Caracterizacin de Macromolculas

Tcnicas para la determinacin del Peso Molecular, Tamao Molecular y Estructura Molecular

La determinacin precisa del Peso Molecular es una componente clave de todos los experimentos de caracterizacin macromolecular. Por ejemplo, para protenas, la determinacin del peso molecular confirmar el nivel de purificacin y aislamiento de la protena y el grado de agregacin. Para polmeros, el peso molecular, es un determinante fundamental de muchas propiedades fsicas como la rigidez, resistencia, viscoelasticidad y dureza. Malvern Instruments proporciona soluciones adecuadas para la determinacin del peso molecular, tamao molecular y estructura molecular de todos los tipos de macromolculas - desde una

rpida estimacin del peso molecular de una protena usando unos pocos l de muestra a la caracterizacin completa de la distribucin de pesos moleculares y conformacin de polisacridos complejos o polmeros sintticos. Gel Permeation Chromatography/Size Exclusion Chromatography (GPC/SEC) es la mejor tcnica para la caracterizacin rpida y real del peso y estructura molecular para todo tipo de macromolculas - protenas, polmeros naturales y sintticos. Sea su inters en un sistema completo o en un detector adicional para mejorar un sistema, Malvern ofrece la gama ms completa para todas las necesidades de caracterizacin GPC/SEC de sus macromolculas. En el corazn de ste conjunto estn los sistemas GPC/SEC de Viscotek, incluyendo el

potente sistema "TDAmax" con el software "OmniSEC".

Protenas Polmeros

Peso molecular absoluto Composicin oligomrica y agregacin Tamao de protena y densidad Composicin conjugada Segundo coeficiente virial

Peso molecular absoluto Distribucin de peso molecular Ramificacin y estructura Tamao molecular Composicin del copolmero

Para el caso de polmeros sintticos y macromolculas naturales desnaturalizadas, consistentes en general en molculas carentes de estructura especfica, se puede decir que las fuerzas intramoleculares son muy dbiles. Como consecuencia existirn muchas configuraciones ( conformaciones) posibles para la molcula, que posean la misma energa, y que por consiguiente son igualmente probables. La situacin se presta a definir parmetros relativos al tamao y estructura, de carcter estadstico: distancia media extremo-extremo, y radio de giro medio

Estas magnitudes se pueden calcular teoricamente para un modelo terico: el random coil cadena aleatoria, tambin denominado ovillo estadstico. El modelo se construye tericamente utilizando monmeros tericos, o eslabones de la cadena, que podran ser de una longitud equivalente al enlace, molcula que se repite para construir la macromolcula. Cada eslabn se une al anterior adoptando una orientacin al azar, salvo por las restricciones impuestas por los enlaces qumicos. El resultado final es un ovillo aleatorio, random coil

La distancia media extremo-extremo se define como la raiz cuadrada de la media de los cuadrados de las distancias extremo-extremo (marcada en la figura con una linea discontinua para una configuracin particular): <h> = ( <h2> ) 1/2

El radio de giro medio = RG = ( <R2> )1/2, siendo R = mi ri2 / mi, donde mi es cada elemento de masa separado a una distancia ri del centro de masas de la molcula. Los resultados tericos del tratamiento estadstico del random coil resultan en frmulas que nos dan la distancia media extremo-extremo y el radio de giro medio. Para la distancia se obtiene <h> = cte Ma. Donde cte es una constante que depende de la longitud del monmero utilizado en la construccin terica, de los ngulos de enlace que se hallan permitido, y del tipo de interacciones que existan con el disolvente, y a es una constante que oscila entre 0.6 y 1, dependiendo de la flexibilidad admitida para el polmero. Ambas constante se pueden medir experimentalmente, sobre todo a partir de medidas de viscosidad, de forma que se pueden contrastar siempre los resultados tericos con las medidas experimentales. Una frmula explicita relaciona la distancia media extremo-extremo y el radio de giro medio: RG = <h2> / 6.

Microscopa (o tambin sin tilde microscopia)1 es el conjunto de tcnicas y mtodos destinados a hacer visible los objetos de estudio que por su pequeez estn fuera del rango de resolucin del ojo normal. Si bien el microscopio es el elemento central de la microscopa, el uso del mismo se requiere para producir las imgenes adecuadas, de todo un conjunto de mtodos y tcnicas afines pero extrnsecas al aparato. Algunas de ellas son, tcnicas de preparacin y manejo de los objetos de estudio, tcnicas de salida, procesamiento, interpretacin y registro de imgenes, etc. Exceptuando tcnicas especiales como las utilizadas en microscopio de fuerza atmica, microscopio de iones en campo y microscopio de efecto tnel, la microscopa generalmente implica la difraccin,reflexin o refraccin de algn tipo de radiacin incidente en el sujeto de estudio.

Microscopa ptica (microscopa de luz clsica), consiste en hacer pasar luz visible de una fuente (difractada,reflejada o refractada en el sujeto de estudio) a travs de lentes pticos simples o mltiples, para lograr una vista ampliada de la muestra.

La imagen resultante puede ser detectada directamente por el ojo humano, impresa en una placa fotogrfica o registrada y mostrada

digitalmente (y eventualmente almacenada en algn soporte digital). En la fig. mo1 puede verse un microscopio estereoscpico (adecuado principalmente para una visin binocular directa).

Imgenes de microscopio electrnico :

Fibra de poliester(MEB).

Granos de polen(MEB).

Imagen de Diatomea5000X (MEB).

Nemtodo parsito de la soja con falso color (MEB).

Cabeza una hormiga (MEB).

Fibra de amianto(MEB).

Ojo de Euphausia superba (MEB).

Cuerpo de unamosca de la fruta(MEB).

Ojo de una mosca de la fruta (MEB).

Sangre humana (MEB).

Microscopia electrnica de barrido (SEM).

Estructuras cristalinas. Estructuras de fracturas. Estructuras en perfiles y pelculas. Estudio de inclusiones, aglomerados y huecos en matrices polimricas. Estudio de la forma de cristales. Estructuras fibrilares. Porcentajes de cristalinidad.

Microscopia electrnica de transmisin (MET). Difraccin de rayos X (DRX).

Medida de dimensiones de cristales. Estudio de fases en mezclas polimricas. Agregados moleculares.

A modo de resumen muy general, podemos decir que desde un punto de vista estructural existen dos tipos de macromolculas: Aquellas que en disolucin no adoptan una conformacin definida, y que en estado slido forman slidos amorfos, slo parcialmente cristalinos; y aquellas que adoptan configuraciones concretas (a-hlices, lminas , etc.,), perfectamente definidas, y consecuencia de fuerzas intramoleculares especficas. Al primer tipo pertenecen la mayor parte de los polmeros sintticos, mientras que las macromolculas naturales en estado nativa suelen pertenecer al segundo. Una caracterstica de estas ltimas es que son susceptibles de desnaturalizacin en el laboratorio, convirtindose generalmente en macromolculas del primer tipo, carentes de estructura definida.

Microscopa Electrnica , aplicaciones avanzadas e imagen tridimensional

Este microscopio electrnico permite la localizacin y reconstruccin tridimensional a nivel ultraestructural, tanto empleando muestras incluidas en resinas como criomuestras. Por ello, no slo es de aplicacin en reas relacionadas con la morfologa como la reconstruccin 3D de orgnulos celulares sino que tambin es de inters en la caracterizacin de macromolculas en reas relacionadas con bioqumica y biologa molecular.

MICROSCIPIA

1.0 Generalidades El microscopio hizo posible conocer los mundos de dimensiones nfimas, entre ellos la clula, base de la vida. Los microscopios son aparatos que, en virtud de las leyes de formacin de imgenes pticas aumentadas a travs de lentes convergentes, permiten la observacin de pequeos detalles de una muestra dada que a simple vista no se percibiran. Surge en el siglo XVII los microscopios compuestos, utilizados por el holands Antonie van Leewenhock en el estudio de la microfauna de los estanques y charcas, unidas a las de Robert Hooke, establecieron la microscopia como poderosa herramienta cientfica. Zacharias y Hans Janssen construyeron en los aos 1590's el primer microscopio registrado.

2.0 Tipos de Microscopios Optico Confocal Electrnico de Transmisin Electrnico de Barrido Microscopa de campo prximo - De barrido efecto tnel - De fuerzas atmicas Microscopio estereoscpico

Campo claro :La muestra se observa ms oscura que el campo que la rodea. Campo oscuro: Posee un condensador paraboloide, hace que los rayos luminosos no penetren directamente en el objetivo, sino que iluminan oblicuamente la preparacin. De contraste de fase: Se basa en modificaciones de la trayectoria de los rayos de luz, los cuales producen contrastes notables en la preparacin. De fluorescencia: La fluorescencia es la propiedad que tienen algunas sustancias de emitir luz propia cuando inciden sobre ellas radiaciones energticas, tratar el material biolgico con flurocromos facilita la observacin al microscopio . Tipos de Micoscropio ptico

La muestra se observa ms oscura que el campo que lo rodea. Microscopio de campo claro

La muestra se observa brillantemente iluminada sobre un fondo oscuro. Microscopio de campo oscuro

Microscopio de contraste de fases Se observa una imagen con diferentes grados de brillo y oscuridad. El material denso aparece brillante, mientras que las partes de la clula que tienen una densidad cercana al agua (citoplasma) aparecen oscuras. Se utiliza para visualizar estructuras celulares sin necesidad de usar colorantes o matar microorganismos.

Microscopio ptico de fluorescencia Una molcula que fluorece emite luz de longitud de onda que se encuentra dentro del espectro visible, cuando es expuesta a una fuente de luz ultravioleta. Microscopio compuesto modificado con una fuente de radiaciones ultravioletas y un filtro. Se usan colorantes que emiten luz visible cuando se bombardean con rayos UV.

Microscopio confocal Se usa para estudiar la estructura de los materiales biolgicos. Emplea un sistema de iluminacin con rayo lser que es muy convergente y, en consecuencia produce un punto de barrido muy poco profundo. Se utiliza un sistema de espejos para mover el rayo lser a travs del espcimen, iluminando un solo punto por vez. Se registran los datos de cada punto de la muestra recorrida con este rayo mvil y se guardan en una computadora. Luego se puede llevar la imagen a un monitor de alta resolucin. Este mtodo tiene la ventaja de que se pueden tomar imgenes de la muestra en cortes muy finos. Las regiones fuera de foco se restan de la imagen mediante un programa para dar una definicin mxima a la imagen. Es posible tambin crear imgenes mltiples a diferentes profundidades dentro del espcimen y realizar reconstrucciones tridimensionales.

En 1932, Bruche y Johnsson construyen el primer microscopio electrnico a base de lentes electrostticas, ese mismo ao Knoll y Ruska dan a conocer los primeros resultados obtenidos con un microscopio electrnico Siemens, construido con lentes magnticas. As nace el microscopio electrnico, en 1936 ya se ha perfeccionado y se fabrican microscopios electrnicos que superan en resolucin al microscopio ptico. Utiliza un flujo de electrones en lugar de luz. Consta fundamentalmente de un tubo de rayos catdicos, en el cual debe mantenerse el vacio. Microscopio Electrnico

Permiten estudiar la estrutura celular. La resolucin y el aumento son mayores. Los virus, y los objetos ms pequeos, como las macromolculas solamente pueden verse a travs del microscopio elctronico. El Microscopio electrnico consta de: * Un filamento de tungsteno (ctodo) que emite electrones. * Condensador o lente electromagntica, que concentra el haz de electrones. * Objetivo o lente electromagntica, que ampla el cono de proyeccin del haz de luz. *Ocular o lente electromagntica, que aumenta la imagen. *Proyector o lente proyectora. que ampla la imagen. * Pantalla fluorescente, que recoge la imagen para hacerla visible al ojo humano. Aplicaciones

Microscopio Electrnico de Transmisin Utiliza un chorro de electrones en lugar de luz visible para definir el objeto. Requiere que se aumente el contraste por sombreado metlico utilizando un metal pesado. Pasos para la preparacin de rutina de los especimenes en la microscopia electrnica de transmisin Fijacin con glutaraldehdo. Lavado con un buffer. Fijacin con tetrxido de osmio. Fijar piezas detejidos no mayores de 1mm 3 Microfotografa electrnica de Transmisin de paredes celulares.

Microscopio electrnico analtico de transmisin de alta resolucin JEOL-2000 FXII Permite observaciones de hasta 0,28 nm. de resolucin. Puede focalizar el haz de electrones hasta 2 nm. de dimetro y trabaja con voltajes de aceleracin variables de 20 a 200 kV. Lleva acoplado un sistema computerizado de anlisis de energa de rayos

X dispersados eXL-10 de LINK ANALYTICAL que permite determinar la composicin qumica de la microregin sobre la que se focaliza el haz electrnico. Aumentos entre 5 000X y 1 000 000X

Microscopio Electrnico de Barrido Bombardea la superficie del espcimen con un rayo de electrones. Produce imgenes con una profundidad aparentemente tridimensional. Tcnica verstile para la visualizacin y el anlisis de las caractersticas microestructurales de muestras slidas(elevada resolucin es 2nm y campo de resolucin) . Tcnica de inters en campos como :Medicina, Biologa, Ciencias de Materiales, Metalurgia, Arqueologa, etc. Microfotografa electrnica de Barrido de paredes celulares.

Microscopio de fuerzas atmicas Instrumento mecnico- ptico que detecta fuerzas a nivel atmico (del orden de los nanoNewton) a travs de la medicin ptica del movimiento sobre la superficie. Obtiene imgenes tridimensionales de la superficie de muestras (Sin preparacin especial de las muestras). Lleva acoplado un microscopio ptico( permite la visualizacin del conjunto punta-muestra y poder situar la punta sobre una zona determinada de la muestra). Distingue detalles en la superficie de la muestra con una amplificacin de varios millones( Resolucin de menos de 1nm). Aplicaciones Anlisis de: Cristales de aminocidos. ADN y ARN Complejos Protena - cidos nucleicos. Cromosomas. Membranas celulares. Protenas y ppticos Cristales moleculares. Polmeros y biomateriales Componentes de las membranas de la clula.

Microscopio de barrido efecto tnel Forma parte de los instrumentos llamados 'nanoscopios( visualiza objetos del tamao de nanmetros (10 a la menos nueve metros). Inventado en 1981 por G. Binning y H. Rhrer, (IBM, Zurich) (galardonados con el Premio Nobel de Fsica en 1986 por su invencin). Dispone de una aguja tan afilada que en su extremo slo hay un tomo. La punta se sita sobre el material y se acerca hasta la distancia de 1 nanmetro (10 a la menos 9 metros). Una corriente elctrica dbil genera una diferencia de potencial de 1 voltio. Al recorrer la superficie de la muestra, la aguja reproduce la topografa atmica de la muestra. Aplicaciones Imgenes atmicas de molculas de ADN. Mover tomos individuales. Mapas precisos de superficies de metales o de semiconductores, cada tomo puede distinguirse de su vecino.

Microscopio estereoscpico Visin tridimensional de los objetos, para observaciones que requieren pequeos aumentos

3.0 Partes del micoscropio ptico

Partes del microscopio ptico. SISTEMA MECANICO Pe Brazo Tubo Lugar donde se deposita la preparacin. Platina Base sobre la que se apoya el microscopio. Sostiene el tubo en su porcin superior y por el extremo inferior se adapta al pie. Forma cilndrica En su extremidad superior se colocan los oculares. (Es ennegracido internamnete para evitar los reflejos de luz).

Platina:Presenta un orificio en el eje ptico del tubo que permite el paso de los rayos luminosos a la preparacin,puede ser fija, en cuyo caso permanece inmvil; en otros casos puede ser giratoria, es decir, mediante tornillos laterales puede centrarse o producir movimientos circulares. Escala Pinza

SISTEMA MECANICO Revlver Pieza giratoria en los cuales se enroscan los objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos .

SISTEMA DE Mecnico Tornillo micromtrico Tornillo macromtrico Freno. Aproxima el enfoque,permite un enfoque rpido de la preparacin. Se logra el enfoque exacto y ntido de la preparacin Tornillos de enfoque

SISTEMA PTICO Oculares: Los oculares estn constituidos generalmente por dos lentes, dispuestas sobre un tubo corto . Objetivos: Producen aumento de las imgenes de los objetos y organismos. Partes del microscopio ptico. Sistema de lentes

SISTEMA PTICO Objetivos Partes del microscopio ptico. Estn colocados en el revolver. Tienen un sistema de amortiguacin. Un anillo coloreado indica los aumentos. Poseen un aumento de 4x, 10x, 40x y 100x aumentos. Sistema de lentes:

SISTEMA PTICO Objetivos Partes del microscopio ptico. Sistema de lentes: Rojo 4x Amarillo 10x Blanco 100x (Inmersin) Azul 40x amortiguacin

SISTEMA PTICO Partes del microscopio ptico. Sistema de lentes: Estn colocados en la parte superior del tubo. Poseen un aumento de 10x, 15x y 20x. Oculares

SISTEMA PTICO Objetivos Partes del microscopio ptico. ACEITE DE INMERSIN Sistema de lentes: Hoy no son de madera de cedro, sino sintticos. Los hay de baja, media y alta viscosidad. Su empleo es imprescindible con el objetivo de inmersin (100x).

SISTEMA PTICO Sistema de Iluminacin: Fuente de luz Condensador Partes del microscopio ptico. Diafragma Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin. Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.

SISTEMA PTICO Fuente de luz Partes del microscopio ptico. Suele ser una lmpara halgena de intensidad graduable. Se enciende y apaga con un interruptor. En el exterior puede tener un filtro. Sistema de Iluminacin: lmpara Interruptor graduacin de la luz Filtro

SISTEMA PTICO Condensador Partes del microscopio ptico. Concentra la luz de la lmpara en un punto de la preparacin. Sistema de Iluminacin: condensador Diafragma o iris Dentro del condensador. Al cerrarse mejora el contraste, pero empeora la resolucin. diafragma

4.0 Pasos a seguir para su uso. Conectar el microscopio a la corriente elctrica. Colocar el objetivo de menor aumento en posicin de empleo y bajar la platina completamente.(Si se recogio correctamente ya debe estar en esas condiciones). Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con las pinzas metlicas. Encender la fuente de luz con la intensidad mnima y se va aumentando poco a poco. Comenzar la observacin con el objetivo de 4x (ya est en posicin) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparacin es de bacterias.

Pasos a seguir para su uso. 6. Para realizar el enfoque: Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el tornillo macromtrico( Mirando directamente y no a travs del ocular, se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacin y daar ambos). Mirando, a travs de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparacin con el

macromtrico y, cuando se observe algo ntida la muestra, girar el micromtrico hasta obtener un enfoque fino. 7. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debera estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micromtrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdi por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operacin desde el paso 5.

Pasos a seguir para su uso. 8. Empleo del objetivo de inmersin: Bajar totalmente la platina. Subir totalmente el condensador para ver claramente el crculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habr que echar el aceite. Girar el revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio camino entre ste y el de 40x. Colocar una gota mnima de aceite de inmersin sobre el crculo de luz. Terminar de girar suavemente el revlver hasta la posicin del objetivo de inmersin. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente. Enfocar cuidadosamente con el micromtrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersin y la preparacin es mnima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande.

Pasos a seguir para su uso. Una vez se haya puesto aceite de inmersin sobre la preparacin, ya no se puede volver a usar el objetivo. Finalizada la observacin de la preparacin se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revlver. Se puede retirar la preparacin de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersin en posicin de observacin. Limpiar el objetivo de inmersin con cuidado empleando un papel especial para ptica. Comprobar tambin que el objetivo 40x est perfectamente limpio. - Apagar el equipo y desconectarlo de la corriente.

Aumento Poder de resolucin Lmite de resolucin Nmero de campo Profundidad de campo Contraste 5.0 Parmetros pticos.

Se calcula multiplicando el aumento del objetivo por el aumento del ocular. 40 x 10 x 400x 5.1 Aumento

Es la capacidad del instrumento para dar imgenes distintas de puntos situados muy cerca uno del otro en el objeto. Depende de: la long. de onda (?) y de la apertura numrica (AN). 5.2 Poder de resolucin R AN 0.61 ? Es la capacidad de reunin de la luz de objetivo, tambin se encuentra grabada en la manga del lente.

Es la distancia mnima que debe existir entre dos puntos para que puedan ser discriminados como tales. El Lmite de Resolucin es la inversa del Poder de Resolucin, de manera que cuanto mayor sea ste, menor ser el Lmite de Resolucin. 5.3 Lmite de resolucin Lmite de Resolucin Poder de Resolucin 1

Es el dimetro de la imagen observada a travs del ocular, expresado en milmetros. 5.4 Nmero de campo Espesor de la preparacin enfocada en cualquier momento. 5.5 Profundidad de campo

Diferencia de absorcin de luz entre el objeto y el medio Puede aumentarse con las tinciones. 5.6 Contraste

6.0 Mantenimiento del microscopio El microscopio debe estar protegido del polvo, humedad y otros agentes que pudieran daarlo .( Guardado en estuche, campana y otros). Las partes mecnicas deben limpiarse con un pao suave.( Humedecer el pao con Xilol si se ha trabajado con aceite de inmersin). La limpieza de las partes pticas requiere precauciones especiales. Nunca deben tocarse las lentes del ocular, objetivo y condensador con los dedos. Para guardarlo se acostumbra colocar el objetivo de menor aumento sobre la platina y bajado hasta el tope; el condensador debe estar en su posicin ms baja, para evitar que tropiece con alguno de los objetivos . Guardar en lugares secos, para evitar que la humedad favorezca la formacin de hongos. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macromtrico, micromtrico, platina,

revlver y condensador). El cambio de objetivo se hace girando el revlver y dirigiendo siempre la mirada a la preparacin para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrndolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se est observando a travs del ocular. Mantener seca y limpia la platina del microscopio

7.0 Conclusiones El Microscopio es: un instrumento que se utilizan para obtener una imagen aumentada de objetos minsculos o detalles muy pequeos de los mismos. El microscopio simple o lente de aumento es el ms sencillo de todos y consiste en realidad en una lupa que agranda la imagen del objeto observado. Dos lentes convexas bastan para construir un microscopio. Cada lente hace converger los rayos luminosos que la atraviesan. Una de ellas, llamada objetivo, se sita cerca del objeto que se quiere estudiar. La imagen es observada por la segunda lente, llamada ocular, que acta sencillamente como una lupa. Zacharias y Hans Janssen construyeron en los aos 1590's el primer microscopio registrado. En 1932, Bruche y Johnsson construyen el primer microscopio electrnico a base de lentes electrostticas. Los virus, y los objetos ms pequeos, como las macromolculas solamente pueden verse a travs del microscopio elctronico. Leer ms: http://www.monografias.com/trabajos91/microscopia/microscopia.shtml#ixzz2yKpRJh5a

Un microscopio electrnico es aqul que utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible para formar imgenes de objetos diminutos. Los microscopios electrnicos permiten alcanzar ampliaciones hasta 5000 veces ms potentes que los mejoresmicroscopios pticos, debido a que la longitud de onda de los electrones es mucho menor que la de los fotones "visibles".
Tipos de microscopios electrnicos

(1) carcasa, (2) emisor de electrones, (3) electrones, (4) ctodo, (5) nodo, (6) Lente condensador, (7) muestra analizada, (8) Lente objetivo, (9) Lente proyector, (10) Detector (sensor o pelcula fotogrfica).

Existen dos tipos principales de microscopios electrnicos: el microscopio electrnico de transmisin y el microscopio electrnico de barrido.

Microscopio electrnico de transmisin[editar]

Artculo principal: Microscopio electrnico de transmisin

El microscopio electrnico de transmisin emite un haz de electrones dirigido hacia el objeto cuya imagen se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra. Para utilizar un microscopio electrnico de transmisin debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de ngstroms. Los microscopios electrnicos de transmisin pueden aumentar la imagen de un objeto hasta un milln de veces.

Microscopio electrnico de barrido (MEB)[editar]

Imagen de una hormiga tomada con un MEB (microscopio electrnico de barrido). Artculo principal: Microscopio electrnico de barrido

En el microscopio electrnico de barrido (MEB) la muestra es recubierta con una capa de metal delgado, y es barrida con electrones enviados desde un can. Un detector mide la cantidad de electrones enviados que arroja la intensidad de la zona de muestra, siendo capaz de mostrar figuras en tres dimensiones, proyectados en una imagen de TV. Su resolucin est entre 3 y 20 nm, dependiendo del microscopio. Permite obtener imgenes de gran resolucin en materiales ptreos, metlicos y orgnicos. La luz se sustituye por un haz de electrones, las lentes por electroimanes y las muestras se hacen conductoras metalizando su superficie.

La microscopa electrnica es una tcnica que requiere instrumentos de alta complejidad y personal altamente especializado. Se utilizan la microscopa electrnica de transmisin o convencional y la de barrido. Las muestras para microscopa electrnica deben fijarse en glutaraldehdo, que se solicita al laboratorio de Anatoma Patolgica con las instrucciones para la toma y fijacin de la muestra. Los fragmentos deben ser pequeos y tienen que fijarse en forma de varios trocitos cuboideos de tejido de no ms de 1 mm, obtenidos con hoja de afeitar o bistur limpios. Las muestras se incluyen en resinas sintticas (Epon) y se practican cortes 10 veces ms delgados que los de microscopa de luz llamados cortes ultrafinos. La tincin se realiza con sales de metales pesados como citrato de plomo, tetrxido de Osmio o acetato de uranilo, que permiten un contraste adecuado del tejido bajo el haz de electrones. Los cortes ultrafinos se montan sobre grillas de cobre, se tien y se observan al microscopio electrnico. Para documentar los hallazgos es necesario obtener fotografas en blanco y negro de las preparaciones. Las grillas, muestras, inclusiones y fotografas se guardan en un archivo especial durante aos.

Microscopa electrnica de transmisin

En esta tcnica la preparacin teida es traspasada por un haz de electrones, lo cual proporciona la imagen ultrafina sobre una pantalla ad hoc. El microscopio electrnico de transmisin es capaz de generar un haz de electrones a alta tensin (80kV) y concentrarlo sobre la preparacin mediante un complejo sistema de campos electromagnticos equivalentes a las "lentes" del microscopio de luz. La mayor utilidad de la microscopa electrnica de transmisin es en Oncologa. Es particularmente til en el diagnstico de neoplasias malignas, ya que permite identificar la estirpe o diferenciacin de una neoplasia. Por ejemplo, al demostrar elementos de diferenciacin no apreciables a microscopa de luz como desmosomas, propios de clulas epiteliales, que orientan hacia carcinoma; microvellosidades bien desarrolladas, que sugieren adenocarcinoma; melanosomas en melanoma y grnulos densos rodeados por membrana en carcinoma neuroendocrino. En conjunto con la inmunohistoqumica permite identificar un alto procentaje de las neoplasias malignas (95%). Igualmente, en el diagnstico diferencial de metstasis tumor

maligno indiferenciado en ganglio linftico ( melanoma maligno, carcinoma, linfoma). En el frecuente dilema adenocarcinoma versus mesotelioma maligno pleural; tambin en el diagnstico de la granulomatosis de clulas de Langerhans. Esta tcnica juega un papel muy importante en el estudio de las enfermedades del rin, en particular en glomerulopatas primarias y secundarias. Junto con la inmunofluorescencia directa representan el estudio bsico para llegar a un diagnstico preciso en cada caso. Otras aplicaciones son la identificacin de partculas virales intranucleares y citoplasmticas. Tambin en enfermedades metablicas para estudiar el tipo de inclusiones o cuerpos de inclusin en las clulas afectadas (Niemann-Pick, Tay-Sachs, amiloide, etctera). En enfermedades ampollares de la piel es el nico mtodo para diferenciar variedades de epidermlisis bulosa congnita. En ciertas enfermedades respiratorias se ha detectado un trastorno importante del transporte mucociliar. Ultraestructuralmente, se observan cilios con alteraciones en nmero y disposicin del esqueleto ciliar microtubular y ausencia de los brazos internos de dinena y de las espculas radiales del esqueleto microtubular constituyendo el llamado sndrome de cilios inmviles o disquinesia ciliar. Estas anomalas representan un trastorno de carcter congnito y la microscopa electrnica es el nico mtodo que permite hacer un diagnstico preciso en estos pacientes. En muchos casos la informacin negativa, o sea la ausencia de algn carcter morfolgico especfico, puede ser tambin muy til . El examen cuidadoso y la evaluacin de las caractersticas ultraestructurales a la luz del cuadro clnico y la imagen histopatolgica al microscopio de luz y los estudios inmunohistoqumicos, permiten un diagnstico de certeza en la mayora de los casos.

Microscopa electrnica de barrido

La microscopa electrnica de barrido permite el estudio de superficies celulares. La imagen se obtiene rastreando la superficie de la muestra con un haz electrnico ultrafino. Las seales generadas se recolectan, amplifican y captan en un tubo de rayos catdicos. Se utiliza en forma rutinaria en el estudio de enfermedades del tallo piloso. En estas condiciones hay anomalas estructurales y de superficie de los pelos, que pueden identificarse fcilmente con esta tcnica. De esta forma, es posible incluso establecer un pronstico de reversibilidad de las alteraciones utilizando esta tcnica.

Microscopio ptico

Microscopio ptico.Descripcin:A) ocular, B) objetivo, C) portador del objeto,D) lentes de la iluminacin, E) sujecin del objeto, F) espejo de la iluminacin.
Un microscopio ptico es un microscopio basado en lentes pticos. Tambin se le conoce comomicroscopio de luz, (que utiliza luz o "fotones") o microscopio de campo claro. El desarrollo de este aparato suele asociarse con los trabajos de Anton van Leeuwenhoek. Los microscopios de Leeuwenhoek constaban de una nica lente pequea y convexa, montada sobre una plancha, con un mecanismo para sujetar el material que se iba a examinar (la muestra o espcimen). Este uso de una nica lente convexa se conoce como microscopio simple, en el que se incluye la lupa, entre otros aparatos pticos.