Metode de determinare a aminoacizilor prezenti in serul fiziologic

Aminoacizii sunt unitile constituente ale proteinelor i cuprind n molecula lor dou grupri funcionale: carboxil i amino.Exist 20 de aminoacizi proteinogeni specificai prin codul genetic, prezeni n toate organismele ii. Aminoacizii naturali au formula general: !"#$"#%%$ &$2 n care gruparea aminic se afl la carbonul fa de carboxil.Excepie face prolina al crui azot,dei tot n poziia fa de carboxil, face parte dintr"un inel pirolidinic, fiind o grup aminic secundar.

Aminoacizii eseniali #ei 20 de aminoacizi naturali constituie alfabetul proteinelor.'istribuia lor calitati i cantitati ntr"o protein determin caracteristicile c(imice, aloarea ei nutriti i funciileei metabolice n organism.'intre cei 20 de aminoacizi uzuali,organismul uman i al ertebratelor superioare poate sintetiza un numr limitat,restul trebuie s fie furnizai zilnic prin (ran i se numesc aminoacizi eseniali )*).#ei mai muli autori, consider drept aminoacizi eseniali urmtorii: alina,fenilalanina,metionina,lisina,triptofanul+ alii, includ i leucina,izoleucina ,treonina i (istidina. Caracteristici generale : Aminoacizii ndeplinesc mai multe roluri biologice,fiind n acelai timp: ioni dipolari cu un moment de dipol mare, care determin o cretere considerabil a mediului n care se dizol + electrolii amfoteri solubili n ap, cu capacitatea de a aciona ca substane tampon n diferite domenii de p$+ sunt optic acti i, datorit faptului c posed unul sau mai muli atomi de carbon asimetrici, cu excepia glicinei+ sunt compui cu grupe reacti e capabile s participe la reacii c(imice a ,nd ca rezultat o mare gam de produse sintetice+ sunt liganzi ai multor metale+ sunt participani n reacii metabolice cruciale, de care depinde iaa i sunt substane in itro pentru o gam mare de enzime+ sunt constitueni eseniali ai moleculelor proteice ale cror caractere specifice,biologice i

c(imice sunt determinate n mare parte de numrul, distribuia i interrelaiile aminoacizilor din care se compun. Ei prezint unitate i di ersitate n acelai timp:unitate, deoarece sunt "aminoacizi cu toate consecinele fizice care decurg din aceasta i pentru c cei care sunt componeni uzuali ai proteinelor au aceeai configuraie optic a atomului de carbon din poziia , i di ersitate, deoarece fiecare din ei posed o caten diferit, care"i confer proprieti unice, deosebindu"l fizic,c(imic i biologic de ceilali. -ntre metodele de determinare a aminoacizilor serici pe primul loc se situeaza cele cromatografice, electroforeza capilara .#E/ cu detectie fluorescenta. Aceasta este dez oltata ca o simpla metoda de determinare cantitati a a tirozinei, argininei, acidului glutamic din serul fiziologic. Au fost in estigate conditiile de separare si deri atizre cu izotiocianatii fluorescenti. Ecuatiile de regresie au rele at o relatie liniara .coeficienti de corelare: 0.**20 1 0.***2/ intre arful suprafetei si concentratia fiecarui analit. Au fost atinse limite de detectie de 30 "30 4 pentru aminoacizii detectati, iar ni elul acestora in serul fiziologic putand fi usor determinati cu o recuoerare de *5.6 1 307.68. Electroforeza capilara a capatat o atentie deosebita pentru separarea unor arietati de compusi , iar in zilele noastre este considerata o te(nica importanta complementara te(nicilor de separare cromatografica. #u toate acestea, limita de detectare a concentratiei in cazul electroforezei complementare cu un detector 9: este restransa datorita unor probe in;ectate si o lungime de unda scurta existenta doar pentru detectia <on"column=. >rin urmare, electroforeza capilara cu detectie fluorescenta reprezinta un interes particular atata timp cat pot fi atinse limite de detectie ;oase. Aminoacizii care actioneaza ca neurotransmitatori sunt compusi biologici importanti care au de asemenea functii metabolice in sistemul central ner os. ?c(imbarile ce au loc la ni elul anumitor aminoacizi neurotransmitatori sunt cunoscute ca fiind asociate cu boli neuro" degenerati e: boala Alz(eimer sau $untington. Asadar, masura ni elului de aminoacizi neurotransmitatori in fluidul corpului este semnificant. Este cunoscut faptul ca arginina, tirozina, acidul glutamic reprezinta 5 aminoacizi neurotransmitatori importanti ce sunt larg distribuiti in serul uman. -n prezent s"au dez oltat cate a metode de electroforeza capilara cu detectie fluorescenta pentru a determina aminoacizii din diferite probe biologice, cu toate acestea, nu s"a orbit nimic despre determinarea cantitati a a argininei, tirozinei si a acidului glutamic in serul sanguin. -n figura de mai ;os este reprezentata forma initiala a monta;ului, inainte de alimentarea cu tensiune, cand substantele sunt amestecate. #and sistemul este alimentat cu tensiune electrica, componentele se separa in functie de gradientul lor de potential. Electroforeza capilara .E#/ este folosita pentru separarea speciilor ionice datorita incarcaturii lor electrice si a fortelor de atractie si respingere. ?e deosebeste de cromatografia de lic(ide de inalta performanta .$>@#/ doar prin faptul ca separarea pe componenti se face sub inalta tensiune electrica pe cand la $>@# se face cu o pompa de inalta presiune. Exista si combinatii intre electroforeza capilara si $>@# . ce nu se poate detecta cu $>@# intra in sistemul de detectare al electroforezei capilare/.

Aigura3. ?c(ema de principiu a electroforezei fara medii stabilizante

Aigura 2. >rincipiul electroforezei capilare: 3" anod+ 2" solutie tampon+ 5" celula electroforetica+ B" catod+ 6" fotodetector .in 9:, dioda ArraC/+ 7" tub capilar+ 0" sursa de radiatie+ 2" fanta+ *" amplificator+ 30" sistem de preluare, ac(izitie si afisare a datelor+ 33" cromatograma electroforetica
3

>rincipiul de functionare este relati simplu. @a aplicarea tensiunii electrice 9, ionii substantelor din amestec or incepe sa migreze prin tubul capilar in functie de potentialele lor specifice. Astfel se realizeaza separarea compusilor din amestecul de analizat. 'eplasarea lor e bidirectionala .de la stanga la dreapta si de la dreapta la stanga/. -n deplasarea lor prin tubul capilar, la un moment dat ionii substantei or fi detectati cu a;utorul unui sistem de detectie ce or transmite semnalul la un amplificator. 'upa amplificare semnalul a;unge la sistemul de preluare, ac(izitie si afisare a datelor care ne a oferi informatiile in ccea ce pri este substantele din amstecul analizat sub forma unei cromatograme electroforetice. Aiecare substanta este caracterizata de timpul propriu de retentie .analiza cantitati a/, iar inaltimea picului corespunzator ofera informatii despre cantitatea de substanta existenta. -n continuare a om prezenta o metoda electroforeza capilara simpla si rapida pentru analiza argininei, tirozinei si acidului glutamic, metoda ce a fost pusa in aplicare asupra unei mostre de ser fiziologic, a and bune rezultate. Aparatura experimentala: Doate separarile au fost efectuate pe un sistem >EA#E 6630 .FecGman #oulter -nstrument, Aullerton, #A, 9?A/ ec(ipat cu un detector @-A .@aser -nduced Aluorescence/. @umina de sensibilizare a unui laser cu argon ionizat .5mH/ a fost focalizata in tubul capilar prin conexiune cu o fibra optica. @ungimea de unda a fost efectuata la B22nm si a fost utilizat o banda de tip pass"filter de 620 nm. ?istemul a fost controlat de un softHare >EA#E D4. ?epararea are loc n capilare de siliciu B0cm x 06 Im .Jongnian >(otoconducti e Aiber, $ebei, #(ina/. -nainte de prima utilizare, capilara a fost tratata cu 200 m4 $#l timp de 20 minute, 200 m4 &a%$ 20 minute si apa distilata 30 minute. -ntre doua tratari in acest mod, a rulat un ciclu de clatire folosind 200 m4 &a%$ pentru 3 minut, apa distilata 3 minut si solutie tampon 2 minute. #apilara a fost mentinuta la 26K#. Materii prime Arginina, tirozina, acidul glutamic au fost obtinute de la -nstitutul &ational de #ontrol Aarmaceutic si Fioproduse din #(ina. >robele de ser fiziologic au fost ac(izitionate de la spitalul din Lansu. $#l, &a%$, acetonitril, metanol, aceton i borat au fost de grad analitic reacti . 2.52 m4 soluii stoc de Arg, DCr i Llu au fost pregtite n ap distilat, respecti . 2.62 m4 de soluie stoc A-D# a fost pregtit n aceton. Doate soluiile au fost stocate la BK #. Pregatirea electrolitilor ?olutia tampon a fost preparata din 300 m4 solutie de borat si acetonitril. p$"ul dorit a fost a;ustat cu 200 m4 $#l sau 200 m4 &a%$.

Pregatirea mostrei 0,3 m@ din serul uman a fost amestecata cu 0,B metanol timp de 50 de secunde si lasata sa stea 36 minute. ?olutia rezultata a fost centrifugata la 5000 rpm timp de 6 minute pentru a separa proteinele precipitate. Derivatizarea - procedur stocul de soluie de aminoacizi a fost n primul r,nd, diluat la 25.2 m4 pentru a prepara soluia de lucru, apoi 60 ml de soluie de lucru au fost amestecate cu 360 ml de soluie de A-D# i solutie tampon. >entru mostre, a fost ca cea a soluiilor standard. Apoi, toate amestecurile au fost diluate p,n la 3,0 ml cu ap distilat i se pstreaz la ntuneric pentru a reaciona la temperatura camerei. Mnainte de a analiza, soluiile standard de deri atizare au fost diluate cu ap distilat pentru a atinge concentraiile dorite.

Separarea compusilor 'ependenta timpului de migrare a aminoacizilor a fost in estigata la p$ cu alori intre *.26 1 30.B6. Dimpul de migare a aminoacizilor creste cu cresterea p$"lui. 'e asemenea, cresterea p$"lui duce la imbunatatirea separarii aminoacizilor. Acest lucru reprezinta o consecinta a scaderii fluxului electroosmotic si modificarea densitatii de sarcina a aminoacizilor de tip N zHitterion O. -n acest caz a em un p$ de 30,06. A fost in estigata si influenta concentratiei solutiei de borat de la 6"B0 m4 .p$ P30,06/ . !ezultatele au aratat ca timpul migrarilor au crescut rapid cu cresterea concentratiei de borat. #u toate acestea, separarea aminoacizilor poate fi de asemena imbunatatita semnificant prin cresterea concentratiei de borat. Efectul tensiunii aplicate asupra timpului de migrare a celor trei aminoacizi a fost analizat . 36, 20, 26 G:/. Asa cum era de asteptat, rezolutiile au fost pierdute in timpul aplicarii unor tensiuni mari datorita ferestrei inguste de separare. -n aceasta lucrare s"a ales o tensiune de20 G: pentru rezolutii mai mari si timp scurt de analiza. #onform rezultatelor experimentale, aminoacizii au fost separati cu 20 m4 borat la p$ 30,06 si cu un olta; de 20 G: aplicat. Optimizarea derivatizarii ?"a urmarit deri atizarea aminoacizilor cu izotiocianati fluorescenti .A-D#/ la intuneric si la temperatura camerei pentru a atinge sensibilitate ridicata. Eficienta deri atizarii a fost testata intr"un inter al de timp de 0"B2 ore. !ezultatele au aratat ca cel mai inalt raspuns poate fi obtinut cand timpul de reactie era mai mare de 20 de ore. #a urmare, acest timp de 20 de ore a fost utilizat in experimente ulterioare. Efectul concentratiei de borat a fost in estigat intr"un inter al cuprins instre 30"B0 m4. Asa cum este aratat in figura 3, intensitatea fluorescenta a deri atilor acidului glutamic poate fi imbunatatita prin cresterea concentratiei de borat intr"un inter al de 30"50 m4, in sc(imb intensitatea fluorescentei argininei si tirozinei a fost neinsemnata. Atunci cand concentratia a
5

depasit 50 m4, intensitatea fluorescentei celor trei aminoacizi a scazut. Mn experimentele ulterioare am folosit 50 mm, deoarece n acest fel cea mai mare intensitate fluorescent a fost realizata pentru cele trei aminoacizi simultan

Aigura 5. Efectul concentratiei de borat asupra deri atizarii. #onditiile deri atizarii: B,37 I4 pentru fiecare aminoacid, p$ solutie tampon *,26+ conditii analitice: 20m4 borat cu p$ 30.06, tensiunea de separare 20G:. :arf de identificare: 3 arginina, 2 tirozina, 5 acid glutamic.

Aigura B. Efectul p$ asupra deri atizarii. #onditiile identice cu cele din figura 3 cu exceptia concentratiei solutiei tampon 50 m4.

>rin urmare, efectul p$"lui solutiei tampon asupra intensitatii semnalului fluorescent a fost testat intr"un inter al *.26"30.06, iar rezultatele au fost aratate in figura 2. ?"a obser at ca cel mai inalt raspuns al deri atilor aminoacizilor ar putea fi obtinut intr"un inter al al p$ *.26"*.06. -n aceasta metoda a fost ales un p$ de *.06. 'eoarece sol entii oragnici au un efect benefic asupra reactiilor de deri atizare, a fost in estigat efectul acetonitrilului, acetonei si metanolului asupra deri atizarii. 'in rezultate a reiesit faptul ca metanolul nu are nici un efect asupra deri atizarii, dar acetonitrilul poate imbunatati mai mult intensitatea semnalului de fluorescenta fata de acetona. #u toate acestea, a fost folosit acetonitrilul pentru a modifica deri atizarea. Aigura 5 arata dependenta intensitatii semnalului de fluorescenta asuora concentratiei acetonitrilului de la0"368. ?"a descoperit ca cea mai inalta intensitate a semnalului de fluorescenta pentru deri atii aminoacizilor a fost atinsa la 308 acetonitril. #onform experimentului, conditiile optime de deri atizare sunt 50 m4 solutie tampon, p$ *.06 cu continut 308 acetonitril. Aplicare >entru e aluarea aplicabilitatii cantitati e a metodei, au fost analizate solutiile standard de arginina, tirozina si acidul glutamic la diferite concentratii sub anumite conditii. @iniaritatea dintre zonele de arf si concentratiile fiecarui analit a fost analizata, iar rezultatele sunt aratate mai ;os:

#ompusi Arginina Dirozina Acid glutamic

a

#oncentratie .30"304/ 2.5"B370 B3.7"B370 B3.7"B370

#oeficient de corelatie B B J P " 3.*62x30 Q B.2*5x30 R 0.**27 J P " 6.200x306 Q 6.B*2x30BR 0.***2 6 B J P " 3.200x30 Q7.030x30 R 0.**20

Ecuatia de regresiea

@imite de detectie .30"30 4/ 0.B 0.7 3.5

Dabel 3. 'ate de regresie si limitele de detectie ale analitilor J si R reprezinta zona de arf, respecti concentratia analitului .30"304/.

Aigura 6. Electroferograma mostrei de ser. #onditii deri atizare: 50 m4 solutie borat la p$ *.06 cu 30 8 acetonitril. -dentificarea arfurilor: 3 arginina .0.*7 n4/, 2 tirozina .33.0 n4/, 5 acid glutamic .6.B n4/. #ompusi Arginina Dirozina Acid glutamic "B ?er fiziologic 3 #ontinut .x30 4/ 0.B2 6.27 2.05 !ecuperat .8/ *6.2 307.6 *B.0 "B ?er fiziologic 2 #ontinut .x30 4/ 0.B7 6.*7 2.*B !ecuperat .8/ *0.0 *B.7 *5.6 Dabel 2. !ezultatele determinarii mostrelor de aminoacizi in serul fiziologic !ezultatele au aratat ca exista o legatura de liniaritate intre zonele de arf si concentratii. !epetabilitatea metodei a fost studiata prin masurarea timpului de migrare si zona de arf a cinci preparate in;ectabile. Abaterile standard relati e a timpului de migrare si zonele de arf apartin unui inter al intre 0.0"3.*8 si respecti 3.7"6.78. Concluzii >entru separarea si detectia unor aminoacizi a fost dez oltata a noua metoda de electroforeza capilara cu detectie fluorescenta. Aceasta metoda ofera un timp mai scurt de analiza, limite de detectie mai mici si o buna reproductibilitate. !ezultatele au indicat faptul ca metoda este aplicabila pentru determinarea cantitati a a aminoacizilor neurotransmitatori din mostrele biologice.

Fibliografie
Jiyou Zhang, Jiannaiao Tian, Jiaqin iu, !ong "ao, #ingguo Chen and Zhide !u $ %&uantification of 'eurotransmitter Amino Acids in !uman (erum )y Capillary *lectrophoresis +ith aser$,nduced -luorescence .etection/, recei0ed January 12, 23345 accepted July 2, 23345 pu)lished online 'o0em)er 13, 23346 1. Beale S.C. Analitical Chemistr ! 1998! "#! "$%& $. 'r lov S.(.& Dovichi (.). Anaitical Chemistr ! 2000! "$! 111& *. +ang ,.& Blom-erg ../. )ournal o0 Chromatograph A! 2000, 1"2! 3*& 3. Bartle '.D.& M ers P. )ournal o0 Chromatograph A! 2001, %14! *& 2. Shung S.'.& 5accardo 6.& .ittle M.& Ban7s P. )ournal o0 Chromatograph A 1998, 1#%! $#*& 4. 'ang S.,.! +ei +.& 8eung 9.S. )ournal o0 Chromatograph B 2000, "33! 13%& ". 5hang ).8.& Chen :./.& ,u 5.D.& Ma :. Analitical Chemistr ! 2002, 3"1! $#*& 1. 6agg /.9.& 6oster A.C. (euroscience 983! %! "#1; %. 5hang D.M.& 5hang ).M.& Ma +.8.& Chen D.8.& ,an ,.+.& Shu ,.).& .iu /.;. )ournal o0 Chromatograph B! 2001, "21! $""& 1#. 5hang ..& Chen ,.& ,u S.& Cheng ). '.& .i 5.+.& Shao M. )ournal o0 Chromatograph B 1998, "#"! 2%& 11. <mmadi M.& +eimer B.C. )ournal o0 Chromatograph A! 2002, %43! $3*& 1$. 5hou S.8.& 5uo ,.& Sto-augh ).6.& .unte C.9.& .unte S.M. Anaitical Chemistr ! 1995, 4"! 2%3& 1*. Shah A.).& Biasi =.D.& 8a lor S./.& >o-erts C.& ,emmati P.& Munton >.& +est A.& >outiedge C.& Camilleri P. )ournal o0 Chromatograph B! 1999, "*2! 1**& 13. Boulat O.& Mc.aren D./.& Arriaga 9.A.& Chen D.D.8. )ournal o0 Chromatograph B 2001, "23! $1"& 36. Mattusch ).& ,uhn /. &+ennrich >. Aresenius? )ournal o0 AnalCtical #(emistrC, 1995, *21! "*$&

14. +ehr 9... @1%%#A Practical 6luorescence! /uil-ault /./. @9d.A De77er! (eB 8or7! p. 1*2.

10