NORMA TCNICA COLOMBIANA

NTC 4433
2006-04-26

MICROBIOLOGA. MTODO PARA EVALUAR COMERCIAL EN ALIMENTOS

LA

ESTERILIDAD

E:

MICROBIOLOGY. METHOD FOR DETERMINATION OF STERILITY COMMERCIAL IN FOODS

CORRESPONDENCIA:

DESCRIPTORES:

microbiologa de alimentos - preparacin de muestras; anlisis microbiolgico preparacin de muestras; esterilidad

I.C.S.: 07.100.30
Editada por el Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin (ICONTEC) Apartado 14237 Bogot, D.C. Tel. 6078888 Fax 2221435

Prohibida su reproduccin

Primera actualizacin Editada 2004-05-09

PRLOGO

El Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin, ICONTEC, es el organismo nacional de normalizacin, segn el Decreto 2269 de 1993. ICONTEC es una entidad de carcter privado, sin nimo de lucro, cuya Misin es fundamental para brindar soporte y desarrollo al productor y proteccin al consumidor. Colabora con el sector gubernamental y apoya al sector privado del pas, para lograr ventajas competitivas en los mercados interno y externo. La representacin de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalizacin Tcnica est garantizada por los Comits Tcnicos y el perodo de Consulta Pblica, este ltimo caracterizado por la participacin del pblico en general. La NTC 4433 (Primera actualizacin) fue ratificada por el Consejo Directivo de 2006-04-26. Esta norma est sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en todo momento a las necesidades y exigencias actuales. A continuacin se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a travs de su participacin en el Comit Tcnico 25 de Microbiologa. ALGARRA S.A. ALPINAPRODUCTOS ALIMENTICIOS S.A. ASINAL LTDA. BIANLISIS LTDA. BIOCONTROL LTDA. BIOQUILAB LTDA. CARULLA VIVERO S.A. CERCAL LTDA. COLFRIGOS S.A. COMPAA NACIONAL DE CHOCOLATES S.A. CREPES & WAFLES S.A. ENZIPN DE COLOMBIA LTDA. FBRICA DE ESPECIAS Y CONDIMENTOS EL REY S.A. GLORIA PREZ IVONNE BERNIER LAORATORIO LTDA. LABFARVE LABORATORIO DE FARMACOLOGA VEGETAL LABORATORIO LABCONTROL E.U. LABORATORIOS GRAM LARKIN LTDA. LESNIAK E.U. MERCADEO DE ALIMENTOS DE COLOMBIA S.A. MERCK S.A. MICROBILOGOS ASOCIADOS LTDA. NULAB LTDA. QUIK LTDA. QUMICOS Y REACTIVOS LTDA. QUIMIREL SUIZO S.A. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

Adems de las anteriores, en Consulta Pblica el Proyecto se puso a consideracin de las siguientes empresas: 3M COLOMBIA S.A. ACEITES Y GRASAS VEGETALES S.A. AQUALAB LTDA. ASOCIACIN COLOMBIANA DE MICROBIOLOGA AVESCO S.A. BAVARIA S.A. BIOMERIUX S.A. BIOTRENDS LABORATORIOS LTDA. CASA LUKER S.A. CENICAA CENTROAGUAS S.A. CERVECERA LEONA S.A. CONGELAGRO CONSULTORAS MICROBIOLGICAS

EMPRESA DE ACUEDUCTO Y ALCANTARILLADO DE BOGOT E.S.P. FRIGORFICO SUIZO S.A. FRIGORFICOS COLOMBIANOS S.A. FRIGORFICOS GUADALUPE S.A. GAEOSAS COLOMBIANAS S.A. INGENIO PICHICIHI S.A. INGENIO RIOPAILA S.A. INSTITUTO COLOMBIANO AGROPECUARIO ICA INSTITUTO NACIONAL DE SALUD INS INSTITUTO NACIONAL DE VIGILANCIA DE MEDICAMENTOS Y ALIMENTOS INVIMA LABORATORIO MICROBIOLGICO SIS LEVAPAN S.A. LLOREDA GRASAS S.A. MINISTERIO DE PROTECCIN SOCIAL NESTL DE COLOMBIA S.A. PASIFLORA COLOMBIANA S.A.

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA PRODUCTORA DE CONCENTRADOS Y JUGOS DE FRUTA S.A. PURIFICACIN Y ANLISIS DE FLUIDOS QUALA S.A. QUIOS LTDA. REPRESENTACIONES BIOTECNOLGICAS LTDA. RICA RONDO, INDUSTRIA NACIONAL DE ALIMENTOS S.A. SECRETARA DE SALUD DE BOGOT TECNIMICRO LABORATORIO DE ANLISIS UNIDAD ADMINISTRATIVA DE SALUD PBLICA UNIVERSIDAD CATLICA DE COLOMBIA VIQUINGOS S.A.

ICONTEC cuenta con un Centro de Informacin que pone a disposicin de los interesados normas internacionales, regionales y nacionales y otros documentos relacionados. DIRECCIN DE NORMALIZACIN

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MICROBIOLOGA. MTODO PARA EVALUAR LA ESTERILIDAD COMERCIAL EN ALIMENTOS

1.

OBJETO

Esta norma establece el procedimiento para determinar si los alimentos envasados en envases o bolsas, hermticamente cerrados, cumplen con los requisitos de esterilizacin comercial a los que se sometieron y se aplica a todos aquellos alimentos catalogados como comercialmente estriles, cuando se desee comprobar esta condicin o cuando los datos del proceso no estn disponibles o no sean satisfactorios. 2. DEFINICIONES

2.1 esterilidad comercial de un alimento tratado trmicamente es el estado que se consigue aplicando calor suficiente, slo o en combinacin con otros tratamientos apropiados, con el objeto de liberar a ese alimento de microorganismos patgenos y de otros microorganismos capaces de reproducirse en l en unas condiciones normales no refrigeradas en las que se mantendr probablemente el alimento durante su distribucin y almacenamiento. 2.2 envase o bolsa hermticamente cerrada aqul que est diseado y se entiende como seguro contra la entrada de microorganismos y mantiene la esterilidad comercial de su contenido despus de su procesamiento. 2.3 envase o bolsa hinchada o abombada envase que presenta deformacin convexa. 3. REA DE ENSAYO

Debe disponerse de un rea asptica para realizar el ensayo.

NOTA Se recomienda consultar la NTC 4092 Microbiologa de alimentos y de alimentos para animales. Reglas generales para el anlisis microbiolgico (ISO 7218).

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4. EQUIPOS Y MATERIALES 5. 5.1 Pipeteador

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Microscopio con objetivo de inmersin Potencimetro Envases para muestras Abrelatas o punzn de acero inoxidable estriles Pipetas Incubadora Tubos de cultivo Lminas portaobjetos

DESINFECTANTES, MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS DESINFECTANTES

5.1.1 Agua clorada con 100 mg/kg - 300 g/kg de cloro libre, recientemente preparada, tamponada a un pH de 6,8. 5.1.2 Solucin de yodo y alcohol (por ejemplo, 2,5 % m/v de yodo en etanol). 5.1.3 Solucin de cido peractico al 2 % en un humectante apropiado (por ejemplo, 0,1 % de polisorbitn 80). 5.1.4 Cualquier otra solucin recomendada para este uso. 5.2 MEDIOS DE CULTIVO

5.2.1 Caldo BHI con almidn 0,1 % u otro de composicin similar, de acuerdo con las instrucciones dadas por el fabricante. 5.2.2 Cualquier otro medio recomendado para este uso. 5.3 REACTIVOS

5.3.1 Coloracin Gram. 5.3.2 Azul de metileno (azul de metileno polcromo al 0,05 % m/m). 5.3.3 Almidn al 0,1 % m/m.

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6. MUESTREO

NTC 4433 (Primera actualizacin)

Se deben tomar de un mismo lote cuatro muestras para inspeccin del mismo lote, evaluacin de los envases e incubacin.

7.

INSPECCIN, EVALUACIN DE LOS ENVASES E INCUBACIN

Inicialmente se debe realizar una inspeccin previa de los envases correspondientes de la muestra que se desea evaluar antes de proceder con la prueba de esterilidad comercial. En el Anexo A (Normativo) se indica el diagrama de flujo para el procedimiento general de las etapas para evaluar la esterilidad comercial. 7.1 INSPECCIN EXTERNA Y EVALUACIN DE LOS ENVASES

7.1.1 Se debe examinar visualmente cada envase de la muestra; si posee rtulos removibles, estos deben retirarse. Se anotan cuidadosa y exactamente todas las marcas de identificacin y manchas o seales de corrosin que se observen en los envases. En el caso de rtulos removibles, despus de despegarlo e inspeccionarlo, debe identificarse con la misma referencia del envase y conservarse. 7.1.2 El examen visual debe realizarse con buena iluminacin, de ser posible con lentes de aumento. En el caso de los envases de metal se deben revisar las costuras para detectar defectos como aristas, abolladuras (en el cierre o cerca de ste), depresiones del borde, picos, pliegues, pestaas salientes y defectos de solapado. 7.1.3 Llenado excesivo Se sospecha de un llenado excesivo de un envase, cuando el peso neto excede del nivel de tolerancia razonable del peso neto declarado o previsto, o del peso neto medio determinado mediante el examen de un nmero considerable de envases de aspecto normal. 7.1.4 Llenado insuficiente Latas abolladas o envases con manchas o residuos de producto en la superficie o en el rtulo del envase, pueden indicar fugas de lquido o descalibracin del equipo de llenado. 7.2 INCUBACIN

Los envases hinchados o perforados no deben someterse a incubacin. Se toman dos envases, se envuelven en papel absorbente y uno de ellos se incuba a una temperatura de 35 C 2 C y el otro se incuba a una temperatura de 55 C 2 C durante 10 d. Se examinan los envases diariamente para observar si el papel absorbente est manchado de producto, lo cual indicara fugas y para observar si se forma gas antes de terminar el periodo de incubacin, lo cual se detecta por abombamiento del envase o de la tapa. En cualquiera de los dos casos anteriores, se procede inmediatamente a abrir y a examinar el contenido de los envases.

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8. 8.1

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LIMPIEZA, DESINFECCIN Y APERTURA DEL ENVASE ENVASES

Cuando se trata de envases (latas, laminados, envases flexibles, planos, etc.) que contienen componentes lquidos o semilquidos, se puede utilizar un punzn de acero inoxidable estril para perforar el envase y se toman muestras del contenido utilizando una pipeta estril o un aparato equivalente. Para abrir latas que contengan productos slidos se debe utilizar un abrelatas estril, cortando aspticamente en torno al cuerpo de la lata. Para materiales laminados, despus de desinfectarlos y secarlos se cortan aspticamente. Se debe describir y registrar cualquier olor extrao proveniente del contenido, que se pueda percibir inmediatamente despus de abrir el envase. Debe evitarse olfatear directamente el contenido. Se descontamina el envase. Para asegurar un mezclado de los posibles organismos contaminantes se aconseja agitar el envase inmediatamente antes de abrirlo. Se debe inspeccionar el envase despus de la incubacin, de acuerdo con lo indicado en el literal A.11 del Anexo A (Normativo). Se debe trabajar en una cmara de siembras para trabajar las muestras a analizar. 9. ANLISIS MICROBIOLGICO

Se efectuar de acuerdo con lo indicado en el Anexo B (Normativo). Para realizar el anlisis microbiolgico, se debe realizar un control ambiental de la calidad del rea de siembra, utilizando placas de agar glucosa almidn. Estas cajas deben dejarse expuestas durante un periodo de 30 min. El contenido restante del envase que no se analiza microbiolgicamente se debe esterilizar y vaciar en un envase de desechos apropiado. 9.1 CONTRAMUESTRA

Se debe tomar como contramuestra, mnimo dos envases del mismo lote. 9.2 MUESTRA ANALTICA E INOCULACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

9.2.1 Productos lquidos Se toman muestras utilizando pipetas apropiadas, taponadas, estriles con extremos de dimetro ancho.
NOTA Siempre debe tomarse la muestra con el pipeteador o pipetas de precisin.

Se recomienda inocular cada tubo de medio lquido con al menos 1 ml 2 ml de la muestra tomada del contenido del envase. 9.2.2 Productos slidos y semislidos Deben tomarse muestras de 1 g a 2 g tanto del ncleo como de la superficie. 4

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Para una muestra del ncleo se debe utilizar un dispositivo estril apropiado que tenga un dimetro y longitud suficientes. Para una muestra de la superficie se raspa con un aplicador estril o pinzas estriles y se toman porciones para inocular los tubos. 9.2.3 Anlisis microscpico directo Se puede realizar con coloracin Gram, o teido con azul de metileno. 9.3 INTERPRETACIN DE RESULTADOS

Si ninguno de los 8 tubos aerobios da positivo y ninguno de los 8 tubos anaerobios muestra crecimiento, se reportar en el informe: Prueba de esterilidad comercial satisfactoria. Si no se cumple la condicin anterior se reportar: Prueba de esterilidad comercial no satisfactoria Si hay produccin de gas en cualquiera de los tubos a 35 C, se debe sospechar que la contaminacin es ambiental, por lo cual el microorganismo que ha crecido debe ser inoculado en otra lata e incubada 14 d a 35 C. La ausencia de abombamiento en la lata indica que el microorganismo no se encontraba en la muestra original y que la contaminacin corresponde al laboratorio y se reportar Prueba de esterilidad comercial satisfactoria. Si hay crecimiento aerbico en el medio incubado a 35 C para latas normales, indica esterilidad no satisfactoria o contaminacin en el laboratorio. Para descartar problemas de contaminacin ambiental, debe verificar los resultados obtenidos de los controles ambientales y observar los tubos incubados a 55 C, si no hay crecimiento el problema es de esterilidad, se debe verificar las caractersticas de la muestra en cuanto a olor y apariencia anormal, pH o presencia de bacterias en el examen microscpico de la lata original lo cual corrobora el concepto de Prueba de esterilidad no satisfactoria. Si hay crecimiento a 35 C y ausencia de crecimiento a 55 C confirman el concepto de esterilidad no satisfactoria. Para estos casos se debe sembrar en condiciones aerbicas en agar nutritivo a 55 C y confirmar la presencia de esporas despus de 72 h causantes de una descomposicin agria.

Un histrico de resultados de crecimiento anaerbico a 55 C con produccin de gas ponen en evidencia presencia de esporas incapaces de crecer en temperaturas normales de almacenamiento y distribucin. 9.4 REPORTE DE RESULTADOS

Para el reporte de resultados, vase el Anexo C (Informativo).

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ANEXO A (Normativo)

DIAGRAMA DE FLUJO DE LAS ETAPAS DE LA EVALUACIN DE LA ESTERILIDAD COMERCIAL

A.1 Inspeccin visual externa de los recipientes y mediciones fsicas no destructivas: (vase el numeral 6.1.1)

Se inspecciona el rtulo, se registra el cdigo y se pesa el recipiente con el contenido. Se marcan el recipiente y el rtulo; se despega el rtulo, cuando aplique; se inspeccionael rtulo para localizar manchas y se inspecciona el recipiente para observar posibles seales de corrosin.

Envase normal (vase el numeral 8.2)

Envase hinchado o abombado, con fugas, pinchado o agujereado (vase el numeral 8.1)

A.2

Incubacin (vase el numeral 7.1.2)

A.3

Se limpian y desinfectan las superficies exteriores del envase (vase el numeral 8)

A.4

Abrir el envase aspticamente

A.5

Se toma aspticamente una muestra del contenido para someterlo a examen microbiolgico (vase el numeral 9.2)

A.6

Se prepara un frotis y se examina directamente al microscopio (vase el numeral 9.2.3)

A.7

Anlisis microbiolgico (vase el Anexo B (Normativo)

A.8

Se mide el pH del contenido

A.9

Evaluacin sensorial del contenido: olor, color, textura y aspecto para lo cual se puede utilizar una unidad de referencia. Esta evaluacin puede ayudar a determinar si el envase ha sido tratado trmicamente. No debe probarse jams el producto objeto de investigacin o anlisis

A.10 Se vaca el recipiente y se esteriliza (si esta putrefacto)

A.11 Se somete a ensayo el envase para verificarlo y detectar fugas (por ejemplo: ensayo de vaco, prueba de tintura, etc.). En el caso de enlatados, se examinan los cierres y/o costuras para ver si estn correctamente formados

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ANEXO B (Normativo)

DIAGRAMA DE FLUJO PARA EL RECUENTO MICROBIOLGICO

B.1 MUESTRA A 35C 2C Inspeccin externa del envase (vase el numeral 7.1.1) B.2 MUESTRA A 55C 2C Inspeccin externa del envase (vase el numeral 7.1.1)

Envoltura en papel absorbente (vase el numeral 7.1.2)

Envoltura en papel absorbente (vase el numeral 7.1.2)

Incubacin a 35C 2C durante 10 d y frotis directo, coloracin de Gram (vase el numeral 9.2.3)

Incubacin a 35C 2C durante 10 d y frotis directo, coloracin de Gram (vase el numeral 9.2.3)

Apertura del envase y siembra de una muestra en 8 tubos con 10 ml de caldo BHI con almidn

Apertura del envase y siembra de una muestra en 8 tubos con 10 ml de caldo BHI con almidn

4 tubos en aerobiosis

4 tubos en anaerobiosis

4 tubos en aerobiosis

4 tubos en anaerobiosis

35C 2C 72 h

35C 2C 72 h

55C 2C 72 h

55C 2C 72 h

Frotis y coloracin de Gram de los tres tubos (numeral 9.2.3 y Nota 3)

Frotis y coloracin de Gram de los tres tubos (numeral 9.2.3 y Nota 3)

Frotis y coloracin de Gram de los tres tubos (numeral 9.2.3 y Nota 3)

Frotis y coloracin de Gram de los tres tubos (numeral 9.2.3 y Nota 3)

Se confirma crecimiento en mximo un tubo de los seis aerobios y ninguno anaerobio muestra crecimiento (vase el numeral 9.3)

NO

PRUEBA DE ESTERILIDAD COMERCIAL INSATISFACTORIA (vase el numeral 9.3)

SI PRUEBA DE ESTERILIDAD COMERCIAL SATISFACTORIA (VASE EL NUMERAL 9.3)

NOTA 3 Se puede confirmar el crecimiento en placas de Agar nutritivo sembrando a 35 C 2 C y a 55 C 2 C por 24 h, en condiciones de aerobios y aerobiosis.

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ANEXO C (Informativo)

REPORTE DE RESULTADOS MTODO PARA EVALUAR ESTERILIDAD COMERCIAL EN ALIMENTOS El siguiente cuadro ilustra los lmites permitidos para el reporte de los resultados:

Requisitos Crecimiento en anaerobiosis a 37 C Crecimiento en anaerobiosis a 55 C Control en anaerobiosis a 37 C Control en anaerobiosis a 55 C Crecimiento en aerobiosis a 37 C Crecimiento en aerobiosis a 55 C Control en aerobiosis a 37 C Control en aerobiosis a 55 C Olor Aspecto pH Control ambiental

Lmite permitido negativo negativo negativo negativo negativo negativo negativo negativo normal Caracterstico Caracterstico negativo

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BIBLIOGRAFA

Manual operativo de anlisis microbiolgicos para alimentos. Gilma Janeth Luna. Fondo editorial Fundacin Universidad Jorge Tadeo Lozano. Pginas de la 122 a la 123. 1991. Manual de tcnicas de anlisis para control de calidad microbiolgico de alimentos para consumo humano. Ministerio de Salud. INVIMA. Repblica de Colombia. Pginas de la 59 a 61. 1997. Methods of Analysis of AOAC International (OMA), AOAC. 17.6 Microbiological methods for determining commercial sterility of low-acid canned food. 17th Edition, current through 1st Revision, ds. 2002. Food and Drug Administration. Policy. Corn&we Policy Guides Manual. 2002. APHA (American Public Health Association). Standard methods for the examination of dairy products. Port City Press, Baltimore. 1993. Norma Oficial Mexicana NOM-130-SSA1-1995. Bienes y servicios. Alimentos envasados en recipientes de cierre hermtico y sometidos a tratamiento trmico. Disposiciones y especificaciones sanitarias.