNA 9earning 0enter 'ebsite pada 0ompanion Gebsite. Aplikasi &04 telah tersebar luas pada penelitian dan obat(obatan, seperti membuat penyelidikan DNA, mempelajari ekspresi gen, memperbanyak jumlah menit dari DNA untuk meneteksi patogen "iral dan infeksi bakteri, memperbanyak DNA untuk mendiagnosis kondisi genetik, mendeteksi jejak DNA dari jaringan pada kejadian perkara, dan bahkan

memperbanyak DNA purba dari jaringan fosil dinosaurus *gambar -.E+. #anyak penerapan &04 dideskripsikan diseluruh buku. # oduk Kloning #$R &04 sering digunakan oleh pendekatan kepustakaan untuk kloning gen karena sangat cepat dan efektif. 3ekurangan kloning &04 adalah untuk mendesain primer, anda harus tahu sesuatu tentang sekuens DNA yang diinginkan. 3loning dengan &04 mudah jika gen telah diklon dari spesies lain(sebagai contoh, penggunaan primer untuk gen yang diklon sebelumnya pada tikus untuk mengklon gen yang sama pada manusia. Ada banyak cara untuk mengklon gen dengan &04. atu pendekatan modern untuk kloning &04 memberikan manfaat dari thermosable polymerase. aat DNA dikopi, %a? dan polimerase lain digunakan secara normal menambahkan satu nukleotida adenin pada ujung -H dari seluruh produk &04. etelah memperbanyak gen target, produk &04 yang telah diklon dapat disambung pada &lasmid yang disebut "ektor %. "ektor % terdiri dari satu unting nukleotida timin pada setiap ujung yang dapat melengkapi pasangan basa dengan nukleotida adenin pada produk &04 yang menggantung. etelah disambung pada "ektor %, rekombinan plasmid yang berisi produk klon &04 dapat dikenalkan kepada bakteri dan sekuen nukleotida dapat ditentukan. ekarang anda telah mempelajari beberapa dari banyak strategi yang digunakan untuk kloning gen, pada seksi selanjutnya, kita akan mempelajari berbagai pendekatan yang peneliti gunakan untuk mempelajari kloning gen.