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Katherina Fernndez E.
Universidad de Concepcin Octubre 2007
Taninos
Hidrolizables
(Polmeros de cidos fenlicos)
No Hidrolizables (Condensados)
(Polmeros de flava-3-oles)
Florotaninos
(Grupo minoritario y recientemente descubierto)
Taninos Hidrolizables
Son esteres de cidos fenlicos (cido glico y elgico), con una azcar (glucosa) o un polialcohol
cido Glico
Galotaninos
cido Elgico
Elagitaninos
Desde 1989 gracias a Haslam, Okuda y Yokida ms de 750 nuevas estructuras se han elucidado
Galotanino
Taninos Condensados
Unidad bsica: flavan-3-ol Catequinas
Florotaninos
Son aislados desde varias especies de algas pardas Sus estructuras estn constituidas de unidades de floroglucinol unidas por C-C o C-O
Identificacin
(Espectroscopa/Espectrometra)
Cromatografa
Un poco de historia
Primera aplicacin por Tswett 1906 Adsorcin cromatogrfica de pigmentos de hoja en una columna de carbonato de calcio Cromatografa de particin liquido-liquido (Martin and Synge, 1941) Cromatografa gaseosa (James and Martin, 1952) Cromatografia en papel (Bate Smith 1964) High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) (1966) y la incorporacin DAD (1982) y el desarrollo de materiales para nuevas columnas mejor el la caracterizacin fenoles
Cromatografa
Mejores resultados y actividades son obtenidos si los taninos son previamente purificados y/o concentrados
Extracts dissolved in 20mL buffer phosphate (pH 7.0)
Skin
100 berries
Seed
Extraction
Cromatografa
Monmeros y oligmeros:
Fase Reversa (RP-HPLC) Separar componentes por polaridad
gradientes solvente acuoso a un solvente orgnico
Columnas
Reversed-phase silica (C-18) Polystyrene divinylbenzene (PSDVB)
Extrado de Lazarus et al., 1999
Cromatografa
Proantocianidinas
Cromatografa
Proantocianidinas:
Caracterizacin Estructural
Catlisis cida en la presencia de un agente nucleofilico (Phloroglucinol, Tiol, Benzil mercaptano) seguido de deteccin en HPLC Cromatografia de permeacin en gel (GPC)
Win es
Sugar, Acids and LMW phenolics were discarded
Proanthocyanidins (freeze-dried)
Phloroglucinolysis
HPLC
Cromatografa
Proantocianidinas: Caracterizacin estructural por Phloroglucinlisis
Cromatograma HPLC
90 80 70 Ascorbic Acid Phloroglucinol
(280 nm)
Extension units: 1, epigallocatechinphloroglucinol (EGC); 2, catechinphloroglucinol (C); 3 epicatechinphloroglucinol (EC) and 5, epicatechin gallateploroglucinol (ECG).
5
Absorbance (mAU)
60 50 40 30 20
2
10 0 0 1 2 3 4 5 6
Espectrometra/Espectroscopa
UV-Visible Espectrometra
Espectro flavan-3-oles
Se necesita incorporar otros indicadores que den solo cuenta de los taninos MEDICIONES INDIRECTAS
Espectrometra/Espectroscopa
Ensayos Colorimtricos para Taninos
Tanino + qumico = complejo o aducto coloreado
Desventajas: Falta de selectividad hacia los taninos Funcionan bien solo con muestras de taninos purificadas
Espectrometra/Espectroscopa
Ensayos colorimtricos para taninos
Butanol-HCl (Butanlisis) (Porter at al, 1986) Depolimerizacin cida, oxidacin y deteccin. Es selectivo para taninos condensados, interferencias por agua y metales en la muestra Prussian Blue o Folin Ciocalteu (reacciones de oxidoreduccin). Los fenoles se oxidan no selectivamente Vainillina. Influenciada por T, [ ], tiempo, entre otros (Sun et al., 1998) DMACA (4-dimetilaminocinamaldehido) (Treutter, 1989) Detectan el producto coloreado de la reaccin tanino- aldehdo
Espectrometra/Espectroscopa
Mtodos de Precipitacin con Protenas
Aprovechan la habilidad de los taninos para reaccionar con los protenas
Esta habilidad va a depender de: Peso molecular de los taninos El nmero de sitios disponibles pH T Fuerza inica Punto isoelectrico
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Protenas empleadas: Haemoglobin (Bate-Smith, 1973) Bovine Serum Albumine (BSA), (Hagerman and Butler, 1978; Harbertson et
al., 2003)
Gelatina (Glories, 1984) Ovoalbumina, (Llaudy et al., 2004) Saliva humana (-amilasa) (Baxter, 1997)
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Espectrometra/Espectroscopa
Mtodos de Precipitacin con Otros Reactivos Polietilenglicol (PEG) (Jones, 1965; Makkar et al.,1995) Polivinilpirrolidona (PVP) y Polivinilpoliprirrolidona (PVPP) (Makkar et al., 1993; Clifford, 1974) Acetato de Cobre (Yebra et al, 1995) Formaldehdo (Singleton, 1974) Ion metlico Iterbio (Yb+3) (Reed et al., 1985) Metilcelulosa (MCP) (Sarneckis et al., 2006)
Espectrometra/Espectroscopa
Espectrometra de masa (MS)
MS unida a LC para determinar la masa exacta de taninos
Un poco de historia.
El primer espectrmetro de masa fue construido en 1940 Time of flight (TOF) MS (1946) Ion cyclotron MS (1948) Quadrapole filters and ion-trap detectors (1953) Gas chromatography-TOF MS (1956)
Nueva era para la identificacin estructural
Liquid secondary ion mass spectrometry (LSI-MS) (1978) Fast atom bombardment mass spectrometry (FAB-MS) (1981)
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Espectrometra/Espectroscopa
Espectrometra de masa (MS)
No se necesita una gran preparacin de la muestra y la manipulacin no es excesiva Suave ionizacin iones moleculares abundantes con minima fragmentacin Se necesitan muestras relativamente puras
Matrix-assited laser desorption ionization (MALDI) MS (1987) MALDI-TOF-MS (2003) es una poderosa herramienta de mapping Electrospray Ionization (ESI-MS) (2002) HPLC-ESI-MS (1993) acoplar es una ventaja para el anlisis
Espectrometra/Espectroscopa
Resonancia Magntica Nuclear (NMR)
El primer equipo fue introducido en 1953 y se convirti en una herramienta analtica con el Varian A-60 en 1961 Con la introduccin de la transformada de Fourier (FT-MNR) en 1966 se mejoro el desempeo y su aplicacin a fenoles LC-NMR poderosa herramienta para separar y caracterizar compuestos (Wolfender et al., 2003) Electron paramagneric resonance (EPR) tambin ha sido empleada para analizar fenoles (Hageman et al., 2003)
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Espectrometra/Espectroscopa
Espectrometra Infraroja (IR)
Descubierta F. Wilheim Herschel in 1800 Regin de inters del espectro IR :
Near Infrared (NIR): 14000-4000 cm-1 (700 to 2500 nm) Mid-Infrared (MIR): 4000 to 400 cm-1 (2500 to 2.5*104 nm)
Espectrometra/Espectroscopa
Espectrometra Infraroja (IR)
Ventajas No destructiva, de anlisis rpido, multicomponente Mnima preparacin de la muestras
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Normalized Absorbance
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0 800
1000
1200
1400
-1
1600
Taninos de Vino
1800
Wavenumbers (cm )
IR + Anlisis Multivariado
Predecir
Reference Analysis
Y=X*b + e
b. Regresion Coefficient; e. residuals
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Quantitative Analysis of Red Wine Tannins Using Fourier Transform Mid-Infrared Spectrometry
MODELING
Concentration and mDP
86 varietal wines
modeling
FT- MIR
Catalysis Phloroglucinol
HPLC
m od eli ng
Concentration by
Protein Precipitation Assay
550 500
150
200
250
300
350
400
450
500
550
16
6,5
5,5
mDp by FT-MIR
4,5
3,5
RMSEC=6.7% RMSEP=10.3%
2,5
R=0.958
mDP by Phloroglucinolysis
Conclusin
Un vasto nmero de tcnicas pueden ser empleadas para el anlisis de taninos Es un extenso campo que an esta en desarrolloy en la caracterizacin de taninos queda mucho an por hacer
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