MICROBIOLOGIA I DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECIILOR STAFILO- I STREPTOCOCICE

CARACTERISTICA GENERAL A GRUPULUI COCILOR PIOGENI Familia Staphylococcaceae Genuri: Staphylococcus Gamella Macrococcus Salinicoccus Familia Streptococcaceae Genuri: Streptococcus Lactococcus Familia Neisseriaceae Genul Neisseria Caracter comun capacitatea de a condiiona procese supurative-distructive. Morfologic reprezint coci (sferici, lanceolai, riniformi), imobili, nesporogeni, unele specii formeaz capsule.

1.

2.

n funcie de caracterele tinctoriale se disting: Coci gram pozitivi (Staphylococcaceae, Streptococcaceae) Coci gram negativi (Neisseriaceae)

Cocii piogeni se deosebesc prin: Caractere de cultur (exigene nutritive, tipul de respiraie, etc) Caractere biochimice Factori de patogenitate Rolul n patologia uman Infecii nespecifice Infecii specifice (gonoreea, scarlatina, etc)

GENUL STAPHYLOCOCCUS Se disting 2 grupuri (varieti): 1. Stafilococi coagulazo-pozitivi - SCP foarte viruleni (S.aureus, S.intermedius) 2. Stafilococi coagulazo-negativi SCN potenial-patogeni (aproximativ 30 specii: S.epidermidis, S. saprophyticus, S. capitis, S.haemolyticus, S.hominis, etc) Habitat: 20-70% din populaie sunt purttori: S.aureus - cavitatea nazal, intestin, S.epidermidis narine, tegument, S.saprophyticus - tegument.

Staphylococcus aureus Caracterele morfobiologice

Caractere morfo-tinctoriale: coci gram+, n frotiu se aranjeaz n grmezi neregulate (greac: staphylos-ciorchine, kokkos grunte), n perechi sau izolat . Imobili, nesporogeni, necapsulai (uneori microcapsule)

Caractere de cultur: facultativ anaerobi, nepretenioi la cultivare, cresc pe medii uzuale. Temperatura optima 37C, pH-7,07,5. - n BP turbiditate uniform - Geloza salin cu glbenu de ou-GGO (3 % NaCl) - Mediul Chapman (7,5 % NaCl, manitol) - Geloz-snge

Colonii S, opace, pigmentate (auriu, citric, alb), pe geloz-snge cauzeaz hemoliz. Pe GGO coloniile sunt nconjurate cu un halou opac (aciunea lecitinazei). Caractere biochimice: catalazo-pozitivi, fermenteaz manitolul Factori de patogenitate I. Factori structurali: peptidoglicanul (induce secreia citokinelor de ctre celulele limfocitare, responsabile de starea de oc) acizii lipoteichoici (induc o hipersensibilitate tardiv) proteina A (asigur fixarea Fc al IgG, mpiedic opsonizarea i fagocitoza)

a)

b)

c)

adezine, care permit fixarea S.aureus pe diverse molecule plasmatice ale gazdei: Fibronectin i laminin. Fibronectina este prezent pe suprafee epiteliale i endoteliale, precum i n chiaguri sanguine. Fibrinogen. Fixarea de fibrinogen asigur aderarea la chiaguri i esuturi lezate. Colagen. Tulpinile ce posed astfel de adezine cauzeaz osteomielite i artrite septice Microcapsula, rol antifagocitar

II. Toxine - Alfa-toxina (alfa-hemolizina). Efect citolitic fa de trombocite, monocite, hematii, cu eliminarea citokinelor, care pot fi cauza ocului septic stafilococic. - Beta-toxina (sfingomielinaza). Prezent la tulpinile izolate de la bovine cu mastit. - Gamma i delta-toxine. Efect leuco- i hemolitic. - Leucocidina, efect litic fa de leucocite i macrofage, factor important n procese dermonecrotice - Exfoliatine (epidermolizine) A i B. Manifest tropism cutanat. Mecanism: se fixeaz de unele proteine cutanate (profilagrin i filagrin), inducnd desprinderea intra-epidermic dintre stratum granulosum i stratum spinosum, cu formarea leziunilor buloase (impetigo bulos, sindromul pielii oprite).

Enterotoxine: A, B, C1, C2, C3, D, E, G. Termostabile, rezistente la aciunea enzimelor proteolitice ale tubului digestiv. Determin intoxicaii alimentare (enterotoxina B poate cauza oc toxic). - Toxina sindromului toxic stafilococic (TSST-1). Determin stare de oc stafilococic.
-

Toate toxinele sunt imunogene. Enterotoxinele, TSST-1 reprezint superantigene, activnd 20% de limfocite T (particip la declanarea strii de oc)

III. Coagulazele - Coagulaza liber - protein extracelular care se leag de protrombina gazdei cu formarea unui complex. Astfel activat, trombina determin conversia fibrinogenului n fibrin cu coagularea plasmei. Reprezint cauza tromboflebitelor septice i protejeaz cocii de fagocitoz. - Coagulaza legat (clumping factor) este un determinant superficial al S.aureus fixator de fibrinogen. Antifagocitar. Provoac fenomenul de aglutinare a stafilococilor n prezena fibrinogenului.

IV. Stafilokinaza (fibrinolizina) activator al plasminogenului (asociat cu bacteriofagi lizogeni). Complexul stafilokinaz-plasminogen manifest activitate proteolitic, cauznd dizolvarea trombilor (responsabil de localizri septice secundare). V. Enzime de patogenitate: - Hialuronidaza faciliteaz diseminarea bacteriilor - Alte enzime: proteaze, lipaze (inclusiv lecitinaza), ADN-aze, fosfataze, etc. Rol n diseminarea infeciei i producerea leziunilor. Se disting multiple serotipuri de S.aureus, iar receptorii pentru bacteriofagi permit clasificarea n lizotipuri (fago-variante)

Epidemiologia infeciilor stafilococice Sursa de infecie: omul bolnav sau purttori sntoi de germeni. Rareori bovinele bolnave de mastit. Mecanismele i cile de transmitere: - Contact direct sau diseminare manuportat - Contact indirect (alimente, praf, mbrcminte, etc) Factori favorizani: diabet, tratament imunosupresiv, arsuri, plgi, etc

Formele clinice ale infeciilor cu S.aureus Infecii supurative - infecii cutanate: foliculite, furuncule, carbuncule, abcese, panariiu, infecie de plag (frecvent de origine nosocomial). Exfoliatina determin sindromul pielii oprite (sindromul Lyel) la copii, pemfigus epidemic la nou-nscui (boala Ritter) i impetigo bulos la maturi.

Infecii ale mucoaselor: mastoidite, sinusite, otite, angine... Infecii ale seroaselor: artrite, pleurezie, peritonit, meningit... Infecii osoase: osteomielit, spondilodiscit, infecie de protez Infecii viscerale: abces pulmonar, cerebral, flegmon perirenal, pielonefrite, etc Septicemii i endocardite. Cauzate i ntreinute de un focar infecios primar complicat de tromboflebit. n mediu spitalicesc au caracter nosocomial (catetere intravasculare, proteze valvulare cardiace, articulare, stimulatoare cardiace...)

Manifestri digestive - Intoxicaii alimentare (doza toxic - 1g la 100 g aliment). Vome, diaree, deshidratare, absena febrei - Enterocolite consecutive unei antibioterapii Sindromul ocului toxic stafilococic: febr, hipotensiune arterial, erupie cutanat scarlatiniform, stare de oc, leziuni viscerale (cerebrale, renale, hepatice, musculare). Descris n 1978 n SUA la femei care utilizau tampoane periodice i sufereau de vaginit cu S. aureus. Tulpini responsabile de acest sindrom pot fi izolate din diverse leziuni stafilococice.

Infecii cauzate de SCN S.epidermidis determin infecii asociate cu proteze i catetere, frecvent de origine nosocomial (endocardite, endoftalmii, peritonite la pacieni cu dializ peritoneal, bacteriemii). S.epidermidis produce un polizaharid de adeziune, care-l fixeaz pe implante din plastic. S.saprophyticus i S.haemolyticus pot cauza infecii ale tractului urinar S.lugdunensis infecii de plag, endocardite

Imunitatea antistafilococic este mixt: celular i umoral Diagnostic de laborator Materiale de examinat n funcie de forma clinic 1. Diagnostic direct Examen microscopic direct (Gram, RIF)

Examen bacteriologic. La interpretare se ine cont de datele clinice. n caz de infecii nosocomiale sau otrvire alimentar se identific markerii epidemiologici (lizotip, serotip, antibiotip). Determinarea antibiogramei este obligatorie (tulpini multirezistente). (Diferenierea speciilor de stafilococi n Ghid) - Identificarea acizilor nucleici prin tehnici de biologie molecular - n cazuri particulare se caut prezena toxinelor (reacia de latex-aglutinare, ELISA)
-

2. Diagnostic indirect (serologic) Se examineaz seruri sanguine pentru depistarea anticorpilor anti-stafilolizine-alfa (titru> 2 UI/ml) n caz de infecii profunde sau cronice, sau anti-acizi teichoici (titru> 1:16) n caz de endocardite sau focare inaccesibile. Tratamentul specific al infeciilor stafilococice: autovaccinuri, vaccinuri inactivate, seruri imune (n infecii cronice) Antibiotice: peniciline semi-sintetice (oxacilin), augmentin, imipenem, aminoside, macrolide, fluorochinolone, glicopeptide (vancomicin, teicoplanin) cotrimoxazol, fosfomicin, rifampicin, acidul fuzidic, etc Profilaxia specific: plasm antistafilococic, Ig anti-stafilococic, ser hiperimun, anatoxin stafilococic

FAMILIA STREPTOCOCCACEAE

Genul Streptococcus (fragili i exigeni la cultivare) Genul Lactococcus (anterior streptococi din grupul N)

Genul Streptococcus Reunete specii facultativ anaerobe caracterizate prin morfologie tipic (coci gram+ n lanuri, imobili, nesporogeni, capsulai), metabolism fermentativ i lipsa catalazei. Clasificarea streptococilor 1. Dup aspectul hemolizei pe geloz-snge Streptococi beta-hemolitici (hemoliz complet, zon clar n jurul coloniilor) Streptococi alfa-hemolitici (hemoliz incomplet, zon verzuie n jurul coloniilor) Streptococi nehemolitici (gamma-hemoliz)

2. Clasificarea imunologic Lancefield Dup antigenul polizaharidic C din peretele celular se disting 20 grupe serologice (A H, K W). Streptococii care nu posed acest Ag nu se ncadreaz n clasificarea Lancefield (ex.: S.pneumoniae). Ei se identific dup caractere de cultur i biochimice. 3.Dup habitat i patogenitate - Streptococi piogeni, viruleni, beta-hemolitici (aparin grupurilor A,B,C,G) - Streptococi orali, comensali, nehemolitici sau alfa-hemolitici, negrupabili dup Lancefield - Streptococi fecali, specii comensale sau condiionat patogene ale tractului digestiv uman i animal - Streptococi lactici, reprezint flora laptelui i produselor lactate

Diferenierea streptococilor patogeni de cei saprofii se efectueaz de asemenea n baza criteriilor Cherman:
1. 2.

3.
4. 5. 6. 7.

Creterea la 10 i 45 C Creterea n bulion cu 6,5% NaCl Creterea n mediu cu pH 9,6 Hidroliza esculinei pe mediu cu 40% bil Liza culturii n bulion biliat Sensibilitatea la bacitracin i optochin Hidroliza hipuratului de sodiu

Streptococcus pyogenes (gr. A) Bacterie strict uman, posibil portaj oro- i nasofaringean (20%). Caractere morfologice: lanuri scurte sau perechi de coci sferici gram+, imobili, capsulai, nesporogeni. Caractere de cultur: facultativ-anaerobi, cultiv pe medii elective. Pe geloz-snge, dup 18-24 ore incubare la 37 C colonii S mici, cu zon de -hemoliz. n bulion glucozat, bulion-ser formeaz depozit la fundul i pe pereii tubului. S.pyogenes este sensibil la bacitracin.

Structura antigenic a S.pyogenes (Lancefield-Griffith): 1. Polizaharidul C din peretele celular, specific pentru grupul A (dup Lancefield). Poate fi identificat n RP, latexaglutinare, co-aglutinare. 2. Proteinele de suprafa: M (fimbriale), R i T (uneori asociate cu acizii lipo-teicoici), care permit diferenierea n 90 serotipuri (dup Griffith). Proteina M manifest reactivitate imunologic ncruciat (mimicrie antigenic) cu constitueni normali ai organismului (miozin, sarcolem, sinoviale), determinnd procese imunopatologice (manifestri post-streptococice). Ag proteice de tip se identific prin RP (Ag M) i RA (Ag T). 3. n MCP exist Ag comun cu membrana bazal a glomerulilor renali

Factori de patogenitate 1. Factori de structur Capsula din acid hialuronic, neimunogen. Efect antifagocitar Proteina M, adeziune, antifagocitar Acizii lipoteichoici, adeziune la celule epiteliale Proteina F, receptor de fibronectin 2. Toxine - Streptolizinele O (oxigen-labil) i S (oxigenstabil). Sunt toxine citolitice. SLO manifest efect cardiotoxic, hemolitic. Inhib chimiotactismul PMN i reduce activitatea celulelor imunocompetente.

Induce formarea Ac neutralizani antistreptolizine (ASLO). SLS nu este imunogen. Manifest activitate citolitic i leucotoxic. - Toxinele eritrogene (pirogene) A, B i C sunt determinate de fagi moderai. Au activitate de superantigen, producnd inflamaie asociat cu stare de oc. Mitogene i imunosupresive. Tulpinile lizogene determin scarlatina. 3. Enzime de patogenitate: hialuronidaza, streptodornaza B (ADNaza), lipoproteinaza, streptokinaza (fibrinolizina)

Epidemiologia infeciilor provocate de S.pyogenes Sursa de infecie: bolnavii i purttorii sntoi (faringe i amigdale, mai rar anus, vagin, tegument). Mecanismele i cile de transmitere: - Aerogen (picturi Pflugge) - Contact direct (leziuni cutanate)

Patogenia i formele clinice ale infeciilor provocate de S.pyogenes Infecii ale mucoaselor Sfera ORL: rinite, faringite, angine eritematoase (risc de reumatism articular acut), abcese periamigdaliene, adenite cervicale, sinusite, otite, mastoidite. Scarlatina (angin streptococic nsoit de erupie cutanat). Infecii cutanate i subcutanate: erizipel, impetigo, celulit, fasciit necrozant, mionecroz (sindromul Meleney), eritemul nodos, infecii ale plgilor i arsurilor

Septicemii Sindromul ocului toxic streptococic, secundar unei infecii locale, n special subcutanat Alte infecii: endometrite, pneumonii Infecii post-streptococice - RAA (reumatismul articular acut), mai frecvent la copii de vrst colar. Apare dup infecii faringiene i este determinat de aciunea direct a streptolizinei, depozite de complexe imune (RHS III), precum i prin interaciunea autoAc i al Ac antistreptococici cu autoantigene din miofibrile, valvule cardice i sinoviale (RHS II).

Glomerulonefrita acut (GNA) Maladie a copilului de vrst precolar. Survine dup 10-20 zile de la o infecie cutanat, mai rar faringean. Se caracterizeaz prin perturbarea funciei renale, edem i hipertensiune arterial. Patogenie: efect toxic direct, reacii autoimune, bazate pe asemnarea unor Ag streptococice din MCP i membrana bazal glomerular (RHS II i III), persistena formelor L.
-

Imunitatea antistreptococic este specific de tip, asigurat de Ac anti-proteina M. Ac antieritrotoxin protejeaz de eritemul scarlatinos.

Streptococcus agalactiae (gr. B) Alfa-hemolitic. Streptococ piogen animal (bovidee), ocazional gzduit de om n orofaringe, vagin i intestin. Rol n patologie: - La gravide: infecie urinar, infecie de plag, amniotite, endometrite, avort sau natere prematur - La nou-nscut: infecie precoce (septicemie, pneumopatie n primele 10 zile de via) sau tardiv (meningit) - La adult: infecie de plag, osteo-artrite, infecii uro-genitale, septicemii, endocardite, meningite.

Streptococi din grupul C (S.equisimilis, S.equi) i din grupul G Beta-hemolitici cu rezervor animal i uman (tegument, mucoase). Responsabili de infecii cutanate, faringite, septicemii post-partum, infecii osteo-articulare, meningite, pneumopatii. Rareori urmate de GNA. Excepional pot cauza scarlatin.

Streptococii din grupul D (S.bovis, S.equinus) Fac parte din flora comensal a tubului digestiv al omului i animalelor. Rolul n patologia uman: endocardite, infecii neonatale, cholecistite, peritonite, infecii urinare, septicemii.

1.

2.

Streptococii negrupabili (lipsii de antigene de perete) Streptococcus pneumoniae (prezent pe mucoasele omului i ale unor mamifere, n special n nasofaringe) Ali streptococi negrupabili (S.mitis, S.mutans, S.oralis, S.sanguis). Prezeni n cavitatea bucal, joac rol n geneza cariei dentare, n infecii materno-fetale, bacteriemii i endocardite

Streptococcus pneumoniae Caractere morfo-tinctoriale: diplococi ovoizi sau lanceolai, gram+, imobili, nesporogeni, capsulai. Caractere de cultur: cultiv pe medii elective (geloz-snge, geloz-ser, bulionser), pH optimal 7,8. Pe geloz-snge, peste 18-24 ore de incubare la 35-37 C n atmosfer cu 5-10% CO2, formeaz colonii S mici, cu o zon de hemoliz alfa (verzuie). Din cauza autolizei pneumococilor centrul coloniilor se deprim. Tulpinile necapsulate formeaz colonii R.

1.

2.

3.

Structura antigenic Antigene capsulare, de origine polizaharidic. Permit clasificarea pneumococilor n 90 serotipuri. Antigenul proteic R, mascat de Ag capsulare Antigenul proteic M, specific de tip

1. 2. 3.

4.

5. 6.

7. 8.

Factori de patogenitate: Capsula (rol antifagocitar) Adezine sIgA - proteaz Acidul lipoteichoic (implicat n reacii inflamatoare cu semne generale i leziuni tisulare, posibil oc) Autolizinele (eliberarea unor factori bacterieni cu rol n virulen) Pneumolizina (hemolizina). Efect citotoxic asupra celulelor epiteliale i endoteliale. Reduce activitatea bactericid a PMN. Hialuronidaza Neuraminidaza

S.pneumoniae se difereniaz de ali streptococi prin: Sensibilitatea la optochin Liza culturii de pneumococi n prezena srurilor biliare (activarea autolizinelor) testul de solubilitate n bil Patogenitatea pneumococilor pentru oarece Prezena capsulei Hidroliza inulinei

Epidemiologia infeciilor cu pneumococi Sursa de infecie purttorii sntoi (nasofaringe) sau bolnavii Calea de transmitere aerogen Infeciile cauzate de S.pneumoniae 1. Infecii respiratorii: pneumonia franc lobar acut, broncho-pneumonii, bronite, otite, sinusite, mastoidite. 2. Meningite (n special la copii) 3. Bacteriemii cu artrite, peritonit, pericardit, endocardit. Imunitatea antipneumococic este specific de tip, prin Ac anti-capsulari.

1. -

Diagnosticul de laborator al infeciilor streptococice Prelevate n funcie de forma clinic (tampon faringean sau cutanat, puncie a esutului subcutanat, LCR, puroi, snge, etc) Metodele de diagnostic Diagnosticul direct Examenul microscopic (frotiu Gram orientativ, RIF)

- Examenul bacteriologic (de baz) - Detectarea serologic a Ag specifice - Identificarea ADN prin tehnici de biologie molecular - Diagnosticul indirect (util n infecii poststreptococice) - Evidenierea Ac ASLO n cazul RAA (titru diagnostic > 200 UA/ml) - Ac antistreptodornaz B (titru diagnostic > 240 UA/ml) + ASLO n cazul GNA - Dozarea Ac anti-hialuronidaz (titru diagnostic > 350 UA/ml) i antistreptokinaz (titru diagnostic > 160 UA/ml)

Diagnosticul scarlatinei - Pentru identificarea eritemului scarlatinos se utilizeaz reacia Schultz-Charlton (antieritrotoxina inoculat n erupie determin dispariia exantemului) - Reacia Dick pentru depistarea Ac antieritrotoxin (determinarea receptivitii la scarlatin). I/dermic se inoculeaz 0,1 ml eritrotoxin. Rezultat pozitiv: peste 24 ore eritem local peste 10 mm (lipsa anti-eritrotoxinei, receptivitate) Rezultat negativ: absena eritemului (anticorpi prezeni, persoan imun la scarlatin)

Profilaxia specific a infeciilor streptococice Vaccin contra S.pyogenes nu exist (variabilitatea proteinei M, Ag comune cu esuturile umane) Femeile purttoare de S.agalactiae sunt imunizate cu vaccin din polizaharide capsulare Exist un vaccin anti-pneumococic, constituit din antigene capsulare mai frecvent ntlnite n regiune

Tratamentul infeciilor streptococice S.pyogenes este sensibil la penicilina G i macrolide. Tratamentul anginelor previne complicaiile poststreptococice. S.pneumoniae este sensibil la peniciline i cefalosporine. Exist tulpini rezistente la tetraciclin, eritromicin, macrolide.

Familia Enterococcaceae Genul Enterococcus Specii: E.faecalis, E.faecium, E.durans, etc Caractere morfo-biologice: coci ovoizi, gram+, dispui n perechi sau lanuri scurte. Anaerobi facultativi. Diferenierea de genul Streptococcus: cresc la 10 i 45 grade C, se multiplic n prezena a 6,5% NaCl, hidrolizeaz esculina n mediu cu 40% bil i produc piridonil arilamidaz.

Habitat: comensali ai intestinului omului i animalelor, uneori se ntlnesc pe mucoasa genital, n orofaringe i pe tegument. Reprezint markeri microbiologici de poluare fecal a mediului. Rezisteni n mediul extern i la antibiotice. Rolul n patologia uman: endocardite, infecii urinare, meningite, infecii neonatale. Frecvent infecii cu caracter nosocomial (infecie de plag).