PCR

(Polymerase Chain Reaction)

Reaccin en cadena de la Polimerasa

3 de Marzo 2014

La invencin y la prctica con xito (PCR ) por Kary Mullis y sus colegas en 1983 sentaron las bases para una revolucin cientfica. En i993 obtuvo el premio Nobel.
A pesar de que en 1971 y 74 Dr. Molineux de Inc .khorana describi la misma tcnica casi con detalle, aunque, lamentablemente, consideraron que dicha metodologa no era funcional

Desde entonces ha desempeado un papel crucial en la tecnologa subyacente a muchos aspectos de la era genmica que experimentamos hoy

APLICACIONES : clonacin acelular de fragmentos de DNA, deteccin de secuencias sin purificacin previa, rastreo de mutaciones, diagnostico de enfermedades genticas, resolucin de problemas forenses o arqueolgicos, estudios evolutivos . . .

Principio del mtodo:

PCR no es una tcnica analtica, sino mas bien es una metodologa , resultante de la aplicacin practica de tres conceptos .
desnaturalizacin

hibridacin

replicacin

Primers Olignucleoti dos

dNTPs, Mg2+,

polimerasa Taq

PCR (reactivos esenciales)

Para la realizacin practica se precisan en la mezcla de reaccin los siguientes reactivos : dNTPs, en exceso, acompaados de Mg2+, para la sntesis de copias de DNA

Oligonucleotidos de cadena sencilla , sintticos 18 a 30 nt , pueden ejercer de cebadores, complementaria a la regin diana Complementarios a las secuencias en los extremos del fragmento de ADN a amplificar Por esta razn no se puede amplificar regin de DNA si no se conocen la secuencia de sus dos extremos

DNA polimerasa termoestable, Enzimticamente actica temperatura alta 75-95C, enzima ms usada es la polimerasa Taq, (Thermus aqualitus)

PCR se llev a cabo en un termociclador, que automatiza la sincronizacin de cada ciclo Todos los ingredientes colocan en un tubo se

El usuario configura la mquina para operar dentro de un rango de temperatura definido y nmero de ciclos PCR comn 20 a 40 ciclos de 1.5 a 5 minutos de duracin cada uno, de desnaturalizacin, hibridacin y replicacin.

El primer paso es identificar la regin de la molcula de DNA que se desea amplificar

Si las secuencias en cada uno y de esta regin se conocen, se pueden generar Oligonucletidos o primers que son complementarios a estas dos secuencias

Esto se considera un primer reverso , mientras que la hibridacin del cebador con la otra hebra se tiene en el extremo 3 ' hacia el centro de la secuencia a amplificar (se denominan as puesto que avanzan en sentidos opuestos)

y la hebra recin hecho se har en la direccin opuesta a la realizada en la otra hebra -El cebador que hibrida con esta cadena se considera un cebador directo

PCR contendra desoxirribonuclesidos trifosfato polimerasa Taq termoestable,todo esto contenido en el tubo colocado en termociclador

Esta mquina tiene la capacidad de rpidamente cambiar la temperatura a 90C para separar las dos hebras

Una vez que las hebras se han separado la temperatura termociclador progresa a una temperatura de hibridacin de los primers pero por lo general entre 50-60 C

Despus del reconcimiento de los primers, taq polimerasa genera hebras complementarias de ADN mediante la incorporacin de dNTPs en cada cebador primers , usando cadena A o B

Esto se considera un termociclo

cuando el primer ciclo trmico se ha completado se habr formado una hebra 1A

durante el segundo termociclo el mismo proceso se repite, generando cuatro nuevas cadenas de ADN al cierre de los segundos ciclos trmicos que ahora tenemos 4 molculas de ADN con 8 hebras

tdas estas molculas contienen la secuencia que deseamos amplificar por PCR, pero ninguna de las 4 molculas que hemos hecho hasta ahora terminan exactamente en ambos extremos con primers

Estas llevaron a cabo despus del tercer termociclo con cada termociclo posterior el nmero relativo de estos molculas aumenta hasta despus de muchos ciclos

RT PCR : amplificacin de RNA PCR con transcriptasa inversa, es una amplificacin de mRNA a travs de su sntesis previa de DNA complementario No se obtienen copias de RNA de partida, sino de DNA, aunque se conserva la secuencia de RNA.

Es usado para estudios de expresin gentica in vitro.

Mezcla inicial contiene muestras de ARN transcriptasa inversa, DNA polimerasa, primers , dNTPs.

 Jos Luque Cabrera. Biologa molecular e ingeniera gentica: conceptos, tcnicas y aplicaciones en ciencias de la salud . Elsevier Health Sciences, 2001 http://goo.gl/PWDtGE