Kapan mikroinjeksinya akan dipakai?

Kalo pada tanaman jarang yang menggunakan mikroinjeksi untuk transfer gen asing tadi? Bingung tentang runtutan kerjanya? Mana yang akan duluan kita pakai? Apakah kita pakai protoplas terlebih dahulu atau mikroinjeksinya? Upaya yang aman dan efektif untuk mengatasi hama tersebut adalah dengan perakitan kultivar kedelai yang tahan terhadap hama penggerek polong. Salah satu upaya yang dapat dilakukan untuk merakit tanaman kedelai tahan hama penggerek polong adalah dengan membentuk tanaman kedelai transgenic dengan menggunakan metode transformasi gen. Transformasi gen pada tanaman dapat dilakukan dengan dua cara yaitu transformasi secara langsung meliputi metode mikroinjeksi DNA, elektroforasi, fusi protoplas dan particle bombardment, serta transformasi tidak langsung dengan bantuan vektor Agrobacterium tumefaciens yang merupakan bakteri obligat gram negatif yang hidup alami di tanah. Transformasi tidak langsung melalui A. tumefaciens memanfaatkan vektor ganda dengan dua plasmid (plasmid biner). A. tumefaciens yang dilengkapi dengan plasmid biner mampu memindahkan gen asing dan mengintegrasikannya ke dalam genom tanaman (Smith & Hood, 1995). Klon gen yang sudah banyak diteliti dalam usaha mengatasi serangan hama dari ordo Lepidoptera adalah gen Cry yang merupakan penyandi protein aktifanti serangga yang diisolasi dari bakteri Bacillus thuringiensis (Bt). Gen ini menghasilkan kristal protein yang bersifat racun bila terhidrolisis dalam jaringan usus serangga. Bt yang dikode oleh Cry1Ab terbukti efektif terhadap hama ordo Lepidoptera (Wunn et al.1996). Transformasi gen Cry untuk perakitan tanaman tahan hama Lepidoptera telahberhasil dilakukan pada tanaman jagung (Jagung Bt tahan penggerek batang), tanaman kapas (kapas Bt tahan penggerek buah), dan tanaman padi (padi Bt tahan penggerek batang).

Injeksi di mana DNA secara langsung disuntikkan ke protoplas tanaman atau sel (khusus ke dalam inti atau sitoplasma) menggunakan baik tipped (0,5-1,0 micrometerdiameter) kaca jarum atau mikropipet. Metode transfer gen yang digunakan untuk memperkenalkan DNA ke dalam sel besar seperti oosit, telur, dan sel-sel dari embrio awal.

Perbedaan yang paling penting adalah dinding sel dan sel tekanan internal hingga 30 bar . Jika jenis cannula yang digunakan untuk sel-sel hewan yang digunakan pada sel-sel tumbuhan itu menyebabkan kerugian drastis tekanan dan sel mati. Untuk mengatasi masalah tersebut , bahkan lebih tipis kiat kanula sedang dikembangkan dan digunakan dalam kombinasi dengan tekanan generator yang halus disesuaikan . Dengan cara ini kanula memasuki sel tanaman tanpa merusaknya . Pendekatan lain untuk meningkatkan injeksi sebagai metode transformasi sel tanaman berfokus pada efisiensi dengan gen disuntikkan diintegrasikan ke dalam genom tanaman . Salah satu cara untuk meningkatkan ini adalah untuk menyuntikkan protein khusus bersama dengan urutan gen target yang mendukung integrasi stabil gen 'asing' ke dalam genom tanaman dan diproduksi oleh Agrobacterium tumefaciens ( agroinjeksi ) . Tanah ini bakteri secara alami mampu memasukkan gen sendiri ke dalam genom tanaman .

Hasil : Beberapa proyek penelitian biosafety telah melihat injeksi pada tanaman dan telah berhasil ditetapkan sebagai metode transformasi baru. Namun, itu tidak mungkin dalam semua kasus untuk mencapai efisiensi transformasi yang tinggi . Selain itu, hal itu mungkin untuk meregenerasi sel-sel tanaman transgenik menjadi tanaman setelah injeksi hanya ketika gen penanda ( resistensi kanamisin ) telah diperkenalkan . Untuk saat kemudian , bahkan injeksi tidak bisa tanpa gen penanda .

Sebaliknya , agroinjeksi tidak diperlukan untuk menghasilkan tanaman transgenik menggunakan injeksi . Pada prinsipnya , ini membuka kemungkinan menggunakan metode ini secara komersial dengan biaya rendah .

Injeksi dalam sel tanaman . ( A , B ) REM foto konvensional ( A ) dan baru dikembangkan pipet kaca ( B ) . ( C ) protein Fluorescent setelah injeksi ke dalam inti sel tanaman. ( DF ) Injeksi ke dalam kloroplas ( organel dalam sel tanaman ) , Klorofil ( D ) dan GFP fluoresensi ( E ) dan tumpang tindih dari dua ( F ) . Lebih dari Safety GMO

MIKROINJEKSI Injeksi adalah metode yang dapat diandalkan untuk memberikan molekul asing langsung (organel, kromosom, DNA, RNA, protein, obat-obatan, dll) ke protoplas melalui sebuah kaca tipis kapiler dan mikromanipulator. Untuk sistem injeksi yang efisien dengan Helianthus protoplas hipokotil , kami menggabungkan sistem kultur protoplas sederhana dan efisien dengan prosedur canggih injeksi untuk meminimalkan dampak negatif terhadap kelangsungan hidup sel dan regenerasi mereka. Untuk injeksi lucifer kuning, DNA atau kromosom , protoplas diimobilisasi dengan menyertakannya dalam lapisan tipis ( 120 m ) dari 1 % agarose dalam media pertumbuhan KMAR600 . Dengan metode ini sekitar 40 protoplas dapat disuntikkan per jam; dalam protoplas microinjected , pembagian frekuensi sel dan produksi microcalli naik ke 70 % . Untuk frekuensi transformasi , hanya bukti visual dicapai . Verifikasi genetik dan molekul transformasi dan transfer gen kromosom - dimediasi sedang berlangsung . Aspek penting lainnya adalah bahwa prosedur injeksi harus sesingkat mungkin untuk menghindari dehidrasi sel dan denaturasi protein . Prosedur injeksi mapan membuka perspektif baru pada penelitian bunga matahari dasar serta prosedur transformasi genetik . PENDAHULUAN Penerapan metode bioteknologi untuk gen introgresi ke genotipe bunga matahari elit adalah kepentingan tinggi untuk program pemuliaan yang bertujuan untuk menghasilkan genotipe unggul untuk mendapatkan hasil stabilisasi ( Schnabl et al . 2002 ) . Hasil signifikan lebih tinggi pada bunga matahari dapat dicapai dengan memperbesar resistensi terhadap penyakit dan stres lainnya pada tingkat heterosis yang ada ( Gulya et al . 1997 , Seiler & Rieseberg 1997) . Injeksi selular adalah metode yang dapat diandalkan untuk memberikan molekul asing langsung seperti kromosom , DNA , RNA , protein , obat-obatan , dll , atau organel , kromosom dan transfer inti ke protoplas melalui kaca tipis kapiler dan mikromanipulator . Ini juga merupakan teknik transformasi yang efisien ( Griesbach 1987; . Vos et al, 1999 ) . Untuk mendapatkan wawasan mengenai dinamika mikromanipulasi di Helianthus protoplas , kami telah melakukan penelitian untuk mengoptimalkan beberapa parameter injeksi , untuk memungkinkan manipulasi genom melalui transfer gen langsung melalui fragmen DNA , kromosom metafase atau micronuclei . Sistem dasar prosedur injeksi telah dijelaskan oleh Vos et al . (1999 ) . Protoplas Hypokotyl bunga matahari ( Helianthus annuus L. ) , genotipe sinar matahari yang menunjukkan streaming yang baik sitoplasma , dengan sitoplasma padat , setidaknya 40 m dengan diameter , bentuk melingkar dan tidak ada kerusakan membran terlihat digunakan . Protoplas baru diisolasi dikultur semalam di KMAR600 medium cair ( Binsfeld et al . 1999) . Setelah 24 jam sel-sel penting ditemukan oleh sentrifugasi dan dicampur dengan volume yang sama dari agarose ( 2 % ) dan tertanam dalam monolayer ( 120 m ) sebagai menunjukkan pada Gambar 1 . Untuk injeksi , coverslip tersebut telah dihapus dari dipadatkan agarosa monolayer , dan ditutup dengan setetes media Kmar . Injeksi dilakukan di bawah cahaya terang tapi lapangan untuk injeksi lucifer kuning, fluoresensi iluminasi diterapkan . Setelah injeksi, protoplas dikultur menurut Binsfeld (1999 ) . Osmolaritas telah disesuaikan menjadi 600 mOsmol kg H2O - 1 dengan mannitol . Untuk pengembangan microcallus baik , bersamaan mingguan dengan perubahan dari budaya media , osmolaritas berkurang dalam langkah 100 mOsmol kg H2O - 1 . Suplementasi zat pengatur tumbuh dilakukan seperti yang dijelaskan oleh Wingender et al . ( 1996) . HASIL DAN PEMBAHASAN Teknik injeksi telah banyak digunakan dalam sel tanaman penelitian , tetapi dalam banyak

kasus teknik ini menjadi tidak layak karena melelahkan set- up , memakan waktu manipulasi dan metode manipulasi mahal dan canggih (Gambar 2A ) . Salah satu faktor penting untuk manipulasi sel mudah adalah ukuran sel . Dalam percobaan kami, kami menemukan bahwa protoplas dipilih mulai 40-50 pM jauh meningkatkan efisiensi dan kelincahan manipulasi sel . Dalam pengertian ini , sekitar 40 protoplas bisa disuntikkan per jam (Gambar 2C ) . Aspek penting lainnya untuk pabrik protoplas injeksi efisien adalah imobilisasi mereka dalam satu pesawat (dalam monolayer ) . Oleh sel tertanam hanya satu mikromanipulator diperlukan , karena itu dipanaskan ( 30-35 C ) drop - gel agarosa rendah ditambahkan ke protoplas dan hati-hati jatuh di tengah-tengah cawan petri dan ditutup dengan coverslip (Gambar 1 ) , untuk membentuk lapisan tipis yang homogen . Persiapan itu kemudian ditempatkan pada suhu 4 C selama 1 menit untuk memantapkan agarosa dan melumpuhkan protoplas . The terpilih Helianthus Protoplas bergerak dengan kepadatan bervariasi 10 sampai 50 protoplasts/mm2 , dan ditutupi dengan Kmar medium kultur cair. Setelah dua minggu dalam budaya , efisiensi anyaman rata-rata dan produksi microcalli dalam percobaan yang berbeda pergi hingga 70 % (Gambar 2E ) . Kesesuaian sel untuk injeksi dihukum secara visual atas dasar adanya helai sitoplasma dan sitoplasma streaming. Tingkat kelangsungan hidup terbaik dari sel disuntikkan dicapai 30 sampai 60 jam setelah isolasi , ketika mereka telah direformasi sebagian dinding sel mereka. Pemindahan kromosom (Gambar 2B ) atau micronuclei harus dilakukan ketika sel mengalami divisi pertama. Selama operasi injeksi , air suling ditambahkan untuk menggantikan air yang menguap dari medium kultur . Prosedur ini adalah pentingnya untuk menghindari kerusakan yang cepat dan ireversibel disebabkan oleh dehidrasi dari monolayer agarosa dan kerusakan masing-masing sel tertanam (Gambar 2D ) . Sehubungan dengan kapiler injeksi, mereka harus cukup tajam untuk menembus dinding sel dengan mudah dan menghindari kerusakan membran . Faktor lain yang penting diamati dalam percobaan kami adalah bahwa ujung kapiler harus lebih pendek dari 4 mm , karena tips yang lagi cenderung terlalu fleksibel untuk menembus langsung monolayer agarosa dan posisi yang ditujukan dalam sel . Dalam percobaan kami, kami juga mencatat bahwa suntikan dengan hati-hati lambat cenderung lebih protektif untuk sel maka suntikan cepat dan pulsive . Karena tekanan internal yang secara langsung tergantung pada volume disuntikkan, ini merupakan faktor penting untuk menghindari kerusakan sel. Beberapa laporan menunjukkan bahwa untuk sel-sel mulai 40-50 m dengan diameter, volume disuntikkan dapat berkisar 0,014 pl dan mewakili persentase volume sel dari 1 sampai 20% (Vos et al. 1999). Pemahaman faktor-faktor yang dibahas mengizinkan kita untuk mengembangkan sistem injeksi yang efisien untuk berbagai macam molekul atau organel di Helianthus protoplas dipilih, dapat dibuktikan dengan tes vitalitas sel dengan suntikan lucifer kuning. Berdasarkan vitalitas sel dan tingkat kelangsungan hidup lebih dari 75% setelah injeksi, kita menilai prosedur ini sesuai untuk sistem manipulasi yang efisien. KESIMPULAN Penekanan dari artikel ini adalah untuk menganalisis beberapa faktor yang memainkan peranan penting dalam prosedur injeksi sel tumbuhan , yang telah perlahan-lahan menjadi lebih dan lebih penting dalam beberapa percobaan sel tanaman . Prosedur ini memungkinkan pengenalan bentuk apa pun yang hampir molekul , pada saat tertentu dari siklus sel . Ada banyak sistem yang baik untuk transformasi tanaman yang lebih tinggi , tapi injeksi masih memiliki keuntungan menjadi pendekatan yang lebih langsung dapat mentransfer molekul besar atau organel di dinding sel , dan membuka perspektif baru untuk manipulasi genetik yang berguna , misalnya kromosom , organel atau langsung gen memberikan teknik ke dalam sel reseptor . Dalam percobaan kami protoplas Helianthus ditoleransi injeksi sangat baik , dengan postinjection cepat pulih dari proses vital . Dengan hasil tersebut , tampak jelas bahwa injeksi merupakan alat yang sangat baik yang sangat memperluas kemungkinan kita

untuk mendapatkan wawasan tentang transformasi melalui gen langsung atau manipulasi genom dan juga interaksi studi genetik dan fisiologis .

MIKROINJEKSI NEW ransformasi tanaman

Telah ada banyak kegembiraan dalam beberapa tahun terakhir tentang kemampuan kita untuk insinyur genetik tanaman menggunakan teknik baru isolasi gen dan penyisipan . Dipasangkan dengan metodologi standar kultur jaringan tanaman dan regenerasi tanaman , teknik-teknik baru memungkinkan kita untuk membangun tanaman transgenik yang mengandung dan mengekspresikan tunggal , gen yang jelas dari sumber manapun - mikroba , binatang, atau jenis tanaman lainnya . Tanaman transgenik , biasanya normal dalam penampilan dan karakter , berbeda dari orangtua hanya berkenaan dengan fungsi dan pengaruh gen yang disisipkan .

Ini rekayasa genetika diarahkan tanaman mensyaratkan bahwa gen bunga yang tersedia, bahwa gen diperkenalkan ke dalam sel tanaman mampu regenerasi menjadi tanaman utuh , dan bahwa gen disertai dengan penanda dipilih sehingga sel tanaman berubah dapat diisolasi dari populasi besar untransformed , sel-sel normal . Akhirnya , sel tumbuhan berubah harus mempertahankan kapasitasnya untuk regenerasi . Spesies tertentu seperti tembakau dan tanaman regenerasi petunia cukup mudah , membuat tanaman transgenik mudah didapat . Meskipun jagung, kedelai , dan gandum - tanaman pertanian utama Illinois dan Midwest lebih bandel untuk manipulasi , kemajuan sedang dibuat menuju transformasi rutin dan regenerasi keturunan transgenik spesies ini . Beberapa teknik dapat memperkenalkan gen ke dalam sel tanaman . Mungkin metode yang paling sukses melibatkan patogen bakteri Agrobacterium tumefaciens , yang memiliki kemampuan bawaan untuk mentransfer DNA ke sel tanaman . Di alam , transfer ini menyebabkan pembentukan tumor tanaman ( crown galls ) pada tempat terjadinya infeksi . Biologi molekuler , bagaimanapun, telah dilucuti bakteri ini dan dibangun strain peliharaan yang tidak lagi menyebabkan tumor tetapi mentransfer DNA yang menarik bagi sel tanaman . Kerugian utama dari sistem Agrobacterium sangat efisien adalah bahwa hal itu tidak bekerja dengan semua jenis tanaman, terutama sereal .

Teknik lainnya menggunakan bahan fisik atau kimia untuk mentransfer DNA ke dalam sel tanaman . Protoplas , sel-sel tanaman yang telah dilucuti dari dinding sel pelindung mereka , akan mengambil DNA murni ketika diobati dengan agen membran - aktif tertentu atau dengan elektroporasi , denyut nadi cepat dari tegangan tinggi arus searah . Setelah masuk sel , DNA terintegrasi dan gen asing akan mengungkapkan . Kedua teknik sangat tergantung pada pengembangan sistem protoplas yang mempertahankan kapasitas untuk menumbuhkan tanaman utuh. Jagung transgenik, padi , dan kedelai telah diproduksi dengan teknik ini , terutama elektroporasi . Tingkat keberhasilan , bagaimanapun, adalah rendah, dan teknik tidak terlalu direproduksi .

DNA juga dapat microinjected ke dalam sel tanaman target menggunakan jarum kaca yang sangat tipis dengan metode yang mirip dengan yang digunakan dengan hewan . Injeksi , bagaimanapun, telah menghasilkan hanya beberapa tanaman transgenik . Teknik ini sulit, teknis sulit , dan terbatas pada jumlah sel sebenarnya disuntikkan . Biolistics , metode baru , melibatkan mempercepat partikel yang sangat kecil dilapisi tungsten atau emas dengan DNA ke dalam sel menggunakan pulsa listrik, tekanan udara , atau mesiu perkusi . Sebagai partikel melewati sel , DNA larut dan menjadi bebas untuk mengintegrasikan ke dalam genom tanaman - sel . Teknik ini tidak mungkin benar-benar bekerja cukup baik dan telah menjadi , bersama dengan elektroporasi , salah satu metodologi pilihan . Biolistics memiliki keuntungan yang berlaku untuk seluruh sel dalam suspensi atau jaringan tanaman utuh atau diiris . Misalnya , meristem tanaman atau jaringan yang mampu regenerasi dapat ditargetkan secara langsung . Tidak seperti transformasi atau elektroporasi , teknik ini tidak memerlukan protoplas atau bahkan isolasi - sel tunggal . Menggunakan biolistics , tanaman jagung dan kedelai transgenik telah diproduksi yang berisi diwariskan salinan gen yang disisipkan . Hanya beberapa gen dari agronomi penting telah dimasukkan ke tanaman : gen memberikan perlawanan terhadap serangga dan virus tertentu dan juga mereka berunding toleransi terhadap herbisida berspektrum luas . Hasil yang terakhir peningkatan spesifisitas herbisida , yang memungkinkan petani untuk menggunakan lebih efektif , bahan kimia lingkungan aman . Baru-baru ini , gen telah diperkenalkan ke tomat bahwa penundaan overripening dan memperpanjang umur simpan buah . Ciri-ciri lain yang menarik termasuk yang terkait dengan kualitas gabah . Gen untuk meningkatkan kandungan asam amino seperti lisin , metionin , dan triptofan dalam biji akan meningkatkan nilai gizi , sehingga mengurangi kebutuhan untuk mengubah biji-bijian dengan suplemen pakan mahal . Semua sifat dibahas di sini berhubungan dengan ekspresi gen tunggal. Tapi banyak karakter agronomi penting seperti hasil dan penginapan tidak dipahami dengan baik dan dikendalikan oleh banyak gen . Memanipulasi sifat poligenik tersebut dengan rekayasa genetika akan memerlukan penelitian lebih lanjut dan pengembangan teknik untuk mengisolasi ,

merekonstruksi , dan mentransfer blok kompleks gen . Penelitian yang luas dan menjanjikan sedang dilakukan tentang aditif tahan penyakit dan toleransi stres , sifat poligenik penting . Rekayasa genetika tanaman sehingga bergerak perlahan tapi pasti dari bangku laboratorium ke lapangan .

Dalam perkembangannya, biologi molekuler kini telah diterapkan dalam budidaya perikanan. Beberapa permasalahan perikanan terutama dalam budidaya ikan dapat teratasi dengan bioteknologi molekuler, salah satu teknologi tersebut adalah Teknologi Transgenik . Transgenik terdiri dari kata trans yang berarti pindah dan gen yang berarti pembawa sifat. Jadi transgenik adalah memindahkan gen dari satu makhluk hidup kemakhluk hidup lainnya, baik dari satu hewan ke hewan lainnya atau dari satu tanaman ketanaman lainnya, atau dari gen hewan ke tanaman dan sebaliknya. Transgenik secara definisi adalah The Use of Gene Manipulation to Permanently Modify the Cell or Germ Cells of Organism (Penggunaan Manipulasi Gen untuk Mengadakan Perubahan yang tetap pada Sel Makhluk Hidup). Transgenik atau teknologi DNA rekombinan (rDNA) merupakan rekayasa genetik yang memungkinkan kombinasi ulang (rekombinasi) atau penggabungan ulang gen dari sumber yang berbeda secara in vitro (Karim,2002). Dalam proses bioteknologi modern, sifat-sifat dari suatu mahluk hidup dirubah dengan cara memindahkan gen-gen dari satu spesies mahluk hidup ke spesies yang lain, ataupun memodifikasi gen-gen dalam satu spesies. Organisme yang direkayasa secara genetika disebut Genetically Modified Organism (GMO), atau disebut Organisme Transgenik . II. TRANSGENIK MIKROINJEKSI Teknologi transgenik dengan mikroinjeksi pada ikan dilakukan melalui mikrophile yang terdapat pada chorion telur (oosit). Metode ini terdiri dari beberapa tahap, yaitu

3.1. Persiapan Gen

Pertama-tama dipersiapkan gen yang akan ditranfer. Persiapan ini dimulai dari isolasi DNA, yang dapat diisolasi dari darah, daging, sirip ataupun sisik. Misalnya dari sisik dapat dilakukan dengan prosedur sebagai berikut :

A. Isolasi dan Purifikasi DNA

Sampel dari jaringan ikan ditimbang sebanyak 25-50 mg lalu dicacah menggunakan skapel, kemudian dimasukkan ke dalam tabung evendorf ukuran 2 ml. 200 l Tissue Lysis Buffer dan 40 l Proteinase K ditambahkan ke dalam tabung yang berisi sampel jaringan, kemudian dicampur dengan segera dan diinkubasi pada suhu 55 oC selama 1 jam (atau sampai jaringan hancur dengan sempurna). 200 l Binding Buffer ditambahkan lagi ke dalam tabung lalu dihomogenkan dengan segera, kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu 70 oC. 100 l Isopropanol ditambahkan ke dalam tabung, kemudian dihomogenkan.

Memindahkan sampel ke dalam high filter tube yang telah dipasangkan dengan collection tube. Sampel disentrifuge selama 1 menit dengan kecepatan 9200 rpm. Membuang collection tube, menambahkan 500 l Inhibitor Removal Buffer, kemudian disentrifuge selama 1 menit pada kecepatan 9200 rpm. Membuang collection tube, menambahkan 500 l Wash Buffer, kemudian disentrifuge selama 1 menit pada kecepatan 9200 rpm. Membuang collection tube, menambahkan 500 l Wash Buffer, kemudian disentrifuge selama 1 menit pada kecepatan 9200 rpm. Membuang supernatan dari collection tube, kemudian disentrifuge selama 10 detik dengan kecepatan 14.000 rpm. Membuang collection tube, memasangkan tabung evendorf baru pada high filter tube. 200 l Elution Buffer (yang telah diinkubasi hingga suhu 70 oC) ditambahkan ke dalam high filter tube, kemudian disentrifuge selama 1 menit dengan kecepatan 9200 rpm. Membuang high filter tube, menambahkan 140 l Isopropanol, kemudian disentrifuge selama 30 menit dengan kecepatan 14.000 rpm. Membuang supernatan, menambahkan 66,7 l Et-OH (Alkoho l 70%) dingin, kemudian disentrifuge selama 10 menit dengan kecepatan 14.000 rpm. Membuang supernatan (pelet tidak boleh ikut terbuang), kemudian dianginanginkan hingga pelet mengering (kurang lebih selama 12 jam). 20 l TE ditambahkan ke dalam tabung, dan DNA to tal siap diproses lebih lanjut.

B. Isolasi Promotor (Restriksi DNA). Mencari sekuen promoter region gen pengkode, tergantung pada jenis gen yang akan ditranfer, misal gen GH ikan jenis lain yang telah dilaporkan sebelumnya pada gene bank (Nasional Center for Biotechnology Information-NCBI).

Mencari dan menentukan enzim restriksi yang sesuai untuk memotong promoter region gen pengkode, misalnya untuk GH adalah BamHl, Ball , Sfil, Sbal, dan EcoRl. Hasil dari pemotongan dengan enzim restriksi kemudian dielektroforesis dan dibandingkan berat molekulnya dengan DNA marker. Pita (band) yang sesuai dengan DNA marker untuk promotor gen pengkode dipisahkan dengan cara memotong gel yang berisi band tersebut kemudian diisolasi dari gel dengan menggunakan DNA elution kit. Diperoleh suspect DNA promotor gen pengkode, misalnya promo tor gen pengkode GH.

Secara skematis pemotongan (restriksi) gen yang terjadi dapat dilihat pada Gambar 1 di bawah ini.

3.2. Koleksi Telur, Sperma & Fertilisasi

Keleksi telur dan sperma dapat dilakukan melalui pemijahan buatan (induced breeding) dengan menggunakan hormon. Jenis hormon yang dapat digunakan diantaranya adalah GnRHa, LHRHa, Ovaprim (GnRHa ikan Salmon + dopamin), Ovopel (GnRHa mamalia + dopamin). Selain itu dapat pula melalui penyuntikan dengan ekstrak kelenjar hipofisa ikan, misal Carp Pituita ry Gland (Kelenjar Hipofisa Ikan Mas) yang dikenal dengan nama tekhnik hipofisasi. Sebelum dilakukan fertilisasi, terlebih dahulu diperiksa motilitas sperma. Sperm a ikan akan bergerak setelah kontak dengan air. Sperma yang baik mempunyai daya gerak atau motil selama lebih kurang 30 (tiga puluh) detik. Motilitas sperma ini viabilitas telur dapat dipertahankan apabila disimpan dalam larutan Ringer pada suhu 4 oC, dan biasanya selama 2 (dua) jam dari waktu fertilisasi. Adapun komposisi larutan Ringer ini adalah : 6,5 gram NaCl, 0,25 gram KCl, 0,2 gram NaHCO3, 0,4 gram CaCl2-2H2O yang dilarutkan dalam 1 (satu) liter aquabid est. Bagaimana bentuk struktur telur dapat dilihat pada Gambar 2.

Setelah telur dan sperma dikumpulkan atau dikoleksi, maka dilakukan fertilisasi, yaitu dengan menyatukan sperma dan ovum (telur) dalam suatu wadah dan kemudian diaduk dengan bulu ayam selama kira-kira satu menit. Setelah itu telur atau Ova siap untuk dilakukan transfer gen secara mikroinjeksi.

3.3. Injeksi Gen ke Dalam Telur

Mikroinjeksi gen pada telur dapat dilakukan secara manual ataupun dengan mengg unakan mesin yang diseput dengan Gen Pusher . Secara skematis photo alat tersebut dapat dilihat pada Gambar 3 di bawah ini.

Gambar 3. Skematis Gen Pusher untuk Mikroinjeksi Telur.

Dalam transgenik mikroinjeksi, penginjeksian gen dapat dilakukan pada dua tempat,yaitu : 1. Pada pronukleus, apakah pronukleus jantan atau beti na (Gambar 4). 2. Pada zygot, yaitu pada blastodisnya (Gambar 5).

ambar 4. Metode Mikroinjeksi Gen pada Pronukleus Telur (Zygot) Ikan (Pinkert, 1994)

Gambar 5. Mitode Mikroinjeksi Gen pada Telur (Zygot) Ikan (Grabher dan Wittbrodt, 2007)

Pada ikan injeksi atau trans gen dilakukan pada mikropil, sebagai contoh diam eter lubang mikropil telur ikan salmon 17 m, dalamnya 4 m, dan diameter mikropil canalnya 1,2 m (Riehl, 1980 dalam Hew dan Fletcher ( 2003). Setelah gen diinjeksikan, maka telur-telur tersebut di inkubasi untuk ditetaskan, kemudian dilakukan pula perawatan larva sampai menjadi benih dan seterusnya sampai berreproduksi kembali.

3.4. Pemeriksaan/Pengujian

Sebelum ikan transgenik tersebut dirilis, maka terlebih dahulu dilakukan pengujian atau pemeriksaan baik secara genetik maupun fenotip. Secara genotip bertujuan apakah gen yang ditransfer atau disisipkan tersebut sudah benar-benar menyambung sesuai dengan yang diinginkan. Pemeriksaan ada tidaknya tran sgen yang terintegrasi di dalam genom dianalisis dengan southern blot. Untuk ekspresi transgen diperiksa dengan metoda northern blot. Ikan transgenik yang berkembang dari zigot tersebut dikenal sebagai Founders dan bersifat hemizygote. Untuk perbanyakan ikan transgenik, founders fish ini kemudian dikawinkan dengan ikan non transgenik. Untuk mendapatkan ikan transgenik yang homozygote, ikan transgenik hemizygote dikawinkan antar sesamanya. Ikan transgenik yang homozygote ini kemudian dipelajari fenotifnya dengan mengamati pertumbuhan, konversi pakan dan bentukbentuk morfologinya (ada tidaknya kelainan pada organ). Sebagai contoh pada Tabel 1 dibawah ini terlihat resistensi gen asing pada beberapa jenis ikan trangenik, Tabel 2 dan 3 adalah penurunan sipat induk ke turunannya F1 dan F2, serta Gambar 6 per bandingan pertumbuhan ikan Salmon transgenik dengan ikan Salmon non trangenik.

PERALATAN DAN PROSEDUR peralatan

Tabel Injection . Sebuah meja yang berat dipisahkan dari getaran yang kuat dan arus udara biasanya cukup . Jika getaran adalah masalah , lempengan logam berat ditempatkan pada satu set kecil, sebagian meningkat , ban ban dalam dapat membantu .

Terbalik mikroskop DIC . Sebuah Axiovert Zeiss , atau setara Nikon Olympus atau instrumen , dilengkapi dengan standar 5X dan 40X tujuan Nomarski ( perendaman non-migas ) sudah cukup . Atas optik garis tidak diperlukan . Mikroskop harus memiliki datar, bebas geser tahap meluncur dengan rotasi berpusat .

Mikromanipulator . Narashige , Leitz , dan Zeiss membuat manipulator yang cukup yang dapat menampung dan posisi pemegang jarum . Ideal manipulator akan memiliki mobilitas baik di X ( depan dan belakang ) , Y ( sisi ke sisi ) , dan Z ( vertikal ) sumbu , dan memungkinkan mudah perubahan sudut jarum dan posisi .

Sistem injeksi bertekanan dengan pemegang jarum . Jarum suntik ditempatkan pada dudukan dengan kerah ketat segel , yang kemudian dipasang pipa plastik ke sumber tekanan diatur . Pressure regulator terpasang ke tangki gas nitrogen . Sebuah Narishige atau Eppendorf injeksi pengontrol dilengkapi dengan saklar pedal kaki adalah bagus tapi agak mahal pilihan . Tritech ( Los Angeles , CA ) membuat sistem lebih murah . Mello dkk . ( 1991 ) menggambarkan suatu sistem buatan sendiri.

Jarum penarik . Sutter instrumen P - 87 dan P - 97 penarik microelectrode sangat baik untuk membuat jarum sangat konsisten bentuk dan ukuran tertentu, meskipun berbagai penarik microelectrode lainnya dapat digunakan . Beberapa laboratorium dapat dengan mudah berbagi penarik tunggal. bahan

Injeksi jarum . Tarik jarum menggunakan kaca borosilikat kapiler ( 1.0mm OD , 0,75 mm ID ) dengan filamen kaca internal yang baik , yang memungkinkan penimbunan oleh kapiler (

misalnya , FLG10 dari Dagan Corp , Minneapolis MN , atau setara dari Dunia Presisi Inst , Sarasota FL . atau Clark Inst . , Reading , Inggris ) . Baik jarum lancip cepat ( ~ 5-7 mm ) ke titik yang tajam tetapi terbuka ( 1 mm ) , meskipun setiap pengguna dapat mengembangkan preferensi yang unik . Untuk penarik jarum yang menghasilkan ujung tertutup , membuka tip dengan lembut menekan jarum di slide kaca , atau dengan memindahkan jarum terhadap puing-puing di pad agarosa di bawah mikroskop ( lihat di bawah ) .

Injeksi bantalan . Bawa 2 % agarose dalam air mendidih , aduk , dan tempat di blok panas . Menggunakan rusak pipet atau cut-off P200 tip , menempatkan drop ( ~ 100ul ) panas agarosa ke sebuah # 1 , coverslip kaca 50X22 mm . Cepat menempatkan coverslip kedua pada drop dan ringan sentuh . Atau , menempatkan beberapa tetes pada coverslip pertama, yang harus melakukan penggabungan dan sebagian menutupi permukaan setelah menambahkan coverslip kedua, bantalan tersebut dapat digunakan untuk beberapa putaran injeksi ( Mello and Fire , 1995) . Setelah agarosa dipadatkan , kupas atau slide coverslips terpisah , dan panggang coverslip - pad dalam oven vakum pada 80 C selama 1 h untuk semalam . Atau , bantalan injeksi dapat udara kering dalam semalam , namun cacing tidak menempel dengan baik di iklim lembab . Panggang atau bahkan re - bake bantalan sebelum digunakan jika kepatuhan cacing miskin kronis . Konsentrasi agarosa tinggi ( 2,5-3 % ) dapat meningkatkan adhesi cacing tetapi juga akan meningkatkan tingkat mereka mengering ( lihat di bawah ) .

Minyak Injection . Seri 700 minyak Halocarbon ( Halocarbon Produk , River Edge , NJ ) . Atau , Heavy Oil parafin dapat digunakan ( BDH Chemicals , Poole , Inggris; Gallard Schlesinger , Carle Place , NY ) .

Worm memilih. Sebuah pick worm dengan sangat datar , sempit , berbentuk panah kepala yang terbaik .

Pemulihan penyangga dan penyangga M9 . Pemulihan penyangga : HEPES 5mm pH 7,2 , 3 mM CaCl2 , MgCl2 3 mM , 66 mM NaCl , 2,4 mM KCl , 4 % Glukosa ( b / v ) . Standar M9 Buffer .

Worms . Kenyang, muda untuk setengah baya ( 1 hari tua ) hermafrodit gravid dengan baris penuh tapi satu telur terbaik.

Jarum loading pipet . Tempatkan standar kaca pipet kapiler 10ul atas api sampai melembutkan , kemudian keluarkan dari api dan dengan cepat menarik keluar dan istirahat untuk menghasilkan dua ditarik keluar pipet . Gunakan corong dan tabung untuk mendepak solusi . Atau, pipettor p2 dapat digunakan untuk memuat jarum . metode injeksi

Isi pipet jarum loading oleh kapiler dengan 1 ul campuran injeksi DNA .

Masukkan ujung pipet melalui bagian belakang jarum suntik , dan mengusir campuran injeksi ke filamen internal jarum . Menonton untuk melihat bahwa solusi injeksi ditarik ke ujung jarum . Beberapa jarum suntik dapat disiapkan dan disimpan oleh beristirahat mereka di mengangkat tanah liat atau pegunungan lilin dalam kotak lembab dengan tutupnya .

Tempatkan jarum dimuat ke pemegang jarum dan mount di manipulator .

Posisikan jarum sehingga ujungnya berada di tengah lapangan mikroskop pandang menggunakan tujuan 5X . Setelah diposisikan , bergerak ke atas jarum ( menggunakan kontrol Z axis) sehingga sedikit tidak fokus .

Tempatkan setetes minyak pada pad injeksi dan tempat bawah mikroskop binokuler di atas pelat penutup Petri kecil .

Scoop satu sampai beberapa cacing dari daerah bebas bakteri dari piring NGM dengan memilih telanjang dan transfer ke drop minyak. Hindari kontak dengan kepala cacing . Atau , pertama kali menyentuh cacing memilih untuk minyak , dan menggunakan tetesan minyak untuk mengambil hewan dari daerah bebas bakteri . Idenya adalah untuk meminimalkan perpindahan bakteri ke pad .

Api kemudian dinginkan cacing memilih dan menggunakannya untuk posisi cacing dalam penurunan minyak , dan dengan lembut mendorong mereka turun ke pad . Orient cacing dalam baris dengan sisi ventral mereka menghadap arah yang sama ( berlawanan arah jarum ) . Jika cacing gagal untuk mematuhi pad , pindah ke lokasi baru atau menggosok tubuh dengan memilih untuk menghapus air atau tetesan bakteri . Jika kepatuhan masih masalah re -

bake bantalan atau menggunakan lebih tebal atau lebih tinggi konsentrasi agarosa bantalan ( lihat di atas ) .