Cuaderno de Prcticas

MICROBIOLOGA CLNICA Curso 2012-13

FACULTAD DE FARMACIA
Alumno:

LUNES

ASPECTOS GENERALES
Normas de bioseguridad en el laboratorio Medios de contencin Niveles de bioseguridad Gestin y tratamiento de los residuos Aspectos generales infecciones urinarias Toma de muestra de orina

REALIZACIN DE LA PRCTICA
ANLISIS CUANTITATIVO ORINA ANLISIS CUALITATIVO ORINA

L-1 L-2 L-3

Siembra de la muestra de orina (Bote n 2) en Agar CLED Siembra de la muestra de orina (Bote n 1)
en Agar Cromognico y Agar MacConkey

Toma de muestra de mucosa farngea Siembra de dos placas de Agar Sangre Siembra de una placa de Agar Salino Manitol

ANLISIS CUALITATIVO MUCOSA FARNGEA

L-4 L-5

NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA CLNICA LABORATORIO DE NIVEL DE BIOSEGURIDAD 2

Los agentes biolgicos se clasifican en cuatro grupos de riesgo en funcin de los siguientes factores:

Virulencia Dosis infectiva del microorganismo Disponibilidad de tratamiento Modo de transmisin en el laboratorio Riesgo de difusin en la comunidad Viabilidad del microorganismo en el entorno

GRUPO DE RIESGO 1

PATOGENICIDAD No suelen causar enfermedad en personas sanas Causan infecciones moderadas o graves Las infecciones suelen ser de buen pronstico Generalmente no se transmiten por va area Se suelen transmitir por contacto o ingestin Es difcil su propagacin en la comunidad Existen tratamiento y profilaxis eficaces Causan infecciones graves Algunos se transmiten por va area Pueden propagarse en la comunidad La terapia es de eficacia variable Causan infecciones graves o muy graves Muchos se transmiten por va area Se propagan fcilmente en la comunidad La terapia no es muy eficaz

GRUPO DE RIESGO

ALGUNOS EJEMPLOS BACTERIAS: Escherichia coli Staphylococcus epidermidis Lactobacillus bulgaricus Streptococcus lactis Streptomyces sp. HONGOS: Saccharomyces cerevisiae Penicillium roqueforti BACTERIAS: Bordetella pertussis Clostridium botulinum Clostridium tetani Corynebacterium diphtheriae Staphylococcus aureus Streptococcus sp. Haemophilus influenzae Salmonella enterica Shigella sp. Yersinia enterocolitica Legionella Neisseria sp. Treponema pallidum

HONGOS: Aspergillus sp. Candida sp. Cryptococcus neoformans VIRUS: Adenovirus Rotavirus Virus de la hepatitis A Virus de la gripe Virus del sarampin Virus de las paperas Virus de la rubola PARSITOS: Cryptosporidium sp. Entamoeba histolytica Toxoplasma gondii Trichinella

BACTERIAS: Bacillus anthracis Brucella Escherichia coli enterotoxignica Francisella tularensis Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium leprae Rickettsia Salmonella typhi Shigella dysenteriae Yersinia pestis HONGOS: Blastomyces dermatitidis Coccidioides immitis Histoplasma capsulatum VIRUS: Virus de Virus de Virus de Virus de Virus de Virus de Virus de Virus de la la la la la la la la encefalitis de California encefalitis equina americana estomatitis vesicular hepatitis B hepatitis C hepatitis D fiebre amarilla inmunodeficiencia humana (HIV)

PARSITOS: Echinococcus Leishmania brasiliensis Leishmania donovani Plasmodium falciparum Taenia solium Tripanosoma cruzi

VIRUS: Virus de la viruela Virus de la fiebre hemorrgica de Crimea (Congo) Virus de Marburg Virus bola

Segn el grupo de riesgo al que pertenezca un determinado microorganismo su estudio deber ser llevado a cabo en laboratorios con mayores o menores medidas de bioseguridad.

MICROORGANISMOS

RIESGO PROVOCADO

TIPO DE LABORATORIO

GRUPO DE RIESGO 1

INDIVIDUAL Bajo COLECTIVO Bajo

BSICO (Enseanza)

GRUPO DE RIESGO 2

INDIVIDUAL Moderado COLECTIVO Moderado

SEGURIDAD (Hospital)

GRUPO DE RIESGO 3

INDIVIDUAL Elevado COLECTIVO Elevado

ALTA SEGURIDAD (Diagnstico especializado)

GRUPO DE RIESGO 4

INDIVIDUAL Elevado COLECTIVO Elevado

MXIMA SEGURIDAD (Servicio estatal)

Los microorganismos incluidos dentro del grupo de riesgo 2 constituyen la mayora de los que se manipulan habitualmente en los Laboratorios de Microbiologa Clnica. Por lo que se refiere a las prcticas de nuestra asignatura estos son los microorganismos que normalmente podremos encontrar en las muestras personales que se han tomado, y que se van a manipular tratando de establecer la identificacin y susceptibilidad antimicrobiana de algunos de ellos.

MEDIOS DE CONTENCIN El trmino contencin se utiliza para describir los mtodos que hacen segura la manipulacin de los agentes infecciosos en el laboratorio y su objetivo es reducir al mnimo la exposicin del personal y del entorno a agentes potencialmente patgenos. Para la seguridad de los laboratorios de Microbiologa Clnica son importantes tres elementos de contencin:

1. BARRERAS PRIMARIAS: Constituyen la primera lnea de proteccin y pertenecen a esta categora los siguientes elementos: Batas Gorros Guantes Gafas Mascarillas Cabinas de Seguridad Biolgica

2. BARRERAS SECUNDARIAS: Se refieren a las normas que deben cumplirse para la construccin de un Laboratorio de Microbiologa Clnica tales como: Alicatado Paredes Grifos Interruptores Aparatos que generan ruido Aparatos que generan calor etc.

3. PROCEDIMIENTOS ESTNDAR: Se refieren a la metodologa de funcionamiento del laboratorio y de la manipulacin de las muestras clnicas. 1. Personal autorizado. El laboratorio de Microbiologa Clnica es un espacio restringido y solo pueden permanecer en l personas autorizadas. Estas personas deben conocer al responsable de seguridad del laboratorio. Meticulosidad en el trabajo. Las personas deben trabajar concentradas en las manipulaciones que estn realizando y realizar todo su trabajo con meticulosidad para minimizar el riesgo de salpicaduras, pinchazos, cortes, formacin de aerosoles, etc. Costumbres improcedentes. Las personas no deben llevarse a la boca lpices u otros objetos. Cabinas de bioseguridad. Las actividades que generan aerosoles o salpicaduras, tales como la esterilizacin del asa y la agitacin en vortex, deben realizarse en cabinas de bioseguridad. Tambin deben utilizarse cabinas de bioseguridad cuando se manipulen muestras clnicas sospechosas de contener agentes infecciosos de transmisin area, tales como las muestras respiratorias. Material punzante y cortante. Es muy importante desechar el material punzante o cortante (agujas, hojas de bistur, etc.) en recipientes especficos para ese material. No envainar las agujas una vez utilizadas. Material contaminado Desechar el material contaminado en recipientes adecuados. Recipientes de seguridad para material de vidrio. Recipientes de plstico o metlicos para esterilizacin o incineracin. Lavado de las manos Se deben lavar las manos despus de cada tarea o accidente. Siempre se deben lavar las manos ANTES DE SALIR DEL LABORATORIO. Utilizar jabn neutro y frotar al menos durante 20 segundos antes de aclarar con agua. Informar al Responsable de Seguridad del Laboratorio Cualquier accidente o anomala debe comunicarse responsable de seguridad del laboratorio. al

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

NIVELES DE BIOSEGURIDAD Existen cuatro niveles de bioseguridad que se corresponden con los cuatro grupos de riesgo en que se clasifican los agentes infecciosos. MUESTRA CLNICA SOSPECHOSA DE CONTENER MICROORGANISMOS Grupo de Riesgo 1 Grupo de Riesgo 2 Grupo de Riesgo 3 Grupo de Riesgo 4 TIPO DE LABORATORIO RECOMENDADO PARA SU ESTUDIO Bsico Seguridad Alta Seguridad Mxima Seguridad NIVEL DE BIOSEGURIDAD QUE DEBE TENER EL LABORATORIO 1 2 3 4

GESTIN Y TRATAMIENTO DE LOS RESIDUOS Ante la posibilidad de contraer infecciones en el laboratorio al manipular una muestra clnica o un cultivo, parece razonable realizar un tratamiento particularizado de los residuos infecciosos antes de eliminarlos como residuos urbanos. Objetos punzantes y cortantes Los objetos punzantes y cortantes, como agujas, pipetas Pasteur de vidrio y otros, constituyen un claro riesgo de inoculacin accidental de microorganismos. Se depositan en recipientes especficos resistentes a la puncin y con cierre hermtico. Es muy importante cerrar correctamente estos recipientes, que deben ser autoclavados o incinerados antes de desecharlos. Lquidos infecciosos Los lquidos infecciosos deben recogerse en recipientes hermticos y someterlos a esterilizacin. Residuos slidos Los residuos slidos (muestras clnicas, medios de cultivo sembrados, etc.) deben ser incinerados o esterilizados por autoclave antes de ser desechados.

ASPECTOS GENERALES DE LAS INFECCIONES URINARIAS En una persona sana el tracto urinario est libre de microorganismos. nicamente existe microbiota normal de forma permanente en la mucosa de la uretra. Las infecciones del tracto urinario estn causadas generalmente por bacterias de la microbiota intestinal que, ascendiendo por la uretra, alcanzan la vejiga urinaria y en algunos casos progresan afectando a los urteres y los riones. Las infecciones urinarias se presentan con mayor frecuencia en las mujeres que en los hombres. Ello es debido a la cortedad de la uretra lo cual facilita el trnsito de la microbiota intestinal hasta la uretra. Por otra parte, existen ciertos modos de conducta o estados fisiolgicos que pueden favorecer la aparicin de infecciones en el tracto urinario: Relaciones sexuales Cambios morfolgicos durante el embarazo Hipertrofia de la prstata Reflujo vesicouretral Introduccin de sondas permanentes

Las infecciones extrahospitalarias suelen ser monomicrobianas, mientras que las infecciones intrahospitalarias suelen ser polimicrobianas. RECOGIDA DE LA MUESTRA DE ORINA SEGN TCNICA DEL CHORRO MEDIO La tcnica ms utilizada para la recogida de muestras de orina es la llamada TCNICA DEL CHORRO MEDIO. Esta tcnica, que vamos a describir seguidamente, es la correcta para establecer conclusiones vlidas acerca del diagnstico de un paciente. Sin embargo, y por conveniencia de la prctica de laboratorio que vamos a realizar, la toma de la muestra de orina la haremos, intencionadamente, de forma incorrecta (frasco n 1) para aumentar la probabilidad de encontrar microorganismos con los cuales poder seguir trabajando el resto de los das de la semana, y de forma correcta (frasco n 2) para realizar un anlisis cuantitativo de la muestra de orina que se est procesando.

TCNICA DEL CHORRO MEDIO (METODOLOGA CORRECTA) Se procede primero al lavado de las manos. Seguidamente, se lava con agua y jabn la zona genital, se enjuaga con abundante agua y se seca bien. Recogida del chorro medio: Se empieza a orinar y se recoge en el bote solo la muestra del chorro medio, es decir, NO SE DEBE RECOGER NI LA PRIMERA NI LA LTIMA PARTE DEL CHORRO DE ORINA . Se tapa bien el bote, se rotula y se lleva al laboratorio lo ms pronto posible. Si van a transcurrir ms de dos horas hasta su llegada al laboratorio el transporte debe realizarse manteniendo la muestra en fro (la refrigeracin no es necesaria en el caso de la muestra recogida para las prcticas). RECOGIDA DE LA MUESTRA DE ORINA PARA LA REALIZACIN DE LA PRCTICA Para la realizacin de la prctica realizaremos dos tomas de muestra en dos botes. Ambas tomas se recogern por la maana temprano y habiendo tenido como mnimo una retencin de 6-8 horas sin orinar. Se proceder en la forma siguiente:
1. En el bote que llamaremos n 1 se recoger la primera porcin de orina. En este bote, la orina recogida habr arrastrado la microbiota existente en la mucosa uretral. Aunque esta no es la forma correcta para hacer una evaluacin del nmero de bacterias existentes en la orina, nos permitir realizar un ANLISIS CUALITATIVO de la muestra estudiada. En el bote que llamaremos n 2 se recoger la muestra del chorro medio. Esta muestra la vamos a considerar vlida para realizar el ANLISIS CUANTITATIVO de la muestra en estudio aunque no se haya realizado el lavado de los genitales. El resto de la orina no se recoge.

2.

3.

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L-1
ANLISIS CUANTITATIVO DE ORINA Siembra de la muestra de orina (Bote n 2) en Agar CLED Se trata de sembrar una cierta cantidad de la muestra de orina para hacer un recuento total del nmero de microorganismos presentes. El nmero obtenido se referir al ndice de Kass y se establecern conclusiones acerca de posibles infecciones del tracto urinario (ITU). Medio de cultivo utilizado. Utilizaremos como medio de cultivo una placa de Agar CLED (Cistina-Lactosa-Deficiente en Electrolitos) que es un medio no selectivo y diferencial que permite realizar la identificacin presuntiva de los principales patgenos que causan infecciones del tracto urinario. En este medio, la deficiencia en electrolitos dificulta el movimiento de bacterias muy mviles, como Proteus, que acabaran invadiendo toda la placa, enmascarando e impidiendo el recuento de otras colonias. METODOLOGA: 1. Introducir verticalmente en el bote de orina n 2 un asa de plstico estril y calibrada de 1 L. El bote n 2 se corresponde con la orina tomada del chorro medio. Sembrar una placa de Agar CLED en la forma indicada: Repartir la gota en la placa en forma diametral Con la misma asa hacer estras para aislar colonias Incubar la placa inoculada a 37 C durante 24 horas.

2.

11

L-2
ANLISIS CUALITATIVO DE ORINA Siembra de la muestra de orina (Bote n 1) en Agar Cromognico y Agar MacConkey Se trata de sembrar una muestra de orina en medios de cultivo para aislamiento de colonias y posterior identificacin de una enterobacteria que pudiera estar presente en la muestra de orina. Medios de cultivo utilizados. Utilizaremos una placa de Agar Cromognico (medio no selectivo y diferencial) y otra de Agar MacConkey (medio moderadamente selectivo y diferencial). El carcter diferencial se traduce en que las colonias crecidas presentan diferentes pigmentaciones en funcin de su capacidad para utilizar ciertos sustratos (presentes en el Agar Cromognico) y la lactosa (presente en el Agar MacConkey).

MEDIO CULTIVO

AGENTES INHIBIDORES

CRECIMIENTO GRAM +

CRECIMIENTO GRAM -

CARCTER DIFERENCIAL

AGAR MACCONKEY AGAR CROMOGNICO

Sales biliares Cristal violeta NO

+ +

S SI

METODOLOGA Sembrar la placa de Agar MacConkey de la siguiente manera: 1. 2. Con un asa (de plstico) calibrada de 10 L agitar el bote n 1 desde el fondo. Tomar 10 L de la muestra con el asa y descargarlos en un sector de la placa (sector 1) realizando estras. Repetir la descarga dos veces ms. En total se habrn descargado 30 L. Despus de la tercera descarga, sembrar otros sectores de la placa (del sector 2 hasta el sector 7) arrastrando inculo en cada ocasin del sector anterior, en la forma que se indica en el esquema, pero sin tomar ms inculo.

3.

12

Descargar 30 L de la muestra en el sector 1

4 7

5 6
Inoculacin para aislamiento de colonias en Agar MacConkey

Sembrar la placa de Agar Cromognico de la siguiente manera: 1. Dividir la placa de Agar Cromognico en dos, dibujando un dimetro en la base de la placa con el rotulador negro. Por parejas, cada alumno sembrar la mitad de la placa. Tomar 10 L de la muestra con el asa y realizar estras continuas desde un extremo a otro de su mitad de la placa. Se puede sembrar horizontal o verticalmente. Despus de la tercera descarga, sembrar otros sectores de la placa (del sector 2 hasta el sector 7) arrastrando inculo en cada ocasin del sector anterior, en la forma que se indica en el esquema, pero sin tomar ms inculo.

2.

3.

Tras la incubacin en Agar MacConkey, las bacterias que fermentan la lactosa producen cidos que cambian el pH del medio, por lo que se produce el viraje del indicador. En funcin de la mayor o menor cantidad de cidos liberados, el pH baja ms o menos y las colonias

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aparecen finalmente con diferentes colores. Esta diferencia en la coloracin nos permite establecer una identificacin presuntiva del microorganismo que ha dado lugar a la formacin de la colonia. De igual manera, la utilizacin de los sustratos en el Agar cromognico produce la diferente coloracin de las colonias crecidas. En das sucesivos realizaremos observaciones microscpicas y pruebas bioqumicas tratando de identificar alguna de las enterobacterias que pudieran estar presentes originariamente en la muestra de trabajo.

ANLISIS CUALITATIVO DE MUCOSA FARNGEA Toma de muestra de microbiota presente en la mucosa farngea Realizaremos una toma de muestra de la mucosa farngea donde existe una poblacin microbiana muy abundante. El objetivo de la prctica es sembrar esta muestra en medio de cultivo para el aislamiento de colonias y posteriormente realizar observaciones microscpicas y pruebas bioqumicas tratando de identificar cocos Gram positivos pertenecientes a los gneros Staphylococcus y/o Streptococcus. METODOLOGA 1. 2. Con ayuda de un depresor estril presionar la lengua hacia abajo. Utilizando un hisopo de algodn estril tocar la mucosa farngea realizando una ligera presin al tiempo que se gira la punta del hisopo. La toma de muestra descrita compaeros de forma recproca. se realiza entre dos

L-3

3. 4.

Inmediatamente despus se siembra la muestra en dos placas de agar sangre en la forma que se describe en el siguiente apartado.

14

ANLISIS CUALITATIVO DE MUCOSA FARNGEA Siembra de las placas n 1 y n 2 de Agar Sangre Medio de cultivo utilizado: AGAR SANGRE Medio Componentes especficos Utilizacin preferente No selectivo Sangre desfibrinada de oveja al 5% Eritrocitos intactos Utilizacin general Observacin de hemlisis

L-4

METODOLOGA 1. Siembra de la placa de Agar Sangre n 1. Descargar el hisopo en un sector prximo al borde de la placa y despus continuar sembrando el resto de la placa haciendo estras muy prximas de forma que no quede agar sin inocular entre ellas. El sector donde hemos descargado inicialmente el hisopo lo llamaremos zona densa.

15

Zona densa donde se ha descargado el hisopo

2.

Siembra de la placa de Agar Sangre n 2. Tomar con el asa de metal inculo de la zona densa de la placa n 1 y sembrar la placa n 2 haciendo estras continuas y prximas entre si comenzando en un borde de la placa. Direccin antero-posterior de la siembra en estras

ANLISIS CUALITATIVO DE MUCOSA FARNGEA Siembra de una placa de Agar Salino Manitol Medio de cultivo utilizado Utilizaremos una placa de agar salino manitol. Este medio es altamente selectivo debido a la elevada concentracin de cloruro sdico que contiene (7,5%). Este medio resulta muy recomendable para el aislamiento de Staphylococcus aureus a partir de muestras clnicas que lleven poblaciones bacterianas mixtas. Numerosas especies bacterianas son inhibidas en su crecimiento en este medio. Los estafilococos coagulasa positivos (S. aureus) resisten la elevada concentracin salina del medio y, adems, al fermentar el azcar manitol, acidifican el medio formando colonias de color amarillo que aparecen tambin rodeadas de una zona de color amarillo. Los estafilococos coagulasa negativos (S. epidermidis, S. saprophyticus) son capaces de soportar la alta concentracin salina pero no son capaces de fermentar el manitol. Las colonias son transparentes presentando la tonalidad rojiza propia del medio de cultivo.

L-5

16

Los enterococos (Enterococcus) tambin pueden soportar la alta concentracin salina y algunas especies de este gnero pueden fermentar el manitol y dar lugar a la aparicin de colonias amarillas. METODOLOGA 1. Realizaremos una nueva toma de muestra de mucosa farngea en la misma forma que ya se ha descrito para realizar la siembra de la placa de agar sangre n 1. Sembraremos la placa de agar salino manitol deslizando uniformemente el hisopo por toda la superficie de la placa en una direccin antero-posterior.

2.

LUNES APUNTES PERSONALES

17

18

MARTES

REALIZACIN DE LA PRCTICA
ANLISIS CUANTITATIVO ORINA

M-1 M-2

Lectura de la placa de Agar CLED Identificacin presuntiva de las colonias crecidas en las placas de Agar Cromognico y Agar MacConkey Tincin de Gram de colonias aisladas en las placas de Agar Cromognico y Agar MacConkey Prueba de la citocromo-oxidasa a la presunta enterobacteria

M-3
ANLISIS CUALITATIVO ORINA

M-4

M-5

Siembra de la colonia seleccionada en Agar MacConkey

M-1
ANLISIS CUANTITATIVO DE ORINA Lectura de la placa de Agar CLED Se trata de conocer el nmero de microorganismos que estn presentes en cada mL de orina y, en funcin del resultado, establecer conclusiones tericas acerca de si existe o no infeccin en el tracto urinario. Desde 1956 se vienen siguiendo los parmetros establecidos por KASS:

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N DE BACTERIAS EN ORINA

N> 10 /mL
5

Bacteriuria significativa Probable infeccin Diagnstico dudoso Debe repetirse el anlisis con otra toma Bacteriuria no significativa Probable contaminacin

10 /mL

>

> 10

/mL

N< 10 / mL
4

AGENTES MICROBIANOS AISLADOS FRECUENTEMENTE EN CASOS DE INFECCIONES URINARIAS INDIVIDUO SIN FACTORES PREDISPONENTES INDIVIDUO CON FACTORES PREDISPONENTES
Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Otras enterobacterias Enterococos Candida albicans Staphylococcus epidermidis

FRECUENTES Proteus mirabilis

Escherichia coli

Klebsiella pneumoniae

POCO Enterococos FRECUENTES Staphylococcus saprophyticus

Corynebacterium urealyticum

METODOLOGA: 1. Cada alumno contar el nmero de unidades formadoras de colonias crecidas en la placa de Agar CLED que sembr ayer lunes con el asa calibrada de 1 L. Se contarn todas las colonias. Para realizar el recuento podemos ayudarnos de un transiluminador existente en el laboratorio. Puede darse la circunstancia de que no aparezcan colonias crecidas, o por el contrario que el nmero sea tal alto 20

que no puedan ser contadas con exactitud. En tales circunstancias el profesor indicar la conclusin que debe establecerse. 2. Conocido el nmero de colonias que han crecido en la placa debemos considerar que tales colonias han crecido a partir de la muestra de orina tomando la cantidad de 1 L. Para establecer las conclusiones tericas siguiendo los parmetros de KASS debemos referir el nmero de colonias encontrado a la cantidad de 1 mL.

Ejemplo prctico
Cantidad de orina tomada con el asa Nmero de colonias crecidas en la placa 1 L 0,001 mL 56 56 x 10 Nmero de bacterias / mL orina 56.000
3

(= N) (= N)

0,56 x 105

N > 105 (100.000)

Parmetros de KASS

Bacteriuria significativa Bacteriuria no significativa Bacteriuria dudosa

N < 104 (10.000)

10 >
5

> 10

Conclusin del ejemplo

Bacteriuria dudosa

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ANLISIS CUALITATIVO DE ORINA Identificacin presuntiva de las colonias crecidas sobre las placas de Agar Cromognico y Agar MacConkey Esta prctica la iniciamos ayer lunes sembrando muestras de orina en dos placas con diferentes medios de cultivo. Recordemos que las dos placas que habamos sembrado eran: Agar MacConkey y Agar Cromognico. La identificacin presuntiva que vamos a realizar estar basada en los diferentes colores que presenten las colonias, lo cual es el resultado de las diferencias existentes en la capacidad de las bacterias para utilizar la lactosa presente en el Agar de MacConkey y descomponer los sustratos presentes en el Agar Cromognico.

M-2

Utilizacin de la lactosa
1. La lactosa, que es un nutriente externo, debe penetrar dentro de la clula bacteriana para ser metabolizada. Para ello es necesario una enzima (beta-galactsido-permeasa) que transporta la lactosa desde el exterior hasta el citoplasma bacteriano. Una vez en el citoplasma bacteriano la lactosa debe ser desdoblada en sus dos componentes (glucosa y galactosa), para lo cual es necesaria la existencia de otra enzima (betagalactosidasa). Los dos monosacridos resultantes pueden ser metabolizados por diferentes rutas catablicas, producindose una mayor o menor cantidad de liberacin de cidos. Por todo lo anterior, resulta evidente que para que un microorganismo pueda utilizar la lactosa debe poseer las dos enzimas. Si carece de alguna de ellas el microorganismo no puede utilizar la lactosa. Con respecto al enzima beta-galactsido-permeasa, existen ciertos microorganismos con una actividad permeasa intensa (fermentadores fuertes o rpidos) y otros con una actividad dbil (fermentadores dbiles o tardos). Ello se traduce, en una rpida y abundante liberacin de cidos o en una liberacin lenta y escasa, respectivamente.

2.

3.

4.

22

FERMENTACIN DE LA LACTOSA POR ENTEROBACTERIAS

Microorganismo Fermentador de lactosa Fuerte Fuerte Tipo fermentacin de la glucosa Acido mixta Butiln-gliclica Liberacin cidos Muchos Pocos Liberacin CO2 Poco Mucho

Escherichia coli Enterobacter aerogenes Klebsiella pneumoniae Citrobacter Serratia Salmonella Shigella Proteus Edwarsiella Providencia

Fuerte Lento Lento

Butiln-gliclica cido mixta cido mixta Butiln-gliclica

Pocos Muchos Muchos Pocos

Mucho Poco Poco Mucho

NO FERMENTAN LA LACTOSA

MICROORGANISMO Escherichia coli Enterobacter Klebsiella Citrobacter Serratia Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Proteus

MACCONKEY Roja-Rosada Precipitado Rosadas No mucosa Rosada Mucosa Incolora-Roja Roja-Rosada No mucosa Rosada Puntiforme Rosada Puntiforme Incolora

CLED Amarillas Grandes Amarillas Grandes Amarillentas Azuladas Grandes Amarillas Azul intenso Amarillas Pequeas Amarillas Pequeas Azules

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CRECIMIENTO EN AGAR CROMOGNICO E. coli Enterococos Coliformes Proteus Morganella Providencia Pseudomonas Estafilococos S. saprophyticus Estreptococos

-Galactosidasa Hidrlisis lactosa

- Glucosidasa Hidrlisis celobiosa

Triptofano Desaminasa Trp

Pigmentacin colonia

+ + + + +

Rosa Azul Turquesa Azul oscuro Prpura Halo marrn Verde Marrn Blanco Crema Rosa Blanco plido Blanco

METODOLOGA: Se observarn las colonias crecidas en Agar MacConkey y Agar Cromognico y en base al color se establecern identificaciones presuntivas.

M-3
ANLISIS CUALITATIVO DE ORINA Tincin de Gram de colonias aisladas y crecidas en las placas de Agar Cromognico y Agar MacConkey METODOLOGA: 1. Se harn tinciones de Gram de colonias individuales que hayan crecido en estas dos placas. Deben observarse bacilos cortos Gram negativos (color rojo) para su posible correspondencia con enterobacterias.

24

2.

Muy importante. Cada alumno deber controlar con exactitud la relacin existente entre lo que se est observando al microscopio y la colonia de la cual fue realizada la tincin (de qu placa procede y qu color tena la colonia).

TINCIN DE GRAM
Tomar con el asa una pequea cantidad de la colonia a estudiar Realizar una extensin sobre una gota de agua en el portaobjetos Secar en la parte alta del mechero o en una plancha con control de temperatura Fijar la extensin pasando el portaobjetos por la llama del mechero Cristal violeta 2 minutos Lavar abundantemente con agua Lugol (mordiente) 2 minutos

Lavar abundantemente con agua Alcohol 96 (decoloracin) 10-20 segundos

Lavar abundantemente con agua Safranina 2 minutos Lavar abundantemente con agua Secar en la parte alta del mechero Aadir aceite de inmersin y observar con el objetivo 100X

25

M-4
ANLISIS CUALITATIVO DE ORINA

Prueba de la citocromo-oxidasa
de presunta enterobacteria aislada en Agar Cromognico o Agar MacConkey Se realizar la prueba de la oxidasa a aquella colonia: a) b) Aislada sobre Agar Cromognico o Agar MacConkey. Identificada presuntamente como una enterobacteria (en funcin del color de la colonia en el medio correspondiente y de su comportamiento en la tincin de Gram).

METODOLOGA: Prueba de la citocromo-oxidasa La citocromo oxidasa es un complejo formado por los citocromos a y a3 (citocromo-oxidasa = complejo a+a3). Este complejo es el ltimo de la cadena respiratoria y transfiere directamente los electrones al oxgeno molecular. A Depositar unas gotas del reactivo tetrametil-parafeniln diamina (existente en unas ampollas de plstico) sobre un trozo de papel de filtro. Este reactivo es incoloro en estado reducido. Tomar con un palillo de madera (las asas de hierro dan falsos positivos) una muestra de la colonia a investigar y extenderla encima de las gotas del reactivo. Si el microorganismo posee el enzima citocromooxidasa, el enzima capta los electrones del reactivo y los transfiere directamente al oxgeno molecular. Como resultado el reactivo se oxida. El reactivo es azul intenso en estado oxidado. El resultado debe observarse en un tiempo inferior a 30 segundos. Un tiempo ms prolongado conduce a una oxidacin espontnea del reactivo y a un falso positivo. Interpretacin: No hay cambio de color Azul intenso Oxidasa Oxidasa +

26

M-5
ANLISIS CUALITATIVO DE ORINA Siembra de 1 colonia (presunta enterobacteria procedente de Agar Cromognico o Agar MacConkey) en Agar MacConkey

El objetivo de esta siembra es tener masa suficiente de la presunta enterobacteria para realizar otras pruebas. METODOLOGA: Tocar con un asa estril una porcin de la colonia a la que se haya realizado tincin de Gram, con el resultado de la aparicin de bacilos Gram negativos, y que haya dado la prueba de la oxidasa negativa, y hacer estras en direccin antero-posterior sobre una placa de Agar MacConkey.

MARTES APUNTES PERSONALES

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28

MIRCOLES

REALIZACIN DE LA PRCTICA X-1 X-2

ANLISIS CUALITATIVO MUCOSA FARNGEA

Observacin de halos de hemlisis en las placas de Agar Sangre n 1 y n 2 Tincin de Gram de presuntos cocos Gram + crecidos en: placa de Agar Sangre n 2 Observacin de la placa de Agar Salino Manitol y tincin de Gram de colonias aisladas Siembra de cocos Gram + en sectores sobre la placa de agar sangre n 3

X-3

X-4

X-1
ANLISIS CUALITATIVO DE MUCOSA FARNGEA Observacin de halos de hemlisis en las placas de Agar Sangre n 1 y n 2

En el agar sangre se puede conocer la capacidad de ciertas bacterias para producir enzimas extracelulares (hemolisinas) que actan sobre los glbulos rojos provocando distintos tipos de hemlisis:

Beta hemlisis

Lisis completa de los glbulos rojos Halo transparente alrededor de la colonia

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Lisis parcial de los glbulos rojos Se abren poros en la membrana Alfa hemlisis Salida de hemoglobina al medio Oxidacin del grupo hemo Formacin de biliverdina (color verdoso) Halo verdoso alrededor de la colonia

Aproximacin interpretativa segn relacin tamao colonia / tamao halo de hemlisis: Relacin Colonia grande / Halo hemlisis pequeo Colonia pequea / Halo hemlisis grande Podra tratarse de Staphylococcus Streptococcus

Aproximacin interpretativa segn observaciones Colonia

Grande Amarillenta-Incolora Beta-hemoltica Pequea Blancas-Griscea No hemoltica Grande Blancas-Amarillenta Anaranjada No hemoltica

Morfologa celular
Clulas esfricas Racimos irregulares Clulas esfricas Racimos irregulares

Podra ser
Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis

Clulas esfricas Racimos irregulares

Staphylococcus saprophyticus

30

Pequea Grisceas-Translcida Beta-hemoltica Pequea Grisceas-Translcida Alfa-hemoltica Pequea Gris Alfa-hemoltica No hemoltica

Clulas esfricas Clulas ovoides Aisladas-Parejas Cadenas Clulas esfricas Clulas ovoides Aisladas-Parejas Cadenas Clulas esfricas Clulas ovoides Aisladas-Parejas Cadenas

Streptococcus pyogenes

Streptococcus pneumoniae Grupo Viridans: S. mutans S. salivarius S. bovis S. mitis

METODOLOGA: 1. Se observarn las placas de agar sangre denominadas n 1 y n 2. Dada la tcnica utilizada para la siembra la placa n 1 deber tener crecimiento en masa, mientras que sobre la placa n 2 deberan observarse colonias aisladas.

X-2
ANLISIS CUALITATIVO DE MUCOSA FARNGEA

Tincin de Gram
de presuntos cocos Gram + crecidos en: la placa de Agar Sangre n 2

METODOLOGA: 1. Tincin de Gram de colonias bien aisladas sobre la placa de agar sangre n 2. Igual que con las dems tinciones, es muy importante controlar la correspondencia entre la colonia y la observacin que se est haciendo al microscopio. Interpretacin:
Agrupacin Racimos Morfologa celular Esfricas Posible Staphylococcus

2.

31

Aislados Parejas Cadenas cortas Cadenas largas

Esfricas/ Ovaladas

Streptococcus

X-3
ANLISIS CUALITATIVO DE MUCOSA FARNGEA Observacin de la placa de Agar Salino Manitol y tincin de Gram de colonias aisladas Este medio resulta muy adecuado para el aislamiento de S. aureus a partir de muestras nasales, farngeas y fecales. Este microorganismo es capaz de soportar la alta concentracin salina del medio (7,5 % NaCl) y de fermentar el manitol (formacin de cidos y viraje del indicador con formacin de halos amarillos alrededor de la colonia que tambin adquiere color amarillo). Otras especies tambin pueden crecer en este medio con produccin de cidos, por lo que la identificacin definitiva deber ser confirmada por pruebas bioqumicas. Microorganismo S. aureus S. epidermidis S. urealyticus S. xylosus S. lentus S. simulans S. saprophyticus S. haemolyticus Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Enterococcus avium Enterococcus durans Fermentacin Manitol SI No Si Si Si Si Variable Variable Si Variable Si Variable Colonia Halo amarillo Incoloras Halo amarillo Halo amarillo Halo amarillo Halo amarillo Halo amarillo o incoloro Halo amarillo o incoloro Halo amarillo Halo amarillo o incoloro Halo amarillo Halo amarillo o incoloro

32

METODOLOGA: 1 2. Observacin de las colonias crecidas en el medio atendiendo al color que presentan. Realizar tincin de Gram de colonias aisladas y observar al microscopio para determinar la morfologa y la agrupacin celular, si existe.

ANLISIS CUALITATIVO DE MUCOSA FARNGEA de cocos Gram positivos en sectores sobre la placa de Agar Sangre n 3 Los cultivo identificados como cocos Gram + sern seleccionados para sembrar una nueva placa de agar sangre que llamaremos n 3. Pretendemos con ello, pasadas 24 horas de incubacin, obtener cultivos puros y abundantes de cocos Gram + que sern sometidos a pruebas de caracterizacin enzimtica para poder identificarlos. METODOLOGA: 1. Rotulacin de la placa: Tomaremos la placa de agar sangre n 3 y la dividiremos en sectores, tantos como colonias diferentes hayamos identificado pertenecientes a cocos Gram positivos, sea cual sea su morfologa celular (esfrica u ovalada), sea cual sea su agrupacin (racimos, clulas aisladas, parejas, etc.) y sea cual sea su procedencia (Agar Sangre o Agar Salino Manitol). Para dividir la placa en sectores se rotular la base en forma radial.

X-4

Siembra

33

PLACA ROTULADA EN TRES SECTORES

SECTOR 1

SECTOR 2

SECTOR 3 2. Siembra de los sectores: Cada sector ser inoculado con un cultivo diferente de cocos Gram positivos.

MIRCOLES APUNTES PERSONALES

34

35

36

JUEVES

REALIZACIN DE LA PRCTICA J-1

ANLISIS CUALITATIVO ORINA

Siembra de Agar KLIGLER a partir de colonias crecidas en Agar MacConkey Siembra de la galera API 20 E a partir de colonias crecidas en Agar MacConkey Siembra de una placa de Agar M.H. a partir de colonias crecidas en Agar MacConkey Siembra de una placa de Agar M.H. a partir de colonias crecidas en Agar MacConkey

J-2
PRUEBA DE BAUER-KIRBY (ANTIBIOGRAMA)

J-3

PRUEBA DE PSILON (DETERMINACIN DE LA CMI)

J-4

J-5
ANLISIS CUALITATIVO MUCOSA FARNGEA

Siembra de la galera API STAPH a partir de placa de Agar Sangre n 3

J-6

Siembra de la galera API STREP a partir de placa de Agar Sangre n 3

ANLISIS CUALITATIVO DE ORINA Siembra de un tubo de Agar Kligler a partir de colonias crecidas en Agar MacConkey El medio Kligler se utiliza preferentemente para la identificacin de enterobacterias. La lectura del medio no es suficiente para la identificacin de especies ni siquiera para la identificacin de gneros. No obstante, despus de ser inoculado con una enterobacteria su 37

J-1

lectura establece un abanico de varios gneros de enterobacterias capaces de dar los resultados observados.

La lectura del medio Kligler nos proporciona datos interesantes del microorganismo inoculado
Capacidad de utilizar fermentativamente la glucosa Capacidad de utilizar fermentativamente la lactosa Capacidad de producir SH2 durante el metabolismo Capacidad de producir un abundante desprendimiento de gases

Composicin fundamental del medio Kligler

Peptona Lactosa/Glucosa (10/1 g/L) Sulfato ferroso Tiosulfato sdico METODOLOGA: 1. Inculo a utilizar El medio ser inoculado individualmente por cada alumno con la presunta enterobacteria que tiene aislada y crecida abundantemente en su placa de Agar MacConkey. 2. Fondo y superficie del tubo de agar inclinado Al tratarse de un medio slido con la superficie inclinada podemos distinguir en el tubo dos partes diferenciadas: Fondo Pico de flauta 3. En condiciones de anaerobiosis En contacto con el oxgeno Fuente de C y energa Fuente de C y energa Fuente de Fe Fuente de S

Inoculacin del tubo de Agar Kligler Utilizando un hilo de siembra, tomar inculo de la placa de Agar MacConkey donde se ha aislado en cultivo puro una

38

enterobacteria procedente Posteriormente: a b c

de

la

muestra

de

orina.

Inocular el tubo en picadura sin llegar a tocar el fondo Retirar el hilo de siembra en lnea recta Inocular la superficie en estras

c Las estras aparecen continuas Pero se hacen en zig-zag sin interrupcin

J-2
SIEMBRA DE LA GALERA API 20 E A partir de colonias crecidas en Agar MacConkey El API 20 E es un conjunto de pruebas de caracterizacin enzimtica que se utiliza para la identificacin de enterobacterias y de otros bacilos Gram negativos. El sistema API 20 E est constituido por una galera que contiene 20 micropocillos, cada uno con diferentes metabolitos estriles y deshidratados que sern ensayados para determinar si existe (o no) la actividad enzimtica especfica en la bacteria que estamos tratando de identificar.

39

5- Identification de la souche Rsultats de la galerie:

Cpula Tubo

METODOLOGA: 1. Eleccin del inculo Para la inoculacin de la galera API 20 E cada alumno dispone de una placa de Agar MacConkey que sembr con una presunta enterobacteria. Sin embargo, la inoculacin de la galera ser realizada conjuntamente por cada lateral de mesa constituido por seis alumnos. Esto nos lleva a la necesidad de tener que seleccionar una nica placa de MacConkey por lateral de 1 7 mesa. Ser 5 3 5 cada 7 2 seleccionada aquella cuyo conjunto de datos haya sido el ms convincente para pensar que se trata de una enterobacteria Rsultats reports sur la fiche didentification (color de la colonia en las placas, observacin de la morfologa celular al microscopio y prueba de la oxidasa) . Para ello, los Code n:lateral 5 215 773 (55) alumnos de cada consultarn sus datos y decidirn cul ser la placa seleccionada. 2. Preparacin de la suspensin a) b) Preparar la placa de Agarpour MacConkey Se rfrer au catalogue identifierseleccionada. la souche laide du code Utilizar una ampolla conteniendo 5 ml de Medio para Suspensin. Introducir la ampolla abierta en Densimat para ir midiendo la Densidad ptica (D.O.). Con un hisopo tocar varias colonias existentes en la placa y suspender la masa microbiana en la ampolla. Repetir la operacin hasta conseguir una suspensin coincidente con 0,5 de la escala de McFarland.

c) d)

40

3.

Preparacin del soporte de la galera Es necesario incubar la galera API 20 E en condiciones de humedad dada la pequea cantidad de suspensin que contendrn los micropocillos. De lo contrario, durante la incubacin durante 24 horas a 37 C, se secaran y las pruebas no se podran leer. Para ello, existen unos soportes con pequeos alvolos que se llenarn con agua de grifo. El exceso de agua se desecha.

4.

Colocacin de la galera API 20 E encima del soporte Se depositar la galera encima del soporte que contiene los alvolos llenos de agua. El soporte, que ya contiene la galera, ser colocado en posicin ligeramente inclinada. 41

5.

Llenado de micropocillos con la pipeta de inoculacin:

6.

Inoculacin de los micropocillos a) Llenado del Tubo de los 20 micropocillos Depositar inculo gota a gota dejndolo deslizar por la pared lateral de cada micropocillo. Llenar toda la parte del micropocillo que hemos denominado Tubo (para ello interrumpir el llenado del micropocillo al llegar al nivel donde comienza la parte denominada Cpula). Debe llenarse el micropocillo sin que se formen burbujas, ya que ello propiciara un ambiente oxigenado en el fondo del micropocillo. Adicin de inculo en la cpula En algunos pocillos se debe aadir ms inculo para llenar tambin la Cpula. Estos son los pocillos cuyas iniciales de la actividad enzimtica que se investiga aparecen encerradas en una especie de compartimiento. Por ejemplo:

b)

42

CIT
c) Adicin de parafina en la Cpula En algunos pocillos hay que aadirl parafina en la cpula para crear durante la incubacin un ambiente anaerobio. Son aquellas cuyas iniciales de la actividad enzimtica investigada aparecen subrayadas. Por ejemplo:

ADH
d) Rotular la galera e incubar a 37 C.

J-3
PRUEBA DE BAUER-KIRBY (ANTIBIOGRAMA) Siembra de una placa de Agar Meller-Hinton (M.H.) para determinar el dimetro de los halos de inhibicin Con la realizacin de esta prueba tratamos de determinar cmo afectan diferentes antimicrobianos al crecimiento de un microorganismo. Esta prueba realizada con gran frecuencia en hospitales durante el tratamiento de pacientes con procesos infecciosos utiliza agentes microbianos aislados de estos pacientes. La utilidad radica en referir los resultados que se obtengan en el laboratorio a unas tablas ya confeccionadas y que permiten establecer conclusiones acerca de la efectividad, o no, de tratar a un paciente con un determinado antibitico. Para realizar esta prctica vamos a seguir la tcnica descrita por Bauer y Kirby, utilizando como inculo bacteriano la presunta enterobacteria aislada de las muestras de orina y crecidas en la placa de Agar MacConkey. Medio de cultivo utilizado. Utilizaremos como medio de cultivo el llamado Agar de MellerHinton. Es el medio recomendado por la OMS para realizar pruebas de susceptibilidad antimicrobiana. Existen varias razones que llevan a la utilizacin de este medio, pero una de las ms importantes es que en este medio no se forma PABA (cido para-amino-benzoico) el cual inhibe la actividad de algunos antibiticos y sulfamidas. 43

METODOLOGA: 1. Trazar una circunferencia sobre el papel de filtro existente en el puesto de trabajo utilizando como molde la misma placa de M. H. que va a ser sembrada. Al retirar la placa sealar sobre el papel de filtro tres puntos internos en posicin triangular que sean, aproximadamente, equidistantes entre ellos y equidistantes del borde de la circunferencia.

2.

4. Con un hisopo de algodn estril tomar colonias de la placa de Agar MacConkey e inocular un tubo de caldo hasta alcanzar una turbidez equivalente a 0,5 en la escala de McFarland. Introducir el hisopo en el tubo, empapar bien y descartar el exceso de lquido presionndolo contra el vidrio. Deslizar el hisopo suavemente por toda la superficie de la placa. Repetir la siembra dos veces, girando la placa 120 cada vez.

Se trata de repartir el inculo por toda la superficie de la placa en forma densa y uniforme, para obtener un crecimiento confluente. 4. Colocacin de los discos de antibitico trabajando en la proximidad del mechero. a) Los discos vienen envasados en unos dispensadores de plstico. Depositar tres discos de antibiticos diferentes en la tapadera de la placa que va a ser utilizada. Situar la placa sembrada encima de la circunferencia dibujada en el papel de filtro. Con unas pinzas (pasadas previamente por la llama del mechero) coger cada disco de antibitico y depositarlo en 44

b) c)

la placa sembrada, hacindolo coincidir con cada uno de los puntos dibujados en posicin triangular, los cuales se ven por transparencia. d) e) f) Con la punta de la pinza presionar ligeramente cada disco de antibitico depositado en la placa ya sembrada. Si algn disco se coloca mal situado no se puede volver a coger para desplazarlo al sitio correcto. Rotular la placa e incubar a 37 C.

J-4
TIRA PSILON (DETERMINACIN DE LA CMI) Siembra de una placa de Agar Meller-Hinton a partir de colonias crecidas en Agar MacConkey Mediante esta prueba se puede determinar el valor de la Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) que es la mnima concentracin de antibitico que impide el crecimiento visible de un microorganismo. El valor de la CMI, que es un parmetro obtenido en el laboratorio para cada combinacin de especie bacterianaantibitico, es de gran utilidad. Igual que ocurra con los dimetros de los halos de inhibicin, los valores de la CMI tambin pueden ser utilizados para establecer el tratamiento antibitico ms adecuado de administrar a un paciente que padece un determinado proceso infeccioso. Como inculo bacteriano se utiliza la misma suspensin que hemos preparado anteriormente para realizar la prueba de Bauer-Kirby. Como antibitico utilizaremos unas tiras de papel que estn impregnadas de un nico antibitico. Lo trascendente de estas tiras rectangulares de papel es que por una de sus caras existen lneas transversales de ese antibitico en concentraciones decrecientes; mientras que por la otra cara de la tira aparecen unas cifras numricas que se corresponden exactamente con las concentraciones de antibitico existentes sobre la otra cara. METODOLOGA: 1. La prctica ser realizar colectivamente por cada mesa. De esta forma los 12 alumnos llevarn a cabo la determinacin de un nico valor de la CMI.

45

2. 3.

Elegiremos como inculo uno de los tubos de caldo preparados anteriormente para realizar la prueba de Bauer-Kirby. Siembra del inculo Se realizar la siembra de otra placa de M.H. siguiendo la misma metodologa ya descrita anteriormente para la realizacin de la prueba de Bauer-Kirby.

4.

Colocacin de la tira psilon. Estas tiras vienen en unos envases y de ellos cogeremos una nica tira con cuidado de no tocarla por sus caras. Debemos manejarla con pinzas y cogerla por uno de sus extremos. Con posterioridad, colocaremos la tira rectangular con las cifras numricas hacia arriba sobre el centro de la placa. Halo elptico de difusin del antibitico. La parte ensanchada de la elipse se corresponde con la zona donde el antibitico presenta una mayor concentracin

Halo elptico de inhibicin del crecimiento

Zona de crecimiento microbiano

Tira de psilon con un gradiente de concentracin expresado en g/mL

Valor numrico de la MIC (0,06 g/mL)

46

J-5
ANLISIS CUALITATIVO DE MUCOSA FARNGEA Siembra de la galera API STAPH a partir de la placa de Agar Sangre n 3 El API STAPH es una galera semejante a la descrita en el API 20 E. La diferencia consiste en las actividades enzimticas que se detectan en cada micropocillo. Es una prueba que nos permite identificar la especie de Staphylococcus que ha sido inoculada. Recordemos que ayer mircoles cada alumno sembr una placa de agar sangre por sectores, denominada n 3. Los sectores fueron inoculados con cocos Gram positivos, con independencia de si pertenecan a alguna especie de Staphylococcus o de Streptococcus. Para la eleccin del inculo que va a ser utilizado debemos saber qu sectores existentes sobre la placa de agar sangre n 3 se corresponden con Staphylococcus y qu sectores se corresponden con Streptococcus. Para obtener este dato realizamos la prueba de la catalasa, la cual nos diferencia entre los dos gneros: Staphylococcus Streptococcus Prueba de la catalasa La catalasa es un enzima que descompone el perxido de hidrgeno en H2O y O2 (oxgeno molecular). Ciertos anaerobios facultativos que no poseen actividad catalasa son capaces de descomponer el perxido de hidrgeno por accin de otras enzimas, llamadas peroxidadas, pero que se muestran menos efectivas y ms tardas en su mecanismo de accin que la catalasa. METODOLOGA: a) b) c) Depositar unas gotas de perxido de hidrgeno encima de un portaobjetos. Con un palillo de madera (no asas de metal que dan falsos positivos) tomar una muestra del inculo a investigar. Depositar el inculo encima de las gotas de perxido de hidrgeno. Catalasa + Catalasa

47

Burbujeo intenso en menos de 30 segundos No burbujeo en menos de 30 segundos Burbujeo dbil pasados 2-3 minutos 1.

Catalasa + Catalasa Catalasa -

Investigacin de sectores catalasa +/- sobre la placa de agar sangre n 3. Cada alumno debe investigar sobre los sectores crecidos en su placa de agar sangre n 3 cules de ellos son catalasa + y cules son catalasa -. Para ello, deber seguir la metodologa descrita anteriormente y anotar el resultado de cada sector.

Placa de Agar Sangre N 3 Prueba individual de cada alumno Investigacin de cada sector Sectores que han sido inoculados con cocos Gram + PRUEBA DE LA CATALASA

+
API STAPH

API STREP

La siembra del API STAPH ser realizada conjuntamente por cada lateral de mesa, utilizando como inculo aquel sector catalasa + cuyos resultados previos hayan sido los ms satisfactorios. 2. Eleccin del sector catalasa + a utilizar como inculo. a) Despus de realizar la prueba de la catalasa habrn salido varios sectores catalasa + en el conjunto de las seis placas de agar sangre n 3 investigadas. Se elegir aquel sector que resulte ms apropiado: La prueba catalasa + haya sido muy clara. Que el sector tenga un crecimiento abundante.

b)

48

Que dicho sector, recordando datos de das pasados, se corresponda al microscopio con cocos Gram + de forma esfrica y agrupados en racimos.

3.

Preparacin de la suspensin. a) Abrir una ampolla API STAPH MEDIUM y colocarla en DENSIMAT para medir D.O. b) Con un hisopo recoger masa microbiana de un sector catalasa + y resuspenderla en el lquido de la ampolla hasta conseguir una densidad ptica coincidente con la escala 0,5 de McFarland.

4.

Inoculacin de la galera. Seguir exactamente la misma metodologa descrita para la inoculacin del API 20 E.

5.

Rotular e incubar (24 horas a 37 C).

49

J-6
ANLISIS CUALITATIVO DE MUCOSA FARNGEA Siembra de la galera API STREP a partir de la placa de Agar Sangre n 3 El API STREP es una galera semejante a las ya descritas como API 20 E y API STAPH. Las diferencias radican en las actividades enzimticas que se detectan en cada micropocillo. Es un sistema que nos permite identificar la especie de Sreptococcus que ha sido inoculada. Asimismo, esta galera tambin nos permite identificar otros gneros de cocos Gram +, tales como Enterococcus, Aerococcus, Gemella, etc. Para elegir el inculo que va a ser utilizado debemos saber qu sectores existentes sobre la placa de agar sangre n 3 se corresponden con cocos Gram + y catalasa -, datos que ya hemos obtenido anteriormente. Tambin en este caso la inoculacin de la galera ser realizada conjuntamente por los alumnos de un lateral de mesa. METODOLOGA: 1. Eleccin del sector catalasa - a utilizar como inculo. a) Despus de realizar la prueba de la catalasa habrn salido varios sectores catalasa - en el conjunto de las seis placas de agar sangre n 3 investigadas. Se elegir aquel sector que resulte ms apropiado: La prueba catalasa - haya sido muy clara. El sector tenga un crecimiento muy abundante. Que dicho sector, recordando datos de das pasados, se corresponda al microscopio con cocos Gram + de forma ovalada.

b)

2.

Preparacin de la suspensin. a) Abrir una ampolla CONTENIENDO 2mL de MEDIO SUSPENSIN y colocarla en DENSIMAT para medir D.O.

50

b)

Con un hisopo recoger masa microbiana de un sector catalasa - y resuspenderla en el lquido de la ampolla hasta conseguir una densidad microbiana coincidente con la escala 4 de McFarland.

3.

Inoculacin de la galera. a) Siguiendo la metodologa descrita a propsito del API 20 E inocular los 10 primeros micropocillos (son ms pequeos que los restantes). Abrir una ampolla de vidrio conteniendo GP Medium y verter el contenido sobre el resto de suspensin que ha sobrado despus de la inoculacin de los primeros 10 micropocillos. Inocular con esta nueva suspensin el resto de los micropocillos. Los micropocillos que han de inocularse completamente y a los que hay que aadir parafina siguen la misma metodologa descrita a propsito del API 20 E.

b)

c) e)

4.

Rotular e incubar (24 horas a 37 C).

JUEVES APUNTES PERSONALES

51

52

VIERNES
REALIZACIN DE LA PRCTICA
PRUEBA DE BAUER-KIRBY PRUEBA DE PSILON

V-1 V-2 V-3 V-4 V-5 V-6

Lectura del de la placa de M.H. Lectura de la CMI Lectura del Agar KLIGLER Lectura del API 20 E Lectura del API STAPH Lectura del API STREP

ANLISIS CUALITATIVO ORINA

ANLISIS CUALITATIVO MUCOSA FARNGEA

V-1
LECTURA DEL DE LA PLACA DE M.H. METODOLOGA: Utilizando una regla milimetrada se mide el dimetro del halo de inhibicin incluyendo el dimetro del disco: Un halo de dimetro pequeo no significa que la bacteria sea resistente a ese antimicrobiano. Un halo de dimetro grande no significa que la bacteria sea sensible a ese antimicrobiano.

Para concluir si la bacteria es resistente o sensible a un determinado antimicrobiano se realiza la medida del dimetro del halo de inhibicin y se acude a unas tablas ya previamente confeccionadas.

53

TABLA DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA PARA ENTEROBACTERIAS

HALO INHIBICIN (mm) ANTIMICROBIANO CONTENIDO DEL DISCO 10 g R 13 I 14-16 S 17

VALOR DE CMI (g/mL) R 32 S 8

Ampicilina (AM) Amoxicilina-cido clavulnico (AMC) Gentamicina (GM) Neomicina (N) Kanamicina (K) Estreptomicina (STR) Tetraciclina (TE) cido nalidxico (NA) Cloranfenicol (C) Penicilina (P) Vancomicina (V)

20/10 g

13

14-17

18

32/16

8/4

10 g 30 g 30 g 10 g 30 g 30 g 30 g 30 g 30 g

12 12 13 10 14 13 12 17 14

13-14 13-16 14-17 11-14 15-18 14-18 13-17 18-20 15-16

15 17 18 15 19 19 18 21 17

8 25 16 32 32 -

4 6 4 8 8 -

54

V-2
LECTURA DE LA CMI METODOLOGA Observar la zona de inhibicin del crecimiento en forma de elipse. La parte ms ancha de la elipse se encuentra en la zona de concentracin ms elevada del antibitico en la tira, y la parte ms estrecha de la elipse intercepta un punto de la tira con el cultivo que corresponde al valor de la CMI en la escala de nmeros. Leer la CMI obtenida para la combinacin establecida entre el antibitico existente en la tira y el inculo bacteriano investigado.

55

V-3
LECTURA DEL AGAR KLIGLER FUNDAMENTOS BIOQUMICOS Para llegar a la comprensin de las reacciones bioqumicas debemos considerar: 1) 2) La concentracin de Lactosa es muy superior a la de Glucosa (10/1). La superficie, en contacto con el oxgeno, sufre una alcalinizacin de forma biolgica, de tal manera que las bacterias que estn en superficie realizan el metabolismo oxidativo de las protenas con liberacin de aminas que alcalinizan el medio y neutralizan la dbil acidificacin que exista. Debido a la alcalinizacin, la zona superficial tiende a mantenerse de color rojo. El medio vira a color amarillo cuando se acidificacin (pH < 6,8). produce una

3) 4)

El medio lleva tiosulfato de sodio. Algunas enterobacterias (con independencia de su metabolismo normal) son capaces de utilizar el tiosulfato como aceptor de electrones. Como consecuencia se forma SH2, el cual reacciona con los compuestos de hierro que estn presentes y forman un precipitado negro compuesto de sulfuro ferroso.

UTILIZACIN DE NUTRIENTES 1. La glucosa empieza a utilizarse como fuente de carbono hasta su agotamiento. Como consecuencia de la fermentacin, se liberan cidos que hacen bajar el pH y todo el tubo aparece de color amarillo. Al mismo tiempo, como fuente de nitrgeno, se empiezan a utilizar las peptonas (pptidos) a travs de la descarboxilacin oxidativa, aunque solo en la superficie del tubo donde hay oxgeno. Esto produce la alcalinizacin del medio que hace subir el pH. Esta subida del pH provoca que la superficie vuelva a presentar color rojo. Si el microorganismo es capaz de utilizar la lactosa, se produce una fuerte acidificacin y el color rojo de la superficie vuelve a ser amarillo. Si no es capaz de utilizar la lactosa la superficie permanece de color rojo. 56

2.

3.

EXISTENCIA DE PRECIPITADO NEGRO EN EL FONDO DEL TUBO En algunos casos el color amarillo del fondo resulta enmascarado por un precipitado de color negro debido al sulfuro ferroso. Para formar este precipitado, es necesario que el pH sea cido. Por tanto, la existencia de un precipitado negro obliga a pensar que en el fondo se ha fermentado el azcar y que habra existido un color amarillo originario que despus fue enmascarado por el negro del sulfuro ferroso.

TABLA DE LECTURA
PICO FONDO
Fermentacin glucosa (acidificacin dbil) Fermentacin lactosa (acidificacin fuerte) Color negro (formacin SH2)

Rojo Rojo

Rojo Amarillo

Rojo Negro

Amarillo Amarillo

Pseudomonas

Shigella Providencia Serratia

+
Citrobacter Salmonella Proteus

+ E. coli Enterobacter Klebsiella

ESPECIES TPICAS

57

V-4
LECTURA DEL API 20 E
MICRO POCILLO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ACTIVIDAD ENZIMTICA -Galactosidasa Arginina dehidrolasa Lisina Descarboxilasa Ornitina descarboxilasa Utilizacin del citrato Produccin de SH2 Ureasa Triptfano desaminasa Produccin de indol Produccin de acetona ADICIN DE REACTIVO NO NO NO NO NO NO NO NEGATIVO Incoloro Amarillo Amarillo Amarillo Verde plido Amarillo Incoloro Grisceo Amarillo Amarillo Amarillo Incoloro No difusin Pigmento negro Azul Azul verdoso Azul Azul verdoso Azul Azul verdoso Azul Azul verdoso Azul Azul verdoso Azul Azul verdoso Azul Azul verdoso Azul Azul verdoso Azul Azul verdoso POSITIVO Amarillo Rojo/Naranja Naranja Rojo/Naranja Azul verdoso Azul Depsito negro Rojo Naranja Marrn oscuro Anillo rojo Rosado Rojo Difusin Pigmento negro Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo

ONPG

ADH LDC ODC CIT SH2 URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA OX

Percloruro frrico Reactivo Kovacs VP1 + VP2

Esperar 10 minutos NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO

11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Gelatinasa Fermentacin Oxidacin Fermentacin Oxidacin Fermentacin Oxidacin Fermentacin Oxidacin Fermentacin Oxidacin Fermentacin Oxidacin Fermentacin Oxidacin Fermentacin Oxidacin Fermentacin Oxidacin Citocromo oxidasa

Prueba ya realizada Considerarla como prueba nmero 21

58

METODOLOGA Despus de 18-24 horas de incubacin a 37 C se debe realizar la lectura de la galera segn la coloracin que presenten los micropocillos. Algunos de ellos son de lectura directa sin necesidad de aadir ningn reactivo; en cambio, para la lectura de otros es necesaria la adicin de ciertos reactivos. En funcin de la coloracin que adopte se anotarn los resultados +/- de cada micropocillo. Para realizar la lectura se deben seguir las indicaciones establecidas en la tabla donde se especifica cules son los micropocillos de lectura directa y a cules hay que aadir algn reactivo, incluyendo el tipo de reactivo y las coloraciones que se corresponden con resultados positivos y negativos. Los resultados +/- de cada prueba individual se trasladan a una hojilla donde aparecen las pruebas realizadas. Asimismo, los resultados +/- se transforman en valores numricos segn la siguiente tabla. En total existen 7 grupos de 3 pruebas. VALOR NUMRICO DE LAS PRUEBAS POSITIVAS Y NEGATIVAS CONSIDERAR GRUPOS DE 3 PRUEBAS

Prueba -

1 / 2 / 3 Posicin 1 Posicin

Valor 0 Valor 1 Valor 2 Valor 4

Prueba +

2 Posicin 3 Posicin

Despus de consignar los resultados numricos obtendremos un cdigo constituido por siete nmeros. Existen unas tablas donde se busca la correspondencia entre los cdigos encontrados y los microorganismos con los cuales se corresponden. Tambin se puede realizar la identificacin utilizando un programa informtico.

59

V-5
LECTURA DEL API STAPH
MICRO POCILLO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 ACTIVIDAD ENZIMTICA Testigo negativo ADICIN DE REACTIVO NO NO NO NO NO NO NO NO NO NO Reduccin de nitratos a nitritos Fosfatasa alcalina Produccin de acetilmetil-carbinol NEGATIVO Rojo Rojo Rojo Rojo Rojo Rojo Rojo Rojo Rojo Rojo Incoloro Rosa plido Amarillo Incoloro Rojo Rojo Rojo Rojo Rojo Amarillo Amarillo POSITIVO Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Rojo Violeta Violeta Rosado Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Naranja Rojo Rojo Violeta

GLU FRU MNE MAL LAC TRE MAN XLT MEL NIT PAL VP RAF XYL SAC MDG NAG ADH URE LSTR
Arginina dihidrolasa Ureasa

Acidificacin a partir del carbohidrato

NIT1 + NIT2
Esperar 10 minutos

ZYM A + ZYM B
Esperar 10 minutos Esperar 10 minutos NO

VP 1 + VP 2

Acidificacin a partir del carbohidrato

NO NO NO NO NO NO

Resistencia a lisostafina

Prueba no realizada (considerar +/-) Considerarla como prueba nmero 21

METODOLOGA Seguir las mismas indicaciones especificadas para el API 20 E. 60

V-6
LECTURA DEL API STREP
MICRO POCILLO 1 2 ACTIVIDAD ENZIMTICA Produccin de acetona Hidrlisis ADICIN DE REACTIVO NEGATIVO Incoloro Incoloro Azul plido Incoloro Amarillo plido Gris claro Incoloro Naranja plido Incoloro Incoloro Incoloro Violeta plido Incoloro Violeta plido Incoloro Amarillo Naranja/Rojo Naranja/Rojo Naranja/Rojo Naranja/Rojo Naranja/Rojo Naranja/Rojo Naranja/Rojo Naranja/Rojo Naranja/Rojo Naranja/Rojo POSITIVO Rojo Rosado Azul fuerte Violeta Negro

VP

Esperar 10 minutos Esperar 10 minutos NO

VP 1 + VP 2 NIN

HIP ESC PYRA

-glucosidasa

4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Pirrolidonilarilamidasa -galactosidasa -glucuronidasa -galactosidasa Fosfatasa alcalina Leucina arilamidasa Arginina dihidrolasa

ZYM A + ZYM B
Esperar 10 minutos

Naranja Violeta Azul Violeta Violeta Naranja Rojo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo

GAL
GUR GAL PAL LAP ADH RIB ARA MAN SOR LAC TRE INU RAF AMD GLYG

ZYM A + ZYM B
Esperar 10 minutos Esperar 10 minutos Esperar 10 minutos Esperar 10 minutos

ZYM A + ZYM B ZYM A + ZYM B ZYM A + ZYM B ZYM A + ZYM B

Esperar 10 minutos NO NO NO NO NO NO

Acidificacin

NO NO NO NO NO

Tipo de hemlisis

Beta hemlisis (+) valor 4 Alfa hemlisis (-) valor 0

METODOLOGA Seguir las mismas indicaciones especificadas para el API 20 E.

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VIERNES APUNTES PERSONALES

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OPININ PERSONAL, VOLUNTARIA Y ANNIMA

SOBRE LAS PRCTICAS REALIZADAS GRUPO DE PRCTICAS AL QUE USTED HA ASISTIDO INDIQUE AQU SU GRUPO:

VALORACIN GLOBAL EN ESCALA DE 0-10 INDIQUE AQU SU VALORACIN:

Los comentarios que usted realice sern utilizados para la mejora de las prcticas en cursos sucesivos Esta hoja deber entregarla el ltimo da a la finalizacin de la prctica del viernes. Describa aspectos tales como: inters de las prcticas, organizacin, claridad de las explicaciones, etc.

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INFORME DE PRCTICAS
N. REF. LAB.

Microbiologa

N de registro Apellido

Solicitud hecha por

Nombre

Iniciales del solicitante Manifestaciones clnicas Fecha de nac.: Sexo (V o H): Nmero de cama:

SE DEBEN RELLENAR TODOS LOS RECUADROS. DE NO SER AS, NI LA MUESTRA NI EL FORMUILARIO SERN ACEPTADOS EN EL LABORATORIO

Clave +++ = Profuso ++ = Moderado S = Sensible R = resistente Viajes relevantes: Terapia antibitica actual:
TORUNDA RASP. LQUIDO HECES

Muestra Investigacin precisa solicitada: microscop, cult, sens. Fecha recogida de muestra: Hora: Firma: Muestra
LCR ORINA ESPUTO

ASPECTO:________________________________________ __________________________________________________ __________________________________________________ MICROSCOPA: Leuccitos___________________________ Hemates__________________________ Cel. Epitel. ________________________ Cocos gram positivos_________________________________ Cocos gram negativos_________________________________ Bacilos gram positivos________________________________ Bacilos gram negativos________________________________ CULTIVO: CO2 ANAER. T AMB . 24h) 48h) 1. ________________________________________________ 2._________________________________________________ 3._________________________________________________

SENSIBILIDAD A LOS ANTIBITICOS

S Penicilina Eritromicina Flucoxacilina Amoxicilina Sulfamida Trimetoprim Nitrofurantona c. Nalidxico Gentamicina Mezlocilina Tetraciclina Metronidazol

Fecha en que se recibi la muestra en el laboratorio: Hora: Firma:

Comentarios:_______________________________ __________________________________________

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