TEKNIK ISOLASI DNA, ANALISIS PCR DAN ELEKTROPORESIS PADA DARAH AYAM

1. Isolasi DNA a. Tujuan : Un u! "#n$# a%ui &a'a "#n$isolasi DNA (a)a )a'a% a*a" )an un u! "#n$# a%ui analisis PCR +. Dasa' #o'i DNA a)ala% asa" nu!l#a *an$ "#n$an)un$ "a #'i $#n# i! )an +#',un$si un u! "#n$a u' (#'!#"+an$an +iolo$is s#lu'u% +#n u! !#%i)u(an s#&a'a s#lul#'. DNA #')a(a (a)a nu!l#us, "i o!on)'ia )an !lo'o(las. P#'+#)aan )i an a'a !# i$an*a a)ala%: DNA nu!l#us +#'+#n u! lin#a' )an +#'asosiasi san$a #'a )#n$an ('o #in %is on, s#)an$!an DNA "i o!on)'ia )an !lo'o(las +#'+#n u! si'!ula' )an i)a! +#'asosiasi )#n$an ('o #in %is on. Dili%a )a'i o'$anis"#n*a, s 'u! u' DNA ('o!a'io +#'+#)a )#n$an s 'u! u' DNA #u!a'io . DNA ('o!a'io i)a! "#"ili!i ('o #in %is on )an +#'+#n u! si'!ula', s#)an$!an DNA #u!a'io +#'+#n u! lin#a' )an "#"ili!i ('o #in %is on -Klu$ . Cu""in$s 1//0: 112331145 Ra6#n . 7o%nson 2882: /09. DNA "#"ili!i s 'u! u' (ilinan u as $an)a *an$ an i(a'al#l )#n$an !o"(on#n3!o"(on#nn*a, *ai u $ula (#n osa -)#o!si'i+osa9, $u$us ,os,a , )an (asan$an +asa. Pasan$an +asa (a)a DNA #')i'i a as )ua "a&a", *ai u +asa (u'in )an (i'i"i)in. :;asa (u'in #')i'i a as a)#nin -A9 )an $uanin -<9 *an$ "#"ili!i s 'u! u' &in&in3$an)a, s#)an$!an +asa (i'i"i)in #')i'i a as si osin -C9 )an i"in -T9 *an$ "#"ili!i s 'u! u' &in&in3 un$$al. K# i!a <uanin +#'i!a an )#n$an Si osin, "a!a a!an #'+#n u! i$a i!a an %i)'o$#n, s#)an$!an !# i!a A)#nin +#'i!a an )#n$an Ti"in "a!a %an*a a!an #'+#n u! )ua i!a an %i)'o$#n. Sa u !o"(on#n (#"+an$un -+uil)in$ +lo&!9 DNA #')i'i a as sa u $ula (#n osa, sa u $u$us ,os,a )an sa u (asan$ +asa *an$ )is#+u nu!l#o i)a -L#=is 2881: 1>4331>?9. S#+ua% s#l "#"ili!i DNA *an$ "#'u(a!an "a #'i $#n# i! )an +#'si,a %#'#)i #' (a)a s#lu'u% sis #" !#%i)u(an. <#no" a)ala% s# l#n$!a( "a #'i $#n# i! -DNA9 *an$ )i"ili!i sua u o'$anis"# )an #'o'$anisasi "#nja)i !'o"oso". -Hu"an <#no"# P'oj#& 2882: 19 DNA ju$a )a(a )iisolasi, +ai! (a)a "anusia, %#=an "au(un (a)a u"+u%an. DNA %#=an )a(a )iisolasi "#lalui )a'a%. Da'a% %#=an #')i'i a as (las"a )a'a%, $lo+ulus l#"a!, su+s ansi !i"ia -!a'+o%i)'a , )an ('o #in9, )an $as -o!si$#n, ni 'o$#n )an !a'+on )io!si)a9. Plas"a )a'a% #')i'i a as #'i 'osi -s#l )a'a% "#'a%9, l#u!osi -s#l )a'a% (u i%9 )an 'o"+osi -(la #l# 9. Ko"(on#n )a'a% *an$ )iisolasi *ai u s#l )a'a% (u i%. S#l )a'a% (u i% )ija)i!an (ili%an !a'#na "#"ili!i nu!l#us, )i "ana #')a(a DNA )i )ala"n*a -Ki"+all 2882: ?5 K#n . Ca'' 2881: 11>9. Isolasi DNA "#"ili!i +#+#'a(a a%a(an, *ai u: 19 Isolasi ja'in$an 29 Din)in$ )an "#"+'an s#l )ilisis!an 19 Di#!s 'a!si )ala" la'u an 09 Di(u'i,i!asi 29 Di('#si(i asi P'insi(3('insi( )ala" "#la!u!an isolasi DNA a)a 2, *ai u s#n 'i,u$asi )an ('#si(i asi. P'insi( u a"a s#n 'i,u$asi a)ala% "#"isa%!an su+s ansi +#')asa'!an +#'a j#nis "ol#!ul )#n$an &a'a "#"+#'i!an $a*a s#n 'i,u$al s#%in$$a su+s ansi *an$ l#+i% +#'a a!an +#'a)a )i

Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21

)asa', s#)an$!an su+s ansi *an$ l#+i% 'in$an a!an #'l# a! )i a as. T#!ni! s#n 'i,u$asi #'s#+u )ila!u!an )i )ala" s#+ua% "#sin *an$ +#'na"a "#sin s#n 'i,u$asi )#n$an !#&#(a an *an$ +#'6a'iasi, &on o%n*a 2288 '(" -'o a ion (#' "inu #9 a au 1888 '(" -Ki"+all 2882: 05 L#=is on 2882:13315 LPCH 2882: 29. Ta%a( (#' a"a *an$ )ila!u!an *ai u "#n$isolasi ja'in$an *an$ in$in )i$una!an, *ai u )a'a%. Ta%a( s#lanju n*a *ai u "#lisis!an )in)in$ )an "#"+'an s#l )#n$an la'u an (#lisis s#l )a'a% "#'a%. S# #la% )ila!u!an in!u+asi, )a'a% *an$ #la% +#'&a"(u' )#n$an (#lisis s#l )a'a% "#'a% #'s#+u lalu )is#n 'i,u$asi s#la"a 18 "#ni )#n$an !#&#(a an 2288 '(". S#lanju n*a su(#'na an *an$ #'+#n u! )i+uan$ )an !#"u)ian )ila!u!an #!s 'a!si )i )ala" la'u an. Hal #'s#+u +#' ujuan a$a' )i)a(a #!s 'a! nu!l#us s#l )a'a% (u i%. Ta%a( +#'i!u n*a a)ala% (u'i,i!asi. Ta%a( ini +#' ujuan un u! "#"+#'si%!an s#l )a'a% (u i% )a'i @a 3@a lainn*a, )an a%a( #'a!%i', *ai u ('#si(i asi +#' ujuan un u! "#n$#n)a(!an ('o #in %is on, s#%in$$a un ai3un ai DNA i)a! la$i "#n$$ulun$ -&oilin$9 )an +#'i!a an )#n$an ('o #in %is on, *an$ "#n*#+a+!an DNA "#nja)i #'li%a -Ki"+all 2882: 05 L#=is on 2882:13315LPCH2882:29. Ta%a( isolasi ja'in$an5 un u! "#n$isolasi ja'in$an s#l )a'a% (u i%, "a!a )a'a% *an$ "asi% "#"ili!i !o"(on#n3!o"(on#n l#n$!a( (#'lu )i(isa%!an sa u )#n$an lainn*a s#%in$$a *an$ #'sisa %an*a s#l )a'a% (u i%. Ka'#na i u !# )ala" a+un$ *an$ +#'isi )a'a% )i+#'i!an la'u an (#lisis s#l )a'a% "#'a% *an$ "#'u(a!an la'u an %i(o onis. Ka'#na la'u an #'s#+u %i(o onis, "a!a a!an #'ja)i %#"olisis. La'u an (#lisis s#l )a'a% "#'a% #')i'i a as EDTA -# %*l#n#)ia"in# # 'aa&# i& a&i)9 *an$ a!an "#"+#n u! !o"(l#!s -&%#la #9 )#n$an ion lo$a", s#(#' i M$2A *an$ "#'u(a!an !o,a! o' DNAs#. S#lanju n*a a+un$ )i+ola!3+ali! )#nan $#'a!an "#"u a' *an$ "#"+#n u! an$!a ? a$a' la'u an )a(a "#n*a u )#n$an s#"(u'na s#la"a 18 "#ni . Da'a% *an$ #la% +#'&a"(u' )#n$an (#lisis s#l )a'a% "#'a% #'s#+u lalu )is#n 'i,u$asi s#la"a 18 "#ni )#n$an !#&#(a an 2288 '(". S#lanju n*a su(#'na an *an$ #'+#n u! )i+uan$. Un u! "#lisis!an "#"+'an s#l )an "#"+'an nu!l#us s#l )a'a% (u i% *an$ #'isolasi a)i, )i+#'i!an la'u an (#lisis s#l )a'a% (u i% *an$ #')i'i a as EDTA )an SDS -So)iu" Do)#&*l Sul,a #9 *an$ +#',un$si un u! "#'usa! li(i) (a)a "#"+'an s#l s#%in$$a l#u!osi %an&u' -R*+i&!i . Pu'6#s 2882: 15 Ha'l#* 2882: 0189. Ta%a( s#lanju n*a *ai u (u'i,i!asi. Pu'i,i!asi +#' ujuan un u! "#"+#'si%!an s#l )a'a% (u i% )a'i @a 3@a lainn*a5 K# )ala" la'u an a)i !#"u)ian )i+#'i!an RNAs# )an )iin!u+asi s#la"a 12 "#ni (a)a su%u 1>BC. Hal #'s#+u +#' ujuan un u! "#n$o( i"al!an !#'ja #n@i" *an$ san$a )i(#n$a'u%i ol#% #"(#'a u'. Ta%a( +#'i!u n*a *ai u ('#si(i asi5 Ta%a( ('#si(i asi )ila!u!an )#n$an &a'a "#n# #s!an la'u an ('#si(i asi ('o #in )an !#"u)ian )i6o' #C *an$ +#' ujuan un u! "#n$%o"o$#n!an la'u an. La'u an ('#si(i asi ('o #in #')i'i a as a"oniu" as# a *an$ ji!a +#'i!a an )#n$an ('o #in "#n$a!i+a !an #'+#n u!n*a s#n*a=a +a'u *an$ "#"ili!i !#la'u an *an$ l#+i% '#n)a%, s#%in$$a "#n*#+a+!an ('o #in "#n$#n)a(. La'u an #'s#+u !#"u)ian )is#n 'i,u$asi !#"+ali s#la"a 12 "#ni )#n$an !#&#(a an 1888 '(". Su(#'na an *an$ +#'isi DNA !#"u)ian )i uan$!an !# )ala" a+un$ +#'isi iso('o(anol )in$in )an a+un$ )i+ola!3+ali! !#"+ali )#n$an $#'a!an an$!a ?. P#"+#'ian iso('o(anol +#' ujuan un u! 6isualisasi DNA. S#lanju n*a a+un$ )is#n 'i,u$asi !#"+ali s#la"a 2 "#ni )#n$an !#&#(a an 1888 '(". Hasil )a'i s#n 'i,u$asi a)ala% #')a(a n*a (#l# DNA (a)a )asa' a+un$ *an$ !#"u)ian )i a"+a%!an # anol >8D )an )i+ola!3+ali! !#"+ali. P#"+#'ian # anol +#' ujuan un u! "#"+#'si%!an DNA )a'i (#n$o o'3(#n$o o'n*a. S# #la% #'&a"(u', a+un$ !#"u)ian )is#n 'i,u$asi !#"+ali s#la"a 2 "#ni )#n$an !#&#(a an 1888 '(". Hasil

Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21

a!%i'n*a a)ala% DNA *an$ +#'a)a (a)a #(i )asa' a+un$. Lan$!a% a!%i'n*a a)ala% )#n$an (#"+#'ian T'is3EDTA *an$ +#' ujuan un u! "#la'u !an !#"+ali DNA un u! )i('#s#'6asi -Ha'l#* 2882: 08/330185 L#=is on 2882: 13329. &. ;a%an )an ala 19 ;a%an *an$ )i$una!an Da'a% A*a" 29 Ala *an$ )i$una!an a)ala% s#"ua ala *an$ #')a(a (a)a &a'a !#'ja

). Ca'a K#'ja Da'a% A*a"

)i"asu!!an 1 "L la'. ;u,,#' )l" "o' a'

Da'a% Di%alus!an )#n$an "o' a' *an$ +#'isi la'. ;u,,#'

)i a"+a%!an 2 "l la'. +u,,#'

)i"asu!!an )l" 2 u+# 1,2 "l

)i a"+a%!an SDS 188 El

6o' #C

)iIn!u+asi (a)a su%u 428C s#la"a 1 ja" S#!ali3s#!ali )i+ali! S#n 'i,u$# 0888 '(" 12 "#ni

)ia"+il su(#'na an

)i a"+a%!an K3As# a 128 El

Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21

In!u+asi ,'#@#' 18 "#ni

S#n 'i,u$# 0888 '(" 18 "#ni

)ia"+il su(#'na an

)i a"+a%!an CIAA 1: 1 6ol su(#'na an

Ko&o! (#lan2 G18 "#ni

S#n 'i,u$# 0888 '(" 12 "#ni

)ia"+il la(isan a as

Ta"+a% iso('o(anol 2F1 6ol su(#'na an

In!u+asi ,'#@#' 2 ja" a au 1 "ala"

S#n 'i,u$# 1288 '(" 2 "#ni

Su(#'na an )i+uan$, sisa (#l# n*a

Di a"+a% # anol >8D 188 El

In!u+asi 18312 "#ni

S#n 'i,u$# 1288 '(" 2 "#ni

;uan$ su(#'na an

K#'in$!an (#l# (a)a su%u 1>8C G 1 ja"

Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21

Ta"+a%!an TE 288 El

In!u+asi 1>8C G 1 ja"

)iTa"+a% RNAs# 2 El

!o&o!

In!u+asi 1>8C G 1 ja"

)i a"+a% CIAA 1: 1 6ol su(#'na an

Ko&o! (#lan2 G18 "#ni

S#n 'i,u$# 18.888 '(" 12 "#ni

Di a"+il la(isan a as

Ta"+a% iso('o(anol 1F0 6ol su(#'na an

In!u+asi ,'#@#' 2 ja" a au 1 "ala"

S#n 'i,u$# 1288 '(" 2 "#ni Su(#'na an )i+uan$, sisa (#l# n*a

Di a"+a% # anol >8D 188 El

In!u+asi 18312 "#ni

S#n 'i,u$# 1288 '(" 2 "#ni

;uan$ su(#'na an

Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21

K#'in$!an (#l# (a)a su%u 1>8C G 1 ja"

Di a"+a% TE 1:1 6ol (#l#

Si"(an ,'#@#' F#l#! 'o(o'osis

- Tahapan yang dilakukan untuk mendapatkan DNA darah ayam adalah penggerusan atau homogenasi dengan penambahan nitrogen cair. Fungsinya adalah untuk mempermudah penggerusan dan menjaga agar DNA tidak mengalami kerusakan. Hal ini dilakukan sampai didapatkan darah bebek yang telah hancur. Selanjutnya dilakukan penambahan buffer ekstrak yang berfungsi untuk melisiskan membran sel dan membran fosfolipid bilayer atau dalam praktikum kali ini hanya menggunakan nitrogen cair karena memiliki fungsi yang sama dengan-buffer-ekstrak. - !emudian dilakukan inkubasi sampel dalam "ater bath bersuhu #$ derajat % selama #$ menit. Hal ini dilakukan untuk optimalisasi kerja buffer ekstrak. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi sampel dengan kecepatan &$$$$ rpm selama &$ menit dalam suhu ' derajat %. hal ini dilakukan untuk memisahkan debris dan komponen sel lain yang menjadi pengotor dengan DNA. Hasilnya didapatkan bah"a supernatan ber"arna putih sedangkan pelet ber"arna bening kemerahan. - Supernatan yang telah diperoleh selanjutnya diambil dan ditambahkan dengan larutan (henol)%hloroform)*solamyl Alkohol +(%*,. Hal ini dilakukan untuk mengekstraksi DNA dari kontaminan. Fenol merupakan pelarut organik yang dapat melarutkan protein lipid dan molekul lain sepergi polisakarida sehingga diharapkan akan didapatkan supernatan yang berisi DNA bebas kontaminan. Setelah pencampuran homogenat tersebut di-orteks untuk optimalisasi homogenasi. - Selanjutnya dilakukan sentrofugasi homogenat dengan (%* tersebut dengan kecepatan &$$$$ rpm selama &$ menit dalam suhu ' derajat %. hasil yang didapatkan adalah supernatan dan pelet yang berada pada tiga lapisan lapisan atas ber"arna hijau jernih lapisan tengah ber"arna orange dan pelet yang ber"arna putih. !emudian diambil supernatan pada lapisan paling atas dan ditambahkan larutan %hloroform)*soamyl Alkohol untuk presipitasi lanjutan. !emudian kembali dilakukan -orteks dan sentrifugasi. - .ntuk memperoleh DNA dari darah ayam diperlukan bahan seperti nitrogen cair atau buffer ekstrak +/0%TA1 &$$ m2 Tris-H%l +pH)3, /$ m2 4DTA &' 2 Na%l, steril Fenol) %hloroform) *soamylAlkohol +(%*, 5 /6) /') &7 %hloroform) *soamilalkohol +(%*, 5 /' ) & 8.6 2 Ammonium acetate 4tanol Absolut 4tanol 8$ 0 T4 1uffer pH 3. 4DTA merupakan agen pengkelat yang dapat mengikat ion-ion logam atau ion-ion bermuatan di-positif seperti %a/9 dan 2g/9 sehingga komponen-komponen di membran terluar sel akan terurai dengan terikatnya molekul yang biasanya mengikat. - (ada prosedur ekstraksi yang telah dilakukan ini digunakan fenol-kloroform yang berfungsi sebagai pendenaturasi protein. Sedangkan DNA dan :NA tidak terdenaturasi karena molekul ini tidak larut didalam pelarut organik seperti fenol-kloroform. Selanjutnya dilakukan presipitasi DNA dengan menggunakan etanol. Hal ini berfungsi sebagai penghilang fenolkloroform. Sebab apabila fenol-kloroform masih berada di dalam sampel maka dikha"atirkan akan menghambat kerja en;im-en;im restriksi atau en;im lain yang digunakan untuk analisis

Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21

molekuler. - Hasil yang didapatkan dari presipitasi %* akan terbentuk kembali supernatan dan pelet pada eppendorf kemudian dilakukan pengambilan supernatan. Supernatan ditambahkan dengan amonium nitrat dan etanol absolut untuk presipitasi lanjutan dan menghilangkan kontaminan. Hasilnya diketahui terbentuk filamen-filamen DNA dalam larutan jernih tersebut. !emudian dilakukan inkubasi selama satu malam untuk optimalisasi presipitasi. SDS memiliki fungsi yang sama seperti %TA1 yaitu berfungsi sebagai pelarut lipid dari membran sel. SDS adalah sejenis deterjen yang mampu mengemulsi lipid. Setelah inkubasi selama semalam dengan etanol absolut dan amonium nitrat dan diketahui filamen DNA selanjutnya dilakukan sentrifugasi kembali untuk mendapatkan pelet DNA. Setelah supernatan dibuang selanjutnya ditambahkan etanol 8$0 untuk presipitasi lanjutan. !emudian dilakukan sentrifugasi sampai didapatkan pelet DNA (elet DNA yang didapatkan kemudian dikering anginkan. - DNA hasil ekstraksi metode ini cukup baik kualitasnya dan dapat kita gunakan untuk analisis dengan menggunakan (%: sekuensing Southern blot atau untuk dipotong-potong dengan en;ym restriksi tanpa perlu dimurnikan lagi +dengan metode (%*-ethanol misalnya,. !ekurangan metode ini adalah karena total DNA diisolasi maka konsentrasi sampel DNA sangat tinggi. Akibatnya butuh larutan T4 yang cukup banyak dan "aktu yang cukup lama untuk menunggu sampai DNA larut rata. <ika kita tidak membutuhkan DNA genomik dalam sampel DNA tersebut sampel DNA tersebut dapat kita sonifikasi atau dile"atkan jarum suntik = > /& untuk menghilangkan kekentalannya. !elebihan metode ini adalah sangat sederhana. .ntuk percobaan yang mengharuskan kita mengekstrak DNA sel he"an +pengalaman saya metode ini tidak hanya untuk sel mamalia, dari banyak sampel metode ini sangatlah membantu.

D#oCi'i+onu&l#i) a&i) -DNA9 a)ala% asa" nu!l#a *an$ "#n$an)un$ "a #'i $#n# i! )an +#',un$si un u! "#n$a u' (#'!#"+an$an +iolo$is s#lu'u% +#n u! !#%i)u(an s#&a'a s#lul#'. DNA ju$a )a(a )iisolasi, +ai! (a)a %#=an ,"anusia "au(un (a)a u"+u%an. DNA %#=an )a(a )iisolasi "#lalui )a'a% -All#C(#' s, 288?9. P#'sia(an (#' a"a un u! "#la!u!an #!ni! "ol#!ul#' a)ala% %a'us "#"(un*ai +a%an )asa' +#'u(a DNA F RNA. DNA F RNA +isa !i a isolasi )a'i )a'a%, !ul u' s#l, ja'in$an ana"an, ja'in$an luna! a au ja'in$an !#'as )a'i %#=an )an "anusia -S#n 'a+), 288?9.

Holi!#l 'a"+u !a*a a!an DNA. ,oli!#l "#'u(a!an +a$ian 'a"+u *an$ +a$us un u! (#n$ujian DNA. Holi!#l 'a"+u "#'u(a!an +a$ian )a'i 'a"+u *an$ "#n$%u+un$!an an a'a 'a"+u )an !uli !#(ala. Holi!#l 'a"+u "#n*#)ia!an o+j#! #s DNA *an$ #'+ai! !# i!a ,oli!#l ini )i)a(a a!an )ala" !#a)aan "asi% s#$a', %al ini +#'a' i !# i!a 'a"+u )i a'i! )a'i !uli !#(ala. P#n$a"+ilan )#n$an &a'a ini )#n$an +#+#'a(a %#lai 'a"+u saja a!an "#n)a(a !an DNA *an$ &u!u( +an*a! -S(o'$s"aalu!, 288?9.

Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21

Isolasi DNA (#n in$ s#!ali )ila!u!an, %al ini a!an "#nunjan$ !#$ia an +iolo$i "ol#!ul#' *an$ s#lanju n*a, s#%in$$a ('a! i!u" Isolasi DNA O'$an, Da'a% , Holi!#l Ra"+u , Holi!#l ;ulu A*a".

DNA "#"ili!i s 'u! u' (ilinan u as $an)a *an$ an i(a'al#l )#n$an !o"(on#n3 !o"(on#nn*a, *ai u $ula (#n osa -)#o!si'i+osa9, $u$us ,os,a , )an (asan$an +asa. Pasan$an +asa (a)a DNA #')i'i a as )ua "a&a", *ai u +asa (u'in )an (i'i"i)in. ;asa (u'in #')i'i a as a)#nin -A9 )an $uanin -<9 *an$ "#"ili!i s 'u! u' &in&in3$an)a, s#)an$!an +asa (i'i"i)in #')i'i a as si osin -C9 )an i"in -T9 *an$ "#"ili!i s 'u! u' &in&in3 un$$a. DNA #')a(a (a)a nu!l#us, "i o!on)'ia )an !lo'o(las. P#'+#)aan )i an a'a !# i$an*a a)ala%: DNA nu!l#us +#'+#n u! lin#a' )an +#'asosiasi san$a #'a )#n$an ('o #in %is on, s#)an$!an DNA "i o!on)'ia )an !lo'o(las +#'+#n u! si'!ula' )an i)a! +#'asosiasi )#n$an ('o #in %is on. S#lain i u, DNA "i o!on)'ia )an !lo'o(las "#"ili!i &i'i !%as, *ai u %an*a "#=a'is!an si,a 3si,a *an$ +#'asal )a'i $a'is i+u. Hal ini san$a +#'+#)a )#n$an DNA nu!l#us *an$ "#"ili!i (ola (#=a'isan si,a )a'i !#)ua o'an$ ua -All#C(#' s, 288?9.

DNA "anusia )a(a )iisolasi "#lalui )a'a%- %#=an , "anusia 9. Da'a% "anusia #')i'i a as (las"a )a'a%, $lo+ulus l#"a!, su+s ansi !i"ia -!a'+o%i)'a , ('o #in )an %o'"on9, )an $as -o!si$#n, ni 'o$#n )an !a'+on )io!si)a9. Plas"a )a'a% #')i'i a as #'i 'osi -s#l )a'a% "#'a%9, l#u!osi -s#l )a'a% (u i%9 )an 'o"+osi

-(la #l# 9. Ko"(on#n )a'a% *an$ )iisolasi *ai u s#l )a'a% (u i%. S#l )a'a% (u i% )ija)i!an (ili%an !a'#na "#"ili!i nu!l#us, )i "ana #')a(a DNA )i )ala"n*a -All#C(#' s, 288?9.

Isolasi DNA )a'a% +isa "#n$$una!an ('o o!ol H;I. Sa(#l )a'a% *an$ #la% )i+#!u!an (a)a su%u 3>88 C (a)a EDTA 6a&u ain#' u+#s )i&ai'!an, s# #la% i u )i a"+a%!an si 'a # +u,,#' s an)a' )i a"+a%, )i&a"(u' )an a+un$ )is#n 'i,us#. Su(#'na an*a )i+uan$, )an (#na"+a%an +u,,#' )i in$!a !an, )i&a"(u' )an )is#n 'i,us la$i. S# #la% su(#'na an )i+uan$, (#l# )ila'u !an !#"+ali (a)a la'u an )# #'$#n SDS )an ('o #inas# K, )an &a"(u'an )iin!u+asi (a)a 228 C s#la"a sa u ja". Sa"(#l !#"u)ian )i#!s 'a! ,#nol s#!ali )#n$an "#n$$una!an (%#nolF&%lo'o,o'"Fisoa"*l al&o%ol solu ion. S# #la% s#n 'i,u$asi, la(isan +#'ai' )i+#'si%!an )a'i a+un$ "i!'os#n 'i,us#. DNA "#'u(a!an ('#&i(i a # )a'i # %anol, )ila'u !an !#"+ali (a)a +u,,#' !#"u)ian )i('#si(i asi )ua !ali. P#' a"a !ali (#n$#'in$an (#l# , +u,,#' )i a"+a% )an DNA )iin!u+asi (a)a su%u 228 C s#"ala"an, la'u an DNA )iuji )#n$an "#n$$una!an (ol*"#'as# &%ain '#a& ion.

Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21

Holi!#l 'a"+u !a*a a!an DNA. Ra"+u *an$ 'on o! )#n$an s#n)i'in*a ji!a )iisolasi DNAn*a, "a!a a!an )i(#'ol#% %asil *an$ !u'an$ "#"uas!an. Ol#% !a'#na i u, un u! "#"(#'ol#% %asil *an$ "a!si"al )i$una!an ,oli!#l 'a"+u *an$ "asi% s#$a' *an$ +isa )i)a(a !an )#n$an "#n$a"+il +#+#'a(a %#lainan 'a"+u )a'i !uli !#(ala lan$sun$ -S(o'$s"aalu!, 288?9. Sala% sa u "# o)# *an$ )i$una!an un u! isolasi DNA a)ala% sal in$ ou . Sal in$ ou "#'u(a!an "# o)# *an$ )i$una!an un u! "#"isa%!an ('o #in *an$ )i)asa'!an (a)a ('insi( +a%=a ('o #in !u'an$ #'la'u !# i!a +#'a)a (a)a )a#'a% *an$ !ons#n 'asi !a)a' $a'a"n*a in$$i. Kons#n 'asi $a'a" )ii+u u%!an ol#% ('o #in un u! "#"(#'&#(a !#lua'n*a la'u an *an$ +#'+#)a )a'i ('o #in sa u !# ('o #in *an$ lain*a -P'o,&%", 288?9.

Tujuan P'a! i!u" A)a(un ujuan )a'i ('a! i!u" ini a)ala% : M#n$# a%ui +a$ai"ana "#n)a(a !an DNA A*a" 2. M#"(#laja'i )an "#"(#'ol#% DNA )a'a% A*a"

Ala )an ;a%an Ala : S#n 'i,u$# Coll#& ion u+# Hi$% ,il #' u+# Mi!'o(i(# Io' #C "iC#' In!u+a o' AJua+a % M#sin #l#! 'o(o'#sis

Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21

Mo' a' Mi&'o=a6# o6#n H'#@#'

;a%an : Da'a% En %o! E anol a+solu # La'u an ;u,,#' So)iu" D#)osol Hos,a - SDS 9 K3As# a CIAA Iso('o(anol E anol >8 D

Ca'a K#'ja Masu!an )a'a% )ala" u+# *an$ #la% )iisi # anol a+solu #. Masu!an 1 "l la'u an ;u,,#' )ala" "o' a'. Halus!an )a'a% )#n$an "o' a' *an$ +#'isi la'u an ;u,,#'. Ta"+a%!an 2 "l la'u an ;u,,#'. Masu!an )ala" u+# 1,2 "l , a"+a%!an SDS 188 E l In!u+asi!an (a)a su%u 42 C s#la"a 1 ja" S#n 'i,u$# s#+#sa' 0888 '(" s#la"a 12 "#ni , a"+il su(#'na an Ta"a%!an K3as# a 128 E l In!u+asi ,'#@#' s#la"a 18 "#ni S#n 'i,u$# 0888 '(" s#la"a 18 "#ni ,a"+il su(#'na ann*a Ta"+a%!an CIAA )#n$an (#'+an)in$an 1:1 )#n$an 6olu"# su(#'na an. K#"u)ian !o&o! (#lan K(#lan s#la"a 18 "#ni . S#n 'i,u$# 0888 '(" s#la"a 12 "#ni .

Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21

K#"u)ian a"+il la(isan a asn*a, a"+a% iso('o(anol 2F1 6olu"# su(#'na an . In!u+asi ,'##@#' s#la"a 2 ja" F 1 "ala". S#n 'i,u$# 1288 '(" s#la"a 2 "#ni ;uan$ su(#'na an sisa!an (#l# n*a , a"+a%!an # anol >8 D 188 E l In!u+asi!an 18 312 "#ni . S#n 'i,u$# 1288 '(" 2 "#ni ,+uan$ su(#'na an K#'in$!an (#l# (a)a su%u 1> C !u'an$ l#+i% 1 ja". Ta"+a%!an TE 288 E l . In!u+asi!an (a)a su%u 1> C !u'an$ l#+i% 1 ja". Ta"+a%!an RNA s# 2 E l. In!u+asi!an (a)a su%u 1> C s#la"a 1 ja". Ta"+a%!an CIAA )#n$an (#'+an)in$an 1:1 )#n$an 6olu"# su(#'na an K#"u)ian !o&o! (#lan K(#lan s#la"a 18 "#ni . S#n 'i,u$# 18.888 '(" s#la"a 12 "#ni . A"+il la(isan a asn*a. Ta"+a%!an Iso('o(anol L 6olu"# su(#'na an . In!u+asi ,'#@#' 2 ja" a au 1 "ala". S#n 'i,u$# 1288 '(" 2 "#ni . Ta"+a%!an # anol >8 D 188 E l. In!u+asi!an 18 312 "#ni S#n 'i,u$# 1288 '(" s#la"a 2 "#ni . ;uan$ su(#'na an K#'in$!an (#ll# (a)a su%u 1> C !u'an$ l#+i% 1 ja" Ta"+a%!an TE )#n$an (#'+an)in$an 1:1 )#n$an 6olu"# (#ll# Si"(an )ala" ,'#@#' , la!u!an El#! 'o,o'#sis

Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21

<a"+a' 1.M#n$%alus!an )a'a% )#n$an "o' a'

<a"+a' 2.M#"asu!an )ala" u+# 1,2 "l )an )i a"+a%!an SDS 188 E l

Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21

<a"+a' 1.

Da'a% a*a" )ala" u+#

<a"+a' 0.Da'a% a*a" )i &o'6# #'

<a"+a' 2.Da'a% A*a" s# #la% )i &o6#' #'

<a"+a' 4. S#n 'i,u$# s#+#sa' 0888 '(" s#la"a 12 "#ni

Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21

Hasil P#n$a"a an

Pi a DNA A*a"

<a"+a' >. Hasil isolasi DNA +#' u'u 3 u'u )a'i !i'i !# !anan a)ala% %asil !#'ja !#lo"(o! 1, 2, 1, 0 )an 2

P#"+a%asan Isolasi DNA )ila!u!an un u! "#n)a(a !an DNA )ala" sua u s#l. DNA *an$ )iisolasi )ala" s#l )a(a )i!a #$o'i!an "#nja)i 2 *ai u DNA in i s#l )an DNA "i o!on)'ia. Dala" !#$ia an ini ('a! i!u" ini, DNA *an$ )iisolasi a)ala% DNA Mi o!on)'ia. DNA Mi o!on)'ia )a(a )ija)i!an s#+a$ai "a'!a-(#nan)a9 un u! #s DNA )ala" u(a*a "#n$in)#n i,i!asi %u+un$an !#!#'a+a an s#&a'a "a #'nal )i!a'#na!an (ola (#=a'isan !# u'unan *an$ uni!. S#jau% ini )a a *an$ )ia"a i (a)a <A"+a' >, %asil (#n$a"a an isolasi DNA )a'a% a*a" (a)a !#lo"(o! 1 sa"a(ai 2, #'li%a #'+#n u!n*a (i a +#'=a'na jin$$a a' in*a +#'%asil )i(#'ol#% a)ala% isola DNA. Isola DNA #'s#+u "#'u(a!an %asil isolasi )an (u'i,i!asi DNA )a'i )a'a% a*a" )i#l#! 'o,o'#sis un u! "#n)a(a !an (i a -+an)9 DNA *an$ s#suai )#n$an DNA "a'!#'. Pi a -+an)9 DNA *an$ +#'a "ol#!uln*a s#suai a au(un "#n)#!a i +#'a "ol#!ul DNA "a'!#' )i #n u!an s#+a$ai sus(#& DNA.

Selanjutnya adalah memasukan sampel DNA yang telah dimurnikan kedalam mesin (%: +polymerase chain reaction, sebagai tahapan amplifikasi. Hasil akhir dari tahap amplifikasi ini adalah seharusnya berupa kopi urutan DNA lengkap dari DNA sampel. Selanjutnya kopi urutan DNA ini akan dikarakterisasi dengan elektroforesis untuk melihat pola pitanya. !arena urutan DNA setiap orang berbeda maka jumlah dan lokasi pita DNA +pola elektroforesis, Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21

setiap indi-idu juga berbeda. (ola pita inilah yang disebut DNA sidik jari +DNA finger print, yang akan dianalisa pola ST: nya. Tahap terakhir adalah DNA berada dalam tahapan typing proses ini dimaksudkan untuk memperoleh tipe DNA. 2esin (%: akan membaca data-data DNA dan menampilkannya dalam bentuk angka-angka dan gambar-gambar identfikasi DNA. Finishing dari tes DNA ini adalah mencocokan tipe-tipe DNA. +Sinly Evan Putra ,2008, Dari tiga sampel DNA ayam bebek dan mentok setelah dielektoforensis menghasilkan pita jingga yang berbeda hal ini menunjukan bah"a tiga jenis unggas mempuyai struktur DNA yang berbeda. !arena bentuk pita yang berbeda berarti mempuyai struktur atau karacteristik yang berbeda pula
DNA *an$ #la% )iisolasi !#"u)ian )i analisis )#n$an #l#! 'o,o'#sis an(a a)a ('i"#' . #l#! 'o,o'#sis *an$ (#' a"a ini )ila!u!an un u! "#n$# a%ui a)a i)a!n*a DNA (a)a sa"(#l an(a "#li%a +#'a(a ju"la% (asan$an +asa -(+9 (a)a DNA #'s#+u . Da'i $a"+a' > )ili%a +a%=a %asil isolasi DNA )a(a )ili%a )a'i a+un$ !# 1 )#n$an =a'na jin$$a (a)a su"u', # a(i =a'na jin$$an*a i)a! +#$i u j#las )i+an)in$ )#n$an sa"(#l *an$ lain , ini )i)u$a DNA *an$ )iisolasi %an*a s#)i!i )i+an)in$ )#n$an DNA a*a" a au +#lu" #'(u'i,i!asi.

Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21

POLYMERASE CHAIN REACTION -PCR9

P#n)a%uluan PCR "#'u(a!an sua u #!ni! (#'+an*a!an "ol#!ul DNA )#n$an u!u'an #' #n u s#&a'a #n@i"a i! "#lalui "#!anis"# (#'u+a%an su%u. S#&a'a 'in$!as, ('insi( PCR )a(a )ij#las!an s#+a$ai +#'i!u . Pa)a su%u /03/28C, DNA "#n$ala"i )#na u'asi -(#"+#la%an un ai $an)a "#nja)i un ai un$$al9. Ma! u *an )i(#'lu!an un u! ('os#s ini s#!i a' 18 )# i! (a)a su%u /28C a au 12 )# i! (a)a su%u />8C. A(a+ila DNA a'$# "#n$an)un$ +an*a! nu!l#o i)a <FC, su%u )#na u'asi )a(a )i in$!a !an. D#na u'asi *an$ i)a! l#n$!a( a!an "#n*#+a+!an '#na u'asi s#&a'a &#(a . S#)an$!an =a! u )#na u'asi *an$ #'lalu la"a )a(a "#"(#n$a'u%i !#'ja #nsi" aJ (ol*"#'asi. Hal ini san$a +#'(#n$a'u% #'%a)a( !#+#'%asilan ('os#s PCR. U"u"n*a s#+#lu" ('os#s si!lus PCR )i"ulai s#'in$ s#!ali )ila!u!an ('# )#na u'asi s#la"a 132 "#ni , un u! "#n*a!in!an +a%=a "ol#!ul DNA a'$# *an$ in$in )ili(a $an)a!an ju"la%n*a +#na'3+#na' #')#na u'asi. A(a+ila su%un*a )i u'un!an an a'a 143>28C #'ja)i ('os#s (#n#"(alan ('i"#' -annealing9 *an$ "#u(a!an (#n#"(alan ('i"#' (a)a DNA *an$ #la% #'+#la% (a)a #"(a! *an$ s(#si,i!. P'i"#' s#+ai!n*a +#'u!u'an 1?322 +asa, "#n$an)un$ 28348D <AC, )an T" -8C9 #'%i un$ un u! !#)ua ('i"#' s#+ai!n*a sa"a. Ho'"ula (#n$%i un$an a)ala% T"N0-<AC9 A2-AAT9. S#"a!in (anjan$ ('i"#'n*a s#"a!in in$$i #"(#'a u' ann#aliln$. A(a+ila su%un*a )inai!an la$i sa"(ai >28C, "a!a ('i"#' )#n$an +an uan #n@i" DNA polymerase a!an "#"+#n u! un aian DNA s#suai )#n$an u'u an DNA *an$ #'+#la%, ('os#s ini )is#+u #lon$asi -extension9. K#&#(a an (#n*usunan nu!l#o i)a )i(#'!i'a!an 213 188 nu!l#o i)a (#' )# i!, (H, !ons#n 'asi $a'a" )an "ol#!ul DNA a'$# . U"u"n*a s# #la% ('os#s si!lus PCR s#l#sai, )i a"+a% (os #lon$asi s#la"a 2318 "#ni (a)a #"(#'a u' >28C a$a' s#"ua PCR +#'+#n u! un aian $an)a.

Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21

K# i$a a%a(an #'s#+u "#'u(a!an sa u si!lus %#'"al. 7u"la% ,'a$"#n DNA *an$ )ia"(li,i!asi a)ala% 2n )i"ana n a)ala% +an*a!n*a si!lus %#'"al. Ru"us #'s#+u +#'asal )a'i (#na"+a%an ju"la% !#(in$ -&o(*9 DNA s#&a'a #!s(on#nsial, )i"ana !#(in$ DNA *an$ #'+#n u! "#nja)i &# a!an +a$i '#a!si s#lanju n*a. ;an*a!n*a si!lus *an$ )ila!u!an #'$an un$ !#(a)a +an*a!n*a ('o)u! PCR *an$ )iin$in!an. U'aian )i a as *an$ "#n$$a"+a'!an ('os#s PCR )a(a )ia"+il )a'i #&%ni&al +ull# in$ OPCR Co'# S*s #"P -PROME<A9. A au )#n$an "o)#l "#sin %#'"al &*&l#' *an$ )i$una!an s#+a$ai ala un u! analisis PCR. Pol*"#'as# C%ain R#a& ion -PCR9 "#'u(a!an sua u "# o)a *an$ +an*a! )i$una!an un u! "#"(#'+an*a! DNA *an$ a!an )i(a!ai (a)a !lonin$ $#n, )# #!si (oli"o',is"#, )ia$nosis (#n*a!i , )an lain3lain. ;a%an a=al un u! PCR a)ala% s#ju"la% DNA *an$ "#n$an)un$ u'u an *an$ in$in )i(#'+an*a!, )i!#nal )#n$an na"a DNA #"(la . DNA #"(la )a(a )i(#'ol#% )#n$an +#'+a$ai &a'a Mol#!ula' "a'!#' "#'u(a!an (o on$an )a'i "a #'ial $#n# i! *an$ "u)a% )ii)#n i,i!asi *an$ )a(a )i$una!an )i la+o'a o'iu" un u! "#"isa%!an s#l, in)i6i)u, (o(ulasi a au s(#si#s. P#n$#"+an$an "ol#!ula' "a'!#' )i"ulai )a'i #!s 'a!si DNA )a'i ja'in$an ana"an -"isaln*a )aun, +iji, (ol#n a au !a)an$3!a)an$ ja'in$an !a*u9. Mol#!ula' "a'!#' *an$ i)#al a)ala% an a'a lain "#"ili!i (oli"o',is"# *an$ in$$i, +#'si,a !o)o"inan, +an*a!Fs#'in$ #')a(a )ala" $#no", a!s#sn*a "u)a%, "#"ili!i !onsis #nsi in$$i. ;#'"a&a"3"a&a" #!ni! #la% )i!#"+an$!an un u! "#"6isualisasi (oli"o',is"# (a)a DNA. U"u"n*a "ol#!ula' "a'!#' )i!lasi,i!asi!an )ala" )ua !#lo"(o!: H*+'i)i@a ion3+as#) "a'!#' )an PCR -(ol*"#'as# &%ain '#a& ion93+as#) "a'!#'. Pa)a H*+'i)i@a ion3+as#) "a'!#' ('o,il DNA )i6isualisasi )#n$an "#la!u!an %i+'i)isasi an a'a DNA *an$ #la% )i(o on$ )#n$an #n@i" '#s 'i!si )#n$an ('o+# *an$ #la% )ila+#l. P'o+# "#'u(a!an ,'a$"#n DNA *an$ )i!# a%ui asal a au s#!u#nn*a. PCR -(ol*"#'as# &%ain '#a& ion93+as#) "a'!#' "#li+a !an a"(li,i!asi in 6i 'o )a'i s#!u#n DNA #' #n u a au lo!us3lo!us #' #n u )#n$an +an uan ('i"#' )an #n@i" DNA (oli"#'as# *an$ #'"os a+il. H'a$"#n *an$ )ia"(li,i!asi )i(isa%!an )#n$an #l#! 'o,o'#sis )an )i)# #!si )#n$an (#=a'naan. PCR -(ol*"#'as# &%ain '#a& ion93+as#) "a'!#' PCR a)ala% s#+ua% #!ni! +iolo$i "ol#!ul#' un u! "#'#(li!asi!an DNA )#n$an "#n$$una!an #n@i" TaJ (oli"#'as#. PCR )i$una!an un u! "#n$a"(li,i!asi +a$ian DNA *an$ (#n)#! -sa"(ai 18 !+9. S#ja! )i #"u!an ol#% Ka'* Mullis (a)a a%un 1/?1, #!ni! ini #la% "#la%i'!an #!ni! PCR3+as#) "a'!#' #!ni! lainn*a *an$ san$a +#'6a'iasi. P'o o!ol )asa' PCR a)ala%: DNA u as $an)a )i)#na u'asi (a)a su%u /2C s#%in$$a "#"+#n uj DNA u as un$$al *an$ +#',un$si s#+a$ai &# a!an. DNA u as un$$al *an$ (#n)#! -)is#+u ('i"#'9 +#'i!a an )#n$an DNA &# a!an (a)a #"(#'a u'# '#n)a%. I!a an ('#i"#' #'ja)i (a)a u as *an$ !o"(l#"#n #' )#n$an &# a!an (a)a )a#'a% ujun$ +a as s#!u#n DNA a'$# . Su%u )i in$!a !an "#nja)i >2C s#%in$$a #n@i" DNA (ol*"#'as# )a(a "#la!u!an sin #sis DNA "#"+#n u! u as $an)a DNA +a'u.

Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21

U as $an)a DNA *an$ +a'u )isin #sis, )i)#na u'asi (a)a su%u in$$i )an si!lus +#'ulan$. P'o)u! PCR )ia"a i )#n$an $#l #l#! 'o,o'#sis )#n$an "#n$$una!an $#l a$a'os# a au(un $#l (olia!'ila"i)a. Pol*"#'as# &%ain '#a& ion -PCR9 Pol*"#'as# &%ain '#a& ion -Q'#a!si R+#'an ai (oli"#'as#Q, PCR9 "#'u(a!an #!ni! *an$ san$a +#'$una )ala" "#"+ua salinan DNA. PCR "#"un$!in!an s#ju"la% !#&il s#!u#ns DNA #' #n u )isalin -ju aan !ali9 un u! )i(#'+an*a! -s#%in$$a )a(a )ianalisis9, a au )i"o)i,i!asi s#&a'a #' #n u. S#+a$ai &on o%, PCR )a(a )i$una!an un u! "#na"+a%!an si us #n@i" '#s 'i!si, a au un u! "#"u asi!an -"#n$u+a%9 +asa #' #n u (a)a DNA. PCR ju$a )a(a )i$una!an un u! "#n)# #!si !#+#'a)aan s#!u#ns DNA #' #n u )ala" sa"(#l. PCR "#"an,aa !an #n@i" DNA (oli"#'as# *an$ s#&a'a ala"i "#"an$ +#'(#'an )ala" (#'+an*a!an DNA (a)a ('os#s '#(li!asi. Na"un )#"i!ian, i)a! s#(#' i (a)a o'$anis"# %i)u(, ('os#s PCR %an*a )a(a "#n*alin ,'a$"#n (#n)#! DNA, +iasan*a sa"(ai )#n$an 18 !+ -!+N!ilo +as# (ai'sN1.888 (asan$ +asa9. H'a$"#n #'s#+u )a(a +#'u(a sua u $#n un$$al, a au %an*a +a$ian )a'i sua u $#n. P'os#s PCR un u! "#"(#'+an*a! DNA "#li+a !an s#'an$!aian si!lus #"(#'a u' *an$ +#'ulan$ )an "asin$3"asin$ si!lus #')i'i a as i$a a%a(an. Ta%a(an *an$ (#' a"a a)ala% )#na u'asi &# a!an DNA -DNA #"(la #9 (a)a #"(#'a u' /03/4 BC, *ai u (#"isa%an u as $an)a DNA "#nja)i )ua u as un$$al. S#su)a% i u, )ila!u!an (#nu'unan #"(#'a u' (a)a a%a( !#)ua sa"(ai 02348 BC *an$ "#"un$!in!an #'ja)in*a (#n#"(#lan -ann#alin$9 a au %i+'i)isasi an a'a oli$onu!l#o i)a ('i"#' )#n$an u as un$$al &# a!an DNA. P'i"#' "#'u(a!an oli$onu!#lo i)a u as un$$al *an$ s#!u#ns3n*a )i'an&an$ !o"(l#"#n #' )#n$an ujun$ ,'a$"#n DNA *an$ in$in )isalin5 ('i"#' "#n#n u!an a=al )an a!%i' )a#'a% *an$ %#n)a! )isalin. Ta%a( *an$ #'a!%i' a)ala% a%a( #!s #nsi a au #lon$asi -#lon$a ion9, *ai u (#"anjan$an ('i"#' "#nja)i sua u u as DNA +a'u ol#% #n@i" DNA (oli"#'as#. T#"(#'a u' (a)a a%a( ini +#'$an un$ (a)a j#nis DNA (oli"#'as# *an$ )i$una!an. Pa)a a!%i'n*a, sa u si!lus PCR a!an "#n$$an)a!an ju"la% "ol#!ul &# a!an DNA a au DNA a'$# . Tujuan P'a! i!u": "#n$a"(li,i!asi $#n ND1 -NADPH D#%i)'o$#nas# su+ uni 19 Ala )an ;a%an : Ala : M#sin T%#'"al &*&l#' Ta+un$ #(#n)o', 8,2 "l Ta+un$ #(#n)o', 8,2 "l Pi(# o' a au (i(# "#n un u! -288Sl31888Sl9, -28Sl3288 Sl9, -2Sl328Sl9, -1Sl3 18Sl9 )an -8,1Sl32Sl9 Ti( (i(# -=a'na +i'u, !unin$ )an (u i%9 Io' #C

Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21

M#sin S#n i',u$asi Ra! a+un$ #(#n)o', Sa'un$ an$an -latex gloves9 ;a%an : Ta+#l 1 .;a%an *an$ )i$una!an saa analisis PCR 1 2 1 0 2 2 C '#a& ion "i& H2O nu&l#as# ,'## P'i"#' H-'#6#'s#9 P'i"#' L -,o'=a')9 Sa"(#l DNA -#n o!9 To al 18 El ?,2 El 8,0 El 8,0 El 1 El El

La'u an *an$ %a'us )i(#'sia(!an un u! '#a!si PCR : Ensi" Pa)a u"u"n*a #nsi" *an$ )i$una!an a)ala% Tag polymerase *an$ )iisolasi )a'i "i!'oo'$anis"# Thermus aquaticus *an$ )a(a # a( s a+il (a)a #"(#'a u' in$$i. 7#nis ini )a(a o( i"u" (a)a #"(#'a u' in$$i, s#%in$$a "#"+ua "i!'oo'$anis"# ini "#nja)i (ili%an *an$ i)#al. A! i6i as #nsi" #'s#+u "#"(un*ai =a! u (a'u% s#!i a' 2 ja" 08 "#ni #"(#'a u' )#na u'asi. S#lain # a( )a(a s a+il (a)a #"(#'a u' in$$i, a! i6i as Tag polymerase o( i"al (a)a (H ?,23/,8 )ala" 18 "M T'is )an )iu!u' (a)a #"(#'a u' 228C. Kin#'jan*a a!an "#nu'un (a)a (H #'lalu in$$i a au #'lalu '#n)a%. P#n*i"(anan Tag polymerase )ila!u!an (a)a #"(#'a u' 3288C. Pa)a =a! u )i$una!an )ala" "#"+ua &a"(u'an la'u an un u! ('os#s PCR, )iusa%a!an !o"(on#n ini )i!#lua'!an #'a!%i' )an s#$#'a )isi"(an !#"+ali !# )ala" ,'##@#n. Ka'#na !o"(on#n ini "#'u(a!an *an$ "a%al, "a!a s#+ai!n*a )i+a$i "#nja)i +#+#'a(a a+un$ #(#n)o' 8,2 "l )ala" 6olu"# !#&il. Hal ini )i"a!su)!an a$a' s# a( (#n$$unaan #n@i" i)a! (#'lu "#n$#lua'!an s#"ua s o&! *an$ a)a. S#lain i u ju$a un u! "#n$%in)a'i #'ja)in*a !on a"inasi *an$ )a(a "#'usa! la'u an )ala" ju"la% +an*a!.

D#oC*nu&l#osi)# 'i(%os(%a #s -)NTP9

Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21

Pa)a u"u"n*a )NTP )ijual )ala" +#n u! freeze-dried a au la'u an (solution). R#a$#n ini s a+il (a)a #"(#'a u' 3288C un u! +#+#'a(a +ulan. 7i!a )ala" +#n u! freeze dried, reagent %a'us )ila'u !an )#n$an KOH s#+#lu" )i$una!an. Na"un )#"i!ian +#+'a(a (#'usa%aan s#(#' i P%a'"a&ia, Si$"a, )an ;o#%'in$#' Mann%#i" "#n$#lua'!an ('o)u!n*a )ala" +#n u! la'u an )#n$an !ons#n 'asi #' #n u. Kons#n 'asi )NTP *an$ sia( )i$una!an un u! PCR +iasan*a a)ala% 2.2 "M, !#"u)ian la'u )NTP #'s#+u s#+ai!n*a )i+a$i "#nja)i +#+'a(a a+un$ #(#n)o', 8,2 "l )ala" 6olu"# !#&il )an )isi"(an (a)a freezer 3288C. Kons#n 'asi )NTP )ala" &a"(u'an la'u an PCR a)ala% 8,2 "M. ;u,#' PCR Ko"(osisi +u,#' PCR )a(a )ili%a (a)a la+#l *an$ )i!#lua'!an ol#% (#'usa%aan (#"+ua . Pa)a ('insi(n*a !o"(on#n *an$ #')a(a )ala" la'u an #')i'i )a'i 18 "M T'is -(H ?,09, 28 "MKCL, 1,2 "MM$CL2, 8,81D $#la in, 8,81 NP08, )an 8,81D T=##n 28 s#' a 8,1D T'i on T3188. Kons#n 'asi la'u an (a)a u"u"n*a 18T )an (#n*i"(anan )ila!u!an (a)a #"(#'a u' 3288C. ;#+#'a(a (#'usa%aan "#"+ua l#'u an M$Cl2 s#&a'a #'(isa%. ;u,#' PCR )ijual sa u (a!# +#'sa"a )#n$an Tag polymerase. Kons#n 'asi la'u an +u,#' )ala" &a"(u'an la'u an PCR a)ala% 1T. P#n*i"(anan )ila!u!an )i )ala" ,'##@# (a)a #"(#'a u' 3288C. P'i"#' Oli$onu!l#o i)a -('i"#'9 (a)a u"un*a )i+ua )#n$an (anjan$ 1?318 +asa )an )i(asa'!an )ala" +#n u! freeze-dried a au la'u an -solu ion9. 7i!a )ala" +#n u! freese-dried, "a!a s#+#lu" )i$una!an %a'us )ila'u !an )#n$an !ons#n 'asi #' #n u )#n$an "#n$$una!an ai' "iliU. Dala" "#la'u !an ('i"#' %a'us )i(#'%a i!an (# unju! *an$ #' #'a )ala" +'osu' )an (# unju! !ons#n 'asi (a)a u+#. S#)an$!an la'u an ('i"#' *an$ sia( )i$una!an un u! PCR (a)a u"u"n*a a)ala% 2,2 ("olFE1 !#"u)ian )i+a$i )ala" a+un$ #(#n)o', 8,2 "l )ala" 6olu"# !#&il )an )isi"(an (a)a #"(#'a u' 3288C. Ai' Ai' *an$ +#'!uali as "#'u(a!an s*a'a +a$i +#'jalann*a sua u la+o'a o'iu". Ai' +u!u *an$ +#'u(a ai' ana% "au(un ai' PAM %a'us "#"nu%i s an)a' !uali as *an$ in$$i. Hal ini san$a (#n in$ ji!a la+o'a o'iu" "#"ili!i (#'ala an un u! "#"+ua +#'+a$ai j#nis ai' !a'#na ai' +a!u *an$ +u'u! a!an "#"(#'&#(a !#'usa!an )a'i ala (#n$ola%an ai', s#(#' i ala )is alasi, ala )#ionisasi ai', )an ala (u'i,i!asi ai'. Hal ini )is#+a+!an ,il #' *an$ )i$una!an )ala" (#'ala an #'s#+u &#(a aus )an (#'lu )i$an i. Di la+o'a o'iu", ai' )i+a$i "#nja)i +#+#'a(a j#nis "#nu'u !#$unaan )an ,un$sin*a, *ai u: Tap water: u"u"n*a )i$una!an s#+a$ai (#n&u&i ala la+o'a o'iu". S*a'a n*a a)ala% j#'ni% )an i)a! +#'+au. Dila+o'a o'iu" "ol#!ul#' s#"ua ala la+o'a o'iu" s#lalu )i +ilas )#n$an ai' )is ilasi a au ai' +#+as ion, !#"u)ian +a'u )is #'ilisasi La olatory grade wqter: "#'u(a!an ai' )is ilasi, "isaln*a un u! "#"+ua la'u an (#n*an$$a -+u,,#'9. !eagent grade water: "#'u(a!an ai' )is ilasi a au ai' +#+as ion )#n$an )ila!u!an ('os#s (u'i,i!asi. Pa)au"u"n*a ai' ini )i$una!an un u! !uil u' ja'in$an )an

Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21

+io&%#"i&al '#a$#n s. S#lain i u )ala" "#"+ua la'u an (#n*an$$a -+u,,#'9 a!an l#+i% +ai! "#n$$una!an ai' j#nis ini. "ltrapure reagent grade water: "#'u(a!an ai' )#n$an in$!a !#"u'nian (alin$ in$$i )an +#+as +a! #'i. ;#+#'a(a (#'usa%aan "#njual j#nis ai' ini )#n$an %a'$a *an$ san$a "a%al, ol#% s#+a+ i u %an*a )i$una!an un u! +io&%#"i&al '#a$#n s. P'os#s PCR s#+ai!n*a "#n$$una!an ai' j#nis ini.

Ca'a K#'ja M#n#n u!an ju"la% sa"(#l un u! analisis PCR -s#suai a+#l 19, !a'#na sa"(#l a)a 1 "a!a +a%an no 1 K 0 )i !ali!an i$a )an s# #la% #'&a"(u' )i+a$i i$a . M#n*ia(!an a+un$ PCR 8,2 "l )an 8,2 "l *an$ #la% )is #'il!an s#suai )#n$an ju"la% sa"(#l, a+un$ *an$ su)a% )iisi +a%an )i a"+a% )#n$an sa"(#l DNA . ;#'i la+#l (a)a s# ia( a+un$ PCR Masu!an s#"ua +a%an !#)ala" a+un$ #(#n)o', !#"u)ian !# T%#'"al &*&l#' "a&%in# )an jala" "#sin #'s#+u s#suai ('o$'a" *an$ )iin$in!an Da'i Hasil PCR #'s#+u )i lanju !an )#n$an analisis #l#! 'o,o'#sis *an$ !# 2

Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21

<a"+a' ? . Ala PCR

P#n*ia(an sa"(#l: 11. 2.2 1.1 0.0 2.2 2C '#a& ion "iC H2O nu!l#as# ,'## P'i"#' H -,o'=a')9 18 uM P'i"#' L -'#6#'s#9 18 uM Sa"(#l DNA To al 18 ul ?,2 ul 8,0 ul 8,0 ul 1 ul 28 ul

P'o$a" PCR: P'#)#na u'asi /28C Si!lus 12C D#na u'asi /28C 1 "#ni 2?8C 18 )# i! 2 "#ni

Ann#alin$ F P#n#"(#lan P'i"#' EC #nsion >28C 1 "#ni >28C

Hinal EC #nsion

18 "#ni

Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21

Hasil Pengamatan

Marker DNA Ayam

=ambar & ) Hasil (%: di-isualisasi melalui elektroforesis agarose / 0 Pembahasan Setelah kegiatan isolasi selanjutnya dilakukan amplikasi gen ND? menggunakan (%: dengan siklus ?6 kali. Sebelum diisolasi sample DNA ditambahkan dengan /@ reaction mi@ H/$ nuklease free (rimer A+For"ard, ) A&$866 ) =A% %AA %T% TTA AAA T%T == +/$bp, (rimer H +:e-erse, ) H&&&66 ) =AT TT= A=% %=A ATT %AA % +&Bbp,. Hasil amplifikasi (%: kemudian dianalisa dengan teknik elektoforesis. 4lektroforesis dapat digunakan untuk mengetahui ukuran DNA dengan menggunakan DNA marker yang sudah diketahui ukurannya. DNA 2arker ini berfungsi sebagai pembanding sehingga bisa diketahui perkiraan ukuran DNA sampel. Dari =ambar & hasil elektroforesis DNA terlihat tidak terbentuk pita jingga seperti halnya DNA 2arker dengan hal ini maka bisa bisa dikatakan bah"a percobaan elektroforesis DNA Ayam belum berhasil dilakukan. Faktor yang dapat mempengaruhi ketidakberhasilan dalam kegiatan elektroforesis kali ini dimungkinkan karena setelah isolasi DNA tidak dilakukan purifikasi DNA sehingga :NA masih ada yang tertinggal dan kemungkinan ketidakcocokan dalam penggunaan DNA marker dan primer. 1eberapa hal yang dapat mempengaruhi hasil elektroforesis adalah jumlah DNA di dalam sampel dan kecepatan migrasi DNA yang diperoleh oleh jenis DNA marker ukuran

Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21

DNA konsentrasi agarose konformasi DNA tegangan arus listrik arah medan listrik temperature keberadaan interchelating agent komposisi basa dan komposisi buffer elektroforesis +http://www.sciencebiotech.net diunduh tanggal &/ Desember /$&$,

ELEKTROFORESIS (endahuluan Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21

4lektroforesis adalah proses migrasi dari fragmen DNA di dalam gel yang direndam dalam larutan penyangga. Fragmen DNA yang lebih kecil berat molekulnya akan berjalan lebih cepat dari molekul DNA yang lebih besar. (erjalanan molekul DNA di dalam gel mengikuti arus listrik dari kutub negatif menuju kutub positif. Semakin besar tegangan arus listrik perjalanan molekul DNA akan semakin cepat demikian pula sebaliknya. Ada bermacam-macam ;at kimia yang digunakan sebagai gel di dalam proses elektroforesis. (enggunaan jenis disesuaikan dengan tujuan yang akan dicapai. (ada kesempatan ini hanya dua cara yang akan disampaikan. Caitu 4lektroforesis =el Agarose +Agarose =el 4lectrophoresisDA=4, dengan -isualisasi menggunakan ethidium bromide dan 4lektroforesis =el (olyacrilamide +(olyacrilamide =el 4lektrophoresisD(A=4, dengan -isualisasi menggunakan sil-er staining. !edua cara 4lektroforesis ini banyak digunakan dalam -isualisasi produk (%:. (rinsipnya alat elektroforesis dibagi menjadi dua elektroforesis. Dasa Teo i 4lektroforesis gel 4lektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. (rinsip dasar teknik ini adalah bah"a DNA :NA atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Aaju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. 4lektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri massa (%: kloning sekuensing DNA atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut. =el yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang +crosslinked, yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. .ntuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil +DNA :NA atau oligonukleotida, gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan ;at yang memungkinkan pertautan silang +cross-linker, menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. .ntuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar +lebih yaitu hori;ontal elektroforesis dan -ertikal

Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21

besar dari beberapa ratus basa, gel yang digunakan adalah agarosa +dari ekstrak rumput laut, yang sudah dimurnikan. Dalam proses elektroforesis sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur +"ell, pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga dan listrik dialirkan kepadanya. 2olekulmolekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat arah pergerakan adalah menuju elektroda positif disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. .ntuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran +yaitu panjangnya, ;at seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu protein didenaturasi dengan deterjen +misalnya natrium dodesil sulfat SDS, untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif. Setelah proses elektroforesis selesai dilakukan proses pe"arnaan +staining, agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. 4tidium bromida perak atau pe"arna Ebiru %oomassieE +%oomassie blue, dapat digunakan untuk keperluan ini. <ika molekul sampel berpendar dalam sinar ultra-iolet +misalnya setelah Edi"arnaiE dengan etidium bromida, gel difoto di ba"ah sinar ultra-iolet. <ika molekul sampel mengandung atom radioaktif autoradiogram gel tersebut dibuat. (ita-pita +band, pada lajur-lajur +lane, yang berbeda pada gel akan tampak setelah proses pe"arnaan7 satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari EsumurE gel. (ita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama yang biasanya berarti bah"a molekul-molekul tersebut berukuran sama. E2arkaE atau penanda +marker, yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis marka tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. (ita-pita pada lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. <arak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul. Tujuan (raktikum

Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21

2emberikan ketrampilan dan pengetahuan untuk melakukan teknik elektroforesis gel agarose 4lektroforesis gel agarose 1ahan dan Alat) Hori;ontal agarose gel electrophoresis apparatus +2.(*D, Fell-forming combs +sisir pembentuk sumur, (o"er supply 2icro"a-e atau hotplate .G transilluminator %amera polaroid (ipetor atau pipetman untuk+/ul-/$ul, atau +&ul-&$ul, Tap pipet +"arna kuning dan putih, Alat timbang+balance, (arafilm atau plastic cling "rap Aarutan yang harus dipersiapkan) &@bufer TA4 4thidium bromide +&$mgDml, Agarose DNA ladder Aoading dye %ara kerja elektroforesis gel agarose) (embuatan gel agarose)

Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21

Tentukan konsentrasi atau persentase agarose yang dibutuhkan dan hal yang ini tergantung dari ukuran fragmen DNA yang dianalisis. (ersentase gel agarose yang direkomendasikan adalah sebagai berikut) $ 60 agarose untuk fragmen DNA berukuran &.$$$-?$.$$$ pb $ 80 agarose untuk fragmen DNA berukuran 3$$-&/.$$$ pb & 60 agarose untuk fragmen DNA berukuran /$$-?.$$$ pb / $0 agarose untuk framen DNA berukuran 6$-/$$$ pb (ilih tipe agarose yang digunakan. !ebanyakan tipe yang digunakan adalah standard agarose. 2isalnya telah ditentukan akan dibuat /0 gel agarose dalam -olume /$$ ml &@ bufer TA4 maka jumlah agarose yang akan ditimbang yaitu) / gram D &$$ ml @ /$$ ml 5 '$$ gram Tempatkan ' gram agarose ke dalam labu erlenmeyer dan isi dengan larutan &H bufer TA4 sampai -olume /$$ m kemudian kocok sampai merata (anaskan dalam micro"a-e sampai mendidih sampai larutan menjadi jernih Dinginkan agarose kira-kira sampai #$o% dan tambahkan 6 ulethidium bromide +&$mgDml, dan campur hingga merata Setelah itu larutan dituang ke dalam tray dan pasang "ell-forming combs tunggu kurang lebih ?$ menit atau sampai gel mengras. Aepas "ell-forming combs secara perlahan-lahan dan gel agarose siap digunakan untuk elektroforesis.

(roses elektroforesis DNA hasil (%: yang diperoleh dianalisa dengan teknik elektroforesis menggunakan agarose /0. Sebanyak $ # gram agarose dilarutkan dengan ?$ ml Tris acetik acid 4DTA +TA4, &@ kemudian dipanaskan dalam microwave sampai larutan menjadi jernih. Aarutan didinginkan pada suhu kamar sampai dingin +hangat-hangat kuku, kemudian dimasukkan dalam &Il ethidium bromide +&$ mgD ml, dan dicampur sampai homogen. Agarose kemudian dituang pada cetakan gel yang telah dipasang sisir dan dibiarkan sampai membeku. Setelah

Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21

membeku gel dimasukkan bak elektroforesis yang telah diisi larutan buffer TA4 &@ sampai semua gel terendam. Sebanyak 8Il produk (%: dicampur dengan /Il loading dye kemudian dimasukkan ke dalam sumur-sumur pada gel. Running dilakukan pada &?6-olt selama /$ menit. !eberadaan pita-pita DNA produk (%: diamati di atas UV transluminator. Hasil positif ditunjukkan adanya pita ber"arna jingga pada gel agarose.

Hasil P#n$a"a an

Pita DNA

=ambar B. Hasil elektroforesis sampel DNA ayam dari 6 kelompok berturut-turut dari kiri ke kanan yaitu kelompok & / ? ' dan 6

Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21

Pembahasan

Fragmen DNA dapat diidentifikasi dengan elektroforesis gel agorose. Dengan teknik ini dapat memisahkan campuran potongan DNA sesuai dengan ukurannya secara akurat dibanding dengan densitas gradient sentrifugasinya. Selanjutnya lokasi DNA dalam gel tersebut dapat diidentifikasi secara langsung dengan menggunakan pe"arna berfluorescen. (otongan-potongan DNA berupa bands-DNA pada gel agarose dapat diidentifikasi dengan menggunakan pe"arna yang mengandung fluoresen dengan konsentrasi rendah seperti intercalating agent ethi!i"m b omi!e +4t1r,. 1erdasarkan pengamatan dapat dilihat pada gambar B bah"a ada "arna jingga "alaupun sangat tipis yang dihasilkan pada sampel DNA + ada pita-pita DNA hasil dari elektroforesis , . !emungkinan ketidakberhasilan tersebut dapat disebabkan oleh banyak faktor diantaranya) !urangnya ketelitian saat analisis (%: saat denaturasi terlalu lama sehingga mempengaruhi kerja en;im tag polymerase yang berakibat pada keberhasilan proses (%: mungkin juga disebabkan arus listrik yang mati secara tiba-tiba saat denaturasi sehingga perhitungan "aktu denaturasi cenderung lebih lama. Sampel primer yang tidak cocok dengan sampel DNA isolasi karena primer yang digunakan adalah primer burung sedang sampel yang kita gunakan adalah unggas sehingga tidak terdeteksi. 2ungkin juga DNA yang digunakan tidak murni untuk menjamin keakuratan pengujian karena darah ayam. Ayam memiliki kandungan polisakarida dan polifenol yang tinggi sehingga apabila tidak menggunakan DNA dengan kondisi yang murni maka dikha"atirkan akan mengganggu pengujian terutama dapat menghambat kerja en;im TaJ polymerase. Apabila ini terjadi maka hasil yang optimal dari pengujian (%: mungkin tidak akan diperoleh.

Kesimp"lan

&.

!egiatan isolasi DNA berhasil dilakukan dengan pembentukan pita jingga "alapun sangat tipis

Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21

/. ?.

DNA hasil isolasi dapat diamplifikasi dengan (%: sebelum dianalisis dengan teknik elektroforesis Hasil elektroforesis tidak menunjukkan terbentuknya pita jingga hal ini dimungkinkan karena tidak dilaksanakannya tahap purifikasi DNA dan ketidakcocokan DNA marker yang digunakan. !egiatan praktikum harus dilakukan secara hati Khati teliti praktikum berhasil dengan baik dan cermat agar

'.

REFERE#SI *s"ari Susanti Cuniastuti. /$$B. Petunju Pra ti um !io imia dan "embar #erja $ahasiswa. Semarang ) Aab.1iokimia <ur. 1iologi.F(2*(A .NN4S. Fatchiyah. /$$#. %el Ele tro&oresis. 2alang) Aab. Sentral 1iologi 2olekuler Dan Seluler Departemen 1iologi 1ra"ijaya !ent =.%. L :.!. %arr. /$$&. %omparati-e anatomy of the -ertebrates. Bth ed. The 2c=ra"Hill %ompanies Ne" Cork) @-ii 9 6/? hlm. !lug F.S. L 2.:. %ummings. &BB'. %oncepts of genetics. (rentice-Hall *nc. 4ngle"ood %liffs) @-i 9 88B hlm. Aaird (F Mijder-eld A Ainders ! :udnicki 2A <aenisch : 1erns A. &BB&. Simplified mammalian DNA isolation procedure. Nucleic Acids :esearch. &B +&6,) '/B?. :a-en (.H. L =.1. <ohnson. /$$/. 1iology. #th ed. 2c=ra"-Hill %ompanies *nc. Ne" Cork) @@i- 9 &/?3 hlm. Sulandari Syamsul. /$$?. Panduan Pra tis "aboratorium '(). %ibinong ) 1idang Moologi. (usat (enelitian 1iologi Aembaga *lmu (engetahuan *ndonesia Cephyhardi. /$$B. 2engenal (%: +(olymerase http)DD""".sciencebiotech.net diunduh tanggal &/ Desember /$&$. %hain :eaction,

http)DD""".lpch.orgDDiseaseHealth*nfoDHealthAibraryDhematologyDbloodo-ie".html http)DD""".mcb.uct.ac.;aDsdspage.html

Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21

http)DDen."ikipedia.orgD"ikiDDNA.html

Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21

Laporan Praktikum Biokimia Lanjut /Dr. Drh. R. Susanti, M.P Isolasi DNA, Polymerase hain Rea!tion, "lektro#oresis$Setyo Nu%roho&'(')*'+'*(,

21