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Cromatografa de intercambio inico. Es el mtodo ms utilizado para la separacin de cidos nucleicos. El mecanismo bsico es el intercambio reversible de los iones en solucin con los grupos funcionales unidos covalentemente a una fase estacionaria insoluble llamada resina. Por ejemplo, un cido nucleico con carga negativa a pH 7,0 se unir a un intercambiador inico con grupos cargados positivamente, pero eluir de la columna al cambiar el pH del tampn (tampn de elucin) ya que los iones del tampn de elucin interaccionan con los grupos cargados del cido nucleico o del intercambiador inico, respectivamente; primero eluirn de la columna las molculas cargadas positivamente que no se unen a la fase estacionaria y posteriormente, al aadir el tampn de elucin, eluirn las molculas con poca carga negativa neta y luego las de mayor carga negativa neta.
03.2006
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Aplicacion PCR
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Una modificacin de este mtodo es la extraccin en fase slida, en la que se utiliza una matriz intercambiadora de aniones empaquetada en columnas de polipropileno. La unin se produce bajo condiciones de baja salinidad y durante los pasos de lavado y elucin se va incrementando la concentracin de sales en los tampones correspondientes. Las impurezas se eliminan debido a su diferente capacidad de unin y se obtienen una rpida y eficiente purificacin de los cidos nucleicos (DNA y/o RNA).
Cromatografa de adsorcin. Se basa en la adsorcin y desorcin de los cidos nucleicos en presencia de sales caotrpicas. Bajo condiciones nativas, los cidos nucleicos estn recubiertos de una capa hidratante de molculas de agua que mantienen la solubilidad del DNA en soluciones acuosas. Con la adicin de iones caotrpicos a los cidos nucleicos, se destruye esta ordenada estructura de molculas de agua de la capa hidratante, por lo que las sales caotrpicas crean un entorno hidrofbico alrededor del DNA. Bajo estas condiciones hidrofbicas, los cidos nucleicos se unen perfectamente a la membrana de slica de las columnas, mientras que las protenas, los metabolitos y otros contaminantes no se unen y, por lo tanto, son eliminados de la muestra durante los pasos de lavado. Posteriormente, los cidos nucleicos se eluyen de la membrana de slica mediante tampones de elucin con baja concentracin de sales (ligeramente alcalinos) o simplemente agua, ya que permiten recuperar la capa hidratante de los cidos nucleicos, liberndolos as de la membrana. Con esta tecnologa, no se produce ningn efecto sobre las molculas de los cidos nucleicos ya que la unin intramolecular de los mismos no es de naturaleza hidrofbica. Con este rpido proceso de purificacin mediante la tecnologa de la adsorcin-desorcin sobre membranas de slica, se obtiene cidos nucleicos altamente purificados y listos para usar en procesos posteriores como PCR, RT-PCR, QPCR, secuenciacin, blotting, clonaje, etc.
Ultrafiltracin. En esta tecnologa, la muestra se carga directamente sobre la membrana de ultrafiltracin y mediante vaco o centrifugacin, se eliminan todos los contaminantes mientras que la muestra con los cidos nucleicos permanecen retenidos en la superficie de la membrana. Despus de un paso de lavado opcional, se recuperan los cidos nucleicos aadiendo agua o un tampn adecuado.
Bolas magnticas. Con esta tecnologa, los cidos nucleicos se unen selectivamente a bolas paramagnticas en presencia de sales caotrpicas mientras que el resto de los contaminantes son eliminados de la muestra. Los cidos nucleicos purificados se eluyen de la solucin con las bolas paramagnticas bajo condiciones de baja salinidad y estn listos para ser usados en posteriores aplicaciones. Pasos generales de la extraccin. Todos los mtodos de preparacin de las muestras pueden dividirse en una serie de pasos generales, de tal forma que la necesidad de cada paso depende del microorganismo y de la muestra: Liberacin de los cidos nucleicos de las bacterias, hongos o virus. Puede ser un paso muy sencillo en el caso de los virus y algunas bacterias (Mycoplasma spp.) pero muy difcil en el caso de otras bacterias (Mycobacterium tuberculosis) y hongos. Hay una gran variedad de mtodos para la liberacin de los cidos nucleicos de diferentes microorganismos, entre los que se encuentran el hervir en agua destilada o tampn de PCR, el uso de detergentes con o sin calor, hidrxido sdico con calor, ciclos de congelacindescongelacin, SDS-proteinasa K, cido perclrico, enzimas (lisozima), sonicacin, etc. aunque la utilizacin de enzimas no es muy recomendable ya que la propia muestra puede contener inhibidores de las mismas. Proteccin y estabilizacin de los cidos nucleicos frente a la degradacin. El RNA es mucho ms difcil de estabilizar que el DNA.
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Aplicacion PCR
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