PRACTICA # 4

OBTENCIN DE ACIDO CITRICO A PARTIR DE Aspergillus niger EN CULTIVO SUMERGIDO

Laboratorio de Biosntesis Microbiana 1938 2010-2

Objetivo Genera
Bsqueda de patrones de comportamiento y variaciones durante un bioproceso.

Inve!ti"ar
1. 2. 3. *. /. 2. 5. sos de! "cido ctrico #$u% es un carbo&idrato reductor' (%cnicas para cuanti)icar carbo&idratos +undamento de !a t%cnica de ,-. Microor0anismos uti!i1ados en !a industria para producir "cido ctrico 3roceso industria! para !a obtenci4n de "cido ctrico por microor0anismos #3or qu% 6sper0i!!us ni0er pre)iere metabo!i1ar !a 0!ucosa m"s que !a !actosa para producir "c. 7trico'

Me#io! #e C$ tivo
2 1 8 (ubo de ensayo de 1281/0 mm. 7on 10 m! de a0ar .abouroud inc!inado est%ri! (ubo de ensayo de 1281/0 mm. 7on 5 m! de so!uci4n sa!ina isot4nica y (9een 80 a! 0.2: est%ri! Matra1 er!enmeyer 2/0 m! con 100 m! de medio de producci4n de ctrico con sacarosa.

Di $%ente!& !o $'ione! % rea'tivo! 60ua desti!ada ?idr48ido de sodio 0.1.o!uci4n sa!ina isot4nica @ (9een 80 a! 0.2: METODOLOG(A )* Pre+ara'i,n #e in,'$ o Aspergillus niger sobre productora de "cido ctrico =cepa 2000> conservada por m%todo de subcu!tivo en a0ar .abouroud a /A7. -* .er/enta'i,n ,e acuerdo a !a tab!a rotu!ar !os matraces. 6 !os tubos con crecimiento de 6. ni0er adicionar 5 m! de so!uci4n sa!ina isot4nica @ (9een 80. 60itar vi0orosamente &asta desprender !as esporas =ayudarse con e! asa bacterio!40ica> (omar con pipeta est%ri! 1 m! de !a suspensi4n de esporas obtenida e inocu!ar cuatro matraces Br!enmeyer con 100 m! de medio de producci4n de "cido ctrico. La mitad de !os matraces se incuban en reposo en !a 0aveta y !a mitad a 28A7 y 1/0 rpm< uti!i1ando una incubadora con a0itaci4n orbita! durante 1 semanas apro8imadamente. ;cido 3</-dinitrosa!ici!ico =,-.> +eno)ta!ena so!uci4n a!co&4!ica a! 1:

(ab!a 1. (iempos de muestreo durante !a obtenci4n de "cido ctrico por 6. ni0er. ,asCa0itaci4n 0 0 128 &rs 5

,as Creposo

0* Deter/ina'ion a1 Deter/ina'i,n #e +2 +i!trar cada uno de !os matraces. Medir e! p? de! sobrenadante< uti!i1ando un potenci4metro ca!ibrado.

b1 A'i#e3 Tota Bsta determinaci4n se rea!i1a por dup!icado. (omar * m! de! sobrenadante y co!ocar!os en un matra1 Br!enmeyer de 2/0 m! conteniendo 20 m! de a0ua desti!ada. 60re0ar 2 0otas de +eno)ta!ena a! 1: (itu!ar con -aD? 0.1-

'1 Con'entra'i,n #e Carbo4i#rato! Eea!i1ar di!uciones de cada muestra co!ectada y repartida de acuerdo a !a tab!a 2 que a continuaci4n se presenta. SE DERBERA TENER PRECAUCIN DE 2OMEGENI5AR PER.ECTAMENTE LA SOLUCION ANTES DE TOMAR LA MUESTRA PARA DILUIR AL IGUAL 6UE DESPUES DE DILUIRLA* ,e cada di!uci4n rea!i1ar por dup!icado !a t%cnica de cuanti)icaci4n de a1cares reductores por e! m%todo de! "cido 3</-dinitrosa!ici!ico =,-.>

Tab a -* ,i!uciones a rea!i1ar para determinar !a concentraci4n de carbo&idratos de cada muestra co!ectada durante !a )ermentaci4n. +ec&a=das> (iempo =&oras> ,i!uci4n 0 0 1C*0 5 128 1C100

CUANTI.ICACION DE CARBO2IDRATOS REDUCTORES POR LA TECNICA DEL ACIDO -&07 DINITROSALICILICO 8DNS1 (omar 0./ m! de cada di!uci4n y trans)erir!os a un se0undo tubo. 60re0ar 0./ m! de reactivo de ,-. a cada tubo 60itar !os tubos y tapar con pape! a!uminio Fncubar / min. en baGo Mara en ebu!!ici4n =introducir todos !os tubos a! mismo tiempo> .acar todos !os tubos a! mismo tiempo. 60re0ar / m! de a0ua desti!ada y Me1c!ar Leer !a absorbancia espectro)otom%tricamente a /*0 nm Dbtener !a concentraci4n de cada di!uci4n de !a muestra interpo!ando !as absorbancias obtenidas en !a curva est"ndar Eea!i1ar un b!anco reactivo con a0ua

CALCULO DE RESULTADOS Con!$/o #e C2O Tie/+o 84r!1 9C2O: .a'tor #e 9C2O:rea

8/";/L1 < )=>

#i $'i,n

8/";/L1

DISCUSIN DE RESULTADOS 7on base en !os resu!tados< par"metros ca!cu!ados e investi0aci4n bib!io0r")ica ana!i1ar para cada tipo de incubaci4n cu"!es )ueron !as meHores condiciones para !a obtenci4n de "cido ctrico de 6. ni0er. BIBLIOGRA.IA Bar)ord I. J +u +. 7&. =1999> K,ata ana!ysisL FnM ,emain 6.L. J ,avies I.B. =Bds.> Manua! os Fndustria! Microbio!o0y and Biotec&no!o0y. 6.M. .6 20M2*0-2*1. Madi0an M.< MartinNo I. J 3arNer I. =1999> KBrocN< bio!o0a de !os microor0anismosL 8a edici4n. 3rentice ?a!!. BspaGa *//-*/8. Oard D. =1989> KBiotecno!o0a de !a )ermentaci4n. 3rincipios< procesos y productosL 6cribia. BspaGa. 12/129. 7rue0er O. J 7rue0er =1993> KBiotecno!o0a< Manua! de Microbio!o0a Fndustria!L 6cribia. BspaGa. 1/3-12*. Pre9a! ?... J Qaira Q.L. =199/> K+un0a! production o) citric acidL Biotec& adv 13 =2>M 209-23*.

ANE?O Me#io #e +ro#$''i,n #e @'i#o 'Atri'o +ara Aspegillus niger

Rea'tivo
7arbo&idrato .u!)ato de amonio +os)ato monob"sico de potasio .u!)ato de ma0nesio .u!)ato )erroso amoniaca! .u!)ato de 1inc .u!)ato de cobre 60ua desti!ada

Con'entra'i,n 8";L1
100.0 2.0 2.0 0./ 5 8 10-* * 8 10-* 2 8 10-* 1000 mL