TEKNIK PEWARNAAN

Pendahuluan
Pengamatan

mikroorganisme sulit:

Berukuran kecil Transparan/tidak berwarna ketika disuspensikan dalam media cair

Perlu

dikembangkan teknik pewarnaan untuk memudahkan dalam:

Pengamatan morfologi mikroorganisme Pengidentifikasian bagain-bagian struktural sel mikroorganisme

Faktor Penentu Keberhasilan Dalam Teknik Pewarnaan

1. 2.

3.

Penempatan olesan, atau lapisan tipis spesimen pada kaca objek Fiksasi olesan pada kaca objek, biasanya dengan pemanasan, menyebabkan mikroorganisme melekat pada kaca objek Aplikasi pewarna yang digunakan (pewarnaan sederhana atau differensial)

Prinsip Dasar Pewarnaan

Secara kimiawi zat pewarna (stain/dye) yang digunakan dalam pewarnaan berupa senyawa organik yang mengandung kromogen+Auksokrom Kromogen:
senyawa berwarna yang terbentuk atas benzen (senyawa organik yang tidak berwarna)+ kromofor (senyawa yang mampu membentuk warna jika bereaksi dengan benzen)

Auksokrom
Senyawa kimia yang dapat mengubah ionisasi dari kromogen Menjadikan kromogen membentuk garam dan dapat berikatan dengan serat atau jaringan

Prinsip Dasar Pewarnaan

Kemampuan zat pewarna (stain) dalam berikatan dengan komponen selular makromolekul seperti protein atau asam nukleat sangat bergantung pada muatan listrik kromogen serta komponen selular yang akan diwarnai. Dikenal ada dua jenis zat pewarna:
1. Pewarna asam (acidic stains) 2. Pewarna basa (basic stains)

Pewarna Asam (acidic stains)

Bersifat

anionik Ionisasi stain membentuk kromogen bermuatan negatif Memiliki afinitas yang kuat terhadap struktur sel yang bermuatan positif, seperti protein Tidak terikat pada sel bakteri hanya mewarnai latar blakang. Contoh Picric acid, eosin dan fuchsin acid

Pewarna basa (basic stains)

Bersifat

kationik Ionisasi stain membentuk kromogen bermuatan positif Memiliki afinitas yang kuat terhadap struktur sel yang bermuatan negatif, seperti asam nukleat Contoh methylene blue

Macam-macam teknik pewarnaan

Pewarnaan sederhana (simple staining) Pewarnaan differensial (differential staining):

Pewarnaan gram Pewarnaan tahan asam

Pewarnaan khusus
Pewarnaan kapsul Pewarnaan spora Pewarnaan flagela

Pewarnaan Sederhana (simple staining)

Pewarnaan

yang hanya menggunakan zat pewarna tunggal Menggunakan zat pewarna basa (mengandung kromogen kationik) Digunakan untuk mewarnai asam nukleat dan komponen dinding sel bakteri (bermuatan negatif) Bertujuan untuk mengamati morfologi dan penataan sel bakteri Zat pewarna yang digunakan: methylene blue, crystal violet, dan carbol fuchsin

Pewarnaan differensial (differential staining)

Pewarnaan

yang menggunakan lebih dari satu zat pewarna Pewarna terbagi menjadi dua macam: pewarna utama (primary dye) dan pewarna tandingan (counterstain) Digunakan untuk menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba

Pewarnaan Gram
Dikembangkan

pertama kali oleh Hans Christian Gram pada tahun 1884 Pewarna yang digunakan:
Intepretasi

Ungu kristal (pewarna utama), iodium gram (mordan), alkohol 95 % (pemucat), safranin (pewarna tandingan) Gram positif: mampu menahan pewarna utama meskipun telah dipucatkan dengan alkohol, serta pemberian warna tandingan. Gram negatif: tidak mampu menahan pewarna utama, serta mampu terwarnai dengan pewarna tandingan setelah pemucatan.
Organisme Organisme

hasil:

berwarna ungu-hitam (warna kristal violet)

berwarna merah (warna safranin)

Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram
Determinasi

gram + dan disebabkan adanya perbedaan struktur dan komposisi dinding sel pada masing-masing kelompok.
Gram mengandung lipid, lemak dalam prosentase yang lebih besar dibandingkan dengan gram +. Dinding sel bakteri gram juga lebih tipis dibandingkan dengan bakteri gram +. Etanol mampu mengekstraksi pewarna utama pada bakteri gram

Pewarnaan Gram

Pewarnaan Tahan Asam

(Acid Fast Stain)

Beberapa Hal

spesies tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, contohnya genus

ini disebabkan komposisi dinding sel yang mengandung lipid yang tebal sehingga menyulitkan pewarna biasa untuk dapat melakukan penetrasi pewarnaan. Pewarna yang digunakan:

Mycobacterium

Proses

pewarnaan dilakukan dengan pemanasan atau tanpa pemanasan (penambahan turgitol/wetting agent)

Karbol fuchsin (pewarna utama), metilen biru (pewarna tandingan), alkohol asam (3 % HCl + 95 % etanol) sebagai pemucat.

Pewarnaan Tahan Asam

Intepretasi

hasil:

Bakteri tahan asam: mampu menahan pewarna utama meskipun telah dilakukan pemucatan terhadap asam alkohol
Bakteri

berwarna merah keunguan

Bakteri tak tahan asam: mampu dipucatkan oleh alkohol asam, dan menerima pewarna tandingan.
Bakteri

berwarna biru

Pewarnaan tahan asam

Pewarnaan Kapsul
Kapsul

(Pewarnaan Khusus)

merupakan bagian dari struktur sel bakteri yang berupa lapisan luar yang bergelatin Kapsul mengandung polisakarida, glikoprotein dan polipeptida. Tidak semua bakteri memililki kapsul Umumnya keberadaan kapsul mengindikasikan virulensi Pewarna yang digunakan:
Kristal violet 1 % (pewarna utama); tembaga sulfat 20 % (pemucat dan pewarna tandingan)
Tidak

ada perlakuan pemanasan

Pewarnaan Kapsul

Pewarnaan Spora
Endospora: Bentuk dormansi bakteri Struktur yang resisten: Panas, radiasi, dingin, asam, desinfektan kimiawi Perebusan > 1 jam tetap viabel Membutuhkan energi dan waktu untuk membentuk spora Pewarnaan spora: menentukan lokasi yang menjadi dasar klasifikasi sentral, subterminal,terminal Struktur: Spore coat Cortex Core (Spore protoplast)

Pewarnaan Spora
Komponen

lanjutan

penyusun inti endospora

Air dalam konsentrasi yang rendah Small acid-soluble spore proteins (SASPs):
Melindungi

DNA dari radiasi UV, pengeringan & pemanasan Sumber karbon & energi untuk pembentukan sel vegetatif baru (germinasi)

Pewarnaan Spora
Pewarna

lanjutan

yang digunakan:

Hijau malakit (pewarna utama), Safranin (pewarna tandingan), air (pemucat)

Perlu pemanasan ketika pemberian warna
Intepretasi

hasil: Spora akan berwarna hijau (hijau malakit), sedangkan sel vegetatif akan berwarna merah (safranin)

Pewarnaan Spora

lanjutan

Pewarnaan Flagel
Digunakan

untuk mewarnai flagel sehingga dapat diamati keberadaan, jumlah, dan penataan flagel pada bakteri. Penataan flagel akan membantu dalam identifikasi bakteri. Untuk mewarnai flagel dibutuhkan teknik pewarnaan yang khusus. Diperlukan bahan tertentu yang dapat melapisi flagel bakteri, sehingga dapat menambah ketebalan flagel. Pewarna selanjutnya akan mewarnai bahan pelindung tersebut.

Pewarnaan flagel

Pewarnaan Negatif
Digunakan

untuk mengamati morfologi dan penataan bakteri Pewarna yang digunakan berupa pewarna asam seperti tinta india atau nigrosin. Pewarna asam tidak akan mewarnai sel, karena permukaan sel bakteri yang bermuatan negatif Bakteri tidak berwarna, sedangkan latar belakangnya akan berwarna gelap Contoh : Pewarnaan kapsul

Pewarnaan Negatif

SEMOGA BERMANFAAT