La fluorescencia asociada con la reaccin de Maillard en la leche y los sistemas que se asemejan a la leche El progreso de la reaccin de Maillard en la leche

y los sistemas semejantes a la leche durante el calentamiento fue seguido mediante el control de compuestos intermedios fluorescentes libres. La intensidad de fluorescencia se examin en un amplio rango de temperatura / tiempo (90 y 140 C/0.5 -30 min). Los diferentes comportamientos cinticos fueron encontrados en la presencia o ausencia de grupos amino en el sistema. Se detectaron rastros de fluorescencia cuando el sistema de lactosa y sin protenas fue calentada; las reacciones de isomerizacin y la degradacin de la lactosa podran generar compuestos fluorescentes. La acumulacin de fluorescencia en el sistema de la lactosa (sin protenas) procedi de acuerdo con la cintica de reaccin de primer orden, mientras que los sistemas con lactosa y casena, lactosa y protena de suero de leche se ajustaron a la cintica de reaccin de orden cero. Las energas de activacin aparentes calculadas fueron 61.3, 78.6, 59.6 y 83.9 kJ mol-1 para el sistema de lactosa, el sistema lactosa/casena, y el sistema lactosa/protena de suero de leche y leche, respectivamente. Por otra parte, se han estudiado los niveles de compuestos fluorescentes intermediarias en la leche comercial espaola (pasteurizada, UHT y en botella leche esterilizada). INTRODUCCION Componentes de los alimentos reaccionan entre s durante el procesamiento, el almacenamiento y la coccin de los alimentos. El tratamiento trmico es la operacin de tratamiento ms ampliamente utilizado en la industria lctea. La razn principal para el tratamiento trmico de la leche es el de mejorar la calidad de conservacin y seguridad del producto. De esta manera, una de las principales reacciones qumicas que tienen lugar en la leche y los productos lcteos es pardeamiento no enzimtico, conocido como la reaccin de Maillard (MR). En un primer paso, los grupos amino libres de la protena de la leche (principalmente de k-casena) reaccionan de forma no enzimtica con azcares reductores (lactosa) para formar una base de Schiff, que se estabiliza a travs de reordenamiento de Amadori (lactylosyllysine). En la etapa avanzada de la reaccin, las protenas se modifican en molculas coloreadas, fluorescentes y entrecruzadas. En el proceso, muchos compuestos reactivos se forman como productos intermedios, tales como compuestos keto y aldoseamine (Hodge, 1953), 3-deoxyosones (Troyano et al, 1992;. Madson y de la pluma, 1981), los furanos (Patton, 1950; Shaw & Berry, 1977), maltol (Potter & Patton, 1956), derivados de pirrol (Klein et al., 1992) pirazinas (Milic y Piletic, 1984) piranonas (Led1 et al., 1983), lactonas (Shigematsu et al., 1971 ), imidazoles sustituidos (Davidek et al., 1992), etc. La reaccin de Maillard juega un papel importante en la produccin de compuestos indeseables de sabor (Ferretti y Flanagan, 1972), disminucin de la calidad nutricional (Baltes, 1982), as como en el desarrollo de la fluorescencia y el color marrn asociado con protenas (Choi et al ., 1949; Adrian, 1975). Se han propuesto muchos ndices qumicos por calor inducidos basados en productos de la MR para la evaluacin del tratamiento trmico en la leche, los productos lcteos y los sistemas de modelo. Algunos de estos parmetros estn relacionados con una etapa temprana de la MR evaluadas por anlisis de productos de Amadori utilizando un analizador de aminocidos (Henle et

al, 1991.) Y la prdida de aminocidos esenciales como la lisina (Fink y Kessler, 1988; Resmini y col ., 1990) y carboximetil analizados por cromatografa lquida de alta resolucin en fase reversa (RPHPLC; Ltidemann y Erbersdobler, 1990). Los parmetros de calor inducido relacionados con la MR avanzada son: total de 5-hidroximetilfurfural (HMF), analizado colorimtricamente (Fink y Kessler, 1988) o mediante RP-HPLC (. Morales et al, 1992, 1995), el ndice de dorado (Pagliarini et al, 1990);. s-lysylpyrrole, analizado por el analizador de aminocidos (Henle y Klostermeyer, 1993); galactosylisomaltol analizado por HPLC (Kramholler et al., 1992). En las etapas anteriores a la formacin de pigmentos marrones, se forman los compuestos fluorescentes. Esto ha sido estudiado en detalle por Baisier y Labuza (1992) y Burton et al. (1963) en sistemas modelo de aminas / azcares. Baisier y Labuza (1992) declararon que la acumulacin de fluorescencia en un sistema modelo de la glucosa / lisina es debido a la interaccin entre los compuestos reactivos reductores y aminas por una reaccin irreversible. La formacin de compuestos fluorescentes principales est vinculada a la presencia de casena y se produce simultneamente con pardeamiento (Tarassuk y Simonson, 1950; Jenness y Coulter, 1948). El objetivo de este trabajo es estudiar la acumulacin de compuestos fluorescentes en los sistemas de la leche y semejantes a lo largo de un amplio rango de temperatura / tiempo, as como la determinacin de la cintica de la formacin de compuestos intermedios fluorescentes (FIC) no unidos a protenas en cada sistema. Adems, los ndices de FIC se han probado como un parmetro no especifico de calor inducido para el procesamiento de leche y un estudio estadstico sobre la presencia de compuestos fluorescentes en la leche espaola comercial ha sido llevado a cabo. MATERIALES Y METODOS Materiales Todos los productos qumicos utilizados fueron de grado analtico. Leche cruda entera fue suministrada por Clesa (Madrid, Espaa). Soluciones ultrafiltrado de leche sinttica (SMUF) se hicieron de acuerdo con Jenness y Koops (1962) y en todos los casos se ajust el pH a 6,62 con KOH (1 N) antes de su uso. Se estudiaron tres sistemas diferentes; lactosa (5,0%, w / v), caseinato de sodio (2,5%, w / v) y las protenas de suero (0,6%, w / v). Nueve leches pasteurizadas, 36 UHT y seis en botella esterilizadas de empresas comerciales representativas fueron comprados en los mercados locales en Espaa, y se almacenaron en sus envases a 6 C hasta su anlisis. Tratamientos de calentamiento Muestras de lactosa (L), lactosa/caseina (LC), lactose/proteina de suero (LW) en soluciones SMUF y leche entera cruda (M) se calentaron en tubos de ensayo con tapn (100 x 10 mm) en un bao de aceite (Precisterm s-387; PSelecta, Espaa) en condiciones controladas a 90-140 C durante tiempos de calentamiento de 0-1500 s (estimado promedio de tiempo de calentamiento 45 s). Las muestras se enfriaron en hielo-agua inmediatamente despus de un tiempo de calentamiento predeterminado y se almacenaron a -80 C hasta el anlisis.

Preparacin de la muestra Cinco mililitros de la muestra bien mezclada se desproteinizado lentamente con 5 ml de solucin de cido tricloroactico (40%, w / v). La muestra se mantuvo durante 3 y 50 min a temperatura ambiente y luego se filtr a travs de filtros de papel Whatman 42. Espectroscopia de fluorescencia Productos de etapa intermedia se analizaron midiendo compuestos fluorescentes de Maillard en la muestra desproteinizada. Los espectros se registraron en un instrumento Kontron (Miln, Italia) espectrofotmetro de fluorescencia en 500 l de muestra diluida con 2,5 ml de tampn fosfato saliane (20 mM, pH 7,0, y 15 mM de NaCl). Las muestras se midieron a 347 nm de excitacin, emisin de 415 mn. Se utiliz una anchura de la rendija de 5 nm. Una solucin de sulfato de quinina de 10 g ml-1 en H2SO4 0,1 N se prepara diariamente como un estndar para la calibracin del instrumento de fluorescencia relativa a 100%, pero una concentracin de 0,1 g ml-1 se utiliza con el sistema L a causa de la fluorescencia menor intensidad (FI) de las muestras. Todas las muestras se analizaron por triplicado. Anlisis estadstico de datos El anlisis estadstico de los datos se realiz mediante anlisis de la varianza siguiendo un modelo de una manera sencilla, equilibrada. El t-test fue utilizado para comparar las medias y el nivel de significacin se fij en 95%. RESULTADOS Y DISCUSIN Este estudio fue diseado utilizando sistemas de lactosa / protena modelo para determinar diversos parmetros cinticos relativos a la formacin de compuestos fluorescentes y velocidades de reaccin que dependen de la temperatura. Los valores medios en blanco de intensidad de fluorescencia (Fib) calculados para L, LC, LW y M se resumen en la Tabla 1. Los valores del blanco se restaron en cada anlisis. La repetibilidad del mtodo para diferentes muestras de leche tratados con calor se muestra en la Tabla 2. Los valores promedio de compuestos fluorescentes obtenidos en los sistemas estudiados (L, LC, LW y M) se muestran en la figura. 1 para diferentes temperaturas y tiempos de calentamiento. La acumulacin de compuestos intermedios fluorescentes libres (FIC) medidos como FI (%) fue proporcional a la temperatura y tiempo de calentamiento en cada sistema de modelo y en la leche. Debe tenerse en cuenta que el valor de la libre FIC (FI%) no est relacionado con un nico compuesto qumico: es una medicin no especfica de los contenidos de fluorescencia en la muestra. Pocos datos estaban disponibles acerca de los compuestos fluorescentes en alimentarios o modelos de sistemas en la literatura. La mayora de los trabajadores no utilizaba un sistema de modelo de Maillard (reduccin de azcar y aminocido o protena) para el estudio de acumulacin de fluorescencia. Narayan y Andreotti (1989) no encontraron una formacin lineal de

fluorescencia en sistemas modelo de glucosa / lisina y Matsuda et al. (1991) incluso detecto una reduccin de la fluorescencia en un sistema de lactulosa -lactoglobulina con almacenamiento prolongado. Por otro lado, Cerruti et al. (1985) observaron un aumento lineal de la fluorescencia con el tiempo de calentamiento en los sistemas de lisina / glucosa con alta actividad de agua. Los datos son difciles de comparar, sin embargo, debido a reactivos y condiciones de calentamiento eran diferentes. Se midi rastros de fluorescencia en el sistema L en condiciones de calentamiento ms graves. Como se ha mencionado en "Materiales y mtodos", una calibracin 100 veces ms precisas se requieren para medir FIC libre en el sistema L (Fig. l (a)). Estos resultados sugieren que la degradacin de las reacciones de isomerizacin y de la lactosa puede contribuir tanto al desarrollo de la fluorescencia. Se detectaron diferentes picos mximos de emisin y excitacin entre el sistema L y sistemas con protenas (CT, LW y M). Probablemente, la ruta de formacin de estos compuestos fluorescentes fue diferente, dependiendo de la presencia o ausencia de grupos amino en el medio de reaccin. Nuestros resultados estn de acuerdo con los resultados de Cerruti et al. (1985), quien encontr niveles de trazas de la intensidad de fluorescencia en un sistema modelo tamponada con glucosa sin grupos amino, pero no es posible determinar si la fluorescencia se produjo en el mismo orden de magnitud. Para comparar el desarrollo de la fluorescencia en los diversos sistemas, un estudio cintico se llev a cabo. Tuvimos que tomar en cuenta que los compuestos fluorescentes son intermedios en una reaccin muy compleja y es imposible medir todos los compuestos altamente reactivos formados en las etapas previas (fase inicial de la RM y reacciones de degradacin de Strecker) que intervienen en su gnesis. Una va esquemtica sugerida para la formacin de compuestos fluorescentes se muestra en la figura. 2. Por supuesto, esto es una simplificacin de la ruta desconocida para la formacin de FIC durante el RM. Nuestros datos indican que la constante de los valores de FIC libre de reaccin producido a partir de la RM (k1) es mayor que la velocidad de reaccin constante de FIC libre formado a partir de la degradacin de azcar (K2) como la nica ruta. Por otra parte, los resultados de la acumulacin de FIC libre en el sistema L eran entre 500 y 1.000 veces menor que para los sistemas con protena. Uno debe ser consciente de que los cambios qumicos en la leche son a menudo el resultado de muchas reacciones separadas, cada una con su propia energa de activacin (Ea). Todas estas reacciones pueden depender de diferentes maneras en las condiciones de reaccin. En consecuencia, una energa de activacin obtenida a partir de la dependencia de la temperatura de una tasa de reaccin debe ser considerada como un aparente, una media (Van Boekel y Walstra, 1995). Formacin del FIC libre podra ser descrita por una cintica de orden cero en sistemas con protenas (CT, LW y M), mientras que en el sistema L cintica de primer orden se ajusta mejor. Baisier y Labuza (1992) describen la cintica de orden cero para la fluorescencia en sistemas modelo con glucosa (0,4 M) y glicina (0,05-0,4 M) en tampn fosfato (0,1 M, pH 7). Petriella et al. (1985) afirmaron que el orden de reaccin para los compuestos fluorescentes formados en un sistema de glucosa / lisina fue entre de orden cero y de primer orden, probablemente 0.6. La extensin de la formacin de FIC est principalmente relacionada con la intensidad del proceso

trmico, donde aparecen temperaturas y tiempos de calentamiento para ser parmetros importantes. La Tabla 3 muestra los valores de las velocidades de reaccin (KT) calculados para cada temperatura, as como energas de activacin aparentes (Ea) calculado en el rango 90 - 140C para los sistemas de LC, LW y M y 120-140 C para el sistema L. Tambin se informa de otros parmetros cinticos de uso frecuente, tales como Q10 y Z. La Dependencia de la temperatura de la reaccin puede expresarse como Q10, que representa el factor por el que se aumenta la velocidad de una reaccin cuando se eleva la temperatura en 10 C, el valor Z se define como el aumento de la temperatura (C) necesaria para aumentar la velocidad de una reaccin por un factor de 10 (Walstra y Jenness, 1984). El valor Z y Q10 se calcularon de acuerdo con las ecuaciones 1 y 2. Los valores Q10 y Z resumidas en la Tabla 3 son los valores medios calculados para el rango de temperatura estudiado, ya que son dependientes de la temperatura. En este caso, los sistemas de M y LC son ms sensibles al cambio de temperatura. El grfico de Arrhenius del logaritmo de la tasa de la constante como una funcin del recproco de la temperatura absoluta (ecuacin 3) habilito las energas de activacin para ser calculadas (Fig. 3). Donde KT es la constante de velocidad de reaccin, A0 es el factor de Arrhenius pre-exponencial, R es la constante de gas ideal, T es la temperatura absoluta Ea es la energa de activacin aparente del proceso. La tasa de formacin de FIC libre en los sistemas de LC y LW y M a temperaturas de 90 y 140C sigue una relacin de Arrhenius con Ea de 78,6, 59,6 y 83,9 kJ mol-1, respectivamente. Para Ea aparente, los valores calculados para LC y M estaban cerca, mientras que el sistema LW tena un valor Ea aparente ms bajo. El comportamiento de la acumulacin de fluorescencia en el sistema LW indica que podra tener dos etapas diferentes, en alrededor de 90 C y 120 C, lo que significa dos Ea diferentes. Si tenemos en cuenta las altas temperaturas, Ea(120-140) es 88.9 kJ mol-1, que est cerca de los otro valores Ea en LC y M. Otros experimentos a temperaturas inferiores a 90 C se estn llevando a cabo en la actualidad para determinar este comportamiento con ms exactitud. No hay datos de la literatura disponibles con los que comparar nuestros resultados, porque la mayora de los otros estudios se han llevado a cabo bajo las condiciones de almacenamiento (Simonson y Tarassuk, 1952), por otra parte, el mecanismo y por lo tanto la tasa de la MR dependen del tipo de azcar y protena utilizada y en las diferentes relaciones entre ellos (Lerici et al., 1990). Patton y Chism (1952) demostraron que la formacin de fluorescencia mostr un perodo de induccin seguida de un perodo de aumento de la concentracin hasta que se alcanz un mximo, despus de lo cual la concentracin disminuy, y Cerrutti ef al. (1985) afirmaron que el perodo de induccin para la formacin de productos coloreados no es idntico a la del compuesto fluorescente, siendo ms larga para fluorescencia. No hemos observado ningn perodo de retraso en nuestros sistemas. Esta observacin puede ser debido a las condiciones de temperatura mucho ms altas utilizadas en nuestro experimento.

En la leche y los productos lcteos el oscurecimiento es tal vez ms importante en la leche evaporada, aunque la leche condensada azucarada, la leche UHT y los productos lcteos en polvo tambin estn sujetos a este defecto. Se han desarrollado mtodos para seguir las reacciones de pardeamiento en diferentes etapas, pero slo unos pocos datos de la literatura se pueden encontrar sobre la acumulacin de compuestos intermedios fluorescentes. Por encima, hemos indicado la posibilidad de utilizar valores de FIC libres como un ndice de calor inducido para evaluar el dao por calor en los alimentos procesados, as como el ndice de dorado bien conocido a 420 nm (Palombo et al., 1984) La validez del ndice FIC libre para caracterizar la leche tratada trmicamente se prob en un grupo de muestras comerciales de leche espaoles. En la figura. 4 un histograma de frecuencias de los niveles de FIC libre en la leche espaola UHT se representa. Los datos se expresan como porcentaje relativo de fluorescencia (FI%). La distribucin ms o menos se asemeja a una curva de Gauss con un valor medio de 28,4 3,8 FI% (corregido para el blanco). Adems, los niveles de FIC libres se determinaron para la leche pasteurizada y en-botella de leche esterilizada. Los valores promedio fueron 19,77 1,69 (n = 9, 17.9 - 22.0) para la leche pasteurizada y 44,08 4,65 (n = 6, 37.1 - 50.4) para en botella de leche esterilizada. Parece que el ndice FIC libre puede distinguir entre los diferentes tratamientos trmicos industriales, pero debemos tener en cuenta que todas las muestras de leche comerciales se compraron menos de 1 mes despus de haber sido procesados. En el mismo lote de muestras, HMF total tambin se midi de acuerdo con el procedimiento de RP-HPLC de Morales et al. (1992). HMF es til como un ndice para determinar la gravedad de tratamiento trmico de la leche (Fink y Kessler, 1986) y en los alimentos en general. Existe una correlacin significativa entre el HMF y libre FIC, se obtuvo de muestras UHT comerciales: Libre FIC (FI%) = 1.987 HMF (mol litro-1) + 18.201 (r = 0,935, n = 36, P <0.005). Algunos experimentos deben llevarse a cabo para determinar la estabilidad del ndice de FIC libre durante la vida til de la leche procesada ya que se sabe que el nivel de furosina, como un ndice de productos de Amadori, durante el almacenamiento de la leche UHT es dependiente del tiempo y la temperatura (Nangpal y Reuter, 1990). En conclusin, la acumulacin de compuestos fluorescentes en la leche y los sistemas que se asemejan parece tener dos rutas de reaccin diferentes. Desde un punto de vista cuantitativo, la va ms importante es la reaccin de Maillard, pero los compuestos fluorescentes tambin se forman en pequeas cantidades por transformacin Lobry Bruyn-Alberda van Ekenstein. Los resultados muestran que en M y el sistema de LC, ms FIC se forman que en el sistema de LW durante tiempos de reaccin prolongados en estas condiciones experimentales. En cualquier caso, la acumulacin de fluorescencia es claramente dependiente del tiempo y la temperatura del tratamiento en todos los sistemas de contenido de protena. Esta observacin podra ser un punto de partida para tener en cuenta la medida de la FIC libre como un ndice de calor de los productos lcteos sometidos a tratamiento trmico. Obviamente, este es un estudio introductorio y ms investigacin debe hacerse para ver si los ndices FIC libres son parmetros tiles para distinguir los procesos industriales en la leche y los productos lcteos.