Conf. Univ. Dr.

Marian PETRE

METODE I TEHNICI MODERNE DE INVESTIGARE MICROBIOLOGIC A APEI

CURS DE FORMARE PROFESIONAL

2012

CUPRINS

PREFA SCURT INTRODUCERE Capitolul I REGULI DE BAZ PENTRU FUNCIONAREA UNUI LABORATOR DE ANALIZE MICROBIOLOGICE 1.1. Organizarea laboratorului de analize microbiologice 1.2. Procedurile de lucru 1.3. Instalatiile, echipamentul, instrumentarul, consumabilele, reactivii, materialele de referinta 1.4. Executarea analizelor microbiologice de laborator 1.5. Raportarea rezultatelor

Capitolul II REGLEMENTAREA ACTIVITILOR PRACTICE, SPECIFICE LABORATORULUI DE ANALIZE MICROBIOLOGICE 2.1. Reguli generale privind desfurarea corespunztoare a activitilor practice n Laboratorul de Analize Microbiologice 2.2. Msuri destinate asigurrii proteciei personalului de lucru

Capitolul III PROGRAMA ANALITIC A SUPORTULUI DE CURS - TEMA 4: METODE I TEHNICI MODERNE DE INVESTIGARE MICROBIOLOGIC A APEI 3.1. Corelare competene coninuturi 3.2. Sugestii metodologice 3.3. Fia de observare

Capitolul IV TEHNICI DE STERILIZARE A USTENSILELOR I A MATERIALELOR CONSUMABILE N LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE 4.1. Procedee de sterilizare a ustensilelor i mediilor nutritive d e cultivare a microorganismelor 4.2. Pregtirea i sterilizarea sticlriei n laboratorul de analize microbiologice

Capitolul V PREPARAREA I STERILIZAREA MEDIILOR NUTRITIVE DE CULTIVARE A MICROORGANISMELOR 5.1. Prepararea i sterilizarea mediilor nutritive de cultivare 5.2. Prepararea mediilor nutritive pentru cultivarea bacteriilor, drojdiilor i mucegaiurilor

Capitolul VI INOCULAREA I INCUBAREA PROBELOR MICROBIOLOGICE 6.1. Estimarea densitii populaiilor microbene 6.1.1. Tehnica obinerii diluiilor decimale 6.2. Inocularea culturilor microbiene 6.2.1. Inocularea n eprubete (tuburi) 6.2.1.1. Inocularea cu ansa 6.2.1.2. Inocularea cu pipeta Pasteur sau cu pipeta gradat 6.2.2. Inocularea n plci Petri 6.3. Incubarea probelor microbiologice

Capitolul VII STUDIUL CARACTERELOR MORFOLOGICE I FIZIOLOGICE ALE COLONIILOR MICROBIENE 7.1. Caractere morfologice ale bacteriilor

7.2. Caractere morfologice ale drojdiilor 7.3. Caractere morfologice ale mucegaiurilor 7.4. Determinarea vitezei de cretere a coloniilor de mucegai 7.5. Estimarea densitii populaiilor microbiene cu ajutorul camerei Thoma 7.6. Estimarea numrului de celule microbiene prin metoda culturilor 7.7. Determinarea calitii microbiene a apei 7.7.1. Determinarea numrului total de microorganisme 7.7.2. Determinarea bacteriilor coliforme

Capitolul VIII EXAMENUL MICROSCOPIC AL MICROORGANISMELOR 8.1. Examenul preparatelor n stare proaspt 8.1.1. Studiul microscopic al culturilor de drojdii 8.1.2. Studiul microscopic al culturilor de mucegaiuri 8.1.3. Evidenierea microscopic a bacteriilor 8.2. Examenul preparatelor n stare uscat 8.2.1. Tehnica de efectuare a preparatelor n stare uscat. Coloraia Gram 8.3. Determinarea dimensiunilor celulare cu scala micrometric

Capitolul IX MICROORGANISME PATOGENE TRANSMISIBILE PRIN AP 9.1. Microorganismele definiie i caracteristici principale 9.2. Specii bacteriene patogene, transmisibile prin ap 9.3. Specii fungice patogene, transmisibile prin ap 9.4. Specii de protozoare patogene, transmisibile prin ap 9.5. Bioindicatori pentru determinarea gradului de contaminare bacterian a apelor

Capitolul X TEHNICI DE ANALIZ MOLECULAR UTILIZATE PENTRU INVESTIGAREA MICROBIOLOGIC A CALITII APEI 10.1. Metode moderne de identificare chemotaxonomic a speciilor bacteriene i fungice 10.1.1. Analiza compoziiei acizilor grai - metod de identificare chemotaxonomic a bacteriilor i fungilor 10.1.2. Metode de analiz a metaboliilor secundari 10.2. Caracterizarea chemotaxonomic a bacteriilor i fungilor filamentoi, prin extracie de ADN celular i evideniere electroforetic n gel de agaroz 10.2.1. Metoda extraciei de ADN bacterian 10.2.1.1. Fragmentarea peretelui celular i eliberarea coninutului celular 10.2.1.2. Prepararea extractului brut de ADN 10.2.1.3. Purificarea extractului de ADN 10.2.2. Metoda extraciei de ADN fungic 10.2.3. Metoda reaciei n lan a polimerazei (Polymerase Chain Reaction) BIBLIOGRAFIE SELECTIV

SCURT INTRODUCERE

Apa reprezint una dintre componentele chimice indispensabile pentru existena vieii pe Terra. Proporia de ap din organismul uman variaz dup vrst: de la peste 97 % la embrionul de 7 zile, scznd treptat la 80 % la nou nscut, 60-65 % la adult i 50-55 % la vrstnic. Totodat, procentul de ap variaz dup intensitatea proceselor metabolice. Acest fapt se reflect i n proporia diferit a apei n esuturi: smal dentar 0,2 %, dentin 10 %, esut osos 22 %, esut adipos 20 %, esut cartilaginos 55 %, muchi striat 75 %, ficat 75 %, rinichi 80 %, creier (substan cenuie) 85 %, plasm sangvin 90%. Femeile avnd o proporie mai ridicat de esut adipos (relativ srac n ap), procentul de ap din organism depinde de sex: n medie 52 % la femei i 63 % la brbai. La obezi, procentul de ap poate scdea astfel pn la 40 %. n organismul uman, apa total (60% din greutatea corporal) se repartizeaz n mai multe compartimente: Apa intracelular (40 %) i apa extracelular (20 %), aceasta la rndul ei reprezentat de apa circulant = intravascular (4- 4,5 %), apa interstiial (15 % - majoritatea legat n geluri) i apa transcelular (1%). Rolurile apei n organism sunt multiple, cele mai importante fiind: - rolul structural, ca i principal component al organismului; - rolul de mediu de reacie pentru i intervenia n toate procesele metabolice; - contribuia la meninerea homeostaziei (fiind esenial pentru variate procese, ca absorbia, transportul, difuzia, osmoza, excreia etc.); - rol n metabolismul macronutrienilor (din a cror degradare rezult ap);

- surs de Ca, Mg, Na, K i alte substane utile pentru organism , dar uneori i de elemente nedorite (toxice, ageni patogeni etc.). Dinamica apei n corpul uman i bilanul hidric al organismului au fost ndelung studiate n fiziologie i sunt astzi binecunoscute, avnd largi aplicaii medicale. Deshidratarea respectiv hiperhidratarea, cu numeroasele variante fiziopatologice, sunt ntlnite n cadrul multor afeciuni i pun serioase probleme de diagnostic i tratament. Un om are nevoie n medie de circa 100 de litri de ap pe zi: 4 litri pentru nevoia fundamental, alimentar (2,5 litri pentru but i 1,5 litri prepararea hranei), 13 litri pentru splat vesela, 13 litri pentru splat rufe, 70 de litri pentru nevoi sanitare (splat pe mini i fa, du, apa pentru cltirea toaletei etc.). Variabilitatea este desigur foarte mare, n funcie de disponibilitatea i preul apei, de obiceiuri etc. Unde nu exist ap curent i consumul casnic e mai mic, iar unde trebuie crat de la mari distane sau e foarte scump se face economie. Sunt i situaii, chiar ri ntregi, unde consumul este sub minimul acceptabil i duce la consecine negative asupra igienei i sntii publice. A face baie n van n loc de du duce automat la un consum mult mai mare de ap, la fel i utilizarea frecvent de maini se splat haine, vesel etc. sau dac aceste au eficien redus din punct de vedere al consumului de ap. Pe primul plan al aciunii apei asupra sntii omului st patologia hidric infecioas. Ea este astzi un concept firesc, dar a fost acceptat public trziu i nu uor. Prima demonstraie oficial i practic a relaiei ap - epidemii a fcut-o dr. John Snow la Londra n 1854, probnd corelaia dintre epidemia de holer consumul apei din fntna de pe Broad Street i o latrin din vecintate, folosit de bolnavi de holer, determinnd oficialitile s realizeze primele canalizri. Patologia hidric infecioas a sczut semnificativ n prima parte a secolului XX, dar n ultimele decenii este statistic n cretere, acest fapt datorndu-se includerii n categoria celor transmise hidric a unor boli virale i

parazitare, care stau tot mai mult n atenia specialitilor. Bolile cu transmitere hidric continu s fac n lume zilnic peste 25.000 de victime. O statistic american pe 60 de ani (1920-1980) indic 1405 epidemii hidrice, din care 5 cu peste 10.000 cazuri, 5 ntre 5-10.000 cazuri, 9 ntre 3.5000 cazuri, 31 ntre 1-3000 cazuri, 39 ntre 500-1000 cazuri, 44 cu 300-500 cazuri, restul cu sub 300 de cazuri / epidemie. Din aceste 1405 epidemii, 603 au survenit n sisteme comunitare, 500 n sisteme non-comunitare i 302 n sisteme individuale. Spectrul de boli a cuprins zeci de afeciuni diferite. Germania a nregistrat multe epidemii hidrice, unele de mare amploare cum este cea din 1882 de la Hamburg care a provocat decesul a 8500 de persoane. n Romnia au fost nregistrate oficial n perioada 1985 - 1995 un numr de 75 de episoade de epidemii hidrice, cu un total de 10238 persoane afectate. Maximul s-a nregistrat n 1993. Se estimeaz ns c aceste date sunt mult subevaluate fa de situaia real, din cauza raportrii deficitare. Principala cale de transmitere a agenilor patogeni este cea prin ingestie (direct, sau a alimentelor contaminate prin ap), dar este posibil infectarea i prin splare i mbiere (leptospiroz, schistostomiaz, tularemie) i prin inhalare (aerosoli cu Legionella). Principalele afeciuni determinate de transmiterea (predominant sau posibil) hidric a agenilor patogeni sunt cele microbiene, virale i parazitare. Dac anumite afeciuni sunt specifice zonelor tropicale, iar altele au fost cvasieradicate n Romnia, multe dintre aceste maladii au nc o frecven ridicat n ara noastr. La nivel mondial, boala diareic este a doua cauz de deces dup bolile cardiovasculare, iar studii n ri dezvoltate arat c incidena bolilor diareice este puternic subestimat, ele fiind, contrar prerii generale, mai frecvente la vrstnici dect la copii, iar efectele socio-economice foarte importante. Un studiu pe 10 ani n Cleveland (SUA) indic boala diareic de etiologie viral ca a doua cauz de boal dup rinofaringit. Mari diferene n patologia hidric vid din diverse cauze, din care unele legate de agentul patogen. Unii ageni patogeni triesc doar n anumit climat (de

regul tropical), alii au nevoie pentru ciclul lor biologic de anumite insecte sau alte organisme vii ca s se nmuleasc. Acelai tip de surs de infecie face s ajung n ap cantiti diferite de infectant. Astfel, n cazul impurificrii fecaloide, ntr-un gram de fecale exist specii bacteriene, cum sunt: Escherichia coli i Salmonella typhi (de ordinul miliardelor de celule), Entamoeba histolitica, Vibrio cholerae, Giardia intestinalis (de ordinul milioanelor de celule), Enterovirusuri (de ordinul sutelor de milioane de entiti virale), precum i ou de Tenia solium i Ascaris lumbricolides (de ordinul zecilor de mii) etc. Timpul de supravieuire n ap a agentului patogen difer mult, n funcie de particularitile intrinseci ale acestuia, precum i de factorii de mediu extern. De aceea, unele ape contaminate masiv nu produc epidemii, deoarece prin diluie scade doza care ajunge n organismul uman sau animal, iar agenii patogeni liberi n ap, de regul, mor repede. Astfel, supravieuirea n ap este n medie de 3 luni la enterovirusuri i Escherichia coli, 2 luni la Salmonella typhi, 1 lun la Shigella sp. i Vibrio cholerae, 25 de zile la Entamoeba histolitica, precum i Giardia intestinalis. Doza infectant difer enorm de la un anumit tip de agent patogen la altul . Astfel, pentru a se mbolnvi, statistic un om trebuie s ingere n medie (doza infectant 50%) miliarde de Escherichia coli, sute de milioane de vibrioni holerici, zeci de milioane de bacteriii din specia Salmonella typhi, zeci de mii de bacterii ale speciei Shigella sp., dar numai cteva sute de enterovirusuri, cteva zeci de celule de Entamoeba hstolitica sau Giardia intestinalis, civa ascarizi sau leptospire. n mod evident, doza depinde preponderent de organismul tip gazd, de vrsta acestuia, precum i de starea sa de sntate etc. Evoluiile recente sunt foarte ngrijortoare. Succesele obinute n prima parte a secolului n combaterea bolilor infecioase cu transmitere hidric a dus la o reducere a ateniei i fondurilor alocate n acest sector, iar autoritile sunt

adesea ignorante. 2 milioane de copii mor anual prin boli diareice transmise hidric, iar numrul anual de astfel de mbolnviri se estimeaz la 900.000.000. Astfel, n rile n curs de dezvoltare, se nregistreaz anual amibiaze (400 milioane infectai, 30.000 mori), poliomielit (80 milioane infectai, 10.000 mori), febr tifoid (1 milion infectai, 25.000 mori), ascaridoz (1 miliard infectai, 20.000 mori), schistostomiaz (200 milioane infectai, 500.000 - 1.000.000 mori), trepanosomiaz (1 milion infectai, 5.000 mori), malarie (800 milioane infectai, 1.200.000 mori) etc. Calitatea microbiologic a apei este n scdere n majoritatea rilor, iar germenii sunt tot mai rezisteni la dezinfectante. Scderea imunitii populaiei, n principal prin mbuntirea general a igienei, a produs o cretere a susceptibilitii la boli hidrice. Se preconizeaz c securitatea microbiologic a apei va fi o mare problem a secolului viitor. Analiza microbiologic const n aplicarea metodelor i tehnicilor corespunztoare de analiz pentru observarea, izolarea, identificarea i cuantificarea specific a microorganismelor existente n probele examinate, n scopul stabilirii prezenei sau absenei microorganismelor nocive pentru sntatea consumatorului sau pentru conservarea calitii alimentare a produselor examinate. n acest context, analiza microbiologic a probelor de ap reprezint un capitol distinct din punct de vedere al impactului calitii surselor de ap asupra consumatorilor. Astfel, metodele i tehnicile actuale de investigare microbiologic se bazeaz pe principiile examinrii rapide i ct mai eficiente a probelor de analiz, n vederea decelrii, identificrii i cunatificrii prezenei microorganismelor patogene sau potenial patogene n produsele analizate.

10

Capitolul I

REGULI DE BAZ PENTRU FUNCIONAREA UNUI LABORATOR DE ANALIZE MICROBIOLOGICE

1.1. Organizarea laboratorului de analize microbiologice

Orice laborator care realizeaza analize microbiologice trebuie sa aiba un sistem de asigurare a calitatii bazat pe documente scrise (proceduri de operare standard pentru fiecare etapa a analizei microbiologice efactuate ca si conditiile de executie (instructiuni de lucru). Calitatea unei analize microbiologice depinde nu numai de calitatea analizei n sine ci si de organizarea generala a laboratorului, calificarea si motivarea personalului. Organizarea i managementul laboratorului Laboratorul trebuie sa aiba o identitate bine stabilita n cadrul organizatiei din care face parte sau sa aiba personalitate juridica. Organizarea si functionarea laboratorului trebuie sa ndeplineasca criteriile prevatute n prezentul document, att pentru sediul permanent, ct si pentru punctele de lucru sau facilitatile de analiza pe teren. Laboratorul va avea: a) personal de conducere cu autoritatea si competenta necesare ndeplinirii sarcinilor de serviciu; b) dovezi ca personalul de laborator nu este supus nici unei presiuni de ordin financiar sau comercial care ar putea influenta negativ calitatea muncii sale;

11

c)

acolo unde este cazul sunt nominalizati manageri adjuncti pentru a suplini personalul de conducere cnd acesta lipseste din laborator;

d)

participa la exercitii de inter-comparare ntre laboratoarele de profil.

Sistemul calitii Documentatia sistemului calitatii dintr-un laborator trebuie sa contina procedurile operationale stabilite pentru ndeplinirea criteriilor prezentei proceduri si urmatoarele documente aditionale: a) b) c) lista personalului de laborator cu semnatura autorizata; procedura laboratorului pentru realizarea trasabilitatii masurarii; unde este cazul o procedura care stabileste cum se documenteaza si se urmaresc toate modificarile introduse n activitatea de analiza curenta; d) e) f) g) h) i) descrierea metodelor de analiza utilizate; procedurile de prelevare si manipulare a probelor; procedurile pentru echipamentele majore si materialele de referinta utilizate; procedura pentru actiuni corective procedura pentru reclamatii procedura pentru pastrarea confidentialitatii si proprietatii intelectuale, daca este cazul. Atunci cnd este nevoie de implementarea unor actiuni corective, acestea trebuie documentate. Responsabilul cu asigurarea calitatii va supraveghea punerea n aplicare a acestor masuri, cu respectarea calendarului stabilit. Laboratorul va asigura calitatea rezultatelor furnizate clientilor prin implementarea unor controale periodice. Procedura de control face obiectul reviziilor periodice si va include cel putin urmatoarele aspecte: a) b) participarea la exercitii de inter-comparare si teste de capabilitate; utilizarea cu regularitate a materialelor de referinta si/sau materialelor cu caracteristici cunoscute preparate n laborator, ca parte a controlului de calitate al laboratorului; c) repetarea analizelor pe probele conservate (contra probe), unde este cazul.

12

Organizarea unui sistem de calitate n laborator este responsabilitatea unui responsabil cu asigurarea calitatii numit de director sau de seful de laborator si priveste mai multe aspecte:

Personalul - stabilirea unei organigrame a laboratorului. stabilirea fiselor de post (se asigura ca personalul sa corespunde din punct de vedere al numarului, educatiei, instruirilor periodice, cunostintelor tehnice si experientei, pentru functiile pe care le ocupa si domeniul de activitate declarat) asigura formatia personalului pentru o anumita sarcina si instruirea permanenta a personalului. Pune la dispozitia personalului procedurile de operare si instructiunile de lucru cuprinse n ghidurile de specialitate. Informeaza personalul cu privire la orice decizie sau introducere de noi POSuri sau IL-uri Laboratorul trebuie sa mentina nregistrari relevante despre calificarea, instruirea, aptitudinile, experienta si competenta personalului - normele de protectia muncii sunt cunoscute, respectate si aplicate.

Obligatiile biologului din laborator validarea analizelor (tehnica si biologica) semnarea buletinelor transmiterea lor fara ntrziere

Obligatiile personalului - trebuie sa se conformeze la toate procedurile si instructiunile de lucru n vigoare din laborator

13

Spatiul si conditiile de lucru Cladirea laboratorului, spatiile de testare, sursele de energie, iluminatul, sistemul de ncalzire si ventilatia, trebuie sa asigure coditiile optime de realizare a analizelor. Conditiile de mediu n spatiile n care se desfasoara analizele trebuie sa nu conduca la invalidarea rezultatelor sau sa influenteze negativ acuratetea si precizia masurarii. Trebuie acordata o atentie deosebita acestor aspecte atunci cnd analizele se desfasoara n alte locuri dect spatiile permanente ale laboratorului. Se va asigura o separare efectiva a spatiilor nvecinate n care se desfasoara activitati incompatibile. Accesul si utilizarea spatiilor destinate analizelor vor fi definite si controlate. Se vor asigura curatenia si buna gospodarire a laboratorului

1.2. Procedurile de lucru - se asigura ca procedurile n vigoare, scrise, verificate, aprobate, datate sunt respectate de catre personal; - se asigura revizuirile procedurilor sunt notate, aprobate, nregistrate, datate si communicate ntregului personal al laboratorului; - ntocmirea unei fise cronologice a tuturor operatiunilor (flux de lucru) care sa permita supravegherea respectarii instructiunilor de lucru; - n cazul n care se semnalizeaza o eroare de functionare sau de executare are initiativa de nlocuirii acesteia si nregistreaza modurile de corectare ntrepinse; - asigura gestionarea adecvata a arhivelor.

1.3. Instalatiile, echipamentul, instrumentarul, consumabilele, reactivii, materialele de referinta Laboratorul va fi dotat cu toate echipamentele si materialele de referinta necesare pentru desfasurarea corecta a analizelor.

14

Echipamentele vo fi mentinute n mod corespunzator, activitatea fiind documentata de proceduri. Orice echipament defect sau care produce rezultate suspecte va fi scos din uz, clar marcat si depozitat pe ct posibil ntr-un spatiu exterior zonei de desfasurare a analizelor, pna cnd va fi reparat si se va demonstra prin teste de calibrare si verificare ca a atins o performanta satisfacatoare. Laboratorul este obligat sa examineze influenta utilizarii acestui echipament asupra rezultatelor analizelor anterioare.n cazul n care laboratorul utilizeaza echipamente care nu sunt n proprietatea si/sau controlul sau, va lua toate masurile necesare pentru a se asigura ca se respecta cerintele prezentului document. Consumabilele, rectivii sunt n termen, disponibili, conservati n conditii bine definite, conform reglemetarilor n vigoare, n concordan cu evolutia cunoaterii tiinifice i tehnice Resursele informatice utilizate pentru controlul, verificarea

aparatelor sau pentru interpretarea rezultatelor sunt autorizate si cu versiuni actualizate.

Trasabilitatea masurarii si calibrarea echipamentelor de lucru Programul de calibrare/verificare si de validare a echipamentelor va fi elaborat si pus n aplicare astfel nct sa asigure trasabilitatea la sistemul national, a masurarilor efectuate de laborator. Materialele de referinta sau substantele etalon vor fi utilizate de laborator numai n scopul calibrarii, daca nu se pot prezenta dovezi obiective ca performanta lor ca materiale de referinta nu se invalideaza prin utilizare n activitatea curenta. Materialele de referinta vor fi calibrate de catre un organism care poate asigura trasabilitatea la sistemul national de masura. Laboratorul va avea un program de calibrare si verificare a materialelor de referinta.

15

Materialele de referinta vor fi trasabile ori de cte ori este posibil la sistemul national si international de masuri si greutati, sau la materialele de referinta certificate, existente la nivel national sau international.

Echipamentele de laborator Amenajare si ntretinere: constructia, localizarea - conform reglementarilor. Amenajarea trebuie sa permita izolarea activitatilor cu risc de contaminare pentru operator si/sau proba (evitnd asadar contaminarea la interior sau la exterior). Trebuie sa fie prevazute zone de stocare la diferite temperaturi a materiilor prime, a reactivilor, separate fata de zonele de stocare a probelor. Depozitarea reactivilor si a materiilor prime toxice sau periculoase se realizeaza separate si pe ambalajul lor trebuie sa fie vizibile mentiunile: "coroziv", "iritant" sau "toxic", pastrate si depozitate n conditii de securitate pentru personal si calitatea analizei probei. Trebuie sa existe proceduri scrise privind modalitatea de ntretinere a laboratorului.

Securitate: respectarea normelor regulamentare pentru evitarea riscului de incendiu si explozie. Instalatiile de distribuire a gazului trebuie sa se conformeze regulamentului si verificate de personal autorizat Substantele regulamentar. inflamabile, periculoase, radioactive trebuie conservate

Instrumentar: carti tehnice adecvat pentru toate analizele microbiologice care pot fi efectuate actualizat, aprobat ntretinut, curatat, verificat periodic (metrologic)

16

Minim necesar de echipamente pentru laboratorul de analize microbiologice: centrifuga 2 termostate dispozitiv de anaerobioza hota cu flux laminar congelator -800C, tanc azot lichid dupa caz microscop optic microscop inversat (pentru virologie) micrometru optic (pentru parazitologie) dispozitiv de colorare a lamelor

Materiale si reactivi achizitionate din surse conforme cu normele specifice folosite i conservate corespunzator, conform modului de utilizare prevazut de furnizor reactivii preparati si/sau reconstituiti n laborator trebuie sa poarte data prepararii si cea a valabilitatii solutiei obtinute. Toti reactivii expirati trebuie eliminati.

Mijloace informatice Accesul total sau partial la date trebuie limitat la personalul autorizat. Materialul informatic trebuie protejat fata de accesul extern al persoanelor neautorizate. Modificarea programelor sau a informatiilor continute trebuie realizata numai de persoane autorizate, iar modificarile trebuiesc nregistrate.

Responsabilul laboratorului trebuie sa semneze o conventie cu responsabilul de mentinere a sistemului informatic care sa prevada ca: personalul implicat respecta regulile secretului professional sistemul este configurat si protejat pentru asigurarea confidentialitatii

17

orice modificare se realizeaza de personal calificat, doar la cererea biologului si face obiectul unui proces verbal detaliat, semnat si nregistrat si postat n arhiva laboratorului.

Eliminarea deseurilor -conform legislatiei si reglementarilor n vigoare -se separa n 2 categorii: - deseuri cu risc - deseuri asimilabile celor menajere.

Deseurile cu risc sunt separate n 3 grupe: a) b) c) potential contaminate produsi toxici sau chimici produsi radioactivi Pentru fiecare din cele 3 grupe, trebuie sa existe reguli stricte privind modalitatile specifice de conditionare, de stocare, de transport, de tratare si pretratare; eventual contractarea unei societati de profil pentru realizarea acestor procedee. Deseurile asimilabile celor menajere sunt depozitate n containere care intra n circuitul de eliminare prin circuitul deseurilor menajere (cu acordul colectivitatii locale).

1.4. Executarea analizelor microbiologice de laborator Laboratorul va avea proceduri de utilizare a tuturor echipamentelor relevante, instructiuni de manipulare si pregatire pre-analitica a probelor si proceduri de lucru pentru acele metode unde lipsa unor asemenea precizari ar pune n pericol corectitudinea rezultatelor analizelor; pot fi substituite de manuale, carti, articole (ex. POS-uri) privind: modul de recoltare al probelor; identificarea probei, transportul probei, eventualele tratamente prealabile ale probei, receptia probelor, conservarea probelor nainte si dupa analize, utilizarea aparaturii, instrumentarului de laborator, IL privind utilizarea reactivilor, POS cu descrierera metodei de lucru utilizata pentru o anumita analiza, POS privind

18

transmiterea rezultatului, POS privind igiena si securitatea laboratorului, POS asigurarea calitatii, gestionarea sistemelor informationale eventual existente Toate instructiunile, standardele de metoda, manualele si literatura de referinta relevanta pentru domeniul de activitate al laboratorului, vor fi mentinute la zi si vor fi accesibile personalului de laborator. Laboratorul va avea un sistem documentat pentru identificarea unica a probelor de analizat, pentru a preveni orice confuzie legata de identitatea acestora. Laboratorul va avea proceduri si facilitati adecvate pentru a preveni deterioararea probelor n timpul depozitarii, manipularii, pregatirii si analizei. n situatiile n care probele trebuie depozitate si/sau pregatite n conditii de mediu speciale, aceste conditii vor fi asigurate, monitorizate si nregistrate. n cazul n care o proba sau o parte dint-o proba trebuie pastrate pentru repetarea analizelor (contra-proba), laboratorul va asigura toate conditiile pentru pastrarea integritatii si securitatii acesteia. Unde este cazul, laboratorul va avea proceduri pentru receptia si pastrarea n siguranta a contra-probelor Laboratorul va utiliza metode de analiza si proceduri de testare adecvate scopului, inclusiv pentru prelevarea probelor, manipularea, transportul,

depozitarea si pregatirea lor. Performantele metodelor de analiza vor respecta limita de detectie, precizia si acuratetea recomandate de legislatia n vigoare, n domeniul apei. Ori de cte ori este necasara utilizarea unei metode nestandardizate, se va obtine acordul clientului, iar metoda de analiza va fi documentata, validata si accesibila clientului sau altor persoane responsabile. Atunci cnd prelevarea probelor este parte integranta a metodei de analiza, laboratorul va documenta aceasta situatie printr-o procedura speciala. Unde este aplicabil, se vor utiliza tehnici statistice pentru esantionare.

19

Atunci cnd se utilizeaza echipamente automate asistate de calculator pentru prelevarea, pregatirea, manipularea, nregistrarea, raportarea si arhivarea rezultatelor analizelor, laboratorul se va asigura ca: a) b) c) sunt ndeplinite criteriile prezentului document; soft-ul utilizat este adecvat si documentat; sunt stabilite si implementate proceduri referitoare la protejarea integritatii datelor; aceste proceduri vor include cel putin securizarea datelor introduse, procesate, transmise, arhivate; d) calculatoarele si echipamentele automate vor fi mentinute n stare de functionarea adecvata prin asigurarea conditiilor de mediu si de operare; e) se vor stabili si implementa proceduri pentru mentinerea securitatii datelor, inclusiv prin prevenirea accesului neautorizat. Unde este cazul vor exista proceduri pentru achizitionarea, receptia si depozitarea materialelor consumabile utilizate n activitatea de laborator.

nregistrarea rezultatelor Laboratorul va mentine un sistem de nregistare a rezultatelor adecvat activitatii sale, n concordanta cu prevederile prezentului document. Laboratorul va nregistra toate observatiile si calculele originale si o copie dupa buletinele de analiza pe o perioada considerata adecvata. nregistrarile referitoare la fiecare analiza vor contine suficiente informatii pentru a permite repetarea lor. Acolo unde este cazul, nregistrarile conexe ca de exemplu calibrarile, vor fi arhivate pe o perioada considerata adecvata.

Stocarea si conservarea arhivelor rezultatele analizelor realizate trebuie pastrate 5 ani (puse la dispozitia controalelor externe de calitate) procesele verbale privind masurile luate pentru corectarea erorilor evidentiate n urma CEC - 5 ani rezultatele CIC - 3 ani

20

1 exemplar de POS-uri, IL-uri si istoria receptiilor - 3 ani contractele cu societatile de profil si documentele legate de eliminarea deseurilor - 3 ani

documentatia privind reactivii si consumabilele - pe durata utilizarii lor documentele referitoare la modificarile programelor informatice. Arhiva trebuie depozitata ntr-un loc adecvat si care sa asigure confidentialitatea datelor. Laboratorul va avea proceduri pentru nregistrarea electronica a datelor. Daca arhiva este informatica se iau masuri de evitare a pierderii de informatie (copii multiple pe CD-ROM - cel putin doua una pentru consultari, una pentru pastrare).

Raportarea rezultatelor Rezultatele fiecarei analize sau serii de analize efectuate de laborator vor fi raportate cu acuratete, clar, neambiguu si obiectiv, n conformitate cu instructiunile din metoda de analiza. Rezultatele vor fi raportate sub forma unui buletin de analiza care va include toate informatiile necesare pentru interpretarea rezultatelor si toate informatiile cerute de utilizarea metodei de analiza. Buletinul de analiza se transmite imediat ce rezultatul analizei este gata catre "client". Buletinul de analiza va include cel putin urmatoarele informatii: Titlul, de exemplu "Buletin de analiza"; Denumirea si adresa laboratorului si locul n care a fost efectuata analiza; Identificarea unica a buletinului de analiza, ca de exemplu un numar si numerotarea fiecarei pagini, ca parte din numarul total de pagini; Unde este cazul, numele si adresa clientului; Descrierea si identificarea neambigua a probelor analizate; Unde este cazul, caracterizarea probei si conditiile n care aceasta a fost analizata; Unde este cazul, data si ora la care proba a fost receptionata si data si ora la care aceasta a fost analizata;

21

Unde este cazul, specificarea metodei de analiza utilizate si descrierea neambigua a oricarei alte metode de analiza nestandardizate utilizate; Unde este cazul, detalii despre procedura de prelevare a probei; Unde este cazul, se va mentiona orice abatere de la metoda de analiza standardizata si orice alta informatie relevanta, ca de exemplu conditiile de mediu; Masurarile, examinarile si rezultatele derivate, nsotite de tabele, grafice, schite sau fotografii dupa caz si orice abateri constatate; Unde este cazul, estimarea incertitudinii n masurare; Semnatura si functia persoanei responsabile pentru continutul buletinului de analiza si data eliberarii buletinului; Unde este relevant, declaratia "rezultatele se refera exclusiv la proba analizata"; Declaratia "acest buletin de analiza nu va fi reprodus partial, fara acordul scris al laboratorului". Cnd buletinul de analiza contine rezultate ale unor analize sub-contractate, aceste rezultate vor fi clar marcate. Acolo unde este cazul, se va acorda atentie formei grafice a buletinului de analiza, astfel nct acesta sa fie usor de citit. Formatul poate fi adaptat fiecarui tip de analiza, dar antetul se recomanda a fi standardizat. Unde este cazul, materialele aditionale buletinului de analiza vor fi organizate ntr-un document separat, intitulat de exemplu "Raport suplimentar la buletinul de analiza nr..", care va primi un numar de ordine si va respecta prevederile prezentului capitol. Atunci cnd este cazul, laboratorul va notifica n scris, cu promptitudine, clientul, asupra oricarui eveniment care produce dubii asupra validitatii rezultatelor nscrise n buletinul de analiza. Unde este cazul, laboratorul va asigura transmiterea rezultatelor catre client, prin telefon, fax, alte mijloace electronice sau pe suport magnetic, pe baza unei

22

proceduri care respecta prevederile prezentului document si confidentialitatea datelor. Raportarea rezultatelor va respecta toate cerintele legislatiei n vigoare referitoare la calitatea apei potabile.

Laboratorul trebuie sa cuprinda: un local de receptie un birou de secretariat si arhiva sala de prelevare a probelor spalatorie camera pentru efectuarea analizelor microbiologice

23

Capitolul II

REGLEMENTAREA ACTIVITILOR PRACTICE, SPECIFICE LABORATORULUI DE ANALIZE MICROBIOLOGICE

2.1. Reguli generale privind desfurarea corespunztoare a activitilor practice n Laboratorul de Microbiologie

Pentru respectarea tuturor normelor i reglementrilor actuale, referitoare la efectuarea corespunztoare a activitilor practice cu profil microbiologic, este absolut necesar ntocmirea unei documentaii tehnico-tiinifice privind constituirea, amplasarea, precum i organizarea structural i funcional a Laboratorului de Microbiologie. Astfel, un asemenea laborator trebuie s cuprind trei compartimente principale, proiectate i realizate cu scopul de a asigura spaiile de lucru n mediu aseptic, precum i fluxul tehnologic de efectuare a tuturor activitilor practice specifice, i anume: 1 - un compartiment de pregtire a instrumentarului de lucru i de prepararea a mediilor de cultivare; 2 un compartiment de sterilizare a instrumentelor i a mediilor de cultivare, repartizate anterior n vase de sticl;

24

3 un compartiment de manipulare aseptic a culturilor microbiene - o sal de pregtire a mediilor i obiectelor de lucru i de decontaminare, coninnd mese, un autoclav, o etuv, un congelator i un frigider (care va fi utilizat i pentru pstrarea tulpinilor microbiene). Tot aici se poate stoca sticlria, mediile de cultur precum i reactivii. - o sal de lucrri propriu-zise, de manipulare a culturilor microbiene, la adpost de curenii de aer, dotat cu mese cu suprafa neted, rezistent, impermeabil, cu conducte de gaz i prize electrice, un sistem de vid i de aer comprimat i o hot sterilizabil, cu radiaii ultraviolete (eventual o hot cu flux laminar). n msura n care este posibil, n legtur cu aceast sal, ar trebui s existe anexe prevzute cu termostate la diferite temperaturi ( 25 0C, 300C, 370C, 440C, 550C). Manipulrile de culturi microbiene sau de produse susceptibile s conin microorganisme se efectueaz innd cont de unele tehnici part iculare prin care s se evite cele dou tipuri de contaminare: 1. contaminarea culturii sau a produsului ce trebuie analizat datorit personalului sau mediului inconjurtor; 2. contaminarea personalului sau a mediului nconjurtor de ctre microorganismele studiate. In laboratorul de microbiologie, operaia de baz este transferul de microorganisme dintr-un recipient n altul, lucrare ce se execut n zona steril de protecie din jurul flcrii becului de gaz. Sticlria cel mai des utilizat n laboratorul de microbiologie const n eprubete de diferite dimensiuni, flacoane Erlenmeyer, plci Petri, pipete Pasteur i pipete gradate. n ultima perioad sunt din ce n ce mai mult utilizate recipientele i pipetele din plastic, de unic folosin. Pentru prelevarea i inocularea culturilor se utilizeaz ansa sau firul metalic, fabricate din nicrom. Ustensilele de etalare permit repartizarea uniform a inoculului pe suprafaa mediilor solidificate i pot fi fabricate prin ndoirea unui tub sau a unei baghete

25

din sticl. n afara acestor ustensile curente de lucru, mai pot fi ntrebuinate o serie de alte instrumente, n funcie de operaia efectuat. Laboratorul de microbiologie trebuie s fie dotat cu urmtoarele aparate i echipamente: robinet cu ap cald i rece, de preferin acionat cu piciorul; hot cu flux laminar sau ni sterilizabil, indispensabil lucrrilor de microbiologie; bec de gaz tip Bunsen pentru lucrul n zona steril din jurul flcrii cu con albastru i pentru sterilizarea ansei; etuv pentru sterilizarea sticlriei; incubator cu termostat pentru incubarea culturilor microbiene de tip staionar; incubator cu termostat i agitator orbital pentru incubarea culturilor microbiene de tip submersibil; autoclav pentru sterilizarea mediilor de cultur i pentru decontaminarea obiectelor; baie de ap termostatat; frigidere pentru conservarea mediilor i a culturilor microbiene; balane; pH-metru; microscoape optice i stereo-microscoape; Pentru evitarea riscurilor de contaminare cu ageni patogeni din culturile efectuate n laborator, precum i de introducere n incinta laboratorului a unor microorganisme existente n spaiul exterior acestuia, pe tot parcursul desfurrii activitilor practice n laborator, fiecare membru al personalului de lucru este obligat s respecte ntocmai urmtoarele reguli specifice: 1 - Utilizarea echipamentului complet de protecie, compus din:

26

a) combinezon sau halat de protecie asociat cu pantaloni lungi, fiecare dintre aceste obiecte fiind confecionate dintr-un material textil natural sau sintetic, care s protezeje corpul uman de interaciunea cu diveri colorani sau cu diferite substane reactive corozive sau decolorante i care s fie rezistente la termosterilizarea cu abur sub presiune; b) masc de protecie a feei, confecionat din tifon sau din materiale sintetice uor sterilizabile prin metode fizice sau chimice; c) mnui de cauciuc pentru ntrebuinare unic, sterilizate n prealabil cu radiaii gamma; d) bonet pentru protecia capului, confecionat din pnz, din tifon sau din materiale sintetice uor sterilizabile prin metode fizice sau chimice; e) ochelari de protecie, fabricai din sticl sau plastic incolor, termosterilizabili prin iradiere cu ultraviolete; f) papuci confecionai din cauciuc, termosterilizabili prin autoclavare, special destinai lucrului n laborator sau, n lipsa acestora, huse de unic folosin, confecionate din pnz sau hrtie rezistent la termosterilizare, destinate acoperirii n ntregime a nclmintei de strad. 2 Echipamentul de protecie trebuie s fie pstrat ntr-un dulap special destinat acestui scop, separat de hainele utilizate n spaiul exterior. 3 - Toate hainele sau alte obiecte personale vor fi pstrate n dulapuri ermetice, amplasate la distan de incinta propriu-zis de lucru. 4 Introducerea n laborator a oricror obiecte de uz personal (exemple: cri, caiete, mape, serviete, geni, sacoe, pungi etc.) este strict interzis, acestea fiind, n mod obligatoriu, depozitate n anticamera special amenajat n acest scop. 5 Lecturarea complet a coninutului lucrrii practice din manual, preferabil n ziua premergtoare sosirii n laborator sau, n anumite situaii extreme, cu minimum o or nainte de nceperea lucrrilor propriu -zise. 6 Elucidarea complet a oricror nelmuriri sau neclariti referitoare la protocolul de lucru ce urmeaz a fi pus n aplicare, prin urmrirea cu atenie a

27

explicaiilor oferite de asistenta / asistentul cu rol coordonator al lucrrilor de laborator i solicitarea de lmuriri suplimentare sau precizri absolut necesare nelegerii corecte a modului de lucru i a rezultatelor preconizate a se obine la finalul lucrrii efectuate. 7 ntocmirea planului de lucru pe etape cu stabilirea judicioas a aparatelor, instrumentelor i materialelor ce urmeaz a fi utilizate pentru efectuarea corespunztoare a lucrrii practice. 8 Identificarea tuturor ustensilelor i a obiectelor de lucru (anse bacteriologice sau micologice, tuburi de cultur, pipete, plci Petri, bal oane Erlenmeyer, pahare Berzelius, cilindri gradai etc.), precum i a materialelor consumabile absolut necesare pentru a fi utilizate n timpul desfurrii lucrrii (colorani, reactivi, ingrediente pentru prepararea mediilor de cultur etc.). 9 Deplasarea prin laborator nu trebuie s se efectueze n vitez, prin fug sau prin mers rapid, iar micrile trebuie s fie atent controlate, fr gesturi brute, care s determine formarea de cureni de aer n zona de lucru. 10 - Toate culturile microbiene ce se utilizeaz n laboratorul de microbiologie, precum i produsele biologice destinate analizelor microbiologice specifice sunt considerate ca fiind potenial infectante. 11 Evitarea expunerii direct pe masa de lucru a tuburilor (eprubetelor) sau a placilor Petri ce conin culturi bacteriene sau fungice, ci numai n interiorul incintei cu aer steril, prevzut n acest scop. 12 Dezinfectarea cu alcool sau alte substane antiseptice a meselor de lucru i a obiectelor auxiliare utilizate n timpului lucrului n laborator (creioane cu grafit, creioane din plastic, tip markerdestinate inscripionrii obiectelor confecionate din sticl, metal sau plastic etc.). 13 - Flambarea ansei la flacara emanat prin intermediul becului de gaz, pn la nroirea complet a firului metalic n form de bucl i a unei poriuni din lungimea acestuia pn la zona de conexiune a acestuia cu mnerul acoperit de un material izolator ignifug.

28

14 Interzicerea transvazrii sub presiune a lichidelor din pipete n interiorul eprubetelor, precum i a deschiderii brute a unor recipiente astupate cu dopuri fixate ermetic pentru a se evita producerea de aerosoli cu grad ridicat de contaminare. 15 Respectarea cu strictee a tuturor operaiunilor de manipulare a culturilor de microorganisme, a ustensilelor, precum i a materialelor de laborator, conform instruciunilor corespunztoare de lucru, n condiii de asepsie total, fr efectuarea de micri brute sau violente care s pericliteze desfurarea n siguran a activitilor specifice. 16 Interzicerea cu desvrire a fumatului sau a ingerrii alimentelor sau buturilor n incinta laboratorului de microbiologie. 17 Semnalarea de urgen a asistentului coordonator de lucrri asupra oricrui accident survenit n timpul lucrului n laborator (spargerea unui tub sau a unei plci Petri de cultur microbian, spargerea unei pipete cu un anumit lichid, rsturnarea unor flacoane coninnd acizi sau baze etc.) i acoperirea rapid i complet, cu o lavet mbibat n soluie dezinfectant, a zonei n care s -a produc accidentul respectiv i apoi curarea integral a particulelor reziduale remanente. 18 Introducerea materialelor contaminate n recipientele special destinate colectrii acestora pentru decontaminare prin sterilizare termic umed (autoclavare). 19 Informarea temeinic asupra proprietilor fizice i chimice ale substanelor manipulate n cursul efecturii experimentelor de laborator (gradul de volatilitate, de inflamabilitate, de explozivitate, temperatura de aprindere, de lichefiere, de sublimare etc.), n vederea evitrii unor posibile accidente datorate lipsei de cunotine referitoare la reaciile poteniale pe care acestea le induc n contact cu ali reageni chimici. 20 Activitatea practic n laboratorul de microbiologie implic n mod direct sau indirect contactul cu un produs biologic infecios sau potenial contaminant!

29

21 Utilizarea aparatelor i dispozitivelor de lucru trebuie efectuat n conformitate cu instruciunile de folosire specifice. 22 La ncheierea oricrei lucrri practice n laboratorul de microbiologie, este obligatorie dezinfectarea minilor prin imersarea acestora ntr-o soluie antiseptic (bromocet, cloramin etc.) timp de 2 3 minute, iar apoi splarea acestora cu ap cald i spun. 23 Pentru asigurarea unui control ct mai riguros al modului de efectuare a lucrrilor de laborator, fiecare participant la activitatea practic, ce urmeaz a se desfura pe parcursul unui semestru de an universitar, are urmtoarele obligaii: a) de a ntreine n mod corespunztor spaiul de lucru care i este destinat, nc de la nceputul primei lucrri practice i pn la ncheierea stagiului de activitate n cursul semestrului respectiv; b) de a pstra ordinea i curenia n spaiul de lucru alocat; c) de a asigura meninerea nealterat a suprafeei de lucru, precum i a diferitelor dispozitive i obiecte adiacente spaiului de activitate. 24 Accesul persoanelor strine n laborator este strict interzis. 25 - Intrarea n laborator i participarea la efectuarea lucrrilor practice se va realiza numai dup audierea i nsuirea temeinic a regulilor de protecie a muncii.

2.2. Msuri destinate asigurrii proteciei personalului de lucru Pentru a preveni accidentele de lucru, este absolut necesar respectarea cu strictee a metodologiei specifice de lucru, precum i a regulilor de dezinfectare i aseptizare, care se aplic laboratorului de microbiologie, dup cum urmeaz: a) toate operaiunile de inoculare se efectueaz la flacra unui bec de gaz, prin flambarea orificiului vaselor de cultivare, att n momentul deschiderii

30

lor, prin detaarea lent (fr micri brute) a capacelor sau a buoanelor, ct i al nchiderii acestora; b) att ansa, ct i acul de platin se sterilizeaz prin nclzire la rou, nainte i dup folosire, iar portansa se va flamba prin cteva treceri s curte pe deasupra flcrii becului de gaz; c) toate recipientele de cultivare (cutiile Petri, eprubetele, vasele Erlenmeyer etc.) i materialele contaminate se introduc dup terminarea lucrului n recipientul special destinat colectrii acestor materiale care vor fi ulterior sterilizate prin autoclavare; d) pipetele i lamele din sticl, ce au fost deja utilizate, nu se decontamineaz la flacr, ci se imerseaz, dup ntrebuinare, n recipiente coninnd soluie dezinfectant, amplasate n centrul fiecrei mese de lucru; e) pentru efectuarea operaiunii de pipetare se vor utiliza instrumente sau dispozitive special destinate acestui scop, respectiv, pipete automate cu vrfuri sterilizate prin iradiere gamma sau pipete din sticl, sterilizate n prealabil prin cldur uscat la 180oC; este total interzis efectuarea pipetrii prin aspiraie i pompare cu gura; f) manipularea substanelor inflamabile i a celor caustice este realizabil numai prin respectarea cu strictee a regulilor de protecie mpotriva accidentelor.

31

Capitolul III

PROGRAMA ANALITIC A SUPORTULUI DE CURS - TEMA 4: METODE I TEHNICI MODERNE DE INVESTIGARE MICROBIOLOGIC A APEI

3.1. Corelare competene coninuturi TABEL DE CORELARE COMPETENE CONINUTURI Nr. crt. Unitatea de competen CONTROLUL CALITII MICROBIOLOGICE A APEI Competene individuale Preleveaz probele de ap n vederea analizei microbiologice Coninuturi Dispozitive de prelevare : - recipiente de sticl, polietilen, pompe, aparat de prelevare automat, recipient pentru prelevarea la adncime. Pregtirea : - Sterilizarea Probe de ap : -probe simple, probe medii, probe de suprafa, probe de adncime, probe pentru determinarea oxigenului Conservarea, marcarea, transportul - reactivi de conservare, unde este cazul, pstrarea la temperaturi sczute, etichete - transport; lzi frigorifice, auto, Buletin de prelevare: - denumire ap, zon de prelevare, punct de prelevare, data si ora, modul de prelevare, aspectul probei in

32

Determin indicatorii microbiologici ai apelor naturale

momentul prelevrii, condiii meteorologice, modul de conservare, numele persoanei care a fcut prelevarea Indicatori microbiologici: - bacterii mezofile, coliformi totali, fecali Determinarea microbiologic: - bacterii mezofile, coliformi totali, fecali conform metodelor de analiz Interpretarea rezultatelor - normele de calitate in vigoare

3.2. SUGESTII METODOLOGICE Ordinea cronologic recomandat pentru parcurgerea coninuturilor este cea din tabelul de corelare competene coninuturi, dar poate fi oricare alta, la alegerea profesorului. Se impune doar tratarea succesiv a coninuturilor corespunztoare aceleiai competene. Numrul de ore recomandat, orientativ, pentru aceste coninuturi este prezentat n tabelul de mai jos Nr. crt. Coninuturi Preleveaz probe de ap n vederea analizei microbiologice a) Alegerea dispozitivelor de prelevare a probelor de ap b) Pregtirea dispozitivelor de prelevare pentru analiza microbiologic Total ore Ore instruire teoretic Ore laborator tehnologic

1.

33

2.

c) Recoltarea probelor de ap pentru analiza microbiologic d) Conservarea, marcarea i transportul probelor de ap e) ntocmirea buletinului de prelevare Determin indicatorii microbiologici ai apelor naturale a) Caracterizarea indicatorilor microbiologici b) Determinarea indicatorilor microbiologici b)Interpretarea rezultatelor analizelor TOTAL

16

12

Se precizeaz faptul c numrul de ore alocat fiecrei teme este orientativ. Se recomand ca procesul de predare nvare s se desfoare, fie n laboratoarele de microbiologie ale unor instituii specializate, fie la diferii ageni economici sub ndrumarea profesorului de specialitate. Colaborarea cu ageni economici de profil este deosebit de important pentru parcurgerea acestui modul. Ageniile teritoriale de Protecia Mediului ar putea fi, n acest caz, partenerii cei mai potrivii. Ideal ar fi ca aceste colaborri s se materializeze n edine de practic la locul de munc n cadrul crora cursanii s execute aceste tipuri de determinri, familiarizndu -se cu modul specific de recoltare a probelor i cu echipamentele moderne utilizate pentru efectuarea determinrilor specifice. Dac, ns, acest lucru nu este posibil orele se pot desfura sub forma vizitelor n cadrul crora cursanii pot doar s asiste la efectuarea acestor determinri.

34

n demersul didactic se vor utiliza fie de lucru sau fie de observaie, aplicnd metodele didactice precizate anterior. La sfritul fiecrei determinri practice fiecare cursant i va ntocmi propriul referat al lucrrii, referat care poate fi utilizat de ctre profesor ca instrument de evaluare curent. De asemenea, referatele pot fi utilizate pentru ntocmirea de ctre cursani a unor portofolii sau proiecte utilizate, de asemenea, pentru evaluarea acestora. Rolul profesorului este de a supraveghea atent activitatea cursanilor, de a-i ndruma pe acetia i de a corecta, atunci cnd este cazul greelile acestora. n scopul formrii competenelor prevzute de program, se recomand utilizarea unor metode de predarenvare interactive cum ar fi: nvarea prin descoperire, problematizarea, joc de rol, studiul de caz, proiecte de lucru, portofolii etc. Strategiile de predare presupun alegerea metodei n funcie de obiectivele propuse. Alegerea tehnicilor de instruire revine profesorului, care are sarcina de a individualiza i de a adapta procesul didactic la particularitile specifice fiecrui cursant. Profesorul are libertatea de a alege metodele i tehnicile didactice i de a propune noi activiti de nvare n msur s asigure formarea competenelor specifice prevzute de program. Exersarea abilitilor-cheie se va realiza ori de cte ori este posibil pe parcursul instruirii, cnd coninuturile i activitile de nvare o permit. Evaluarea trebuie s fie corelat cu criteriile de performan i cu tipul probelor de evaluare care sunt precizate n Standardul de Pregtire Profesional. Cursanii trebuie evaluai numai n ceea ce privete dobndirea competenelor specificate n cadrul suportului de curs. Chiar dac se exerseaz i alte competene-cheie n procesul de predarenvare, trebuie precizat faptul c se va evalua numai competena -cheie prevzut n suportul de curs. O competen se evalueaz numai o singur dat.

35

Principala metod de evaluare a competenelor specifice menionate n acest suport de curs este proba practic. Pe lng aceasta se mai pot utiliza: observarea sistematic, proiectul, portofoliul, tema n clas, autoevaluarea. Probele de evaluare i autoevaluare se pot concepe sub form de fie de observare, fie de autoevaluare, fie de evaluare. Exemplu de fi de observare : 3.3. FI DE OBSERVARE Numele i prenumele cursantului : Data verificrii : Numr de nregistrare : Timp de lucru : Numele i prenumele evaluatorului : Semntura evaluatorului : Rezultat Feed-back

Modulul : Controlul calitii apelor naturale Competena 1 : Preleveaz probe de ap n vederea analizei microbiologice Criterii de performan : a) b) c) d) e) Alegerea dispozitivelor de prelevare a probelor de ap Pregtirea dispozitivelor de prelevare pentru analiza microbiologic Prelevarea probelor de ap pentru analiza microbiologic Conservarea, marcarea i transportul probelor de ap ntocmirea buletinului de prelevare

Instruciuni pentru cursant : Citii cu atenie sarcinile de lucru ;

36

Solicitai lmuriri evaluatorului n cazul unor neclariti la cerinele din sarcinile de lucru Asigurai-v de existena instrumentelor materialelor i echipamentelor necesare rezolvrii sarcinilor de lucru Asigurai-v de ndeplinirea condiiilor de protecia i securitatea muncii precum i de existena echipamentului specific de protecia muncii Deplasai-v pe teren pentru ndeplinirea sarcinilor de lucru

Sarcini de lucru : Preleveaz probe de apa din rul Arge respectnd etapele prelevrii Evaluatorul pune la dispoziia cursantului materiale i reactivi, din care cursantul i alege cele necesare Etapele prelevrii

Nr. probei 1.

Evaluator

Data

Alegerea dispozitivelor de prelevare a probelor de ap Pregtirea dispozitivelor de prelevare pentru analiza microbiologic Prelevarea probelor de ap pentru analiza microbiologic Conservarea, marcarea i transportul probelor de ap ntocmirea buletinului de prelevare

2.

4 5 Not:

Pentru fiecare criteriu de performan se elaboreaz sarcini de lucru. Realizarea acestora de ctre cursani se marcheaz prin bifarea csuelor respective

37

Capitolul IV

TEHNICI DE STERILIZARE A USTENSILELOR I A MATERIALELOR CONSUMABILE N LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE

Distrugerea microorganismelor sau sterilizarea este indispensabil pentru pregtirea materialului de lucru i a mediilor de cultivare. Un produs este considerat steril cnd nu mai conine microorganisme ce se pot revitaliza. Exist mai multe procedee de sterilizare care corespund diferitelor tipuri de materiale ce trebuie tratate. n laboratorul de microbiologie pentru analize de rutin, cldura reprezint modalitatea de sterilizare cea mai frecvent ntrebuinat. 4.1. Procedee de sterilizare a ustensilelor i mediilor nutritive de cultivare a microorganismelor Sterilizarea prin cldur Cldura umed Sterilizarea prin cldur umed se efectueaz n autoclavul cu aburi prin procedeul de autoclavare.

38

Principiu: n atmosfera de vapori de ap sub presiune, toate bacteriile (inclusiv formele sporulate) sunt omorte dup 20 minute la 121 0C. Aceasta este metoda cea mai eficient de sterilizare. Autoclava permite: - pregtirea materialului (medii de cultur, diferite obiecte) n vederea utilizrii n laborator, prin distrugerea microorganismelor; - decontaminarea materialelor dup folosirea n laborator (cel puin 30 minute la 1210C). Microorganismele din produsele patologice, eantioanele de ap i produse alimentare analizate, din culturile microbiene de laborator etc, trebuie neaprat distruse. Aceste dou operaii ar trebui efectuate de preferin n dou autoclave diferite sau, cel puin,n mod separat. Timpul de sterilizare In tabelul 1, sunt prezentai parametrii de sterilizare doar pentru obiecte, medii de cultur sau alte substane ce trebuie sterilizate n autoclav pentru analizele de rutin.

Tabelul 1 Parametrii de sterilizare pentru obiecte, medii nutritive i substane auxiliare Materialul sterilizat Sticlrie curat Ap , ser fiziologic Parafin Sruri minerale Medii curente (bulion nutritiv, geloz nutritiv) Lapte degresat 115 0,7 15 Temperatura ( C) 121 121 121 121 121
0

Presiunea (barr) 1 1 1 1 1

Timp (minute)

20 20 20 20 15 - 20

39

Medii cu substane termolabile (ex. glucide) Glucoz n soluie

110

0,5

20

110

0,5

20

Controlul eficienei sterilizrii prin autoclavare este realizat adesea cu ajutorul unor indicatori de sterilizare cum sunt hrtiile indicatoare: fost ndeplinite condiiile de sterilizare. sunt comercializate benzi de hrtie special imprimate pentru a vira culoarea dac au

Pasteurizarea Sterilizarea trebuie s fie deosebit de pasteurizare, care reprezint doar un procedeu de conservare utilizat n industria alimentar. Pasteurizarea const n tratarea produsului la o temperatur n domeniul 560C - 850C, o durat variabil de la cteva minute pn la o or, n mediu umed, n funcie de produs. n aceste condiii, majoritatea celulelor vegetative bacteriene sunt distruse, dar nu i formele sporulate.

Tyndalizarea Tyndalizarea const n 2 - 3 pasteurizari repetate, alternate cu perioade n care proba este meninut n condiii favorabile pentru germinarea endosporilor bacterieni, care devin vulnerabili trecnd n stare vegetativ i sunt distrui prin pasteurizare. Acest procedeu de sterilizare se poate realiza n baie de ap, de exemplu, n urmtoarele condiii: nclzire la 560C (pn la 800C) timp de 1 or, 3 - 7 zile consecutiv, cu un interval de 24 de ore. Tyndalizarea se poate folosi pentru distrugerea microorganismelor n mediile ce conin substane termolabile.

40

Cldura uscat Sterilizarea prin cldur uscat se efectueaz n sterilizatoarele cu aer cald (etuve). Cldura uscat nu poate distruge bacteriile i n special sporii bacterieni, dect la o temperatur mai ridicat ca n cazul cldurii umede. Tratamentul pentru sterilizare cu cldur uscat este de 4 ore la 1400C sau 1 or la 1800C. Un alt procedeu de sterilizare prin cldur uscat este flambarea, care se efectueaz n flacra becului de gaz pentru: extremitatea firului ansei, exteriorul pipetelor, gtul eprubetelor i al flacoanelor.

Sterilizarea prin filtrare Filtrarea const n trecerea unui produs lichid printr-un perete poros sau o membran care reine bacteriile. Se pot utiliza filtre de portelan (Chamberland), de sticl poroas sau membrane tip Millipore, cu pori de diferite dimensiuni.

Sterilizarea prin gaze toxice Oxidul de etilen, de exemplu, este foarte utilizat pentru sterilizarea materialului medico-chirurgical, a materialelor din plastic numite sterile, de unic folosin din industrie. Sterilizarea cu ajutorul radiaiilor Radiaiile ultraviolete - sunt radiaii cu utilizare curent n laboratorul de microbiologie; ele sunt bactericide, dar nu distrug sporii bacterieni. Acest tip de radiaii acioneaz n mod direct i au putere de penetraie sczut (civa milimetri). Lmpile germicide al cror efect se bazeaz pe aciunea radiaiilor UV cu lungimea de und de 254 nm sunt utilizate : - pentru sterilizarea apei - pentru sterilizarea incintelor i a aerului ambiant

41

Radiaiile gamma Radiaiile gamma fac parte din categoria radiaiilor ionizante i au un efect puternic microbicid. Sunt dificil de produs i de utilizat i foarte periculoase datorit efectelor pe care le au asupra materiei vii. Acest tip de radiaii poate fi utilizat n sterilizarea materialului medical i microbiologic de folosin unic sau pentru sterilizarea unor deeuri. 4.2. Pregtirea i sterilizarea sticlriei n laboratorul de analize microbiologice Pregtirea i sterilizarea materialului n vederea utilizrii n laboratorul de microbiologie este o operaie deosebit de important deoarece exactitatea rezultatelor precum i reuita desfurrii proceselor microbiologice depind n mare msur de rigurozitatea cu care se efectueaz. Principalele operaii de pregtire a sticlriei de laborator sunt: - splarea - uscarea - executarea dopurilor i ambalarea - recipientele pot fi pregtite cu dop din vat hidrofob pentru a nu pstra umezeala dup autoclavare. Din ce n ce mai folosite sunt dopurile din celuloz comprimat (comercializate), sterilizabile pan la 2000C. Pentru nlocuirea eprubetelor cu dop de vat, n scopul pstrrii optime a culturilor, se pot utiliza tuburi prevzute cu capsule care se monteaz prin nurubare. Pentru evitarea contaminrii mediilor de cultur utilizate n analiza microbiologic sau n obinerea culturilor microbiologice, sticlria de labora tor trebuie ambalat i sterilizat corespunztor. Sterilizarea se efectueaz la etuv (sau pupinel), iar materialele supuse acestei operaii trebuie s fie curate i mpachetate n hrtie sau aezate n conteinere metalice nchise. Sterilizarea uscat se poate aplica pentru articole din sticl (plci Petri, baloane, pipete, eprubete), obiecte din porelan, instrumentar metalic fr suduri

42

n cositor, pulberi uscate etc. Aerul fiind slab conductor de cldur, sterilizatorul trebuie s uniformizeze temperatura i s asigure ptrunderea aerului fierbinte n obiectele de sterilizat. n calcularea timpului de sterilizare uscat trebuie avute n vedere urmtoarele etape: perioada de nclzire la temperatura de sterilizare, socotit n general o or; perioada de meninere a temperaturii de sterilizare; perioada de rcire n care scderea temperaturii trebuie realizat treptat pentru evitarea spargerii obiectelor de sticl prin oc termic, aprox. 2 ore. n practic se procedeaz la alegerea unei temperaturi de sterilizare de 180o C i a unei durate de o or. Din exces de pruden se practic sterilizri la temperaturi mai ridicate sau de durate mai mari. n unele cazuri aceast practic este duntoare deoarece, de exemplu, vata ordinar - la durate i temperaturi mari de sterilizare uscat - elibereaz gudroane ce pot inhiba creterea microbian.

Materiale utilizate: - pipete; - plci Petri; - eprubete; - flacoane Erlenmayer; - vat hidrofob; - tifon; - hrtie ambalaj; - etuv.

Mod de lucru: Se confecioneaz dopuri de vat hidrofob pentru eprubete, astfel nct s poat fi extrase uor n timpul inoculrii, iar densitatea materialului s asigure sterilitatea. Eprubetele se introduc in coul de srm i se acoper cu hrtie.

43

Pipetele se astup la partea opus vrfului, cu un dop subire de vat care s rein microorganismele ce ar putea ptrunde n pipet pe la partea superioar. Pipetele se ambaleaz ntr-o fie de hrtie care se rsucete n jurul tubului de sticl, ncepnd de la vrf. Plcile Petri se ambaleaz n hrtie de ambalaj, n funcie de numrul necesar. Flacoanele Erlenmayer pentru medii de cultur se astup cu dop de vat nfurat n tifon. Toat sticlria se sterilizeaz timp de 1 or la 180 oC n etuv, perioad calculat din momentul atingerii temperaturii. Dup aceast perioad etuva se oprete i se ateapt rcirea materialului.

44

Capitolul V

PREPARAREA I STERILIZAREA MEDIILOR NUTRITIVE DE CULTIVARE A MICROORGANISMELOR

5.1. Prepararea i sterilizarea mediilor nutritive de cultivare Un mediu de cultur reprezint un substrat nutritiv complex, steril, care trebuie s asigure microorganismelor cantitatea necesar de ap, sursa de carbon, de azot, sruri minerale, factori de cretere, deci care s le furnizeze substanele i energia necesare n procesele de cretere, reproducere i ntreinerea funciilor vitale. Mediul de cultur trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii: s corespund din punct de vedere nutritiv, s aib o concentraie a substantelor dizolvate care s nu influeneze negativ schimburile osmotice ale celulei s nu conin substane toxice, s aib un anumit pH s fie steril (lipsit de microorganisme vii), astfel nct s se dezvolte numai celulele introduse prin inocul. Mediile de cultur se folosesc n practica de laborator sau n practica industrial i sunt foarte difereniate n funcie de scopul urmrit.

45

n tehnicile de laborator, mediile se folosesc pentru izolarea din mediul natural a diferitelor microorganisme, pentru obinerea de culturi pure, pentru ntreinerea culturilor selecionate. n scopuri industriale, mediile de cultur sunt utilizate pentru obinere de biomas sau a unor compui de natur microbian. Dup scopul utilizrii lor, mediile de cultur se mpart n: * specii * medii de cultur selective care permit dezvoltarea unui numr restrns de medii de cultur de difereniere care permit separarea speciilor n funcie medii de mbogire destinate separrii i cultivrii unor microorganisme medii de cultur generale care asigur dezvoltarea unui mare numr de

microorganisme *

de anumite caractere biochimice * pretenioase din punct de vedere nutritiv sau care se afl n numr redus * * medii de conservare medii de cultur industriale Din punct de vedere al compoziiei chimice, mediile de cultur se mpart n 3 categorii: * medii naturale (empirice) de origine animal sau vegetal, cu o medii sintetice: acestea sunt soluii de substane chimice pure n ap compoziie chimic nedefinit n mod exact; * distilat, cu o compoziie perfect determinat; * medii semi-sintetice: sunt constituite din produse chimice bine definite, dar i din produse de origine natural (cu compoziie cunoscut). Constituenii principali ai mediilor de cultur sunt: 1. Extracte de carne i macerate Aceste produse, comercializate n form concentrat sub denumirea de extracte de carne, conin n principal proteine puin hidrolizate, glucide, sruri

46

minerale, vitamine hidrosolubile. Compoziia lor variaz n funcie de carnea utilizat pentru preparare.

2. Extracte de drojdie Aceste extracte, comercializate sub form deshidratat, sunt preparate din drojdia de bere, fiind utilizate ca surs de aminoacizi i de vitamine hidrosolubile (vitamine din complexul B). 3. Peptone i hidrolizate Peptonele reprezint un amestec de compui solubili n ap care provin n urma aciunii enzimelor asupra materialului proteic. Acestea pot fi: pepton pepsic din carne, pepton tripsic din cazein (cu coninut crescut n triptofan), pepton pancreatic de cazein, pepton tripsic de carne, pepton papainic de soia, peptone compuse. Hidrolizatele sunt peptone obinute n urma aciunii compuilor anorganici asupra proteinelor (acid clorhidric de ex.). Cel mai des ntrebuinat este hidrolizatul acid de cazein, coninnd aminoacizii constitutivi ai cazeinei din lapte.

4. Agar-agarul sau geloza Agar-agarul denumit i geloz este un extract de alge roii (Rhodophyceae) din genul Gelidium i Gracillaria, recoltate n mrile Japoniei sau ale Noii Zeelande. Se dizolv n ap la o temperatur n jur de 900C i se solidific sub 450C, fiind utilizat pentru solidificarea mediilor de cultur. Agar-agarul nu este degradat de microorganismele obinuite i este comercializat n forma sa iniial deshidratat, numit agar fibre (foarte impur), sub form de paiete (mai puin impur), sau sub form de pulbere. Numeroase firme sunt specializate n producerea i comercializarea mediilor de cultur de laborator (firma Difco, Merck, Biokar, Oxoid).

47

Mediile fermentative sunt medii de cultur industriale destinate producerii unor cantiti mari de celule sau produi de metabolism. n compozitia acestor medii intr ca surse de carbon: melasa, produs secundar rezultat la fabricarea zahrului i care conine 45 - 55% zaharoz, diferite tipuri de finuri, cereale boabe, zer bogat n lactoz, tre etc. Dintre sursele de azot cel mai des folosite sunt: finurile proteice de soia, sulfatul de amoniu, ureea, ngrmntul complex. Ca sruri minerale se adaug fosfai, sulfai, cloruri etc. Pentru cultivarea microorganismelor care necesit factori de crete re, se adaug extract de porumb (obinut prin concentrarea apelor rezultate la nmuierea porumbului, bogat in aminoacizi, vitamine, acid lactic, microelemente), extract de drojdie, extract din radicele de mal i germeni de gru i porumb.

5.2. Prepararea mediilor nutritive pentru cultivarea bacteriilor, drojdiilor i mucegaiurilor

Materiale utilizate: - balan cu precizie de 0,1 g; - pahare Berzelius; - sit azbest; - agar nutritiv pulbere; - mediu de cultur extract de mal - agar pulbere; - mediu extract de cartof-dextroz-agar pulbere; - eprubete cu dop, sterile; - pipete de 10 ml; - flacoane Erlenmayer; - bec de gaz; - autoclav electric automat

48

Mod de lucru: Conform indicaiilor de pe flacoanele coninnd mediile de cultur pulverulente, se vor cntri cantitile necesare pentru a obine cte 1 litru din fiecare tip de mediu de cultur pentru eprubete i cte 300 ml mediu pentru baloanele Erlenmayer. n cazul n care nu exist medii deshidratate, procurate de la firme specializate, mediile se vor prepara prin cntrirea componentelor pentru volumul final dorit. Mediul de cultur se aduce la fierbere n paharele Berzelius de 1 l, pn la completa dizolvare a agarului, apoi se repartizeaz cte 10 ml n eprubete sterile, prevzute cu dop de vat, care se aeaz n couri de srm i se acoper cu hrtie. n mediu se determin pH-ul i, dac este necesar, se ajusteaz la valoarea dorit. Mediile cu agar nu trebuie s fie aduse la un pH mai mic de 6, deoarece agarul este parial hidrolizat n timpul sterilizrii la pH acid i nu se mai solidific la rcire. Cnd sunt necesare astfel de medii, pH-ul trebuie ajustat dup sterilizare. Baloanele Erlenmayer se astup cu dop de vat nvelit n tifon, se leag la gur cu hrtie i srm subire oelit. Courile i baloanele Erlenmayer se introduc n autoclava cu alimentare electric, iar sterilizarea se efectueaz conform instruciunilor menionate n cartea tehnic a instalaiei de sterilizare. Se verific nivelul apei n incinta de sterilizare, se nchide capacul, se conecteaz la reeaua electric, se procedeaz la select area programului automat de sterilizare i se ateapt nclzirea prin formarea de abur supranclzit care, dup atingerea temperaturii de 100 o C este eliminat prin purjare, acesta antrennd spre exterior aerul rezidual, remanent n incinta de sterilizare nc de la nceputul operaiunii de sterilizare. Dup 1-2 minute de purjare se nchide robinetul, iar presiunea indicat de manometru va urca pn la valoarea 1,1 unde va fi meninut timp de 15 -20 minute de ctre sistemul automat de sterilizare al autoclavei .

49

ntre presiune i temperatura din autoclav exist o corelaie, aa cum se prezint n tabelul urmtor:

Tabelul 2 Corelaia dintre temperatur i presiune n procesul de sterilizare Temperatura n grade Celsius 100 105 110 112 115 120 121 122 128 130 135 140 Presiunea n kg/m3 0,00 0,20 0,43 0,55 0,69 0,99 1,10 1,33 1,55 1,72 2,16 2,65 Presiunea n atmosfere 0,00 0,20 0,42 0,50 0,67 0,96 1,07 1,29 1,50 1,65 2,09 2,56

Dup acest interval de meninere a temeperaturii la valoarea de 121 o C, se ateapt scderea presiunii pe manometru, se deschide robinetul de purjare, iar dup aproximativ 5-10 minute se poate deschide capacul autoclavei. n general, mediile de cultur trebuie s ofere o suprafa de dezvoltare suficient de mare pentru toate microorganisme. De aceea, dup sterilizare, tuburile cu mediu de cultur se nclin pentru a se extinde la maximum suprafaa de cretere.

50

nclinarea se face prin sprijinirea eprubetelor pe o baghet suficient de groas, innd seama ca mediul negelificat s nu ating dopurile tuburilor de sticl, ci s se opreasc la o distan de 2 - 3 cm fa de acestea. Prin rcire, vaporii ce ies din mediul cald, se condenseaz pe pereii mai reci ai eprubetelor i cad sub form de picturi pe mediu, colectndu -se la partea inferioar a acestora. Din aceast cauz, eprubetele cu mediul rcit nu se aeaz n poziie orizontal, ci doar vertical, n couri de srm, care se acoper cu folie metalizat sterilizat n prealabil. Pentru a nu se prepara n fiecare zi medii de cultur, sau, dac este nevoie de mai multe tipuri de medii n acelai timp, acestea se pregtesc o singur dat i apoi se depoziteaz pentru pstrare. Sticlele cu medii de cultur se eticheteaz, notndu -se tipul mediului i data preparrii. Pentru evitarea uscrii se recomand pstrarea mediilor nutritive n frigider.

51

Capitolul VI

INOCULAREA I INCUBAREA PROBELOR MICROBIOLOGICE

6.1. Estimarea densitii populaiilor microbene Numrarea microorganismelor se execut n mod frecvent n laboratorul de

microbiologie, n vederea aprecierii stadiului de multiplicare a celulelor din diferite culturi folosite n industrie sau pentru determinarea gradului de contaminare a unor produse, n special alimentare. Pentru a asigura o numrare rapid i n acelai timp precis, innd cont c ncrctura microbian a diferitelor produse i culturi poate s fie foarte ridicat, se recomand n prima etap s se efectueze diluri ale produsului supus analizei microbiologice.

6.1.1. Tehnica obinerii diluiilor decimale Dup recoltare, la omogenizarea probelor destinate analizei

microbiologice, se recomand ca raportul ntre produs i diluant s fie de 1:10, obinndu-se astfel prima diluie (diluie 10-1). Pentru efectuarea urmtoarelor diluii decimale, cu o pipet steril, se barboteaz lichidul pentru omogenizare , se recolteaz 1 ml din diluia I i se scurge lichidul n alt eprubet cu 9 ml ser fiziologic steril, obinndu-se diluia a II-a (diluie 10-2) i se continu procedeul pn la obinerea diluiei necesare. Gradul de diluare este condiionat de

52

numrul presupus de microorganisme din proba de analizat; cu ct numrul este mai mare, cu att se fac mai multe diluii. Pentru majoritatea produselor sunt suficiente 4 - 8 diluii succesive. Cnd se face numrarea celulelor dintr-o anumit diluie considerat corespunztoare, numrul obinut se multiplic cu coeficientul de diluie k, pentru a obine numrul de celule existent n produsul iniial (pentru d I, k = 10, pentru d II, k = 100 etc). Pentru evitarea erorilor se recomand omogenizarea coninutului eprubetelor n care s-a fcut diluarea fie prin rotirea eprubetei ntre palme, fie,

cu ajutorul pipetei sterile, prin barbotare, nainte de recoltarea volumului de 1 ml destinat urmtoarei diluii. Se iau toate msurile de precauie pentru a evita contaminarea cu microorganisme din mediul ambiant, lucrnd n zona de protecie din jurul flcrii becului de gaz i respectnd regulile de manipulare.

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

Suspensie iniial

1: 10

1 : 100

1 : 1000

1 : 10000

Fig.1. Schem reprezentativ pentru tehnica de obinere a diluiilor decimale Dup efectuarea diluiilor decimale, numrarea microorganismelor se poate realiza prin metode directe, cu ajutorul camerelor de numrare sau prin metode indirecte.

53

6.2. Inocularea culturilor microbiene

Principiul metodei: Microorganismele pot fi cultivate pe medii de cultur n plci Petri sau n tuburi, att pentru studiul lor, pentru conservarea lor prin refrigerare, ct i pentru obinerea culturilor stoc i de lucru, n diversele procese biotehnologice. Operaia de trecere a unei culturi dintr-un vas de cultur n altul se numete repicare sau trecere, iar fragmentul de cultur ce se trece pe alt mediu se numete inoculum. n jurul flcrii becului de gaz exist o zon steril cu diametrul de aproximativ 20 cm, n lipsa curenilor de aer. Toate manipulrile care necesit deschiderea recipientelor sterile sau coninnd culturi trebuie efectuate n aceast zon de protecie.

6.2.1. Inocularea n eprubete (tuburi)

Materiale utilizate: - culturi de Bacillus subtilis pe agar nutritiv; - culturi de Saccharomyces cerevisiae pe mediul extract de mal - agar; - culturi de Monascus purpureus, Aspergillus niger i Penicillium notatum pe mediul extract de cartof - dextroz - agar; - ans de inoculare; - bec de gaz; - eprubete cu mediu sterilizat i nclinat (nutrient-agar, extract de mal-agar, extract de cartof-dextroz-agar); - termostat la 30 oC; - lamp bactericid.

54

Mod de lucru:

6.2.1.1. Inocularea cu ansa Se terge suprafaa din interiorul niei de lucru cu un tampon mbibat cu alcool 95%. Se aprinde lampa bactericid i se las 15 minute pentru sterilizarea incintei de lucru. Se spal minile cu spun, apoi se cltesc cu alcool. Se aprinde becul de gaz i se regleaz flacra, care trebuie s aib conul de culoare albastr. Se ine eprubeta n care exist cultura ce trebuie repicat cu mna stng, n poziie oblic sau chiar orizontal. n mna dreapt se ine acul de repicat. Acesta se arde n flacra becului de gaz, inndu-l n poziie vertical pentru ca flacra s cuprind o poriune ct mai mare din el. Se ine n flacr pn ce mai mult de jumtate din ac se nroete, apoi se plimb de 2 -3 ori i restul acului pn la mner, n flacr. Dup aceea se apropie gura eprubetei de flacr i, cu degetul mic de la mna dreapt ndoit, se trage afar dopul de vat din gura eprubetei, apucndu -l de captul rmas afar. Nu i se d drumul dopului pe mas sub nici un motiv, ci se ine tot timpul n mn. Se trece gura eprubetei de 2 -3 ori prin flacr. Se introduce acul fierbinte n eprubet i se rcete, nu n cultur, ci alturi, pe o poriune de agar fr cultur. Se ia apoi o foarte mic poriune (de 1 - 2 mm) din cultur pe vrful acului (se alege poriunea cea mai tipic i mai curat a culturii respective). Se scoate acul din eprubet, se arde din nou gura eprubetei i se astup cu dopul de vat din mna dreapt. Se las jos eprubeta i se ia, tot cu mna stng, o alt eprubet cu mediu steril. Acul de repicat cu fragmentul de cultur, se ine mai departe n mna dreapt ferindu-l acum de flacr. Se procedeaz cu eprubeta a doua la fel cum s -a procedat cu prima, adic: se ine n poziie orizontal sau putin oblic n mna stng, se scoate

55

dopul cu degetul cel mic de la mna dreapt ndoit, inndu -se tot timpul operaiei de repicare n mn. Se trece gura eprubetei prin flacr, se introduce acul de repicare cu fragmentul de cultur, atingnd uor mediul (n centrul eprubetei), pn ce bucica de cultur rmne pe mediu. Uneori este bine ca fragmentul de cultur s fie puin afundat n mediu, pentru a face un contact mai strns cu el. Se scoate acul de repicat din eprubet, se arde din nou gura eprubetei i se astup cu dopul din mna dreapt. Se trece i captul dopului care a fost inut cu mna prin flacr, dar foarte rapid. Se arde din nou acul n flacr pan la rou. Aceast operaie este absolut necesar i trebuie fcut cu rbdare, pentru a se evita infectarea mediilor urmtoare. Dup arderea acului se ia din nou eprubeta cu cultura ce trebuie repicat i se repet operaia de repicare cu o alt eprubet steril. Toate micrile descrise mai sus, din care const operaia de repicare, trebuie executate destul de repede pentru a nu permite infectarea mediilor sterile din eprubete. Ele trebuie fcute cu o oarecare ritmicitate i nu prelungite prea mult. De asemenea trebuie respectate o serie de indicaii, care la prima vedere par minore, dar de care depinde foarte mult reuita unei repicri. Astfel, trebuie avute n vedere: -inerea eprubetei n poziie orizontal n timpul repicrii pentru a evita cderea sporilor de ciuperci i bacterii din atmosfer pe mediu; -inerea acului de repicat n poziie vertical n flacr i nu orizontal, pentru ca arderea s se fac pe o poriune ct mai mare; -scoaterea dopului de vat cu degetul mic al minii drepte i inerea lui tot timpul n mn, pentru a-l feri de contaminri secundare; -arderea gurii eprubetei la scoaterea i introducerea dopului de vat, deoarece pe marginile exterioare ale eprubetei pot exista germeni de infecie secundar. Dup dezvoltarea culturii se observ aspectul , culoarea, tipul coloniilor, precum i eventuala prezen a contaminrii cu alte microorganisme.

56

6.2.1.2. Inocularea cu pipeta Pasteur sau cu pipeta gradat Pentru pregtirea pipetei Pasteur, se ia un tub de sticl obinuit, cu diametrul exterior de 6 mm i cel interior de 4 mm, care se taie la o lungime de 25 cm, se rotunjesc marginile la flacr, se astup cu dopuri de vat, se ambaleaz i se sterilizeaz. n momentul utilizrii, partea median a tubului se menine n vrful conului albastru al flcrii, se rotete uor i, cnd sticla s -a nmuiat, se ndeprteaz din flacr i se efileaz dup lungimea dorit. Dup solidificare, se separ n cele dou jumti cu care se poate lucra. nsmnarea cu pipeta se practic atunci cnd se dorete recoltarea unui inocul lichid. Pipeta se trece rapid prin flacr, iar pipeta Pasteur se sparge n dreptul mijlocului efilat. Din tubul ce conine cultura se preleveaz cteva picturi sau un volum determinat de inocul, care se pipeteaz n mediul proaspt, steril. Culturile se termostateaz timpul necesar dezvoltrii fiecrui tip de microorganism.

6.2.2. Inocularea n plci Petri

Materiale utilizate: - plci Petri sterile - medii de cultur pentru bacterii, drojdii, mucegaiuri, aceleai ca n cazul nsmnrii n tuburi - culturi de bacterii, drojdii, mucegaiuri - pipete sterile - ap steril - fir de inoculare - bec de gaz - termostat

57

Mod de lucru Mediul de cultur steril se topete pe baie de ap, dup care se rcete la 47oC i se repartizeaz n mod aseptic n plcile Petri, pentru evitarea unui condens prea mare pe capacul plcii. Se las mediul s se solidifice la temperatura camerei. Pentru economie de spaiu i pentru evitarea formrii unui condens prea abundent, plcile se pot aeza una peste alta, dac este posibil. Se agit tubul coninnd suspensia de celule n ap steril i se recolteaz cu pipeta aproximativ 2 ml din cultur, care se introduc n placa Petri, pe suprafaa mediului nutritiv. Se repartizeaz omogen, pe toat suprafaa, se scurge excesul de lichid i se termostateaz la temperatura convenabil. nsmnarea mediului de cultur din plcile Petri se poate face de asemenea, prin ncorporarea suspensiei de celule, astfel: se pipeteaz n placa steril, goal, 1 ml din suspensia de celule, dup care se toarn mediul topit i rcit la 45 - 470C i se omogenizeaz pentru repartizarea uniform a celulelor din cultur. Se las s se solidifice i se incubeaz.

6.3. Incubarea probelor microbiologice n funcie de tipul i caracteristicile fiziologice ale culturilor microbiene ce urmeaz a fi meninute pentru o perioad bine determinat n condiii constante de temperatur, umiditate i concentraia de oxigen sau dioxid de carbon, precum i de starea de agregare a mediilor nutritive de cultivare, exist mai multe tipuri de incubatoare: cu ncalzire, cu nclzire i rcire, cu agitare, cu dioxid de carbon sub presiune. In interiorul acestor tipuri de incubatoare se introduc culturile microbiene ce urmeaz a fi meninute pentru o perioad de 24 -48 de ore n cazul bacteriilor i de 5-7 zile pentru culturile fungice, n condiiile pstrarii la valori constante a parametrilor de cultivare (temperatur, umiditate, compoziia i distribuia uniform a aerului n incinta de incubare prin recirculare.

58

Capitolul VII STUDIUL CARACTERELOR MORFOLOGICE I FIZIOLOGICE ALE COLONIILOR MICROBIENE

7.1. Caractere morfologice ale bacteriilor a. Culturi pe medii gelozate n plci Petri Se vor examina coloniile bacteriene care s-au dezvoltat pe suprafaa mediului solidificat n perioada care a trecut de la lucrarea anterioar, avndu -se n vedere urmtoarele caractere: Mrimea coloniilor: - colonii mici < 1 mm - colonii medii 1,5 pn la 3 mm - colonii mari 3 mm 2. Forma coloniei: a) punctiform, b) circular, c) filamentoas, d) neregulat, e) rhizoid, f) fusiform. 3. Profilul coloniei: a) plat, b) crescut, c) convex, d) pulvinat, e) umbonat 4. Marginea: a) uniform, b) ondulat, c) lobat, d) erodat, e) filamentoas, f) buclat. 5. Transparena: - colonii transparente - colonii translucide - colonii opace. 6. Suprafaa: - colonii lise (uneori strlucitoare) - colonii rugoase - colonii mucoide 7. Consistena - nu poate fi apreciat cel mai adesea dect n urma prelevrii de probe:

59

- colonii grase, cremoase, care dau uor suspensii omogene - colonii uscate - colonii mucoide (filante), care dau greu suspensii omogene. 8. Pigmentaia: - coloniile sunt cel mai adesea de culoare crem. O culoare diferit este datorat unor pigmeni, care sunt uneori solubili n mediul de cultur i care nu apar dect la o temperatur determinat. n final, coloniile bacteriene pot aparine unuia din urmtoarele tipuri: Tipul 1. Colonii S (engl. Smooth = neted, lucios) - margini regulate, uneori semi-bombate - suprafa neted - consisten cremoas suspensie omogen Tipul 2. Colonii R (engl. Rough = rugos, aspru, zbrcit) - margini adesea neregulate - suprafa rugoas - consisten uscat suspensie heterogen Tipul 3. Colonii M (cu consisten mucoid) - margine uniform, regulat - colonii bombate - suprafa neted, strlucitoare - consisten filant suspensie heterogen corespund adesea bacteriilor capsulate Gram negative (Klebsiella, Enterobacter etc)

b. Culturi n medii lichide n tuburi Dac s-a realizat o cultur ntr-un bulion nutritiv n tuburi, dup o incubare de 48 ore se pot evidenia urmatoarele caractere: 1. Turbiditatea: - tulburare mai mult sau mai puin intens a mediului

60

2. Formarea unei pelicule: - n cazul bacteriilor aerobe apare la suprafaa mediului o mas de celule care formeaz un voal 3. Formare de depozit: n cazul bacteriilor anaerobe se formeaz un sediment pe fundul tubului, mai mult sau mai puin abundent, colorat sau nu.

7.2. Caractere morfologice ale drojdiilor - se va observa forma i profilul coloniei, diametrul acesteia, aspectul (de obicei cremos), suprafaa (lucioas sau mat), culoarea (n general alb -crem).

7.3. Caractere morfologice ale mucegaiurilor Vor fi determinate urmtoarele caractere coloniale: - diametrul coloniei dup un timp cunoscut - culoarea coloniei i modificarea acesteia n timp - culoarea reversului coloniei - textura suprafeei coloniei: pufoas, psloas - eventual prezena picturilor de transpiraiepe miceliul aerian - mirosul

7.4. Determinarea vitezei de cretere a coloniilor de mucegai Dezvoltarea mucegaiurilor are loc destul de rapid n condiii favorabile, astfel c n interval de 2 - 3 zile pe mediu nutritiv se formeaz colonii vizibile, care cresc n diametru. n cazul mucegaiurilor inferioare caracterizate prin miceliu coenocitic, neseptat, coloniile se dezvolt rapid, sunt extinse, cu tendina de a ocupa tot spaiul disponibil, avnd aspect pslos i culori alb, bej, cenuiu, brun. Mucegaiurile superioare caracterizate prin miceliu septat formeaz colonii cu cretere radiar limitat i culori portocaliu, albastru. ce difer de la alb la galben, brun, verde,

61

Principiul metodei: Viteza de cretere a mucegaiurilor se poate determina prin cultivarea acestora n plci Petri, prin nepare central i msurarea zilnic a diametrului coloniei, pn la invadarea complet a suprafeei plcii. Pentru microorganismele cercetate , apariia sporilor coincide cu colorarea zonei respective, ncepnd cu centrul coloniei.

Materiale utilizate: - plci Petri sterile; - ans microbiologic; - mediu de cultur: extract de mal - agar n flacoane Erlenmayer; - soluie acid lactic 5 %, steril; - hrtie indicatoare de pH; - material biologicculturi de mucegaiuri - baie de ap termostat; - bec de gaz.

Mod de lucru: Mediul de cultur se topete pe baia de ap, apoi se termostateaz la 45

o

C. Se adaug soluia steril de acid lactic pn cnd pH -ul devine 3,5, valoare Se toarn 15-20 ml mediu de cultur n fiecare plac Petri i se las la

la care este inhibat dezvoltarea bacteriilor, dar nu i a mucegaiurilor.

temperatura camerei pentru solidificare. Cu vrful acului de inoculare, se recolteaz o mic poriune din cultur sporulat din eprubeta cu cultura de mucegai i se nsmneaz prin nepare n partea centrala a plcii, cu mare atenie pentru a nu se rspndi sporii pe suprafaa mediului de cultur. Cutia se va nchide cu band adeziv i se termostateaz la temperatura camerei, msurndu-se zilnic diametrul coloniei. Se determin viteza de cretere, Vcretere, dup formula: Vcretere = diametrul maxim al coloniei / nr.zile (ore)

62

7.5. Estimarea densitii populaiilor microbiene cu ajutorul camerei Thoma

Estimarea densitii populaiilor microbiene cu ajutorul camerei Thoma este o metod direct de numrare a celulelor, rapid i uor de efectuat, cu utilizri n stabilirea dinamicii de acumulare a celulelor microbie ne ntr-un mediu de cultur, n scopul urmririi formrii de biomas, de obinere a unui inocul sau n diferitele procese fermentative. Metoda prezint dezavantajul c nu deosebete celulele vii de cele moarte, este greu de aplicat pentru bacterii de dimensiuni mici, necesit suspensii celulare destul de dese i nu este foarte exact. Principiul metodei: Camerele de numrat reprezint lame de sticl prevzute cu trei platforme, din care platforma central este denivelat fa de celelalte dou cu 0,10 mm. Camera Thoma prezint o reea cu suprafaa de 1 mm 2, divizat n 400 microcelule elementare, numrtoarea fcndu-se n grupuri de 16 microcelule.

lamela 1/10 mm lama Thoma

Fig. 2. Camera Thoma seciune transversal

1/20 mm

63

1/20 mm

Fig. 3. Camera Thoma vedere frontal

Materiale utilizate: - suspensii de celule de drojdie i spori de muceagi n ap; - lamele; - camera Thoma; - pipete sterile. - microscop.

Mod de lucru: Se execut un preparat umed, plasnd suspensia de celule pe suprafaa reelei. Se aeaz lamela, care, sprijinindu-se pe cele dou platforme laterale, va delimita nlimea stratului de lichid, egal cu adncimea camerei (0,1 mm).

64

Preparatul astfel obinut se fixeaz cu cleme de platina microscopului i se caut imaginea reelei. In cmpul microscopic, prin deplasarea platinei se pot aduce grupe de cte 16 microcelule elementare i se face numrarea celulelor de drojdii. Se exclud de la numrare celulele care se afl cu mai mult de jumtate din suprafaa celulei n exteriorul careului de 4 x 4. Se efectueaz numrri din mai multe cmpuri microscopice (minimum 5) i se calculeaz numrul mediu de celule dintr-o microcelul. Cunoscnd suprafaa unei microcelule i volumul su ( V
1 1 mm3 ), 400 10

n funcie de diluia folosit la numrare, se poate calcula numrul de celule prezente ntr-un cm3 lichid de analizat, cu formula: N = n x 4000 x 1000 x k n care: n = numrul mediu de celule pe microcelul; 4000 = volumul microcelulei, n cm3; 1000 = factor de transformare n cm3; k = coeficientul de diluie.

7.6. Estimarea numrului de celule microbiene prin metoda culturilor

Principiul metodei Metoda cultural Koch const n nsmnarea unui volum cunoscut din suspensia de celule n / sau pe medii de cultur solidificate n plci Petri i, dup o perioad de incubare, se face numratoarea coloniilor considernd c fiecare colonie este rezultat prin multiplicarea unei singure celule. Metoda cultivrii n plci este foarte adesea folosit pentru determinarea numrului de microorganisme vii dintr-un produs i permite, n acelai timp, o analiz calitativ prin studiul caracterelor morfologice ale coloniilor dezvoltate.

65

De obicei se utilizeaz diluiile decimale ale produsului de analizat. Rezultatul se exprima in UFC (uniti formatoare de colonii), deoarece pot exista mai multe celule aglomerate care formeaz o colonie, iar n cazul mucegaiurilor exist fragmente multicelulare de hife; n plus, i 300 colonii. exist destule celule izolate care nu formeaz colonii. Se vor alege plcile care conin ntre 30

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

10-1

10-2

10-3

Fig. 4. Schema reprezentativ a metodei de cultivare n plci Petri a diluiilor decimale ale probei de analizat

Materiale utilizate - mediu de cultur: agar nutritiv sterilizat n flacoane Erlenmayer de 500 ml; - plci Petri sterile; - pipete sterile;

66

- eprubete cu cte 9 ml ap steril; - probe de ap din diferite surse; - baie de ap la 45 oC; - termostat la 37 oC; - dispozitiv de numrat colonii.

Modul de lucru Mediul de cultur coninut n balonul Erlenmayer se pune la topit pe baie de ap. Dup fluidificarea complet, se termostateaza, tot pe baie de ap la 45oC. Folosind pipeta steril, se pregtesc cte 3 diluii din probele de ap i apoi se recolteaz cte 1 cm3 din aceste diluii I, prin desfacerea plcii Petri sterile, se las s treac numai pipeta i se scurge coninutul. Peste volumul de suspensie se toarn mediul de cultur steril la 42 -45 oC i, imediat, prin rotirea n plan orizontal a plcii, se face om ogenizarea cu mediul i se las n repaos pentru solidificarea mediului i fixarea celulelor. Se recomand ca din aceeai diluie s se fac nsmnari n cte dou plci paralele. Plcile cu mediile nsmnate se introduc n termostat, reglat la temperatura de 37oC, pentru dezvoltarea microorganismelor. Numrarea coloniilor se va face dup 72 ore. Pentru numrare se aleg plcile n care numrul de colonii este cuprins ntre 30 - 300, acolo unde este posibil. n cazul n care coloniile sunt dese, pentru a nlesni numrtoarea, placa Petri se inverseaz i se aeaz pe numrtorul de colonii TITRIPLAQUE. Toate operaiunile se execut cu mult atenie evitndu -se orice surs de infectare cu microorganisme strine, care, ajungnd n plac ar influena rezultatul analizei. Numrul de uniti formatoare de colonii este dat de formula: UFC/ml = Nr. colonii x coeficientul de diluie

67

7.7. Determinarea calitii microbiene a apei 7.7.1. Determinarea numrului total de microorganisme Aceast metod se bazeaz pe efectuarea de diluii cu care este nsmnat mediul de cultur lichid. Diluiile se efectueaz din 10 n 10, pornind de la suspensia iniial pentru care se determin numrul de germeni. Mediul de cultur ales convenabil este repartizat steril cte 9 ml n fiecare tub. Serii de 3 sau 5 tuburi vor fi nsmnate cu cte 1 mililitru din suspensia iniial, apoi din diluiile decimale n ordine descresctoare a densitii celulelor (fiecare nou serie antreneaz un nou factor 10 de diluie). Dup incubare se procedeaz la citirea rezultatelor, considerndu-se pozitive tuburile n care este vizibil creterea (sau este vizibil o activitate biologic: virajul unui indicator de pH, degajare de gaz sau altele) i negative celelalte. Pentru fiecare serie de culturi provenite din aceeai diluie, se numr tuburile pozitive, care pot fi: 1. - 0, 1 sau 2 pentru 2 tuburi; 2. - 0, 1, 2 sau 3 pentru 3 tuburi; 3. - 0, 1, 2, 3, 4 sau 5 pentru 5 tuburi. Se compune astfel un numr caracteristic, format din cifrele

corespunztoare pentru

trei diluii succesive (pentru cazul 2), prima diluie

utilizat fiind cea mai concentrat. Numrul este alctuit din trei cifre i anume: prima cifr reprezint numrul de eprubete din ultima diluie n care s -a observat creterea n toate eprubetele nsmntate, urmtoarele dou cifre reprezint numrul de eprubete pozitive din urmtoarele dou diluii succesive. Interpretarea acestui test se bazeaz pe date statistice. Tabelele elaborate dau pentru fiecare numr caracteristic, numrul de celule cel mai probabil dintr-un mililitru din tubul corespunztor primei cifre din numrul caracteristic. Numrul de microorganisme dintr-un gram sau mililitru din produsul iniial se calculeaz nmulind numrul din tabel (corespunztor cifrei

68

caracteristice) cu coeficientul de diluie corespunztor primei cifre din caracteristic. Concentraia iniial se calculeaz innd cont de diluiile efectuate. De exemplu, pentru numrul caracteristic 210 (care nseamn 2 tuburi pozitive pentru cea mai mare densitate de celule, un tub pozitiv pentru cea medie i toate tuburile negative pentru densitatea cea mai mic), n tabel corespunde numrul cel mai probabil de celule 1,5 / ml, care se va nmuli cu coeficientul de diluie. Dac, de exemplu, diluia a fost 10-2, au fost iniial 150 celule / ml. n tabelul urmtor (numit tabelul Mac Grady) se prezint relaia ntre numrul caracteristic corespunztor pentru trei tuburi nsmnate i numrul cel mai probabil de celule: Tabelul 3 Corelaia dintre numrul caracteristic i numrul de celule
Numr caracteristic Numr de celule Numr caracteristic Numr de celule Numr caracteristic Numr de celule

000 001 010 011 020 100 101 102 110 111 120 121 130 200

0,0 0,3 0,3 0,6 0,6 0,4 0,7 1,1 0,7 1,1 1,1 1,5 1,6 0,9

201 202 210 211 212 220 221 222 223 230 231 232 300 301

1,4 2,0 1,5 2,0 3,0 2,0 3,0 3,5 4,0 3,0 3,5 4,0 2,5 4,0

302 310 311 312 313 320 321 322 323 330 331 332 333 334

6,5 4,5 7,5 11,5 16,0 9,5 15,0 20,0 30,0 25,0 45,0 110,0 140,0 145,0

69

7.7.2. Determinarea bacteriilor coliforme Sursa cea mai important de poluare bacterian a apei o constituie reziduurile, excrementele umane i animale, care pot conine germeni patogeni. Metoda pentru determinarea bacteriilor coliforme include teste prezumtive, de confirmare, bazate in primul rnd pe capacitatea bacteriilor de a fermenta lactoza cu producere de acid lactic, CO2, H2, n timp de 48 ore la 35C. Testul prezumtiv const n inocularea probei n mediu nutritiv cu, mediu de mbogire favorabil nmulirii att a bacteriilor coliforme, ct i a altor bacterii care folosesc lactoza ca surs de carbon. Testul de confirmare, const n inocularea culturilor din eprubetele pozitive ale testului prezumtiv pe medii selective, care inhib dezvoltarea bacteriilor nsoitoare i asigur nmulirea bacteriilor coliforme. Din grupul coliform, cel mai frecvent este ntlnit genul Escherichia, cu specia Escherichia coli, care indic o contaminare fecal recent.

Tehnica de lucru. Din prob i diluii succesive de inoculeaz cte 1 ml n c te 3 eprubete cu BCLP. Se termostateaz la 370C timp de 24-48 ore. Se nregistreaz

eprubetele pozitive (mediu tulbure, bule de gaz n plutitor, pH acid), iar eprubetele negative sunt din nou termostatate timp de 24 ore i se nregistreaz din nou eprubetele pozitive. Pentru confirmare, din eprubetele pozitive se recolteaz cte o ans i se inoculeaz eprubete cu BBLVP; dup incubare la 37 0C timp de 48 ore, n condiiile n care se produc din nou gaze n plutitor, tulburare, virajul culorii indicatorului verde briliant de la verde la galben, nseamn c n ap sunt prezente bacteriile coliforme.

70

Calcul i interpretare Folosind metoda titrului, n funcie de numrul eprubetelor pozitive , se stabilete cifra caracteristic i din tabelul lui Mac Crady, corespunztor cifrei caracteristice, se noteaz numrul probabil de coliformi. Pentru a calcula numrul probabil de coliformi/cm3 produs analizat, valoarea din tabel se nmulete cu factorul de diluie corespunztor primei cifre din cifra caracteristic. Numrul de coliformi admii n 100 ml ap, conform SR EN ISO 9308 -1/2004, este 0.

Fig. 5. Schema testului de confirmare a bacteriilor coliforme

71

Capitolul VIII

EXAMENUL MICROSCOPIC AL MICROORGANISMELOR

Studiul morfologiei microbiene nu poate fi conceput fr utilizarea microscopului; examenul microscopic joac un rol important n studiul i identificarea germenilor, precum i n determinarea numrului acestora.

MICROSCOPUL OPTIC

Microscopul optic se compune dintr-un stativ pe care sunt montate un sistem de transmisie optic, o platin port-obiect i un sistem de iluminare. Sistemul de transmisie optic Ocularele au puterea de mrire de 5x, 7x, 10x, 15x, 20x i chiar 30x. n lucrrile curente cele mai des folosite sunt cele 7x i 1 0x. Ocularele au rolul de a mri imaginea preparatului, dar i de a aplatiza i lumina cmpul optic. Obiectivele reprezint un sistem optic bine centrat, constituit din una sau mai multe lentile destinate a forma o imagine real a obiectului. Puterea lor d e mrire este invers proporional cu distana focal, adic cu distana dintre obiect i lentila pe care se formeaz imaginea. Calitatea esential a obiectivelor este puterea lor de rezoluie. Aceasta la rndul ei depinde de mrimea deschiderii unghiului pe care l face conul de raze

72

care intr n lentil precum i de indicele de refracie al mediului dintre obiect i lentil. Obiectivele sunt fixate prin nurubare pe un revolver port -obiectiv care permite selecionarea rapid a unuia din ele, prin simpla rotire. Gama de obiective necesare n microbiologie se compune din trei obiective cu puterea de mrire de 10x, 20x, 40x i un obiectiv cu imersie cu grosismentul 90x. Acest obiectiv se folosete n cazul n care obiectul ce trebuie examinat este mai mic sau dac este necesar a se observa amnunte foarte fine. La obiectivul cu imersie este necesar a se interpune ntre obiect i lentila frontal a obiectivului un lichid transparent (ulei de cedru, ulei de parafin, balsam de Canada etc). Sistemul de iluminare se compune din surs luminoas i dintr-un condensator. Condensatorul este o pies care se gsete imediat sub platina microscopului i care are rolul nu att de a strnge (condensa) razele luminoase venite de la sursa de lumin, ct de a mri seciunea conului de lumin pentru o mai bun claritate a imaginii.

Sistemul de reglare Deplasarea platinei port-obiect sau a sistemului optic se efectueaz cu ajutorul unei cremaliere, prin intermediul a dou butoane: unul mare care d o micare ampl i rapid (viza macrometric) i altul mic, pentru reglajul fin ( viza micrometric).

Modul de utilizare a microscopului Preparatul este plasat pe platina microscopului, avnd grij s fie bine fixat n dispozitivul de prindere. Este selectat obiectivul; n general, un examen debuteaz cu utilizarea obiectivului cel mai mic. n practic, se utilizeaz obiectivul 10x, apoi 20x pentru un preparat necunoscut sau pentru drojdii i mucegaiuri i obiectivul 40x pentru bacterii. Se regleaz distana lentilei obiectivului fa de preparat prin micarea vizei macrometrice i a celei micrometrice. (Obiectivele au o distan de reglare care

73

descrete cu puterea lor). Cutarea imaginii este apoi efectuat prin manevrarea butonului care acioneaz cremaliera, iar dup fixarea imaginii se face o nou reglare a acesteia. Curarea sistemului optic se efectueaz regulat cu xylol i nu cu alcool etilic. Reglarea intensitii luminii condensatorului se face innd seama de puterea de mrire a obiectivelor; cu ct aceasta este mai mare, cu att poziia condensatorului este mai ridicat. 8.1. EXAMENUL PREPARATELOR N STARE PROASPT Acest tip de operatie const n examinarea unui microorganism ntr -un mediu lichid ntre lam i lamel.

8.1.1. STUDIUL MICROSCOPIC AL CULTURILOR DE DROJDII Drojdiile reprezint un grup taxonomic complex i heterogen de microorganisme unicelulare eucariote, care se nmulesc prin nmugurire, ca form general de reproducere i n mod particular prin ascospori. Una din proprietile cele mai importante ale drojdiilor este aceea de a fermenta o serie de zaharuri, n condiii de anaerobioz, cu formare de alcool etilic, dioxid de carbon i compui secundari, care dau aroma caracteristic produselor fermentate, proprietate foarte mult utilizat n industria alimentar. Drojdiile au o compoziie chimic valoroas i, dup cultivare n condiii de aerare sunt utilizate ca surs de proteine cu denumirea de SCP (single cell protein) n alimentaia omului i a animalelor. Celula de drojdie are n mod obinuit form sferic, oval, cilindric, apiculat, sau form de sticl, cu dimensiuni medii de 4 - 14 m. Forma i dimensiunea celulei sunt caractere de specie i pot fi fiziologic i de condiiile de cultivare. influenate de starea

74

Principiul metodei Pentru evidenierea caracterelor morfologice i structurale ale drojdiilor se folosesc preparate microscopice n stare proaspt, studiate la microscop cu obiectivele 10x, 20x, 40x.

Materiale utilizate

- probe biologice, reprezentate de specii fungice cultivate pe mediu cu extract de mal-agar. - lame de microscop; - lamele de microscop - microscop; - pipete sterile; - ans; - eprubete sterile; - albastru de metilen; - alcool etilic 95 %; - ap distilat 100 ml; - sticlu picurtoare.

Modul de lucru A) Prepararea colorantului -soluie albastru de metilen Se cntresc 0,3 g albastru de metilen, peste care se adaug 30 ml alcool etilic 95 %. Dup dizolvarea colorantului n alcool se adaug 100 ml ap distilat. b) Evidenierea caracterelor morfologice

75

De pe suprafaa mediului de cultur se recolteaz cu ansa o poriune din cultura de drojdie care se amestec ntr-o eprubet cu civa ml ap. Din suspensia de celule se depune pe lama microscopic o pictur cu diametrul de ~ 0,7 cm, n zona central, cu ajutorul unei pipete. Se acoper preparatul cu o lamel curat, evitndu-se formarea de bule de aer. Se examineaz la microscop cu obiectivele de 10x, 20x i 40x, reinndu-se forma celulei, prezena nucleilor, prezena celulelor nmugurite. c) Evidenierea celulelor autolizate O suspensie de celule de drojdie se amestec n volume egale cu o soluie de albastru de metilen diluat i dup 3-5 minute se execut un preparat umed: celulele autolizate vor apare intens colorate in albastru, comparativ cu celulele vii, necolorate. ntr-un cmp microscopic se vor determina numrul total de celule i separat, celulele autolizate, fcndu-se raportul acestora.

8.1.2. STUDIUL MICROSCOPIC AL CULTURILOR DE MUCEGAIURI Mucegaiurile (sau fungii filamentoi) includ microorganisme de tip eucariot, monocelulare sau pluricelulare, cu nutriie de tip absorbtiv, difereniate din punct de vedere morfologic i care se reproduc prin spori sexuai sau asexuai. Corpul mucegaiurilor const din celule filamentoase, ramificate, numite hife, care formeaz miceliul. Mucegaiurile pot fi monocelulare, cnd se dezvolt sub forma unei celule uriae cu ramificaii (miceliu coenocitic) sau pluricelulare, caz n care miceliul este septat prin perei despritori (miceliu necoenocitic). Aparatul reproductor este reprezentat de hifele reproductoare purttoare de spori sexuai sau asexuai.

Principiul metodei

76

Pentru evidenierea caracterelor morfologice i structurale -hife vegetative i aparat reproductor - se efectueaz un preparat proaspt ntre lam i lamel sau un preparat n lactofenol, prin tehnica benzii adezive.

Materiale utilizate - culturi fungice crescute n plci Petri ; - lame microscopice; - lamele microscopice; - microscop; - pipete sterile; - ans; - lactofenol; - band adeziv transparent.

Modul de lucru Se efectueaz un preparat umed ntre lam i lamel, n felul urmtor: din cultura n plci Petri se preleveaz cu ajutorul firului metalic, din partea marginal a coloniei i fr a deranja structura iniial a miceliului, o mic poriune, care se desprinde uor ntr-o pictur de ap steril sau lactofenol de pe lama microscopic. Se aeaz lamela evitnd formarea n preparat a bulelor de gaz i se face studiul cu obiectivele 10x, 20x i 40x. Pentru meninerea ct mai exact a structurii aparatului reproductor, se poate aeza uor banda cu partea adeziv peste cultura de mucegai din placa Petri, apoi se pune peste pictura de lactofenol de pe lama microscopic. Se examineaz cu aceleai obiective. Pentru cele dou tulpini fungice se observ forma hifelor, prezena septurilor hifale, prezena conidiforilor cu organele de fructificaie specifice genurilor fungice examinate.

77

8.1.3. EVIDENIEREA MICROSCOPIC A BACTERIILOR

Bacteriile sunt microorganisme monocelulare de tip procariot, cu un cromozom unic, cu dimensiuni medii ntre 0,5 - 8 m, care se nmulesc asexuat prin sciziune binar, izomorf. Bacteriile au un rol major n natur n transformarea compuilor organici n compui anorganici simpli, prin procesul de mineralizare a materiei organice nevii, contribuind la realizarea circuitelor unor elemente chimice de importan vital: carbon, azot, sulf, fosfor etc. n procesele industriale, bacteriile sunt utilizate drept culturi starter n unele procese fermentative din industria alimentar (fabricarea produselor lactate, n panificaie, la conservarea materiilor prime vegetale), la obinerea de enzime, proteine, aminoacizi, acizi organici, solveni, antibiotice, ngrminte biologice, insecticide, vitamine, hormoni etc.

Principiul metodei Metoda se bazeaz pe efectuarea preparatului proaspt ntre lam i lamel din culturi bacteriene.

Materiale utilizate - culturi bacteriene crescute pe medii agarizate nclinate; - culturi bacterine crescute n mediu lichid (mediul MRS); - lame microscop; - lamele; - ans; - ap distilat.

78

Modul de lucru Pe lama microscopic se pune o pictur de ap steril cu diametrul de 0,7 -1 cm. Cu vrful firului metalic se preleveaz steril, la flacra de gaz, o poriune dintr-o cultur bacterian crescut pe agar nutritiv, n eprubete. Cultura se omogenizeaz ntr-o pictur de ap, apoi se ia o lamel curat , se sprijin pe lam la un unghi de 45o, se deplaseaz pn cnd lamela devine tangent la pictur i se las s cad peste aceasta: lichidul n exces se absoarbe cu o hrtie de filtru. Un preparat bun nu trebuie s prezinte bule de aer; acestea pot determina aglomerri de celule i mpiedic o bun observare a proprietilor. Pentru executarea preparatului din culturile bacteriene crescute pe mediu lichid, se preleveaz din proba omogenizat cu o pipet din care se las s cad pe lam o pictur, care se acoper apoi cu lamela. Preparatul astfel obinut se observ cu obiectivele 20x i 40x. Se vor urmri: n ambele cazuri- forma celulelor, eventual formarea de lanuri de bacili; prezena sporilor bacterieni.

8.2. EXAMENUL PREPARATELOR BACTERIENE N STARE USCAT Efectuarea unui preparat n stare uscat sau frotiu const n etalarea probei de studiat urmat de o uscare, de o fixare i, eventual, de o colorare. Frotiurile sunt realizate frecvent pentru bacterii sau pentru produse care conin bacterii, rareori pentru alte microorganisme.

79

8.2.1. TEHNICA DE EFECTUARE A PREPARATELOR USCATE. COLORATIA GRAM

n anul 1884 Christian Gram a constatat c bacteriile reacioneaz diferit n urma aceleiai tehnici de colorare i pune bazele metodei difereniale de colorare ce i poart numele, prin care bacteriile sunt mprite in dou mari grupe : Gram - pozitive i Gram - negative. Aceast afinitate tinctorial diferit fa de colorani este datorat structurii deosebite a peretelui celular la cele dou categorii de bacterii: bacteriile Gram - pozitive se coloreaz n violet prin aceast tehnic, n timp ce bacteriile Gram - negative capt culoarea roz sau roie a colorantului secundar utilizat. Peretele celular al bacteriilor Gram - pozitive const ntr-un strat unitar i omogen de peptidoglican, cu grosimea de 20 - 80 nm. n contrast, peretele celular al bacteriilor Gram - negative este mai complex, format dintr-un strat de peptidoglican de 1 -3 nm nconjurat de o membran extern de 7 - 8 nm.

Principiul metodei n funcie de structura peretelui celular, colorarea difereniat a celulelor prin metoda Gram are la baz o tehnic n mai multe etape. n prima etap, celulele sunt colorate cu colorantul bazic cristal-violet, utilizat drept colorant primar. Cea de a doua etap cuprinde tratamentul cu o solutie de I 2 / KI, cu rol de mordant, care mrete interacia dintre colorant i componentele celulei. A treia etap este reprezentat de splarea cu alcool-aceton, unde se difereniaz cele dou tipuri de bacterii; cele Gram pozitive rein cristalul violet, n timp ce bacteriile Gram - negative pierd colorantul primar i devin incolore. n

80

final, acestea din urm sunt colorate cu un alt colorant, secundar, cum este safranina sau fuxina. n acest mod, cele dou categorii de bacterii rmn colorate diferit, putnd fi difereniate n funcie de structura peretelui lor celular.

Materiale utilizate - cultur bacterian; - violet de geniana; - fenol cristalizat; - iod; - iodur de potasiu; - alcool; - aceton; - fuxin sau safranin - ulei de imersie; - lame de sticl; - balan; - pipete; - baloane cotate; - sticlue picurtoare.

Modul de lucru A. Prepararea soluiilor 1. Violet de geniana: - violet de geniana 1 g - fenol cristalizat5 g - alcool etilic 96 %10 ml - ap distilat..100 ml

81

Se tritureaz cristalele n mojar, se adaug cteva picturi de glicerin i treptat, alcoolul, pn devine ca o past, i apoi cantitatea de ap. Se pstreaz 48 ore, dup care se filtreaz i se folosete la colorarea dup Gram. 2. Soluie de Lugol: - iod metalic1 g - iodur de potasiu. 2 g - ap distilat..300 ml Se dizolv iodura de potasiu n 5 ml ap, se adaug cristalele de iod i se dizolv, apoi se adaug restul de ap pn la 300 ml.

3. Fuxina Ziehl: - fuxin bazic1 g - fenol cristalizat5 g - alcool etilic 96%10 ml - ap distilat.100 ml Se tritureaz cristalele n mojar, se amestec cu cteva picturi de glicerin, se adaug alcoolul treptat, pn se formeaz ca o past i se adaug ap distilat. Se filtreaz dup un repaos de 48 ore. Pentru soluia diluat se face un amestec cu ap distilat n proporie de 1/10. B. Etapele de obinere a frotiurilor colorate sunt urmtoarele: Pregtirea lamei: Lama perfect curat se sterilizeaz prin treceri consecutive ale ambelor fee prin flacra becului de gaz i se las s se rceasc pe stativ, n poziie nclinat. Etalarea suspensiei de celule:

82

Preparatul se realizeaz n pictur de ap steril n care se suspend celulele recoltate cu firul de inoculare. Suspensia de celule se ntinde prin deplasarea firului ansei tangent cu lama, ntr-un strat uniform. Preparatul de pe lama pe care s-a fcut etalarea i uniformizarea materialului biologic poart numele de frotiu. Uscarea frotiului: Dup uniformizare, frotiul se aeaz pe stativul de uscare sau se menine n curentul de aer cald, la distan de flacra becului de gaz, pentru a se produce evaporarea lichidului i ataarea celulelor bacteriene de suprafaa lamei. Fixarea frotiului const n omorrea i aderarea la lam a celulelor microbiene. Fixarea prin cldur se face trecnd frotiul uscat de trei ori, cu o micare lent, prin flacra becului de gaz, cu faa opus celei pe care se afl preparatul. C. Tehnica de colorare const n urmtoarele: Frotiul uscat i fixat se acoper cu violet de geniana, care se menine 1 -2 minute, dup care se scurge i se cltete cu ap. Frotiul se acoper cu solutie Lugol, cu rol de mordant, timp de 1 minut; se scurge i se cltete cu ap; Splarea frotiului de 2-3 ori, cu picturi din amestecul de alcool-aceton (3/1); Frotiul se spal cu ap n jet subire i se coloreaz cu o soluie de fuxin diluat (1/10), care se menine pe preparat 1-2 minute, se scurge excesul de colorant, se spal cu ap; Uscarea frotiului i examinarea preparatului cu obiectiv de imersie. Celulele Gram pozitive [G(+)] vor apare colorate n violet, celulele Gram negative, [ G(-)], n rou.

83

8.3. DETERMINAREA DIMENSIUNILOR CELULARE CU SCALA MICROMETRIC

Principiul metodei Msurarea diametrului celulelor, sporilor sau hifelor poate fi efectuat utiliznd un sistem ocular-obiectiv prevzut cu un micrometru ocular i un micrometru obiectiv. Micrometrul ocular este o plcu rotund din sticl foarte clar, pe care este gravat o scar micrometric. Acesta se introduce n tubul ocularului microscopic, cu faa n jos, dup deurubarea lentilei superioare. Scara micrometric este divizat n 50 de diviziuni egale notate de la 0 50, din 10 n 10. Valoarea unei diviziuni a scrii micrometrice variaz d e la microscop la microscop, dar i n funcie de obiectivul folosit la examinare. De aceea este necesar ca aceste valori s fie determinate pentru fiecare microscop n parte i, la acelai microscop, pentru fiecare combinaie ocular - obiectiv. Etalonarea se face cu ajutorul unei lame speciale numit micrometru obiectiv sau lam micrometric, pe care este de asemenea gravat sau fotografiat o scar lung de 1 mm i divizat n 100 pri. Spre deosebire de scara micrometric a ocularului, valoarea unei diviziuni de pe lama micrometric este cunoscut, fiind egal cu 1/100 dintr-un milimetru, adic cu 10 micrometri. Intervalul dintre 2 diviziuni de pe lama micrometric este egal cu 10 micrometri.

Materiale utilizate - micrometru obiectiv (0,01 mm); - micrometru ocular; - microscop; - culturi de drojdii i mucegaiuri; - lame microscopice;

84

- lamele microscopice; - ans de inoculare.

Modul de lucru Etalonarea scrii micrometrice Iniial, se aeaz lama cu micrometrul obiectiv pe platina microscopului i se introduce ocularul micrometric n ocularul stng al microscopului, cu faa in jos. Apoi, se prinde n cmpul microscopului scara micrometric a obiectivului (cu linii groase) i se pune la punct pn ce apare foarte clar vizibil. n continuare, se efectueaz suprapunerea celor dou scri micrometrice aflate acum n cmpul microscopului (aceea cu linii groase i mai mari fiind scara obiectivului i aceea cu linii mai mici i subiri, scara ocularului). Se rotete ocularul cu scara micrometric astfel nct s se suprapun e xact peste scara obiectivului. Apoi, se caut cte diviziuni ale micrometrului obiectiv sunt acoperite exact de diviziunile micrometrului ocular. Practic, se procedeaz astfel: - se caut prima diviziune a scrii obiectivului, care se suprapune exact peste una din liniile subiri ale scrii oculare; - se numr a cta diviziune a micrometrului ocular se suprapune din nou exact peste o diviziune a micrometrului obiectiv; - pentru stabilirea valorii unui interval dintre dou diviziuni ale ocularului micrometric (care se mai numete i indice sau coeficient micrometric), se calculeaz astfel: dac o diviziune a obiectivului micrometric este egal cu 0,01 mm, atunci fiecare diviziune a micrometrului ocular va fi egal cu 0,01/ nr de diviziuni dup care se suprapun. Etalonarea micrometrului ocular se va face pentru obiectivele 20x i 40x, astfel: dac n gradaii de pe ocular corespund la una sau p gradaii de pe obiectiv, o singur gradaie de pe ocular va avea valoarea 0,01/q sau (p/q)10-2 mm. Prin acelai procedeu se determin indicele micrometric al fiecrui

85

microscop, pentru toate combinatiile ocular-obiectiv, care se scriu apoi pe o list ce se aeaz n interior, pe ua cutiei microscopului. Pentru msurarea dimensiunilor celulei se va aeza preparatul microscopic proaspt ntre lam i lamel, pe platina microscopului i suport, se va poziiona astfel nct s poat fi determinat numrul de gradaii de pe ocular, corespunztor diametrului mare i diametrului mic, rotindu-se ocularul i dispozitivul de poziionare al platinei-port obiect. Cunoscndu-se valoarea unei diviziuni {(p/q)10-2} i numrul de diviziuni citite pe scal, se va determina valoarea dimensiunii celulei: (np/q)10-2 mm.

86

Capitolul IX

MICROORGANISME PATOGENE TRANSMISIBILE PRIN AP

9.1. Microorganismele definiie i caracteristici principale

9.2. Specii bacteriene patogene, transmisibile prin ap

Bacteriile sunt microorgansime care fac parte din regnul Procaryotae, care cuprinde dou diviziuni: Photobacteria i Scotobacteria. Prima diviziune cuprinde dou clase, corespunztoare bacteriilor fotosintetizante aerobe, de tipul cyanobacteriilor, respectiv, bacteriilor fotosintetizante anerobe. Cea de-a doua diviziune, Scotobacteria, cuprinde trei clase, i anume: Bacteria, Rickettsias i Mollicutes. n cazul bacteriilor patogene, prezente n mediul acvatic, transmiterea ctre organismul-gazd se realizeaz prin consumul apei potabile sau menajere, contaminate fecaloid, sau al alimentelor obinute din organisme acvatice infectate bacterian, precum i prin contactul cu apa de suprafa contaminat cu astfel de microrganisme. Numrul bolilor cu etiologie bacterian, transmisibile prin intermediul apei, este extrem de mare, fapt ce impune o sintetizare a principalelor genuri i specii ale acestor microorganisme, a cror interaciune cu organismul uman sau animal determin numeroase boli infecioase denumite, cu un termen generic, bacterioze.

87

Genul Aeromonas cuprinde specii bacteriene potenial patogene pentru om, putnd provoca infecii septicemice la organismele -gazd cu imunitatea compromis, precum i alte tipuri de afeciuni: diaree, pneumonie, abcese, suprainfecii ale unor plgi cutanate. La animalele poikiloterme (peti, amfibieni, reptile) produc septicemii epizootice. Sursele de infecie sunt reprezentate de apa de suprafa cu un coninut ridicat de substane organice, apa freatic contaminat, precum i animalele infectate. Clostridium botulinum este o specie bacterian care este rspndit, att n sol, sub form sporulat, ct i pe suprafaa plantelor sau n sedimentele ecosistemelor acvatice, marine i dulcicole. Sporii bacterieni sunt revivisceni, deoarece, odat ptruni n organismul-gazd, se activeaz metabolic i trec n aa-numitele forme vegetative, mai corect, din punct de vedere tiinific, fiind termenul de forme activate metabolic, care elaboreaz toxine, n condiiile de anaerobioz create n habitatul lor, prin descompunerea i devitalizarea esuturilor organismului-gazd. Botulina, principala toxin sintetizat de aceast specie bacterian, are efecte toxice grave asupra sistemului nervos, n condiiile consumului de alimente contaminate cu aceste microorganisme i se poate distruge prin tratament termic. Clostridium perfringens provoac gangrena gazoas la om i animale infectate, precum i diferite tipuri de enterite necotice. Aceast specie face parte din microbita intestinal, considerat normal, att la oameni, ct i la animale, i se elimin, sub form sporulat, din organismele-gazd, prin intermediul fecalelor. Escherichia coli reprezint o specie bacterian enteropatogen i enterotoxic, de tip invaziv, care provoac infecii gastro-intestinale cu efecte de lung durat, datorit capacitii sporite de rezisten la aciunea unor antibiotice. Transmiterea infeciei se realizeaz prin contaminarea fecal a apei potabile i a apei de mbiere. Klebsiella sp. determin infecii ale tractusului urinar i respirator, acest gen de microorganisme fiind larg rspndit n mediul ambiant, att n sol i ap,

88

ct i n microbiota intestinal uman i animal. Bacteriile din genul Klebsiella reprezint un risc potenial pentru sntatea uman, n condiiile utilizrii apei potabile, contaminate fecal, datorit rezistenei mari la tratamentul cu antibiotice. Listeria monocytogenes este o specie bacterian care poate determina meningite, encefalite, endocardite, avorturi, abcese i septicemii. Aceste microorganisme se elimin prin dejeciile oamenilor, dar i cele ale animalelor domestice i slbatice, ajungnd pe suprafaa plantelor, precum i n apele reziduale. Transmiterea acestor bacterii se realizeaz prin intermediul apei contaminate sau al alimentelor splate cu ap care conine asemenea microorganisme patogene. Mycobacterium tuberculosis este o specie bacterian din Ordinul Actinomycetales, care alturi de speciile: M. bovis, M. avium i M. atipice, determin la om i animale, tuberculoz i micobacterioze. Microorganismele se elimin prin sput sau prin fecalele omului i animalelor, fapt ce induce prezena acestora n apele reziduale. Transmiterea infeciei se efectueaz pe cale respiratorie, precum i prin ingestia apei poluate, n timpul operaiunii de mbiere. O caracteristic extrem de important a acestui grup de microorganisme este aceea c pot supravieui o perioad lung de timp, fapt ce determin un risc potenial major de declanare a unor infecii cu caracter epidemic, pe care l reprezint aceast specie bacterian, extrem de patogen pentru om i animale. Pseudomonas aeruginosa reprezint o specie bacterian care provoac infecii otice i oculare, ale unor leziuni i arsuri, precum i infecii ale cilor digestiv i urinar. Prezente n sol i ap, aceste microorganisme pot fi, ns, izolate din produse clinice, n mediul intraspitalicesc. Infecia se poate declana prin transmiterea bacteriilor ctre organismul receptor, fie prin consumul de buturi minerale sau rcoritoare, mbuteliate n mod absolut defectuos, fie prin ingestia apei potabile sau a apei de mbiere, contaminate n prealabil. n mediul intraspitalicesc poate determina infecii sporadice. Salmonella typhi i S. paratyphi sunt specii bacteriene care determin

89

febrele tifoid i, respectiv, paratifoid. Aceste microorganisme se localizeaz n intestinul organismelor-gazd, att bolnave, ct i purttoare asimptomatice (aparent sntoase) i se elimin prin fecale i urin. Transmiterea microbian se realizeaz prin intermediul apei contaminate fecal de la bolnavi sau de la acei purttori aparent sntoi, precum i prin consumul unor alimente splate cu ap contaminat cu aceste specii de bacterii. Att Salmonella typhi, ct i S. paratyphi, pot fi concentrate n corpul unor specii de molute, care triesc n apa poluat cu aceste bacterii, i transmise organismelor-gazd prin consumul acestor nevertebrate, n stare proaspt. Genul Salmonella cuprinde peste 1.000 de specii patogene i potenial patogene care pot determina infecii gastroenterice, precum i toxiinfecii alimentare. Genul Shigella cuprinde patru specii: Shigella dysenteriae, Sh. flexneri, Sh. boydii i Sh. sonnei, care reprezint agenii etiologici ai dizenteriei bacilare, boal adesea cu caracter epidemic. Epidemiile, cauzate de transmiterea microbian prin intermediul apei, survin n asociere cu contaminarea de origine fecal. Gradul de infeciozitate al acestor specii de microorganisme este extrem de ridicat, cteva celule bacteriene fiind suficiente pentru a declana un focar de infecie. Bacilii dizenterici sunt prezeni n tractusul intestinal al omului i al animalelor, n special, al maimuelor antropoide, n cazul, att al indivizilor declarai bolnavi, ct i al acelor purttori asimptomatici (aparent sntoi). Produsele alimentare perisabile sunt, n mod frecvent, contaminate cu asemenea ageni microbieni patogeni, prin intermediul apei de splare, contaminate fecal, sau al unor insecte din ordinul Diptera. Transmiterea se realizeaz prin consumul de ap sau de alimente contaminate cu aceste bacterii. Staphylococcus aureus reprezint o specie bacterian, cu un areal larg de rspndire, care provoac infecii, uneori, extrem de grave. Printre acestea se pot enumera cteva: furunculoze, abcese, meningite, osteomielite, otite, supuraii ale plgilor, toxiinfecii alimentare, septicemii.

90

Fiind o specie ubicuitar, Staphylococcus aureus se ntlnete, n mod fercvent, n microbiota tegumentelor, a glandelor sudoripare, precum i a mucoaselor, att la om, ct i la animalele homeoterme. Este o specie nesporogen, ns foarte rezistent la variaiile factorilor ambientali, supravieuind timp ndelungat n produse patologice uscate (puroi), n praful de pe obiectele din ncperi. Transmiterea infeciilor se produce prin soluii de continuitate, la nivelul tegumentelor i al mucoaselor nazofaringiene. Prin tratamente termice de sterilizare, la temperatura de fierbere a apei, aceste microorganisme sunt distruse aproape instantaneu. Genul Streptococcus cuprinde dou zeci i dou de specii, dintre care mai importante sunt: Streptococcus pyogenes, S. pneumoniae, S. faecalis, S. faecium, S. bovis, S. agalactiae, S. zooepidemicus, S. equisimilis. Aceste specii microbiene determin infecii respiratorii i urin are, endocardite, meningite, piodermite etc. Transmiterea microorganismelor are loc prin intermediul apei poluate cu fecale, precum i al alimentelor contaminate. Vibrio cholerae reprezint o specie bacterian patogen, care provoac o afeciune exclusiv uman, cu manifestri digestive, n care apa deine rolul cel mai important; vibrionii neaglutinabili determin gastroenterite. Vibrionul holerei se transmite pe calea apei contaminate cu fecale provenite, att de la bolnavii declarai, ct i de la purtt orii asimptomatici, precum i prin alimente, splate cu ap poluat fecal, sau prin consumul unor animale nevertebrate, de tipul molutelor, care concentreaz n corpul lor aceste microorganisme patogene pentru om. Yersinia enterocolitica este o specie bacterian care persist, timp ndelungat, n microbiota intestinului uman, fiind ubicuitar n colonul animalelor domestice i al roztoarelor. Contamineaz frecvent alimentele, producnd infecii intestinale, artrite acute i cronice, glomerulonefrite, eriteme etc.

91

Transmiterea se realizeaz prin intermediul apei contaminate fecal, precum i prin consumul de alimente, preparate din animale care au fost contaminate cu aceste bacterii. Cyanobacteriile, cunoscute sub denumirea mai veche, dar complet eronat, de Cyanophyceae (alge albastre-verzi), reprezint un grup de specii bacteriene fotosintetizante, care s-au dovedit a fi productoare de toxine, transmisibile la om i animale, prin intermediul apei n care acestea se dezvolt. Speciile de Cyanobacterii productoare de cyanotoxine sunt cele care aparin genurilor: Microcystis, Nodularia, Anabaena, Gleotrichia,

Coelosphaerium. n anumite ecosisteme acvatice, datorit acumulrii excesive a compuilor ce conin fosfor i azot, se creeaz condiiile optime pentru o dezvoltare rapid i masiv a acestor cyanobacterii, producndu-se aa-numitul fenomen de eutrofizare, cu efecte toxice dintre cele mai grave, pentru flora i fauna adiacent arealului de multiplicare a acestor microorganisme fotosintetizante. Concentraiile mari ale cyanotoxinelor care sunt sintetizate de ctre cyanobacterii produc intoxicaii att la om, ct i la animalele, care consum ap contaminat, la acestea din urm efectele aprute fiind, de regul, sub forma paraliziilor generalizate i, uneori, chiar letale. Concentraiile mai mici ale acestor toxine produc reacii alergice la oameni, prin contactul apei contaminate cu tegumentul, iar la animale efectele se concretizeaz n reducerea produciei de lapte la vite, oboseal, fotofobie, salivaie abundent, diaree i constipaie. 9.3. Specii fungice patogene, transmisibile prin ap Fungii reprezint un grup distinct de microorganisme, ce cuprinde peste un milion de specii, cunocute pn n prezent, i care, din punct de vedere taxonomic constituie Regnul Fungi.

92

Acest regn cuprinde dou subregnuri: Eumycetes i Archimycetes. Primul subregn, respectiv, Eumycetes, prezint patru clase, i anume: Phycomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes i Fungi imperfecti. Afeciunile produse de fungi sunt denumite, cu un term en generic, micoze. Candida albicans se ncadreaz, din punct de vedere taxonomic, n Clasa Fungi imperfecti, Ordinul Moniliales, Familia Cryptococcaceae, i reprezint o specie de fungi, cu ciclul de via de tip parazitar, care produce micoze cutaneo-mucoase i viscerale sau generalizate, cu denumirea specific de candidoze. Afeciunile viscerale sunt localizate la nivelul tractusului respirator, digestiv i urinar, precum i, n cazuri extrem de grave, la nivelul sistemului nervos central. 9.4. Specii de protozoare patogene, transmisibile prin ap Protozoarele sunt microorganisme unicelulare, autonome, cu via liber sau parazitar, care n decursul ciclului lor evolutiv, prezint dou forme: forma activ (vegetativ) i forma pasiv, chistic (chistul). La protozoarele libere, nchistarea se produce n condiii nefavorabile de mediu, n timp ce la formele parazite, acest fenomen se realizeaz n condiii normale de via, chisturile fiind, pentru anumite specii de protozoare, un mijloc de diseminare la alte organismegazd. Aceste microorganisme sunt ncadrate taxonomic n Regnul Animalia, Subregnul Protozoa, ncrengtura Protozoa, care cuprinde patru clase: Flagellata, Sarcodina, Sporozoa i Ciliophora. Dintre aceste specii de protozoare, care sunt parazite la om i animale, unele se transmit aproape exclusiv prin intermediul apei sau al alimentelor. Iat, n continuare, doar trei specii mai importante dintre acestea. Entamoeba histolytica paraziteaz tubul digestiv al omului, determinnd amoebioza (dizenteria amoebian), mai ales, n regiunile cu clim cald, i

93

sindromul de enterocolit dizenteric. n unele cazuri, poate avea i o localizare extraintestinal, n diferite organe: ficat, splin, pulmon, creier sau, chiar, tegument. Transmiterea este direct, prin ingerarea chisturilor sau indirect, prin intermediul apei de but i de mbiere sau al alimentelor splate cu ap contaminat. Giardia intestinalis reprezint o specie de protozoare flagelate, care paraziteaz organismul uman, n special, copii, i care este localizat n duoden i poriunea proximal a jejunului, mai rar, n coledoc i vezicula biliar, unde provoac giardioz, enterocolit i duodenojejunit. Transmiterea se produce prin intermediul apei i al alimentelor, contaminate fecal. Genul Trichomonas, cu speciile: Trichomonas intestinalis i T. vaginalis constituie un grup de protozoare flagelate, care pot fi localizate la om n intestin i, respectiv, vagin, mai rar, uretr. Pot provoca afeciuni numite trichomonioze enterocolice sau genito-urinare, i se transmit prin intermediul apei potabile sau al apei din piscine, poluate cu dejecii, precum i al alimentelor contaminate. Balantidium coli este o specie de protozoare ciliate, care paraziteaz porcinele, maimuele, omul i, mai rar, roztoarele. La om provoac balantidioza (dizenteria balantidian), asemntoare cu dizenteria amoebian. Acest microorganism face parte din microbiota intestinal a porcinelor, fiind localizat n colon. Transmiterea se realizeaz pe calea alimentelor i a apei contaminate fecal, n special, prin deversarea dejeciilor de la complexele zootehnice. n apele reziduale i rezervoarele de ap, virusurile i microorganismele patogene pot fi prezente n mod intermitent sau sporadic. n general, bacteriile patogene sunt mai numeroase dect bacteriile nepatogene, iar demonstrarea patogenitii depinde foarte mult de capacitatea selectiv a substratului nutritiv folosit. Decelarea prezenei microorganismelor cu potenialul cel mai ridicat de patogenitate, precum i a celor a cror densitate numeric n apele contaminate poate determina infecii cu efecte grave asupra populaiilor umane, reprezint o

94

metod extrem de necesar pentru evaluarea calitii microbiologice a surselor de ap destinate consumului uman. 9.5. Bioindicatori pentru determinarea gradului de contaminare bacterian a apelor Majoritatea bolilor transmisibile prin intermediul apei au ca ageni etiologici microorganismele, eliminate din tubul digestiv, prin intermediul fecalelor. n acest mod, rezult faptul c prima condiie de calitate a apei, din punct de vedere bacteriologic, este absena enterobacteriilor patogene. Decelarea microorganismelor, prezente, n mod normal, n materiile fecale ale omului i animalelor homeoterme se realizeaz prin efectuarea analizelor microbiologice specifice. Aceste microorganisme reprezint, de fapt, bioindicatori de contaminare fecal a apei, datorit faptului c sunt asociate cu microorganismele patogene. Aadar, utilizarea microorganismelor prezente n microbiota intestinal, ca bioindicatori ai polurii fecale, reprezint un procedeu standardizat, unanim acceptat n prezent, pentru supravegherea i evaluarea calitii microbiologice a apei. n mod evident, exist o serie de condiii discriminatorii pe care trebuie s le ndeplineasc aceti bioindicatori ai contaminrii fecale a apei, i anume: prezena constant i densitatea numeric mare n materiile fecale, at t la om, ct i la animale; absena sau doar prezena n numr foarte mic n mediul extern al organismelor umane sau animale sau n alte surse; facilitatea izolrii, identificrii i evalurii numerice, prin analize bacteriologice simple i rapide; existena unei corelaii de ordin cantitativ, ntre numrul acestor bioindicatori i nivelul de contaminare fecal a apei; incapacitatea de a se multiplica n ap;

95

 supravieuirea n mediul acvatic, o perioad de timp mai ndelungat, comparativ cu microorganismele considerate patogene, a cror prezen sau absen indic eficacitatea tratamentelor de dezinfecie a apei. Aadar, iat, n continuare, care sunt principalii b ioindicatori de contaminare bacterian a apelor. 1. Numrul total de uniti formatoare de colonii bacteriene reprezint un indicator de ordin cantitativ, referitor la nivelul de poluare a apelor, avnd un caracter strict prezumtiv i nespecific, deoarece indic doar numrul total de bacterii mezofile, att patogene, ct i nepatogene, prezente n ap, i care se dezvolt la temperatura de 370C. O unitate formatoare de colonii bacteriene este constituit din totalitatea formelor vegetative ale unei bacterii care descind, n mod direct, dintro singur celul bacterian, prin multiplicarea acesteia pe mediile de cultivare in vitro, indiferent de forma pasiv sau activ n care aceasta s -a aflat n momentul efecturii analizei microbiologice. Cu ct numrul acestor bacterii mezofile este mai mare, cu att mai mult sporete prezumia existenei, n apa analizat, a unor microorganisme patogene. Cele mai multe microorganisme din ecosistemele acvatice naturale au perioade de cretere i dezvoltare la temperaturi cuprinse ntre 10-250C, formnd aa-numita microbiot psihrofil. Studiile tiinifice efectuate au demonstrat faptul c ntre microbiota psihrofil i cea mezofil exist, n mod natural, un raport numeric de 3:1. Cu ct acest raport se micoreaz sau se inverseaz n favoarea microbiotei mezofile, cu att nivelul de poluare a apei este mai probabil, iar riscul prezenei bacteriilor patogene este mai crescut. 2. Bacteriile coliforme constituie un grup de specii bacteriene, care aparin Familiei Enterobacteriaceae, cu genurile: Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Serratia, Proteus, Yersinia , i care reprezint bioindicatori specifici ai polurii apelor cu microorganisme patogene.

96

Grupul bacteriilor coliforme este larg rspndit n natur i nu este considerat ca avnd o importan epidemiologic direct pentru evaluarea gradului de contaminare a apelor. Chiar dac nu este de origine exclusiv fecal, grupul coliformilor este prezent n numr mare n materiile fecale ale omului i animalelor homeoterme, ceea ce permite decelarea acestor microorganisme, chiar i dup o diluie considerabil a probei de analizat. n general, se consider c grupul bacteriilor coliforme cuprinde dou subdiviziuni, i anume: grupul de coliformi totali i grupul de coliformi fecali. Termenul de coliformi totali se refer, n mod obinuit, la grupul de enterobacterii, reprezentate de bacili Gram-negativi, nesporulai, facultativ anaerobi, catalazo-pozitivi, oxidazo-negativi, capabili s se dezvolte n prezena srurilor biliare i s fermenteze lactoza, la temperatura de 35 - 370C, cu producere de acid i degajare de CO2, n decurs de 24 - 48 h. Bacteriile coliforme care prezint aceste caracteristici metabolice, menionate anterior, i care posed capacitatea de a se dezvolta i la temperatura de 450C, sunt numii coliformi fecali sau termotolerani. Reprezentantul cel mai important al acestui grup este considerat a fi Escherichia coli. Actualele metode de analiz microbiologic a apelor contaminate au demonstrat faptul c acest grup de coliformi fecali reprezint un bioindicator mult mai specific i sensibil la poluarea cu materii fecale provenite de la om i animale homeoterme, comparativ cu grupul coliformilor totali, n special, la evaluarea gradului de poluare a unor ecosisteme acvatice naturale (ape curgtoare) sau artificiale (staii de tratare a apelor). 3. Streptococii fecali (Enterococii) reprezint un grup de bacterii din Familia Streptococcaceae, genul Streptococcus, cu speciile S. faecalis, S. faccium, S. zymogenes, S. bovis, S. equinum, S. avium, care fac parte din microbiota intestinal a omului i animalelor homeoterme.

97

Streptococii fecali supravieuiesc timp ndelungat n mediul acvatic, fa de grupul coliformilor, dar se gsesc n proporie mult mai redus n coninutul materiilor fecale provenite de la om, comparativ cu coliformii fecali. Studii aprofundate privind incidena izolrii streptococilor fecali din apele fecaloid-menajere, apele meteorice, rezultate n urma ploilor i furtunilor violente, apele reziduale provenite de la cresctoriile piscicole, precum i de la combinatele zootehnice, au condus la reevaluarea semnificaiei sanitare a sistemului binar de bioindicatori, format din dubletul: coliformi fecali streptococi fecali. Astfel, streptococii fecali sunt prezeni, n numr mai mare n dejeciile rezultate de la fermele zootehnice, precum i n apele met eorice reziduale, comparativ cu coliformii fecali, n timp ce, dimpotriv, n dejeciile provenite de la populaiile umane, precum i n apele menajere, proporia coliformilor fecali este de patru ori mai mare dect cea a streptococilor fecali. Speciile Streptococcus bovis, S. equinus, S. avium sunt bioindicatori ai polrii fecale cu dejecii provenite de la mamifere i psri. Aceste trei specii de streptococi fecali nu rezist mult timp n afara tractusului intestinal al acestor animale, fiind rapid inactivate n condiiile existente n mediul ambiant. n consecin, prezena acestor specii de streptococi n ap constituie un indiciu sensibil i elocvent al polurii fecale, de dat extrem de recent, comparativ cu celelalte dou specii, Streptococcus faecalis i S. faecium, care sunt prezente doar n materiile fecale provenite de la om, i care sunt mult mai rezistente n condiiile existenei n mediul extern. Datorit acestei capaciti de a rezista la aciunea agenilor fizici, chimici i biologici din mediul ambiant, streptococii fecali, n calitate de bioindicatori specifici ai polurii de origine fecal a apei, au o important valoare sanitar, prezena lor n probele de analiz bacteriologic constituind un test extrem de relevant pentru verificarea eficacitii tratamentelor de dezinfecie a apei. 4. Bacteriile anerobe sulfito-reductoare constituie un grup de bacterii sporulate anaerobe, care fac parte din Familia Bacillaceae i aparin genului Clostridium, cu reprezentantul su cel mai important d in punct de vedere sanitar,

98

Clostridium perfringens. Aceast specie bacterian este reprezentat de bacili sporulai i capsulai, Gram-pozitivi, imobili, capabili s reduc sulfitul de fier la sulfur feroas, ntr-un mediu selectiv de cultivare, la temperatura de 450C, care coaguleaz lactoza cu formare de cheag alveolar i produc lecitinaz. Asemenea bacterii sporulate anaerobe i sulfito-reductoare se gsesc n intestinul uman, dar i n apele reziduale fecaloid-menajere. Decelarea acestor bacterii sporulate anaerobe are o importan secundar n stabilirea unei poluri fecale recente. n schimb, prezena clostridiilor sulfito-reductoare n probele de analiz bacteriologic reprezint un indicator al unei contaminri a apei cu materii fecale, care s-a produs cu mult timp n urm sau care a avut loc n mod intermitent. n asemenea situaii, coliformii i streptococii fecali pot fi prezeni sau abseni, deoarece sporii clostridiilor sulfito-reductoare pot s supravieuiasc n mediul acvatic perioade ndelungate de timp i s persiste chiar n condiiile n care toate celelalte bacterii cu rol de bioindicatori de contaminare fecal au disprut. Aadar, clostridiile sulfito-reductoare reprezint un bioindicator cu o valoare sanitar deosebit pentru evaluarea unei poluri fecale ndeprtate sau intermitente. Totodat, aceste clostridii sulfito-reductoare pot fi utilizate ca bioindicatori ai supravieuirii bacteriilor patogene anaerobe sporulate, n diferite etape tehnologice de tratare a apelor reziduale, intens poluate fecal, precum i ca test bacteriologic de referin pentru eficacitatea proceselor de epurare a nmolului. Sporii bacteriilor anaerobe pot rezista timp ndelungat n nmol, fiind, astfel, utili pentru estimarea polurii de lung durat, prin compararea concentraiei de spori n raport cu adncimea sedimentului de nmol. n acest context, se poate concluziona c datorit capacitii deosebite a sporilor clostridiilor sulfito-reductoare de a supravieui mai mult timp n ap, comparativ cu grupul coliformilor, precum i datorit rezistenei foarte mari a acestor bacterii sporulate anaerobe la aciunea dezinfectantelor, persistena lor n apele tratate, indic deficiene majore n efectuarea proceselor de epurare a apei.

99

5. Bacteriofagii enterici sunt virusuri adaptate la parazitismul intracelular care afecteaz enterobacteriile. n consecin, aria de rspndire a bacteriofagilor enterici, n mediul extern, corespunde ariei de rspndire a enterobacteriilor. Din intestinul uman i al animalelor, bacteriofagii enterici sunt diseminai n mediu, prezena lor putnd fi decelat i n ap. n evaluarea calitii microbiologice a apei se utilizeaz, drept indicatori ai nivelului de poluare biologic a apelor, bacteriofagul antitific i bacteriofagul anticoli, alturi de ali doi bioindicatori, coliformii fecali i, respectiv, streptococii fecali. Fagii enterici reprezint un indicator indirect al polurii cu virusuri enterice, avnd n vedere faptul c determinarea indicatorilor bacteriologici obinuii ai polurii fecale, nu poate constitui un indicator valabil pentru poluarea viral a apei. Fiind mai rezisteni la aciunea dezinfectant a clorului, comparativ cu coliformii i streptococii fecali, bacteriofagii enterici, prezeni n probele de ap analizate, ofer informaii suplimentare asupra eficienei dezinfec iei apei, prin clorurare n instalaiile de tratare a apelor din marile aezri urbane. n acelai timp, prezena acestor bacteriofagi n probele de analiz a apei, constituie un semnal de avertizare asupra potenialului risc pentru sntatea colectivitilor umane, datorat inconstanei de eficacitate a proceselor de epurare a apelor. 6. Pseudomonas aeruginosa este o specie bacterian, care aparine Familiei Pseudomonadaceae i care cuprinde bacili Gram-nagativi, nesporulai. Aceste bacterii sintetizeaz doi pigmeni caracteristici: piocianina i fluoresceina, sunt oxidazo-pozitivi, reduc nitraii la nitrii, lichefiaz gelatina, oxideaz glucoza i sunt rezistente la aciunea compuilor cuaternari de amoniu. Specia Pseudomonas aeruginosa este larg rspndit n natur (n ap i n sol), fiind, ns, n mod frecvent, izolat de pe mucoase i tegumente, precum i din tubul digestiv, att la om, ct i la animale. n dejeciile provenite de la om bacteriile din aceast specie apar n proporie mult mai mic, comparativ cu coliformii.

100

De altfel, este cunoscut faptul c P. aeruginosa nu poate supravieui prea mult timp n lipsa umiditii, aceast specie avnd, prin excelen, habitatul specific reprezentat de mediul acvatic, dei se poate multiplica n prezena unor cantiti mici de substane nutritive i prezint o capacitate mare de rezisten la aciunea substanelor dezinfectante. Prezena acestei specii bacteriene a fost semnalat, n mod constant, n apele uzate menajere, precum i n efluenii staiilor de epurare. n apa rezidual, de regul, aceast bacterie se afl n asociaii comune cu grupul coliformilor, dar au existat i situaii n care a fost izolat din apa potabil, chiar n absena coliformilor fecali. De asemenea, prezena speciei P. aeruginosa n apa potabil nu constituie un indiciu privind evaluarea curent a contaminrii fecale a apei. Cu toate acestea, bacteriile din specia P. aeruginosa reprezint un bioindicator eficace n anumite situaii specifice, cum sunt: supravegherea aprovizionrii cu ap potabil a spitalelor, prepararea amestecurilor de rehidratare, prepararea alimentelor i a unor produse farmaceutice, n special, pentru nou-nscui. n acelai timp, aceast specie constituie un bioindicator adecvat pentru evaluarea calitii microbiologice a apelor plate i minerale, mbuteliate, astfel nct aceste produse s nu prezinte nici un fel de risc pentru sntatea uman.

101

Capitolul X

TEHNICI DE ANALIZ MOLECULAR UTILIZATE PENTRU INVESTIGAREA MICROBIOLOGIC A CALITII APEI

10.1. Metode moderne de identificare chemotaxonomic a speciilor bacteriene i fungice 10.1.1. Analiza compoziiei acizilor grai - metod de identificare chemotaxonomic a bacteriilor i fungilor Principiul metodei de analiz Asemenea oricror sisteme biologice de nivel celular, bacteriile i fungii posed membran citoplasmatic ca o component de baz a anvelopei celulare, n a crei compoziie lipidele reprezint peste 50%. Lipidele membranare constituie un grup divers de molecule organice, care sunt utilizate frecvent sub forma unor indicatori (markers) pentru clasificarea i identificarea microorganismelor. n mod special, lipidele dublu active (amphipathic lipids), care conin n molecul poriuni att hidrofile, ct i hidrofobe, au o mare importan n sistematica microorganismelor fiind utilizate, fie n stare de molecule integrale, fie sub forma unor pri componente, rezultate din fragmentarea molecular (Kieft i colab., 1994; Zelles i colab., 1994).

102

Asemntor glicolipidelor i fosfogliceridelor, moleculele lipidelor dublu active posed o regiune apical polar, precum i unele regiuni caudale nepolare, formate din lanuri hidrocarbonice, care sunt dispuse ntr-o structur lipidic bistratificat. Regiunile nepolare sunt, n general, esteri ai acizilor grai care posed un numr mare de atomi de carbon. Compoziia n acizi grai a celulelor microorganismelor a fost intens exploatat pentru a facilita caracterizarea lor molecular, ct mai precis posibil, n scopul identificrii lor chemotaxonomice. n general, profilul chimic al acizilor grai prezeni n celulele bacteriene variaz de la un numr de 9 atomi de carbon n molecul pn la 20 de atomi de acest fel (Suzuki i Komagata, 1983; Zelles i Bai, 1994). La majoritatea bacteriilor Gram-pozitive, acizii grai sunt localizai n membrana citoplasmatic, cu toate c, unele dintre aceste microorganisme (cum sunt micobacteriile sau alte grupe sistematice asemntoare acestora) posed lanuri lipidice lungi, cunoscute sub numele de acizi micolici sau hidroxi -acizi grai, care se gsesc localizai ntr-o structur asemntoare membranei externe bacteriene. De asemenea, bacteriile Gram-negative posed acizi grai n membrana citoplasmatic, astfel nct acetia pot fi identificai ntr-o fraciune a peretelui celular, mai exact, sub forma lipopolizaharidelor (Komagata i Suzu ki, 1987; Esnard i colab., 1994). Asemenea majoritii celulelor eucariote, fungii posed n compoziia lor acizi grai a cror compoziie este cu mult mai simpl dect cea a microorganismelor procariote, predominnd acizii grai cu un numr de atomi de carbon oscilnd, predominant, ntre C16 i C18. Aceti acizi grai se gsesc sub forma unor componente lipidice ale membranei citoplasmatice, mult mai complexe, cum sunt: acilglicerolii i fosfogliceridele, precum i sub form de molecule libere, n acest mod, semnificaia lor biologic continund s rmn nc neclar (Esnard i col ab., 1994; Kieft i colab., 1994).

103

Acizii grai bacterieni sau fungici se pot afla sub diferite forme. Astfel, acizii grai hidroxilai sunt, n general, componente ale lipopolizaharidelor, avnd un rol determinant n stabilirea identitii unor specii b acteriene, n mod special a pseudomonadelor non-fluorescente. Totodat, acizii grai nesaturai, dei nu se ntlnesc la procariote, prezint, totui, o importan deosebit n caracterizarea speciilor de fungi. Analiza propriu-zis pentru determinarea calitativ a prezenei acizilor grai n celulele bacteriene i fungice, poate fi divizat n cinci etape principale, i anume: 1 - cultivarea celulelor bacteriene sau fungice n condiii standard (prin respectarea cerinelor nutritive i meninerea, n limitele valorilor optime, a tuturor factorilor fizico-chimici, implicai n realizarea ciclurilor de cretere i dezvoltare a acestora); 2 - eliberarea prin extracie a acizilor grai de pe suprafaa celulei (att a membranei citoplasmatice, ct i a membranei externe); 3 - metilarea acizilor grai n vederea creterii volatilitii acestora; 4 - analiza gaz-cromatografic, utiliznd coloane capilare pentru sporirea sensibilitii i rezoluiei investigaiei; 5 - utilizarea profilurilor chimice ale acizilor grai pentru clasificarea i identificarea speciilor de microorganisme. Identificarea se poate realiza fie prin compararea acestor profiluri din punct de vedere al compoziiei chimice a acizilor grai, care intr n constituia celulelor unei specii necunoscute, cu cele ale altor specii, identificate anterior, i ale cror profiluri sunt deja cunoscute n literatura de specialitate, fie prin selecia computerizat a unor baze de date. Clasificarea implic analiza statistic a datelor, utiliznd profiluri ale acizilor grai identificai la specii similare de microorganisme sau nrudite cu acestea (Zelles i Bai, 1994; Zelles i colab., 1995).

104

Protocolul experimental

n continuare, sunt prezentate etapele principale ale protocolului de lucru, corespunztor metodei de analiz a compoziiei chimice a acizilor grai: 1. Prelevarea unei cantiti de aproximativ 40 mg, dintr-o cultur bacterian sau fungic, cu ajutorul unei anse speciale, i introducerea ace steia n tuburi de sticl, prevzute cu capace ermetic nchise. 2. Saponificarea lipidelor, existente n proba anterior prelevat, prin adugarea unui volum echivalent a 1 ml din amestecul de reacie nr.1, compus din: 45 g NaOH, 150 ml C2H5-OH i 150 ml ap dublu distilat. 3. Agitarea intens a probelor, timp de 5 - 10 sec., cu ajutorul unui agitator mecanic, de tip Vortex. 4. Incubarea probelor la temperatura de 1000C, timp de 5 min., prin introducerea tuburilor, ermetic nchise, ntr-o baie de ap, prevzut cu termostat. 5. Reagitarea probelor timp de 5 sec. 6. Reincubarea la temperatura de 1000C, timp de 25 sec. 7. Rcirea rapid a tuburilor coninnd probele de analizat, timp de 1 min., prin introducerea acestora n ap rece. 8. Metilarea lipidelor din probele de analizat, prin adugarea unui volum de 2 ml din amestecul de reacie nr. 2, alctuit din: 325 ml 6N HCl i 275 ml C2H5-OH. 9. Agitarea puternic, timp de 5 - 10 sec.; 10. Incubarea la o temperatur de 800C, timp de 10 min. 11. Rcirea rapid, timp de 1 min. 12. Extracia lipidic, prin adugarea unui volum echivalent a 1,25 ml din amestecul de reacie nr. 3, compus din: C6H12 i metil-ter-butil-eter (ambele componente avnd concentraii egale n soluia de baz, precum i o puritat e de grad echivalent celui necesar n HPLC). 13. Agitarea manual, timp de 10 min.

105

14. Evacuarea precipitatului rezultat sub forma unui sediment, utiliznd o pipet, prevzut cu un dispozitiv de absorbie fin. 15. Splarea supernatantului, rmas n tuburile de analiz, prin ndeprtarea sedimentului format, prin adugarea unui volum de 3 ml din amestecul de reacie nr. 4, format dintr-o soluie de NaOH, avnd o concentraie de 1,15%. 16. Agitarea manual, timp de 5 min. 17. Prelevarea supernatantului, n proporie de 2/3 din volumul total, cu ajutorul unei pipete Pasteur. 18. Transvazarea supernatantului, prelevat anterior, n flacoane prevzute cu capse de etanare ermetic. 19. Analiza gaz-cromatografic i interpretarea rezultatelor, prin clasificarea i identificarea taxonomic n sistem computerizat. 10.1.2. Metode de analiz a metaboliilor secundari Fungii filamentoi, asemenea altor microorganisme, precum i majoritii speciilor de organisme vegetale, prezint dou zone distincte de desfurare a activitilor metabolice, interconectate prin anumii produi intermediari comuni, care pot fi denumii produi primari sau secundari. Termenul de metabolii secundari a fost introdus, pentru prima dat, de ctre J.D. Bu'Lock, n 1963, fiind preluat dintr-un concept existent, anterior, n domeniul fitopatologiei, i adaptat, ulterior, n scopul definirii unor compui metabolici ai microorganismelor. n realitate, distincia net ntre aceste dou zone ale activitilor metabolice nu este absolut clar, existnd numeroase controverse n privina utilizrii noiunii de metabolism secundar (Paterson i colab., 1990). n cazul speciilor de fungi, este recunoscut, totui, faptul c metabolismul primar se refer, n special, la procese de cretere i dezvoltare, cum sunt cele legate de utilizarea surselor de carbon i azot, biosinteza de ADN i aminoacizi,

106

n timp ce metabolismul secundar implic, n principal, sinteza unor compui cu greutate molecular mic, de tipul alcaloizilor, terpenelor sau policetozelor (Paterson i Bridge, 1994). Multe din cile metabolice implicate n aceste procese de biosintez sunt diferite, nefiind strns interconectate unele cu altele, i nu determin formarea unei anumite categorii de compui chimici, care s posede, n mod necesar, structuri moleculare comune. De altfel, aceti compui sunt clasificai dup criteriul determinant al cilor metabolice, prin intermediul crora sunt sintetizai (de exemplu: policetoze, izoprenoide, etc.). A contrario, metabolismul primar const ntr-o serie de reacii biochimice interconectate, implicnd att procese anabolice, ct i catabolice, care s furnizeze speciilor fungice macromolecule eseniale (ADN, proteine), produi sintetici intermediari i, nu n ultimul rnd, energie (Paterson i Bridge, 1994). n schimb, metabolismul secundar, este restrns n desfurarea sa, doar la specii de microorganisme i plante, fiind, totui, prezent la anumite grupuri taxonomice i chiar la unele specii, la care metabolismul primar este universal (unele excepii existnd la anumite microorganisme aerobe, an aerobe, fototrofe, organotrofe etc.). n general, metaboliii secundari sunt compui organici cu greutate molecular mic, dar care posed o diversitate enorm. n mod frecvent, un anumit metabolit secundar, este el nsui un precursor al unei serii de reacii, care determin formarea altor grupe de compui. S-a observat, adesea, faptul c, pe msur ce numrul de etape ale biosintezei unui metabolit secundar este mai mare, cu att numrul speciilor de microorganisme care l determin este mai mic. Un exemplu elocvent, n acest sens, este reprezentat de genul Aspergillus, care cuprinde numeroase specii ce sintetizeaz produi intermediari asociai n producerea aflatoxinei (versicolorin, sterigmatocistin etc.), ns numai specia A. flavus sintetizeaz aflatoxina (Paterson i Bridge, 1994).

107

Avnd n vedere faptul c micotoxinele nu pot fi recunoscute ca un grup distinct de structuri organice, s-a recurs la un sistem destinat clasificrii acestora prin prisma ciclurilor biosintetice, care sunt interconectate printr-un numr redus de produi intermediari: acetil-coenzima A, acidul mevalonic etc. Datorit unei varieti foarte mari a structurilor chimice, analiza micotoxinelor se poate realiza fie cantitativ, nespecific, pentru un grup mai mare de astfel de metabolii, cu structuri relativ asemntoare, fie calitativ, n mod specific, pentru un anumit tip de toxin. Metodele de analiz n bloc, a mai multor tipuri de micotoxine, pot fi efectuate ca o modalitate de preselecie (pre-screening) a prezenei micotoxinelor ntr-o anumit prob, n timp ce metodele specifice, cu sensibilitate mai mare, pot fi utilizate ca o continuare a investigaiilor realizate prin metodele anterioare, n cazul unor probe ale cror rezultate s-au dovedit a fi pozitive, n urma efecturii analizelor preliminare. n general, procedeele pentru realizarea unor asemenea analize sunt urmtoarele: prelevarea probei de analizat; extracia compusului organic care trebuie detectat; purificarea probei de analiz prin operaiuni de splare, separare etc.; analiza cromatografic; confirmarea rezultatului final. Micotoxinele, n mod normal, se gsesc n concentraii foarte sczute, de ordinul unitilor de tip ppb sau ppm, fiind rspndite n structura complex a diferitelor materiale organice, utilizate ca substraturi de cretere de ctre speciile saprobionte bioproductoare (Paterson i Bridge, 1994). Micotoxinele pot fi extrase sau co-extrase, dup caz, mpreun cu ali produi metabolici, prin solubilizare n diferii solveni organici polari. Utiliznd metode analitice, n special cromatografia n strat subire (Thin Layer Chromatography) i lichid cromatografia de nalt performan (High Performance Liquid Chromatography) aceste micotoxine sunt detectate cu mare precizie.

108

10.2. Caracterizarea chemotaxonomic a bacteriilor i fungilor filamentoi, prin extracie de ADN celular i evideniere electroforetic n gel de agaroz 10.2.1. Metoda extraciei de ADN bacterian O adevrat pletor de tehnici de lucru, destinate extraciei i purificrii ADN, s-a format, n ultima perioad de timp, din dorina nedisimulat de a utiliza un anumit protocol, care s fie pentru fiecare experiment efectuat, n mod concomitent, rapid, sigur i eficient, n scopul obinerii moleculelor de ADN ntr -o form extrem de pur. Cu toate acestea, ns, au aprut, n mod inevitabil, destule probleme legate de anumite aspecte, cum ar fi: inabilitatea de a destrma structura peretelui celular; degradarea ADN pe parcursul extraciei, ca rezultat al coextraciei de nucleaze sau coizolrii de proteine sau, chiar, polizaharide cu greutate molecular mare, care, la rndul lor, interfer cu reaciile ulterioare de extracie a ADN. Majoritatea metodelor utilizate pentru extracia moleculelor de ADN din celulele bacteriene respect trei principii, corespunztoare etapelor principale de desfurare a procesului de extracie propriu-zis: 1 - fragmentarea peretelui celular i eliberarea coninutului celular; 2 - prepararea extractului brut de ADN; 3 - purificarea extractului de ADN. 10.2.1.1. Fragmentarea peretelui celular i eliberarea coninutului celular

Majoritatea bacteriilor Gram-negative pot fi lizate prin tratare cu dodecil sulfat de sodiu (cunoscut i sub denumirea de lauril sulfat de sodiu) 2% (w/v), n timp ce bacteriile Gram-pozitive, necesit digestia enzimatic cu lizozim, proteinaza K i/sau N-acetilmuramidaza, nainte de tratamentul cu dodecil sulfat de sodiu.

109

Multe specii de bacterii Gram-pozitive par s fie rezistente la atacul enzimatic cu lizozim, de aceea utilizarea unei lipaze, n combinaie cu lizozimul, pare s fie un amestec mai eficient n efectuarea operaiunii de nlturare a peretelui celular. Tratamentele fizice, cum sunt: sonicarea, agitarea cu bile de sticl, congelarea prin imersare n azot lichid, pot, de asemenea, s faciliteze realizarea extraciei. n general, cele mai multe metode de extracie de ADN, n special, din biomasa fungic, sunt dependente de tratamente fizice adiacente. Aceast biomas poate fi liofilizat, apoi, mojarat sau congelat n azot lichid, n scopul fragmentrii peretelui celular (Jackman i colab., 1983; Saiki, 1990; Goodwin i Lee, 1993). Perfecionri ulterioare au fost aduse acestor tehnici, pentru a facilita recuperarea consecutiv a ADN, prin: adugarea de 2-mercaptoetanol, care este utilizat frecvent pentru inactivarea nucleazelor, n special, n procedurile de extracie de ADN fungic, dar i pentru tehnicile aplicate celulelor procariote; utilizarea proteinazei K pentru facilitarea digestieiproteinelor; ntrebuinarea bromurii de cetil-trimetil-amoniu (CTAB) pentru nlturarea substanelor impurificatoare de tipul polizaharidelor (cu specificaia c acest compus chimic nu poate fi utilizat n combinaie cu dodecilsulfatul de sodiu sau fenolul, deoarece aceste amestecuri vor forma substane complexe insolubile).

10.2.1.2. Prepararea extractului brut de ADN Prepararea extractului brut de ADN se realizeaz prin adugarea de fenol sau a unui amestec de fenol i cloroform, ntr-o suspensie coninnd biomas celular fragmentat. Tuburile ce conin un asemenea amestec sunt centrifugate rezultnd o separare bifazic.

110

Faza superioar, reprezentat de supernatant, conine acizii nucleici, n timp ce faza sedimentar conine fenol, existnd i o a treia faz intermediar, plasat ntre primele dou, aceasta fiind format dintr -un strat alb, semi-solid, coninnd, n principal, constitueni proteici denaturai. Supernatantul este colectat, iar acizii nucleici pot fi recuperai printr -o precipitare ulterioar, utiliznd etanol rcit cu ghea. n mod frecvent, acest proces de precipitare poate fi intensificat prin incubare, peste noapte, la temperatura de 20oC.

10.2.1.3. Purificarea extractului de ADN n aceast etap, acizii nucleici sunt redizolvai prin adugarea unei soluii tampon corespunztoare i agitarea uoar, apoi coninutul de ARN este nlturat prin adugarea unor soluii de RN-aze, preparate extemporaneu. n general, sunt utilizate dou tipuri de RN-aze: RN-aza A i RN-aza T1, care, prin combinarea lor simultan, vor elimina ntreaga cantitate de ARN din materialul celular extras (Jackson i Cook, 1986; Taylor i Natvig, 1987; Graves i Swaminathan, 1993). De regul, se adaug un amestec de alcool izoamilic i cloroform, soluia fiind omogenizat prin agitare, i apoi centrifugat. Faza apoas, situat n zona superioar a volumului soluiei, este separat de faza sedimentar, prin absorbie cu o micropipet, iar cantitatea de ADN este precipitat din nou, utiliznd etanol rcit cu ghea.

Protocolul experimental Protocolul de lucru cuprinde urmtoarele etape: 1 - prelevarea unei probe de analiz, n cantitate de 40 - 60 mg, dintr-o cultur bacterian, dezvoltat pe un mediu solid, i introducerea acesteia ntr -un tub Eppendorf de 1,5 ml;

111

2 - adugarea unui volum de 500 l de soluie tampon de Tris-HCl-NaClEDTA (TNE) i suspendarea celulelor n soluie, prin omogenizarea cu ajutorul unui agitator tip Vortex; 3 - centrifugarea la o vitez de 10.000 rpm, timp de 10 min.; 4 - eliminarea supernatantului i adugarea unui volum de 500 l de soluie tampon, urmat de resuspendarea celulelor, prin agitare cu ajutorul unui agitator tip Vortex; 5 - adugarea a 400 l de fenol i a 100 l de soluie de dodecilsulfat de sodiu 20%. Ambele soluii vor fi plasate sub ni, iar pipetarea se va efectua doar n acest spaiu; 6 - omogenizarea suspensiei celulare i incubarea acesteia la temperatura camerei, timp de 30 de min.; 7 - adugarea unui volum de 250 l de amestec de cloroform i alcool izoamilic i reomogenizarea suspensiei; 8 - centrifugarea suspensiei la o vitez de 10.000 rpm, 15 min.; 9 - separarea fazei lichide (supernatantul), prin extragere cu o pipet Pasteur, pe ct de mult posibil, evitnd tulburarea stratului sedimentar de debriuri celulare proteice i fenol; 10 - introducerea acestui supernatant ntr-un alt tub Eppendorf, steril, prin utilizarea unei micropipete, dotat cu sistem de msurare automat a volumului de lichid absorbit; 11 - adugarea a dou volume de alcool etilic, rcit cu ghea, i agitarea manual puternic; 12 - introducerea tuburilor n congelator, la 200C, timp de 1 - 2 h; 13 - centrifugarea coninutului tuburilor, la o vitez de 10.000 rpm, timp de 15 min.; 14 - nlturarea supernatantului i adugarea a 100 l dintr-o soluie de etanol 70 %, rcirea cu ghea, n amestec cu acetat de sodiu, i omogenizarea, timp de 1 min., cu ajutorul unui agitator tip Vortex;

112

15 - centrifugarea la o vitez de 10.000 rpm, pentru o perioad de timp de 1 - 2 min.; 16 - nlturarea supernatantului i scurgerea surplusului de lichid, prin nclinarea tuburilor i absorbia picturilor cu ajutorul unei hrtii de filtru; 17 - plasarea tuburilor ntr-un exsicator i uscarea probelor prin cuplarea la o tromp de vacuum, la temperatura camerei, timp de 2 - 3 ore; 18 - resuspendarea sedimentului n 100 l de soluie tampon Tris-HClEtanol i incubarea la 40C, pentru a se asigura completa dizolvare a acizilor nucleici; 19 - separarea a 10 l de prob i introducerea sa ntr-un tub Eppendorf de 1,5 ml, steril; 20 - adugarea a 5 l de colorant activ pentru electroforez. Aceste probe vor fi examinate, ulterior, prin efectuarea electroforezei n gel de agaroz (Paterson i Bridge, 1994). Prepararea gelului de agaroz Procedura de preparare a gelului de agaroz respect urmtoarele operaiuni: 1 - cntrirea a 1 g de agaroz i introducerea ntr-un balon Erlenmeyer; 2 - msurarea unui volum de 100 ml de soluie tampon de Trizma -Acetat de sodiu-EDTA (TAE) i adugarea, n acelai balon, agitnd puternic pentru a asigura omogenizarea agarozei; 3 - nclzirea soluiei de agaroz tamponat, ntr-un cuptor cu microunde, pn la dizolvarea complet a agarozei, apoi rcirea rapid a acesteia, timp de 30 de min., agitnd continuu pentru a evita formarea bulelor de aer, precum i a unei pelicule sub forma unei cruste, la suprafaa lichidului; 4 - turnarea gelului de agaroz n interiorul tancului de electroforez, evitndu-se formarea bulelor de aer;

113

5 - dup solidificarea agarozei se toarn un volum de soluie tampon (TAE), pn cnd gelul este acoperit cu un strat de soluie, de aproximativ 5 mm grosime; 6 - utiliznd o pipet steril se plaseaz submers, n godeurile practicate n structura gelului, amestecul format din gelul de analizat i colorantul de electroforez; 7 - probele sunt, apoi, supuse procesului de electroforez propriu -zis, prin conectarea aparatului la 75 V, timp de 2 - 3 h; 8 - dup migrarea colorantului, n proporie de 2/3 din traseul n ecesar de parcurs, se oprete electroforeza i se imerseaz gelul de agaroz, anterior colorat, ntr-o soluie de bromur de etidiu, timp de 20 de min., la temperatura camerei; 9 - vizualizarea extractului de ADN, prin plasarea gelului de electroforez ntr-un transiluminator i expunerea la o iluminare cu UV. Benzile de ADN vor apare colorate n roz, n timp ce gelul de agaroz va avea o culoare albastru deschis.

10.2.2. Metoda extraciei de ADN fungic n ultima perioad de timp se manifest un interes deosebit fa de modalitile de caracterizare a moleculelor de ADN, aparinnd unor specii de microorganisme, prin elaborarea i aplicarea unor metode standardizate din domeniul biologiei moleculare. n acest context, au fost publicate numeroase lucrri de specialitate privind utilizarea metodelor de extracie i purificare de ADN fungic, cu greutate molecular mare (Sambrook i colab., 1989; Paterson i Bridge, 1994). Una dintre aceste metode, care a f ost, de altfel, utilizat i n caracterizarea i identificarea speciilor de fungi celulozolitici, a fost aceea de extracie de ADN genomic total (Goodwin i Lee, 1993).

114

Aceast metod este, de fapt, o modificare a tehnicii descrise de Raeder i Broda (1984), permind obinerea unui ADN foarte pur, care poate fi utilizat, ulterior, pentru aplicarea tehnicilor de digestie cu enzime de restricie. Prin aplicarea acestei metode, proba de analizat, reprezentat de o cantitate de 50 mg miceliu liofilizat, mojarat n condiii aseptice, se va obine prin extracia unei cantiti de 75 - 100 g, parcurgndu-se un protocol de lucru avnd o durat de aproximativ 2 h.

Protocolul de lucru Principalele etape ale protocolului experimental de extracie a

macromoleculelor de ADN fungic sunt: 1 - mojararea miceliului, liofilizat n prealabil, i cntrirea a 50 mg pentru fiecare prob de analizat; 2 - plasarea acestor cantiti de miceliu, fin mojarat, n tuburi de centrifugare de 1,5 ml capacitate, i adugarea unu i volum de 500 l, dintr-o soluie tampon pentru extracie; 3 - omogenizarea ntregului amestec cu ajutorul unei micropipete i adugarea a 500 l dintr-o soluie saturat de fenol, cloroform i alcool izoamilic, iar, apoi, omogenizarea uoar, pentru prevenirea evaporrii rapide a cloroformului; 4 - centrifugarea la o vitez de 12.000 rpm, la 4oC, timp de o or; 5 - colectarea supernatantului, cu o micropipet, i transferul acestuia n alte tuburi de centrifugare, sterile; 6 - adugarea a 25 l dintr-o soluie de ribonucleaz A (70 U/mg); 7 - incubarea la 37oC, timp de 10 min.; 8 - adugarea unui volum echivalent de cloroform i o uoar omogenizare a noului amestec format; 9 - centrifugarea la o vitez de 12.000 rpm, timp de 10 min.; 10 - colectarea supernatantului cu o micropipet;

115

11 - precipitarea ADN din supernatant prin adugarea de izopropanol rece, n proporie de 54%; 12 - nlturarea noului supernatant, format consecutiv precipitrii, utiliznd pentru aceasta o pipet Pasteur; 13 - colectarea sedimentului, dup o scurt microcentrifugare, timp de 5 10 secunde, i ndeprtarea ntregii cantiti de supernatant; 14 - splarea sedimentului cu etanol 70%, uscarea i, apoi, redizolvarea acestuia n 20 - 100 l de soluie tampon de Tris-HCl-EDTA

Compoziia amestecurilor de reacie, utilizate pentru aplicarea protocolului de lucru Soluia tampon de extracie (extraction buffer): 200 mM Tris-HCl (pH 8,5); 250 mM NaCl 25 mM EDTA 0,1 % dodecil sulfat de sodiu Soluia tampon Tris-HCl-EDTA: 10 mM Tris-HCl (pH 8); 1 mM EDTA Soluia de ribonucleaz: Ribonucleaz A (70 U/mg), preparat n concentraie de 20 mg/ml, ntr -o soluie tampon de Tris-HCl-EDTA.

116

10.2.3. Metoda reaciei n lan a polimerazei (Polymerase Chain Reaction)

Principiul metodei Metoda reaciei n lan a polimerazei (Polymerase Chain Reaction), descris, pentru prima dat, n urm cu peste 10 ani (Saiki i colab., 1985; Mullis i Faloona, 1987) a devenit una dintre cele mai des ntrebuinate tehnici de amplificare selectiv a secvenelor nucleotidice de ADN sau ARN. n ultima perioad s-au dezvoltat numeroase variante ale tehnicii de baz privind reacia n lan a polimerazei, fiind aplicabile, n prezent, diferite variante perfecionate ale acestei metode de caracterizare i identificare chemotaxonomic a diferite specii de microorganisme (Saiki, 1990; Foster i colab., 1993; Atlas i Bej, 1994). Reacia n lan a polimerazei (Polimerase Chain Reaction - PCR) este o metod destinat producerii in vitro a unor cantiti mari de ADN, pornind de la anumite secvene de nucleotide, care sunt utilizate ca int n procesul de amplificare genic (Paterson i Bridge, 1994). Acest proces este analog replicrii naturale a moleculei de ADN, ntocmai cum acest proces se petrece, n mod obinuit, n celulele vii. Cele dou lanuri ale unei molecule de ADN, de tip parental, sunt separate n cte un singur lan, care se activeaz, apoi, sub forma unor tipare, destinate resintezei unor noi lanuri de tip pereche. Lanurile duble sunt sintetizate urmrind regulile de baz privind replicarea ADN. n acest mod, se formeaz dou copii identice ale dublului helix de ADN, pornind de la un singur lan, acest proces semiconservativ producndu -se ntotdeauna n direcia 5 => 3(Fig. 6).

117

A T 5

T A

G C

C G

A T

C G

A T

G C

T A

T A 3

separarea 3

catenelor 5

A T 5

T A

G C

creterea lanului de ADN 3 - OH 3 - OH creterea lanului de ADN 5

G T 5 A C G T G T C

T A

T A 3

Fig. 6 - Sinteza de ADN prin aciunea ADN-polimerazei: creterea lanului de ADN n direcia 5 => 3 (dup Paterson i Bridge, 1994)

118

n natur, replicarea moleculei de ADN se bazeaz pe activitatea unui numr mare de diferite enzime i alte tipuri de compui organici, incluznd ADN polimeraza, deoxiribonucleotidele (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) i ARN-iniiator (RNA-primer). Prezena acestui primer este absolut necesar, deoarece ADN-polimeraza nu poate efectua sinteza de novo, ci are doar capacitatea de a aduga nucleotide la o anumit secven, eliberat de gruprile hidroxil ale celui de -al treilea atom de carbon al deoxiribozei sau ribozei. Primer-ul se recombin cu modelul de ADN parental, dup o prealabil separare a catenelor nucleotidice, prin tratament termic, furniznd o grupare 3 OH i permind, n felul acesta, efectuarea polimerizrii (Paterson i Bridge, 1994). Amplificarea ADN in vitro, prin metode de analiz tip PCR, se bazeaz pe principii asemntoare celor care se aplic replicrii ADN. Moleculele de ADN int, ADN-polimeraz, deoxiribonucleotide i ADNprimer sunt adugate ntr-o soluie tampon cu o compoziie specific. n acelai timp, moleculele de ADN primer sunt constituite din secvene scurte ale unei singure catene de ADN, avnd, n mod obinuit, o lungime de 10 - 20 baze azotate. Pentru nceput, dubla caten de ADN int este desfcut pentru producerea aa-numitelor tipare (matrie) de ADN (DNA-template), formate din catene simple, iar aceast operaiune se realizeaz, de regul, prin nclzire la o anumit temperatur. Apoi, moleculele de ADN-primer se recombin cu aceste catene simple, n acest mod, resintetizndu-se catenele pereche, n direcia 5 => 3. n esen, amplificarea enzimatic a moleculelor de ADN se produce la nivelul unui fragment de ADN, care este flancat de dou molecule de ADN primer, acestea recombinndu-se mpreun cu acele catene opuse secvenei de ADN int (Fig. 7).

119

1. ADN int

5. Repetarea ciclurilor

2. Denaturare termic

4. Extinderea catenelor de ADN

3. Iniierea sintezei ADN cu DNA primers

Fig. 7 - Diagrama desfurrii reaciei n lan a polimerazei (dup Paterson i Bridge, 1994). ADN-primer sunt orientate cu capetele 3 unele n faa

Moleculele de

celorlalte. Ciclurile repetate de denaturare termic a moleculelor de ADN int (pentru separarea dublelor catene nucleotidice), prin recombinarea moleculelor de ADN-primer cu secvenele lor complementare, precum i extinderea acestor molecule recombinate, prin aciunea ADN-polimerazei, determin amplificarea segmentului nucleotidic definit de capetele 5 ale iniiatorilor reaciei lanulu i polimerazic (PCR primer). Primele copii ale moleculelor de ADN-primer, care posed lanuri scurte de ADN, apar n cel de-al doilea ciclu de denaturare, determinnd dublarea numrului lor cu fiecare ciclu care urmeaz, n acest fel, devenind, n scurt ti mp, forma predominant a produsului rezultat din acest proces de amplificare genic

120

(de exemplu: 10 copii ale fiecrei catene int ar putea fi realizate n aproximativ 20 de cicluri). Prin utilizarea unor tipuri de polimeraze termostabile, cum sunt cele de tip Taq sau Tth, se poate renuna la adugarea de polimeraz proaspt, dup fiecare etap de denaturare termic. n mod inevitabil, cheia succesului n efectuarea corect a unei analize de tip PCR este utilizarea unor molecule de ADN-primer, corespunztoare secvenei de ADN int (target DNA). Este demn de reinut faptul c metoda reaciei n lan a polimerazei este extrem de sensibil, astfel nct, procesul de amplificare genomic poate fi iniiat pornind, chiar, de la o singur molecul de AND, utilizat ca model pentru replicare. Aceast sensibilitate crescut determin asigurarea unor condiii speciale de asepsie, dat fiind posibilitatea contaminrii materialului de analizat (Innis i Gelfand, 1990; Saiki, 1990; Paterson i Bridge, 1994).

Protocolul experimental Pentru efectuarea acestui protocol se utilizeaz urmtorii reageni: dou tuburi tip Eppendorf, coninnd probe de ADN (ADN 1, ADN2, ADN3); dou tuburi tip Eppendorf coninnd iniiatori ai reaciei lanului de polimeraz (PCR primers), notai cu iniialele ITS1 i ITS4; un tub tip Eppendorf cu soluie master mix, coninnd: ADN polimeraz (DNA polymerase), ADN tipar (DNA template) i enzim tampon (enzyme buffer); un tub Eppendorf, coninnd ap de puritate tip PCR, notat prin abrevierea H2O; un flacon cu ulei mineral steril. Etapele principale ale protocolului experimental constau n urmtoarele operaiuni: 1 - utiliznd o pipet automat tip P - 200 cu vrf special, de tip ART, se pipeteaz 39 l de soluie amestec de baz (master mix), coninnd ADN

121

polimeraz (DNA polymerase), ADN tipar (DNA template) i soluie de enzim tampon (enzyme buffer solution), n fiecare dintre cele 5 tuburi sterile, de tip Eppendorf, pregtite special i numerotate cu litere majuscule de la A la E; 2 - prin intermediul aceluiai tip de pipet automat, dar utiliznd alte vrfuri, se adaug cte 5 l de soluie de ITS1 primer, n fiecare dintre primele 4 tupuri Eppendorf, exceptnd ultimul tub, notat cu litera E; Nota Bene: pentru fiecare pipetare se utilizeaz un alt vrf, pentru a se evita riscul unei contaminri nedorite; 3 - n acelai mod, se adaug n fiecare din aceste 4 tuburi, cte 5 l de soluie de iniiator tip ITS4 (primer ITS4), utiliznd vrfuri noi, sterile, pentru fiecare dintre pipetrile efectuate; 4 - se adug un volum de 10 l de ap de puritate tip PCR, pentru tubul notat cu litera E; acest tub este utilizat ca prob martor, fr s conin iniiatori de tip ITS; 5 - n continuare, se adaug 1 l de ADN1 n tubul notat cu litera A, apoi 1 l de ADN2 n tubul B, utiliznd de fiecare dat vrfuri noi, pentru fiecare operaiune de pipetare; 6 - n tubul notat cu litera C se adaug 1 l de ap de puritate tip PCR; acest tub reprezint proba martor care nu conine ADN; 7 - nchiznd ermetic tuburile Eppendorf, se agit rapid, timp de 5 sec., cu ajutorul unui dispozitiv tip Vortex; 8 - n continuare, aceste tuburi se supun operaiei de centrifugare, prin plasarea acestora ntr-o microcentrifug a crei turaie se fixeaz la 8.000 rpm; 9 - dup centrifugare, se adaug n fiecare dintre tuburi, cte dou picturi de ulei mineral steril i, din nou, se nchid ermetic; 10 - se plaseaz cele 5 tuburi n incinta unui aparat de analiz tip PCR (PCR machine), dup care se deruleaz programul de analiz, timp de mai multe ore, dup urmtoarea succesiune: 950

- etapa nr. 1 -

3 min.

denaturare

122

- etapa nr. 2 - etapa nr. 3 -

950 500

1 min. 30 sec.

denaturare recombinare catene de ADN, dup separare la temperatur ridicat;

- etapa nr. 4 - etapa nr. 5 -

720

2 min. alungire se pornete de la etapa nr. 2 i se efectueaz 30 cicluri

- etapa nr. 6 - etapa nr. 7 -

720 50

10 min. pn cnd produsele de tip PCR

sunt gata de electroforez Pentru efectuarea electroforezei n gel de agaroz, n scopul vizualizrii produselor de tip PCR, formate prin amplificarea regiunilor de tip ITS, se execut urmtoarele operaiuni: 1 - se msoar 100 ml din soluia tampon tip TAE (coninnd 4,84 g baz Trizma, 2,72 g Na- CH2-COOH x 3 H2O i 0,38 g EDTA, indicele pH al ntregului amestec fiind ajustat la valoarea de 7,2, prin adugarea de acid acetic glacial, i aducerea ntregii soluii la un volum total de 1000 ml, prin adugarea de ap bidistilat) i se toarn ntr-un vas Erlenmeyer de 250 ml; 2 - se cntrete o cantitate de 1,5 g de agaroz i se adaug n vasul Erlenmeyer, agitndu-se uor ntreaga compoziie a amestecului; 3 - soluia obinut se nclzete doar 1 min., ntr-un cuptor cu microunde; 4 - dup topirea agarozei i rcirea acesteia, pn cnd se atinge o temperatur de aproximativ 60oC, se toarn uor n tancul de electroforez avnd grij s nu se formeze goluri de aer, obinndu-se prin solidificarea gelului o suprafa perfect neted; 5 - se pregtesc 6 tuburi sterile, tip Eppendorf, primele 5 fiind numerotate de la 1-5, iar ultima se marcheaz cu litera M; aceste tuburi vor conine 5 probe de produse tip PCR i un marker de mrime pentru molecula de ADN;

123

6 - utiliznd o pipet automat se pipeteaz n fiecare dintre tuburi, cte 5 l de colorant pentru gel (coninnd EDTA 100mM, sucroz 40% i albastru de bromfenol 0,05%); 7 - se preleveaz 5 l din produsul tip PCR, coninut n tubul A, evitnd contaminarea acestei probe cu urme de ulei mineral i se introduce n tubul 1, care conine colorant, adugat n prealabil, n etapa anterioar, agitndu -se pentru omogenizarea amestecului astfel format; 8 - se repet aceast operaiune pentru fiecare dintre tuburile notate cu literele B, C, D, E, introducnd cte 5 l de produse tip PCR, n tuburile 2, 3, 4, i, respectiv, 5, utiliznd mereu alt vrf de pipet; 9 - apoi, se adaug n tubul M un volum de 10 l din soluia coninnd un marker de mrime pentru ADN; 10 - se prepar 250 ml de soluie tampon tip TAE i se adaug peste suprafaa gelului de agaroz ntr-un strat cu o grosime de 4 - 5 mm; 11 - utiliznd vrfuri noi pentru fiecare dintre probe se pipeteaz cu atenie n godeurile de electroforez, cte 10 l de amestec colorant per prob de analiz PCR, din fiecare dintre tuburi, avnd grij s se evite contaminarea ncruciat ntre dou godeuri adiacente; 12 - se adaug ADN marker n tubul M, ntr-un mod identic cu cel prezentat anterior; 13 - se ncepe electroforeza propriu-zis, prin conectarea aparatului la o tensiune de 75 V i o intensitate a curentului electric de 500 mA, timp de 1 - 2 h; 14 - la finalul acestei operaiuni, se scoate gelul din tancul de electroforez i se plaseaz ntr-o baie de colorare, coninnd bromur de etidiu, pentru o perioad de 20 - 30 min.; 15 - pentru vizualizarea benzilor de electroforez, gelul colorat se plaseaz ntr-un transiluminator cu UV; benzile formate sunt scanate, fotografiate, i nregistrate pe caset video.

124

Aadar, cele mai performante metode de analiz i caracterizare a microorganismelor i, n consecin, a proceselor metabolice pe care acestea le produc, se bazeaz pe modalitile precise i eficiente de identificare a moleculelor de ADN, aparinnd unor specii de microorganisme, p rin elaborarea i aplicarea de protocoale standardizate din domeniul biologiei moleculare. n acest context, metoda analizei compoziiei n acizi grai a celulelor microorganismelor a fost intens exploatat pentru a facilita caracterizarea lor molecular, ct mai precis posibil, n scopul identificrii chemotaxonomice a speciilor crora le aparin. Totodat, o alt metod performant de investigare microbiologic a unor probe de analiz este cea de determinare a metaboliilor secundari, care sunt compui organici cu greutate molecular mic, dar care posed o diversitate structural enorm. n mod evident, una dintre metodele moderne frecvent utilizate n caracterizarea i identificarea speciilor de bacterii i fungi, este aceea a extraciei de ADN genomic total. n acelai timp, metoda cea mai des ntrebuinat n procesul de identificare chemotaxonomic a microorganismelor este, evident, ce a a reaciei n lan a polimerazei (Polymerase Chain Reaction - PCR), destinat producerii in vitro a unor cantiti semnificative de ADN, pornind de la anumite secvene de nucleotide, care sunt utilizate ca int n procesul de amplificare genic.

125

BIBLIOGRAFIE SELECTIV

Atlas, R.M. and Bej, A.K. 1994. Polymerase chain reaction. In: Gerhardt, P., Murray, R.G.E., Wood, W.A. and Krieg, N.R. (Eds), Methods for general and molecular bacteriology. American Society for General Microbiology, Washington D.C., pp. 418 -435. Beguin, P. 1990. Molecular biology of cellulose degradation. Ann. Rev. Microbiol, 44:219 - 248. Esnard, J., Potter, T.L. and Zuckerman, B.M. 1994. Differentiation of six strains of Bacillus thuringiensis by hydrolyzable fatty acid composition. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 42:1251 - 1255. Fan, L.T., Gharpuray, M.M. and Lee, Y. 1987. Cellulose Hydrolysis. SpringerVerlag, New-York, pp. 40 - 90. Foster, L.M., Kozak, K.R., Loftus, M.G., Stevens, J.J. and Ross, I. 1993. The polymerase chain reaction and its application to filamentous fungi. Mycological Research, 97:769 - 781. Gabriel, O. and Gersten, D.M. 1992. Staining for enzymatic activity after gel electrophoresis. Analitical Biochemistry, 203:1 - 21. Geesey, G.G. and White, D.C. 1990. Determination of bacterial growth and activity at solid-liquid interfaces. Ann. Rev. Microbiol., 44:579 - 602. Goodwin, D.C. and Lee, S.B. 1993. Microwave minipreparate of total genomic DNA from fungi, plants, protists and animals for PCR. BioTechniques, 15:438 - 444 Graves, L.M. and Swaminathan, B. 1993. Universal bacterial DNA isolation procedure. In: Persing, D.H., Smith, T.F., Tenover, F.C. and White, T.J. (Eds), Diagnostic Molecular Microbiology: principles and applications. American Society for Microbiology, Washington, D.C., pp. 617 - 621.

126

Haak, S.K., Garchow, H., Odelson, D.A., Forney, L.J. and Klug, M.J. 1994. Accuracy, reproducibility and interpretation of fatty acid methyl ester profiles of model bacterial communities. Appl. Environ. Microbiol 60:2483 2493 Hames, B.D. 1990. Gel-electrophoresis of proteins - a practical approach, IRL Press, Oxford, pp. 45 - 78. Hawksworth, D.L., Kirk, P.M., Sutton, and Pegler, D.N. 1995. Ainsworth & Bisby's Dictionary of the Fungi. 8th ed., Wallingford, pp. 56 - 59, 211 - 214, 575 579 Holme, D.J. and Hazel, P. 1994. Protein analysis. In: Analitical Biochemistry, 2 nd ed. Longman Scientific & Technical, Essex, pp. 37 - 78 Holt, J.G. 1994. The Aerobic Endospore-forming Rods and Cocci. In: Holt, J.G. (ed.), Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. Williams & Wilkins, Maryland, USA, pp. 670 - 675. Innis, M.A. and Gelfand, D.H. 1990. Optimization of PCRs. In: Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J. and White, T.J. (Eds), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Academic Press, London, pp. 3 - 12. Jackman, P.J.H., Feltham, R.K.A. and Sneath, P.H.A. 1983. A program in BASIC for numerical taxonomy of microorganisms based on electrophoretic protein patterns. Microbios Letters, 23:87 - 98. Jackson, D.A. and Cook, P.R. 1986. A cell-cycle-dependent DNA polymerase activity that replicates intact DNA in chromatin. J. Mol. Biol, 192:65 - 76 Kieft, T.L., Ringelberg, D.B. and White, D.C. 1994. Changes in ester-linked phospholipid fatty acid profiles of subsurface bacteria during starvation and desiccation in a porous medium. Appl. Environ. Microbiol., 60:32923299 Komagata, K. and Suzuki, K. 1987. Lipid and cell-wall analysis in bacterial systematics. Methods in Microbiology, 19:161 - 207.

127

Kubicek, C.P., Messner, R., Guber, F. and Mach, R.L. 1993. The Trichoderma cellulase regulatory puzzle: From the interior life of a secretory fungus. Enzyme Microbiol. Technol., 15:90 - 98. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Fan, A.L. and Randall, R.J. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent, J. Biol. Chem, 193:265 - 273 Micales, J.A., Bonde, M.R. and Peterson, G.L. 1987. The use of isozyme analysis in fungal taxonomy and genetics. Mycotaxon, 27:405 -449. Mullis, K. and Faloona, F.A. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro, via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology, 155:335350 Nakanishi, K., Matsuno, R., Torii, K., Yamamoto, K. and Kamikubo, T. 1983. Properties of immobilized -D-galactosidase from Bacillus circulans. Enzyme Microbiol. Technol., 5:115 - 120. Nevalainen, H. and Penttila, M. 1995. Molecular biology of cellulolytic fungi. In: Kuck, H. (ed.), The Mycota. Genetics and Biotechnology, vol. 2, SpringerVerlag, Berlin-Heidelberg, pp. 303 - 319. Paterson, R.R.M. and Bridge, P.D. 1994. Molecular Biology Methods. In: Biochemical Techniques for Filamentous Fungi, IMI Technical Handbooks, Wallingford, pp. 35 - 55. Petre, M., Teodorescu, A., 2010. Biotehnologia proteci ei mediului. Vol. I, Ediia a 2-a revizuit i adugit, Editura CD Press, Bucureti (ISBN: 978-606528-040-3; 978-606-528-041-0) Petre, M., Teodorescu, A., 2009. Biotehnologia proteciei mediului Vol. II, Ediia a 2-a revizuit i adugit, Editura CD Press, Bucureti (ISBN: 978 -606528-040-3; 978-606-528-042-7) Petre, M., Teodorescu, R.I, 2010. Dicionar de biotehnologie. Editura CD Press, Bucureti (ISBN: 978-606-528-083-0) Petre, M., 2004. Biologie celular. Editura Printech, Bucureti (ISBN: 973-652911-8)

128

Petre, M., 2003. Ecotoxicologie. Editura Didactic i Pedagogic, Bucureti (ISBN: 973-30-2788-X) Petre, M., 2002. Ecologie sanitar. Editura Didactic i Pedagogic, Bucureti (ISBN: 973-30-2283-7) Petre, M., 2002. Biotehnologii pentru degradarea i conversia microbian a constituenilor vegetali. Editura Didactic i Pedagogic, Bucureti (ISBN: 973-30-2295-0) Popescu, O.V. 1990. Electroforeza proteinelor n geluri de poliacrilamid, Ed. Tehnic, Bucureti, pp. 17 - 255. Raeder, U. and Broda, P. 1985. Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Letters in Applied Microbiology, 1:17 - 20. Saiki, R.K. 1990. Amplification of genomic DNA. In: Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J. and White, T.J. (Eds), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, London, pp. 12 - 20. Suzuki, K.I. and Komagata, K. 1983. Taxonomic significance of cellular fatty acid composition in some coryneform bacteria. Int. J. Syst. Bacteriol., 42:281 295. Taylor, J.W. and Natvig, D.O. 1987. Isolation of fungal DNA. In: Fuller, M.S. and Jaworski, A. (Eds), Zoosporic Fungi in Teaching and Research. Southeastern Publishing Corporation, Athens, pp. 252 - 258. Vournakis, J.N. and Runstadler, P.W. 1989. Microenvironment: the key to improve cell culture products. Biotechnology, 7:143- 145. Wainwright, M. 1992. An Introduction to Fungal Biotechnology. Wiley-Chichester, pp. 55 - 60 Walker, J.M., 1984. Methods in molecular biology, vol. 1 Proteins, Humana Press Inc., Clifton, USA, pp. 57 - 63 Yamazaki, M. and Komagata, K. 1981. Taxonomic significance of electroforetic comparison of enzymes in the genera Rhodotorula and Rhodosporidium. Int. J. System. Bact., 31:361 - 381.

129

Zarnea, G. 1983. Anatomie bacterian. n: Tratat de microbiologie, Ed. Academiei Romne, Bucureti, vol. 1, pp. 290 - 295. Zarnea, G. 1984. Fiziologia microorganismelor. n: Tratat de microbiologie, Ed. Academiei Romne, Bucureti, vol. 2, pp. 28 - 65. Zelles, L. and Bai, Q.Y. 1994. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in environmental samples.Chemosphere, 28:391-411 Zelles, L., Bai, Q.Y., Rackwitz, R., Chadwick, D. and Beese, F. 1995. Determination of phospholipid- and lipopolysaccharide-derived fatty acids as an estimate of microbial biomass and community structure in soils. Biology and Fertility of Soils, 19:115 - 123.

130