INTRODUCCIN A LAS TCNICAS DE DETECCIN DE CIDOS NUCLICOS (N.A.T.

BIOQ. LILIANA DI TULLIO BUDASSI FAC. CS .BIOQUMICAS Y FARMACUTICAS UNIVERSIDAD NACIONAL DE ROSARIO lilianadt2003@yahoo.com.ar

INFECCIONES TRANSMISIBLES POR TRANSFUSIN

Patgenos transmisibles por transfusin

Virus

Virus de la Hepatitis B (HBV) Virus de la Hepatitis C (HCV) Virus de la Inmunodeficiencia Humana 1 y 2 (HIV1/2) Virus Linfotrpico Humano I/II (HTLV I/II) otros: H1N1, virus del Dengue, West Nile Virus Trypanosoma cruzi (Enf. de Chagas-Mazza) otros: Plasmodium malariae, Pl falciparum

Parsitos

Bacterias

Treponema pallidum (Sfilis) Brucella abortus (Brucelosis) otros

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Agentes no convencionales-Priones

TAMIZAJE DE INFECCIONES TRANSMISIBLES POR TRANSFUSIN EN ARGENTINA (LEY 22.990 - LEY NACIONAL DE SANGRE )

HVB: Enzimoinmunoensayos HBsAg y anti-HBc total

HCV :Enzimoinmunoensayo anti- HCV y Ag HCV HIV1/2 : Enzimoinmunoensayo ag-p24 y anti-HIV1/2 HTLV I/II: Enzimoinmunoensayo anti-HTLV I/II Chagas : Enzimoinmunoensayo y Hemaglutinacin indirecta, ambos anti-

Tripanosoma cruzi

Sfilis: Test de VDRL anti- Treponema pallidum

Brucelosis: Reaccin de Huddlesson, anti-Brucella abortus

TAMIZAJE DE INFECCIONES TRANSMISIBLES POR TRANSFUSIN

Mtodos indirectos: deteccin en la sangre (suero o plasma) del donante de la presencia de una respuesta inmune contra un patgeno dado

Diagnstico serolgico mediante diferentes tcnicas de laboratorio Ej: anlisis en bsqueda de anticuerpos especficos contra HIV en el suero del donante (EIA anti-HIV 0/1/2)

Mtodos directos: deteccin directa de la presencia del patgeno (genoma o antgenos) en la sangre del donante
Ej: EIA para detectar p24 HIV, HBsAg o HCV ag Tcnicas de biologa molecular: buscan el DNA o RNA viral

FACTORES DE RIESGO EN LA TRANSMISIN DE

INFECCIONES A TRAVS DE LAS TRANSFUSIN

Errores humanos o de laboratorio Problemas en los sistemas de anlisis/equipos Insuficiencias en la calidad de los anlisis Entrenamiento deficitario

Seroconversiones atpicas
Variantes o genotipos del patgeno no detectadas

Cambios epidemiolgicos
Periodo de ventana serolgico
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PERODO VENTANA
TIEMPO ENTRE EL MOMENTO DE LA INFECCIN Y EL

DESARROLLO DE MARCADORES SEROLGICOS

Perodo Ventana: NAT

Reaccin inmune
Reactivo Serolgico

Eclipse

Infeccin

Tiempo

EVOLUCIN
Riesgo de infeccin por unidad transfundida
1/100

DEL RIESGO EN LA PROVISIN DE SANGRE

HCV HBV

1/1000

1/10,000

1/100,000

HIV

1/180,000

1/1.600,000
1/1000,000 1/1.900,000

Ac Anti-HIV
1985

Ac Anti-HCV
1990

p24
1996 Ao 1999

NAT
2001

Bacterial Contamination of Blood Components: Risks, Strategies, and Regulation Hillyer et al. Joint ASH and AABB Educational Session in Transfusion Medicine. Hematology 2003

NUCLEIC ACID TESTING

Ventajas de NAT
Importante avance teconolgico en screening de sangre

Altamente sensible & especfico dirigido especificamente a las secuencias nuclicas virales Deteccin directa del RNA or DNA viral
Ayuda a la prevencin de transfusin enfermedades transmisibles por

Provee una etapa adicional de seguridad a la provisin de sangre segura

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Reduce el Perodo Ventana desde la infeccin hasta la deteccin

OBJETIVO DE NAT O DGV:

DISMINUCIN DEL PERODO DE VENTANA

NAT positivo
Eclipse

Virus

Perodo Ventana

Reaccin inmune

Reactividad Serolgica
Tiempo
9

Infeccin

Deteccin ms temprana

EJ: EVOLUCIN CLNICA DE HIV: DNDE ACTA NAT?

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EVOLUCIN EN LA IMPLEMENTACIN DE LAS TCNICAS NAT EN LOS BANCOS DE SANGRE

1993 se considera formalmente la utilizacin de NAT para el tamizaje en bancos de sangre, luego que la Food and Drug Administration (FDA) reportara diversos casos de infeccin por el VHC como consecuencia del uso de inmunoglubulina intravenosa manufacturada.

1995 Comit Europeo para Productos Medicinales Manufacturados (CPMP) se adhiri a este lineamiento, hacindolo extensivo a todos los productos medicinales derivados del plasma. 1997 Organizacin Mundial de la Salud (OMS) se establecen estndares para el ADN del VHB, el ARN del VHI-1, el ARN del VHC y el ADN del Parvovirus B19.
2000-2001 diferentes pases incorporan paulatinamente NAT para HCV y HIV en el tamizaje de donaciones. 2009 OMS en su documento Recommendations: Screening Donated Blood for Transfusion-Transmisibles Infection sugiere que junto a los ensayos de tamizaje serolgicos para VHC, VIH y VHB, dirigidos a los marcadores serolgicos de antgenos y/o anticuerpos, se realice la bsqueda de cidos nuclicos virales para 11 estos patgenos.

PERODO VENTANA
MODEL TESTING DATA

Fuente: Busch et al. Transfusion.2005;45(2):254-264. Kleinman and Busch. Transfusion. 2006;36:S23-S29 .

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VENTAJAS NAT
VIRUS Pruebas serolgicas VIH (incluye p24) NAT MP (Minipool) NAT ID (Individual)

16 das

10 das

7 das

VHC
VHB

70 das
59 das

9 das
49 das

7 das
38 das

Acortamiento del perodo de ventana inmunolgico Disminucin del riesgo residual

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TCNICAS BASADAS EN BIOLOGA MOLECULAR Involucran tres etapas: 1. Extraccin o captura del genoma viral 2. Amplificacin 3. Deteccin
Ejemplos:

PCR(Polymerase Chain Reaction) RT-PCR (Real Time PCR) NASBA (Nucleic Acid Based on Amplification) TMA (Transcriptional Mediated Amplification)
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PCR Real Time

PCR

TMA NASBA
Nuclisens Easy Q system
TMA: pasos principales del ensayo

Deteccin

EasyQ Instrument & Reagents

Amplificacin

NucliSens EasyQ Incubator Desktop computer Strip centrifuge

Captura del blanco o diana (target)

NucliSens EasyQ Analyzer

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MODELOS DE PROCESAMIENTO DE LAS TCNICAS NAT

Tcnicas in house Tcnicas comerciales Tcnicas Cualitativas Tcnicas Cuantitativas

Procesamiento de las muestras individuales (ID) o en mini-pools (MP)

POOL 48

POOL 24 UNIDADES

POOL 24 UNIDADES

POOL 8

POOL 8

POOL 8

POOL 8

POOL 8

POOL 8

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NAT DETECTA INFECCIN HCV MS TEMPRANO QUE EL TEST DE ANTICUERPOS

HCV GEq/mL

HCV GEq/mL 10,000,000

S/CO 5
7 das 28 das

10,000,00 100,000
10,000 1,000

4
3 2
NAT ID test

10

20 Das

30

40

1 NAT pool HCV Ac 0 50 17

Fuente: Susan Stramer, Ph.D., American Red Cross, 1999

PUNTOS IMPORTANTES A CONSIDERAR EN CUANTO AL ORIGEN DEL MTODO A ELEGIR:

Sensibilidad Especificidad Deteccin de variantes/subtipos Reproducibilidad Trazabilidad de reactivos y resultados Software adecuado Control Interno Control de Contaminacin Ensayos discriminatorios/confirmatorios Identificacin de su uso: RUO o IVD Marca CE, FDA, ANMAT
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PARA ASEGURAR LA CALIDAD DEL RESULTADO, CADA SISTEMA NAT DEBE POSEER CONTROLES ADECUADOS EN SUS DIFERENTES ETAPAS:

Controles de Reactivos: para evaluar la presencia de ADN/ARN forneo o productos de amplificaciones precedentes. Control Negativo: para evaluar los riesgos de contaminacin (en la organizacin del espacio fsico, en los mtodos de trabajo, posible aerozolizacin durante el alicuotado de reactivos) Control Positivo: para controlar la presencia de inhibidores y el buen desarrollo de las diferentes etapas. Control Interno: para verificar la idoneidad de la amplificacin y/o la presencia de inhibidores de la misma.

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Marca (s)
COBAS Ampliscreen HIV-1 Test

Formato
PCR

Muestra

Uso habilitado

Fabricante

Fecha de Aprobacin
12/20/2002

Plasma

Donor Screen Expanded Indications Roche Molecular For Use: Source Systems, Inc Plasma donors, other living donors, and organ donors
Donor Screen Expanded Indications For Use: Source Plasma donors, living organ donors and cadaveric samples Donor Screen

Procleix

HIV-1/HCV Nucleic Acid Test (TMA)

Plasma

Gen-Probe San Diego, CA 92121

02/08/2002

UltraQual HIV-1 RT-PCR Assay UltraQual HCV RTPCR Assay COBAS AmpliScreen HCV Test

PCR

Plasma
Donor Screen

National Genetics Institute Los Angeles, CA 92121 National Genetics Institute Los Angeles, CA 92121

09/18/2001

PCR

Plasma
Donor Screen Expanded Indications For Use: Source Plasma donors, other living donors, and organ donors Donor Screen Indications For Use: Source Plasma donors, other living donors, and organ donors Qualitative detection of West Nile Virus (WNV) RNA from volunteer donors

09/18/2001

PCR

Roche Molecular Systems, Inc

12/3/2002

Plasma

COBAS AmpliScreen HBV Test

Roche Molecular Systems, Inc

PCR

04/21/2005 20 12/01/2005

Plasma

Procleix WNV Assay Nucleic Acid Test (TMA) ID

Plasma

Gen-Probe San Diego, CA 92121

COMPARACIN DE LA SENSIBILIDAD ANALTICA DE LOS TEST NAT

95% Lmite de Deteccin (95% CI)

Ensayo

HIV (IU/ml) 19.62 (17.15-23.16)

323.4 (284.9-387.3)

HCV (IU/ml) 2.78 (2.44-3.37)

41.9 (28.0-111.8)

HBV (IU/ml) 7.46 (6.43-8.97)

15.99 (13.78-20.06)

WNV** (Copies/ml)

Procleix TMA*

3.4

AmpliScreen* Std preparation AmpliScreen* Multiprep

Taq Screen 15

78.4 (68.4-94.4)

28.8 (20.5-85.8)

4.41 (3.56-6.13)

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* Roches COBAS AmpliScreen US Package Inserts or Procleix Ultrio CE Package Insert ** From Busch et al. 2000.Transfusion 45, 492-499

DISEO, ACONDICIONAMIENTO E INFRAESTRUCTURA

DEL LABORATORIO DE BIOLOGA MOLECULAR

Metas principales para la instalacin:

Proporcionar

el espacio suficiente para el flujo de trabajo y mantenimiento de equipos Evitar la contaminacin Mantener la correcta temperatura , humedad y presin del ambiente
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CONDICIONES GENERALES
Nivel de seguridad 2 : BSL2 Paredes con pintura resistente a la descontaminacin (cidos o lcalis) Pisos con bordes sanitarios, antideslizante o de vinilo. Presin relativa ambiente: neutra o ligeramente negativa en rea de post-amplificacin Divisorios: gabinetes modulares a base de metal, con bordes sanitarios y puertas corredizas Mesadas: resistentes a agentes qumicos Iluminacin: compartimiento estanco Electricidad: UPS de soporte / grupo electrgeno

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REAS DEL LABORATORIO DE BIOLOGA MOLECULAR

rea de preparacin de reactivos y muestras rea de pre-amplificacin rea de post-amplificacin y deteccin

Se definen las diversas reas mediante barreras fsicas o protocolo de barreras entre un rea de trabajo y otra. Objetivo: evitar la contaminacin entre reas de trabajo diferentes
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BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR

Principal objetivo: minimizar la contaminacin a travs de Diseo del ensayo Disposicin del laboratorio Control del flujo de trabajo

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REAS DEL LABORATORIO DE BIOLOGA MOLECULAR

Post-Amplificacin

Pre-Amplificacin

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GESTIN DE LA CALIDAD EN EL LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR

Manuales de Gestin de la Calidad Manuales de procedimientos Manual de Bioseguridad Estndares y normativas:

Norma ISO 9001:2000 Norma ISO /IEC17025 /1999

Estndar Paul Erlich Institute

Organismos internacionales: OMS Collaborative Study Group (provee CCE y establece la unidad de medida: UI/ml) Acreditacin
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CONCLUSIONES (1)
Disminucin del perodo ventana Otras aplicaciones: tests que permiten una deteccin directa de otros virus. Ej: WNV, otros virus emergentes Progresar desde analizar mini-pooles a analizar muestras individuales. Lograr la implementacin de automatizacin total de las tcnicas de NAT: -disminucin de los errores del operador. -mejor estandarizacin operativa. -optimizacin de los tiempos de reaccin. -trazabilidad de los productos liberados.

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CONCLUSIONES (2)
Necesidad de lograr un consenso nacional acerca de temas puntuales referentes a la implementacin de NAT en Argentina:

la obligatoriedad de las tcnicas NAT en Medicina Transfusional, creacin de comits de expertos que evalen la necesidad de legislar el tema definicin de la logstica de centralizacin de muestras para lograr un tamizaje de manera uniforme y a un costo razonable evaluacin de resultados obtenidos hasta el momento mediante las tcnicas in house y comerciales, en pool o ID, con el objeto de definir si la sensibilidad de dichas tcnicas y su ejecucin son tiles en nuestro sistema de salud consolidacin en la formacin de los recursos humanos dedicados 29 a la aplicacin de NAT.