Factores externos que alteran la actividad enzimtica Una vez descrito el mecanismo de actuacin de las enzimas se analizar por

qu la variacin de algunos factores del medio puede afectar a la actividad enzimtica. Concentracin de enzima Las enzimas proteicas se aslan de sus principales fuentes biolgicas (bacterias, hongos, tejidos animales y vegetales) mediante procesos habituales de aislamiento y purificacin de protenas, por lo que la pureza del preparado no es absoluta. Esto hace necesario definir dos conceptos: la unidad de actividad enzimtica y la actividad especfica. Unidad de actividad enzimtica (t/): es la cantidad de enzima capaz de transformar 1,0 jumol de sustrato por minuto a 25 C en condiciones ptimas. Actividad especfica: es el nmero de unidades enzimticas por mg de protena purificada. Constituye una medida de la pureza del preparado. Temperatura El aumento de la temperatura conduce a un aumento en la velocidad de la reaccin, que tiene un lmite cuando se sobrepasa la temperatura de desnaturalizacin de la enzima, lo que conlleva una prdida de su funcin. Debido a este fenmeno, la mutacin de una enzima que produce una forma termolbil puede tener consecuencias muy graves. pH Tal y como se ha visto con detalle en el captulo de protenas, los cambios en el pH del medio pueden alterar al estado de ionizacin de las cadenas laterales de los aminocidos cidos y bsicos. Estos cambios pueden afectar a la afinidad de la enzima por el sustrato, si se ven alteradas las cargas de los aminocidos que participan en la formacin de interacciones no covalentes entre la enzima y el sustrato para formar el complejo ES. Tambin se puede alterar la etapa de transformacin del sustrato en producto, si se modifican los residuos catalticos. El pH al que se producen estas variaciones puede aportar datos sobre qu tipo de residuo es el que se ve modificado. Por ejemplo, un cambio en la actividad enzimtica en un pH prximo a 7 indica que se afecta un residuo de His (con un pKa prximo a 6). Siempre hay que tener en cuenta que el pKz de un mismo residuo puede variar ligeramente dependiendo del entorno molecular en el que se localiza. Reacciones multisustrato

Hasta ahora se han descrito reacciones en las que se transforma un solo sustrato. Pero existen numerosas reacciones catalizadas por enzimas en las que intervienen dos o ms sustratos. En este tipo de reacciones los sustratos pueden unirse a la enzima de forma simultnea o sucesiva. Existen dos mecanismos que explican este comportamiento: Mecanismo secuencial En algunas reacciones en las que intervienen dos sustratos se forma en algn momento un complejo ternario no covalente E S ^. Los sustratos pueden fijarse al azar o hacerlo en un orden especfico. Mecanismo de doble desplazamiento o Ping-pong En estas reacciones no se forma un complejo ternario, sino que el primer sustrato se libera como producto antes de la unin del segundo sustrato a la enzima que ya ha sido modificada en la reaccin anterior. Las quinasas siguen este tipo de mecanismo. El primer sustrato es el ATP que se une a la enzima que libera ADP como producto y se queda fosforilada. El segundo sustrato se une a la protena fosforilada que le transfiere el grupo fosfato. Las enzimas se pueden inhibir de forma reversible e irreversible Existen cierto tipo de molculas, denominadas inhibidores, que ralentizan o detienen las reacciones enzimticas. En algunas ocasiones han resultado tiles para conocer ms datos sobre el mecanismo de reaccin enzimtica pero, sobre todo, resultan muy eficaces en la bsqueda y elaboracin de frmacos. Por ejemplo, un inhibidor puede actuar sobre una enzima que est presente en un organismo patgeno pero no en el organismo husped. En otras ocasiones actan sobre enzimas con una actividad alterada y que son la causa de la patologa tratada. En ambos casos, los frmacos ms adecuados sern los que operen sobre una enzima m uy especfica para evitar efectos secundarios. Los inhibidores reversibles alteran los parmetros cinticos Son molculas que se unen a la enzima mediante interacciones no covalentes, ms o menos estables, de forma reversible. Para estudiar su efecto sobre la actividad cataltica de la enzima se realizan ensayos, con las mismas condiciones experimentales, en ausencia (E + S) y presencia (E + S + I) de inhibidor. Esto permite comparar los parmetros cinticos caractersticos de la reaccin ( V ^ y Km) con los obtenidos en presencia de inhibidor (denominados Vmaxi y Km o parmetros cinticos aparentes). Los datos se reflejan en una grfica de Lineawever- Burk para una mejor comparacin de los resultados. El inhibidor se puede unir a la enzima en el centro activo formando un complejo El que no da producto o en un lugar especfico para el inhibidor. En este ltimo caso la fijacin puede realizarse antes o despus de la unin del sustrato y se forma un complejo

ternario ESI. El complejo El o ESI puede ser ms o menos estable y est definido por las reacciones: E + I <= El (10) si la enzima se une al inhibidor en el centro activo, impidiendo que se una el sustrato; o bien ES + I <= ESI (11) en el caso de que el inhibidor se una al complejo ES. De igual forma que el valor de ks refleja la afinidad de la enzima por el sustrato, la mayor o menor afinidad de la enzima por el inhibidor quedar reflejada por las constantes de disociacin de estos complejos por las frmulas: jy- _ [E] ffl ( , 2) ^ I m T (12) y [E] [I] 1 [ESI] J Dependiendo del tipo de inhibidor se pueden diferenciar tres tipos de inhibicin reversible. Inhibicin competitiva Se caracteriza porque el inhibidor se une al mismo sitio que el sustrato, impidiendo, por tanto, la formacin del complejo ES y la formacin de producto. Suele ser una molcula semejante al sustrato de la reaccin de forma que los dos ligandos compiten por unirse al centro activo (Fig. 8-20.1-a), aunque algunos tienen una estructura diferente. Como la unin es reversible, cuando la concentracin de sustrato es elevada es muy poco probable que el inhibidor se una a la enzima, por lo que la reaccin muestra una Vmax normal (Vm3X = Sin, embargo se necesita ms sustrato para alcanzar la mitad de la Vm3X por lo que la Kmi tiene un valor mayor. El incremento de este valor est relacionado con la [I] y con la Kx y se puede calcular mediante la frmula: = (Fig. 8-20b-c-d) El factor mediante el que se relacionan los parmeros cinticos sin inhibidor y los aparentes (1 + [I\!IQ se denomina a o grado de inhibicin. Inhibicin no competitiva El inhibidor muestra afinidad tanto por la enzima libre como por el complejo ES y la unin se realiza en un lugar distinto del centro activo. Por tanto, su efecto no se puede evitar aumentando la concentracin de sustrato y produce una disminucin de la Vmax ya que el complejo ternario ESI no genera producto. La Vmaxi disminuye por el efecto del inhibidor de forma que Vmaxi - VmJ a . Al no unirse en el centro activo la Km no cambia en presencia de inhibidor por lo que

Km = K ^ (Fig. 8-20.2). Inhibicin acompetitiva o incompetitiva Los inhibidores acompetitivos se unen exclusivamente al complejo ES en un lugar diferente al centro activo. El efecto aparente sobre los parmetros cinticos en presencia de inhibidor es la disminucin de y Km (Fig. 8-20.3), que se pueden calcular mediante las siguientes expresiones: V K y _ ' m a x TS- maxiJmi Inhibidores irreversibles Son molculas que se suelen unir a la enzima mediante enlaces covalentes con los residuos imprescindibles para la catlisis, impidiendo su funcin; aunque tambin pueden unirse mediante interacciones no covalentes m uy estables. Este tipo de inhibidores no tienen un comportamiento cintico de Michaelis-Menten. Su principal utilidad es la creacin de frmacos, pero tambin se utilizan para conocer el mecanismo de reaccin de las enzimas inhibidas.