BIOLOGI MOLEKULER DAN REKAYASA GENETIKA

Kromosom

DNA (deoxyribonucleic acid)

Struktur DNA
Berupa rantai beruntai ganda (double stranded) yang tersusun secara anti paralel dan terpilin membentuk struktur helix Rantai yang membawa kode biologis disebut untai pengkode (coding strand) dan rantai komplemennya disebut noncoding strand Unit dasar DNA berupa nukleotida

Setiap nukleotida disebut monomer: tersusun atas gula deoksiribosa, nitrogen basa purine (adenin dan guanin), nitrogen basa pyrimidine (thymine dan cytocine) dan gugus phosphate
Nukleotida berikatan dengan nukleotida lain melalui ikatan phosphodiester Nukleotida berikatan dengan nukleotida konplemennya melalui basa nitrogennya yang dihubungkan dengan ikatan hidrogen

Konformasi pasangan-basa DNA

Struktur nukleotida dan basa nitrogen

Susunan gula, basa nitrogen dan phosphate pada DNA

P S
nukleotida

P S

P S P S P

P S

P S

P S P

S
P

Aktivitas DNA
Replikasi DNA
Berlangsung pada saat penggandaan DNA sebelum mitosis ataupun meiosis Prosesnya melibatkan enzim: helikase, primase, DNA polimerase, DNA ligase

Rangkaian proses DNA replikasi:

pembukaan ikatan helix, pembentukan gelembung replikasi, inisiasi sintesis kopi DNA, perpanjangan rantai DNA, terminasi sintesis DNA
8

Aktivitas DNA
Reparasi DNA
Berlangsung dalam rangka proof reading setelah replikasi DNA
Bertujuan untuk memastikan bahwa kopi DNA hasil replikasi benarbenar sama dengan templatenya Prosesnya melibatkan enzim: DNA polimerase

Rangkaian proses DNA reparasi

Pembacaan urutan basa Pengenalan basa yang tidak sesuai Pemotongan dan pengambilan basa yang tidak sesuai

Penggantian dengan basa yang sesuai

Penyambungan kembali ikatan basa

Sintesis/replikasi DNA

10

11

Aktivitas Gen Seluruh gen yang terdapat pada suatu spesies dan menentukan karakteristik spesies tersebut secara kolektif disebut genome Aktivitas gen diwujudkan dalam bentuk: transkripsi DNA menjadi mRNA, translasi mRNA menjadi polipeptida/protein, protein menjalankan fungsinya Rangkaian proses perubahan dari DNA RNA Protein berjalan satu arah dan dikenal sebagai dogma sentral biologi
12

Pengaturan aktivitas gen

Gen yang terdapat di dalam genome tidak seluruhnya diaktifkan pada waktu dan tempat yang bersamaan Gen-gen yang berperan dalam penye- lenggaraan metabolisme dasar diaktifkan secara terus-menerus disebut house-keeping genes gen-gen pembentuk enzim dan komponen struktural sel Gen yang diaktifkan pada periode dan waktu tertentu disebut regulated genes contoh: gen-gen yang berperan dalam proses differensiasi, perkembangan dan penuaan
13

Struktur Gen pada Eukariot

Transcription initiation site (Cap) PROMOTER REGION Translation initiation site Translation termination site INTRON 2

Trancription termination site

INTRON 1

Poly A I.s.

EXON 1 TATAbo x UPSTREAM PROMOTOR REGION 5UTR

EXON 2

EXON 3

3UTR

Gambaran skematis bagian-bagian gen pada gen bglobin manusia (modifikasi dr Gilbert et al., 2000)
14

Trankripsi gen
Proses transkripsi gen serupa dengan proses replikasi DNA tetapi terbatas hanya pada gen yang sedang aktif Rangkaian proses transkripsi meliputi:
Inisiasi transkripsi:
pengenalan promotor oleh RNA polimerase Pembentukan ikatan RNA polimerase dengan promotor

Sintesis RNA Terminasi transkripsi

Hasil transkripsi berupa RNA umumnya mRNA

RNA tersusun atas gula ribosa, nitrogen basa purine (adenin dan guanin), nitrogen basa pyrimidine (uracil dan cytocine) dan gugus phosphate Rangkaian basa pada mRNA dibaca sebagai triplet kodon mRNA yang telah terbentuk dikeluarkan dari inti menuju sitosol
15

Translasi (sintesis protein)

Komponen yang diperlukan untuk berlangsungnya proses translasi meliputi: ATP, mRNA, tRNA, ribosom, asam amino, enzim aminoacyl-tRNA sintetase Rangkaian proses transkripsi meliputi:
Inisiasi translasi
Pengataktifan tRNA amino asilasi Penempelan tRNA aktif kepada ribosom Pengenalan kodon start kodon AUG Pembentukan kompleks-inisiasi

Perpanjangan rantai polipeptida Terminasi translasi pada saat sisi peptidil ribosom mencapai stop kodon (UAA, UAG; UGA)
16

tRNA

17

Perpanjangan rantai peptida (elongasi)

18

19

Rekayasa Genetika
Dengan mengetahui prinsip-prinsip aktivitas dan cara kerja gen telah dikembangkan suatu teknologi yang dikenal dengan rekayasa genetika (genetic engineering) Teknik tersebut diantaranya digunakan untuk:
memperbanyak copy DNA menggunakan sel bakteri DNA rekombinan Perbaikan kualitas genetik produk peternakan, pertanian, perikanan dsb Dalam dunia medis diaplikasikan untuk diagnosa penyakit, pengobatan melalui terapi gen, penggunaan antisense
20

Transgen (penyisipan gen kepada organisme lain)

21

APLIKASI BIOTEKNOLOGI DI BIDANG KEDOKTERAN

Beberapa teknik bioteknologi (lanjutan)

Sekuesnasi DNA (DNA sequensing) Lokalisasi RNA Lokalisasi protein

Sekuesnasi DNA (DNA sequensing)

Teknik untuk menentukan urutan basa pada nukleotida yang menyusun suatu gen Metode sekuensasi
Maxim-Gilbert Sanger-Coulson

PCR
Automatic sequencing

Metode Sanger-Coulson

Metode Maxam-Gilbert (Degradasi DNA secara kimiawi)

Automatic sequencing

Lokalisasi RNA
Northtern Blotting In situ Hybridization

Northern Blotting

In situ hybridization

(Wijayanti, 2004)

Identifikasi dan lokalisasi protein

Kromatografi Identifikasi protein (Western Blotting) Lokalisasi protein Immunocyto/histochemistry

Western Blotting
Ekstraksi protein
Pengukuran konsentrasi perotein Elektroforesis pada gel Polyacrilamide (PAGE) Blotting (transfer dari PAGE ke membran)

Deteksi secara immunlogis

(Wijayanti, 2004)

MANFAAT BIOTEKNOLOGI
1. Mempelajari fungsi gen selama perkembangan 2. Identifikasi gen penyebab penyakit 3. Diagnosis penyakit 4. Terapi gen 5. Konsultasi genetik 6. Produksi antibiotik, protein, hormon

7. DNA Fingerprinting
8. Terlaksananya projek genome manusia

MEMPELAJARI FUNGSI GEN SELAMA PERKEMBANGAN

Pembentukan sel dan organisme transgenik Pembentukan chimera Gene targeting (gene knockout) Penggunaan Antisense RNA

Organisme transgenic dan chimera

Organisme transgenik: Chimera hibrid

Organisne transgenik (lanjutan)

Gene targeting

Penggunaan antisense

IDENTIFIKASI GEN PENYEBAB PENYAKIT

Positional gene cloning Candidate gene mapping

DIAGNOSIS PENYAKIT
PCR
HIV hepatitis

Immunocito/histokimia
Identifikasi kanker

Single cell analysis

TERAPI GEN
Stem cell therapy Germ cell therapy antisense

Stem cell therapy

Mengatasi penyakit pada individu penderita Mutasi gen masih dapat diwariskan kepada keturunannya Contoh:
penderita defisiensi ADA (adenosis deaminase) enzim yang diperlukan agar sistem immun berfungsi secara normal

Bentuk terapi:
Sel T pasien diisolasi ditumbuhkan secara in vitro gen ADA normal ditransfer ke sel T pasien sel T yang dimodifikasi dimasukkan kembali ke tubuh pasien sel T berfungsi dengan normal

Germ cell therapy

Dapat memperbaiki mutasi/keabnormalan gen pada keturunannya Bentuk terapi:
Germ cell pasien diisolasi dilakukan perbaikan/koreksi genetik germ cell yang dimodifikasi dimasukkan kembali ke tubuh pasien germ cell menyelesaikan gametogenesis keturunan pasien normal

Antisense
Peluang aplikasi:
Penanganan penderita kanker

KONSULTASI GENETIK
Fetal analysis:
Amniocentesis: Pengambilan cairan amnion untuk diagnosis kemungkinan adanya kelainan pada janin

Chorionic villus sampling: Pengambilan jaringan chorion pada villus placenta untuk diagnosis kemungkinan adanya kelainan pada janin

Informasi peluang pemunculan penyakit genetis pada keturunan pasangan beresiko

Penyakit karena homozigot resesif

PRODUKSI ANTIBIOTIK, PROTEIN, HORMON

Rekombinan vacsin Tissue plasminogen activator Tissue growth factor beta Human blood clotting factor VIII Human insulin Human growth hormon

antibodi

DNA FINGERPRINTING
Identifikasi individu melalui polimorfisme ukuran fragmen DNA hasil pemotongan dengan enzim restriksi Kegunaan:
Uji paternal Uji kekerabatan Uji forensik : identifikasi pelaku dan korban kejahatan

Prosedur untuk DNA fingerprinting

HUMAN GENOME PROJECT

Merupakan proyek terpenting dalam biomedis Ditangani secara nasional di USA oleh Departent of energy (DOE) dan National Institute of Health (NIH)

Dimulai pada th 1986 oleh DOE dalam bentuk Human Genome Program
Tujuan utama:
Menghasilkan peta fisik dari genome manusia Menentukan seluruh urutan nukleotida pada genome manusia

Hewan model yang mendukung keberhasilan HGP

Eschericia coli (bakteri) Saccharomyces cereviceae (ragi) Drosophila melanogaster (lalat buah)

Caenorhabditis elegans (cacing gelang)

Mus musculus (mencit)

Kemajuan di bidang medis setelah HBP

1994, penemuan BRCA1: gen yang rentan terhadap kanker payu dara 1995, urutan lengkap gen H. influenzae 2000, publikasi draft pertama urutan genome manusia oleh HGP dan Celera Genomic 2003, sekuens lengkap dari genome manusia terselesaikan Genom manusia terdiri atas nuclear genome (2x3.109 bp) per sel dan mitochondrial genome (16.569 bp, sirkuler)

Disiplin Ilmu yang muncul akibat sekuenasi genom manusia

Functional genomic fungsi biologis gen Structural genomic - struktur produk gen dan fungsi protein Proteomic kajian komplemen protein suatu sel pada keadaan/waktu spesifik Pharmacogenetic perancangan obat Comparative genomic kajian evolusi molekul Molecular epidemology mengenali molekul penyebab infeksi berdasar urutan genomnya

Manfaat diperolehnya genom manusia

Pemetaan lokus penyakit Penelitian target obat Penelitian dasar

Munculnya kedokteran prediktif

pharmacogenomics

56