Compendiu LP MedLab 2013

1
Capitolul 1 INSTRUCIUNI CU PRIVIRE LA RISCURILE EXISTENTE, POSIBILE SAU PRESUPUSE PENTRU LABORATOARELE MEDICALE
1.1. DEFINIII n sensul legii securitii i sntii n munc, termenii i expresiile de mai jos au urmtorul neles: a. accident de munc - vtmarea violent a organismului, precum i intoxicaia acut profesional, care au loc n mpul procesului de munc sau n ndeplinirea ndatoririlor de serviciu i care provoac incapacitate temporar de munc de cel puin 3 zile calendarisce, invaliditate ori deces; b. boala profesional - afeciunea care se produce ca urmare a exercitrii unei meserii sau profesii, cauzat de ageni nocivi fizici, chimici ori biologici caracterisci locului de munc, precum i de suprasolicitarea diferitelor organe sau sisteme ale organismului, n procesul de munc; c. echipament individual de protecie - orice echipament desnat a fi purtat sau mnuit de un lucrtor pentru a-l proteja mpotriva unuia ori mai multor riscuri care ar putea s i pun n pericol securitatea i sntatea la locul de munc, precum i orice supliment sau accesoriu proiectat pentru a ndeplini acest obiecv. 1.2. PERSONALUL a. La locurile de munc n care se desfoar acviti de laborator vor fi reparzate numai persoane care cunosc echipamentele tehnice, instalaiile i procedeele de lucru, au calificarea i autorizarea necesar i au fost instruite din punct de vedere al securitii muncii. b. La instructajul de protecie a muncii la ncadrare i periodic, se va insista asupra metodelor corecte de lucru, precum i asupra msurilor de protecie individual (echipament, igien). c. n laborator se va gsi n permanent trusa de prim ajutor necesar eventualelor accidentri (arsuri, tieturi, intoxicaii etc.), coninnd soluii alcaline, unguente, soluii acide, atropina etc. d. Se vor asigura duuri cu ap pentru splarea ochilor i unde este cazul i a ntregului corp n cazul stropirii cu acizi sau baze precum i posibilitatea administrrii de oxigen n cazul intoxicrii cu unele substane. e. Se vor afia la loc vizibil msurile de prim ajutor pentru principalele accidente, intoxicaii, arsuri etc., dup specificul fiecrui comparment. f. Nu se vor consuma alimente i nu se va fuma n ncperile unde se lucreaz cu substane toxice sau produse biologice. Se va asigura o ncpere separat pentru servirea mesei. g. Se vor respecta msurile de igien individual. n cazul lucrului cu produse biologice (snge, urin, sput etc.) se va proceda la ansepzarea minilor i a altor zone ale pielii dac este cazul, cu soluii ansepce corespunztoare.
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR h. Toate lucrrile de laborator se vor efectua cu foarte mare precauie i cu o temeinic documentare prealabil. Necunoaterea aparaturii i a aciunii substanelor cu care se lucreaz sau a substanelor care rezult din reacii (toxice, explozive etc.) pot fi cauze de accidente.
1.3. MBRCMINTE I ECHIPAMENT DE PROTECIE a. ntregul personal al laboratorului va purta echipamentul necesar n conformitate cu lucrrile efectuate i substanele folosite, prevzute n normavele n vigoare, att pentru protecia individual ct i pentru protecia produselor cu care se lucreaz, cnd este cazul. b. Se interzice purtarea echipamentului individual de protecie n spaiile desnate servirii mesei. c. n mpul efecturii unor manevre cu pericol de contaminare se va purta masc de protecie de unic ulizare. d. nainte de fumat, de servirea mesei i de orice manevr contaminant minile vor fi splate cu ap cald i spun lichid. Minile vor fi terse cu prosoape de hre de unic folosin. 1.4. ORGANIZAREA LOCULUI DE MUNC I A ACTIVITATILOR DE CURENIE, ELIMINARE DEEURI a. n laboratoare se va asigura o curenie perfect. n cazul laboratoarelor n care se lucreaz cu produse biologice (snge, urin, sput etc.), zilnic se vor dezinfecta suprafeele de lucru. b. Instrumentarul folosit i vasele care au coninut aceste produse (eprubete, sclue, borcane) vor fi sterilizate prin autoclavare nainte de a fi splate, iar dup splare cu detergent vor fi din nou sterilizate la autoclav. c. Colectarea deeurilor solide menajere se va face separat de cele rezultate din acvitatea medical, n recipiente nchise care vor fi descrcate la rampa de gunoi sau la crematoriu. d. Vor fi amenajate ncperi separate pentru depozitarea intermediar a reziduurilor menajere i a celor rezultate din acvitatea medical. 1.5. MANIPULAREA PRODUSELOR PATOLOGICE a. Nu se va gusta nici un fel de substan din laborator. Este interzis depunerea pe masa de laborator a igrilor, alimentelor sau altor substane nefolosite n cadrul lucrrilor. b. Pentru pipetarea materialelor biologice n stare lichid (snge, urin etc.) se vor folosi dispozive care evit contactul gurii cu pipeta (pipete semiautomate pentru examene serologice, pipete Pasteur DE UNIC FOLOSIN n cazul produselor contaminate cu germeni). Dup folosire, pipetele vor fi introduse complet n soluii dezinfectante eficiente. 1.6 SECURITATE CHIMIC a. Lucrrile cu substane toxice i acizi concentrai sau care presupun nclzirea produselor n vas deschis vor fi executate exclusiv sub ni, al crei raj va fi controlat n prealabil. b. n funcie de natura lucrrilor i numrul celor ce lucreaz n laborator, vor fi instalate nie, n numr suficient, prevzute cu instalaiile de gaze, ap i scurgere, cu o bun venlaie, fiind meninute n bun stare de funcionare.
INSTRUCIUNI CU PRIVIRE LA RISCURILE EXISTENTE N LABORATOARELE MEDICALE c. nainte de a pune o substan ntr-o scl sau vas, recipientul respecv va fi echetat.
d. Pipetarea lichidelor toxice se va face cu pipete speciale care s elimine orice posibilitate de accidentare. 1.7 PREVENIREA INCENDIILOR a. n cazul aparatelor electrice racordate la reea, se va ntrerupe curentul nainte de a se proceda la sngere, dup care se va folosi exnctor cu tetraclorur de carbon sau cu zpad carbonic. b. Dac se aprinde mbrcmintea, persoanele vor rmne pe loc i se va snge mbrcmintea nvelindu-se cu o ptur.
Capitolul 2 FACTORI PREANALITICI CU IMPACT ASUPRA ANALIZELOR DE LABORATOR

2.1. SOLICITAREA ANALIZELOR 2.1.1. Cum se solicit analizele de laborator? Solicitarea examinrilor paraclinice se face electronic sau n scris, bulenul de solicitare coninnd n mod obligatoriu urmtoarele date: a. Clinica/salonul emitent b. Laboratorul solicitat c. Nume / Prenume / Vrsta bolnavului d. C.N.P. e. Nurmrul foii de observaie (numr contrat cu CJAS pentru Lab. Policlinica) f. Diagnosc la internare g. Tipul lichidului / probei biologice (snge, urin, lichid cefalorahidian, lichid de puncie, sput) h. Analize solicitate i. Data recoltrii (i ora n cazul testelor solicitate de urgen i a celor bacteriologice) j. Nume/Semntura i parafa medicului solicitant (tampila rotund a cabinetului) k. Numele persoanei care a recoltat proba biologic l. Ora/minutul sosirii n laborator se noteaz pentru probele cu caracter de urgen, de ctre persoana de serviciu n laborator la departamentul Primire probe biologice, proba fiind preluat de la curier 2.1.2. Cine anun/pregtete pacientul pentru recoltarea probei biologice? Asistenta de salon/ambulator anun bolnavul asupra: a. momentului/locului recoltrii b. dietei precedente c. toaletei premergtoare anumitor recoltri (de exemplu pentru exudat faringian, urocultur) 2.1.3. Cine face recoltarea probei biologice? a. asistenta medical de salon / ambulan / laborator: snge venos sau capilar pentru determinri serologice, hematologice, de hemostaz, frou periferic, determinri din urin, sput, scaun. b. medicul: snge arterial, mduv osoas, lichid cefalorahidian, lichide de puncie.
FACTORI PREANALITICI CU IMPACT ASUPRA ANALIZELOR DE LABORATOR Tabel 2.I. Tipuri de colectoare i adivi Proba biologic Plasm Snge Snge Ser Urin Ancoagulant/ adivi Citrat Na3 3,2% - 0,5 ml Citrat Na3 3,2% - 1 ml EDTA K3 Vacutainer/container volum snge/urin 4,5 ml dop albastru 4 ml dop negru 2 ml dop roz-violet 7 ml dop rou Recoltor urin ~ 25 ml Mecanism Complex cu Ca2+ Complex cu Ca2+ Complex cu Ca2+ Aplicaii Coagulare VSH
Hemograma, citometrie n flux, ncrcturi virale, HbA1c Biochimie, Hormoni, Markeri tumorali, virali, Imunologie Sumar + sediment urinar
2.2 COLECTARE MATERIALE SI TEHNICI DE RECOLTARE Recoltarea se face cu sistemul de vacuum, direct n vacutainer! Nu se recolteaz n sering, pentru a transfera apoi n vacutainer ! Coagularea ncepe imediat dup scoaterea sngelui din vase ! Atenie la proporia snge : ancoagulant ! Proporia incorect modific rezultatele testelor de coagulare i a testelor hematologice. Tehnica recoltrii cu sistemul vacutainer a
Se dezinfecteaz plica cotului cu alcool iodat i se aplic garoul pe bra (nu mai mult de 1 min nainte de recoltare) Penetreaz pielea, innd dispozivul ntre poliucele i indexul minii drepte.
Cnd acul a fost poziionat n ven, se inverseaz poziia minilor, presnd tubul de recoltare cu policele drept peste acul protejat din lcaul manonului (indexul i mediusul fiind sprijinite pe juleraul manonului).
Sngele intr n tub proporional cu vacuuumul din interior. Se elibereaz cu mna garoul, meninnd cu mna stng dispozivul de recoltare.
Se scoate tubul cu mna dreapt fixnd cu mna stng n connuare dispozivul de recoltare.
Se agit imediat tubul uor prin rsturnare, pentru buna amestecare cu ancoagulantul. Nu se scutur energic!
Dac trebuie recoltate mai multe tuburi, se inser alt tub recoltor, repetnd etapele de la b-f.
Figura 2.1. Etapele recoltrii sngelui venos prin tehnica cu sistemul vacutainer ATENIE: Se noteaz pe echeta recoltorului numele pacientului i numrul setului de analize !!! Tehnica recoltrii sngelui capilar a. Se recolteaz cu pipete sau recoltoare adecvate, din pulpa degetului sau lobul urechii (haluce sau clci la sugari). b. Pipetele i soluiile trebuie pregte nainte de nepare. c. Se noteaz numele bolnavului pe echeta recoltorului. d. Recoltarea se face de regul dimineaa, pe nemncate a jeun - (n cazuri de urgen recoltrile pentru leucocite sau pentru hemoglobin, hematocrit se fac la orice or).
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR e. Se dezinfecteaz pulpa degetului (de preferat degetul IV) sau lobul urechii, prin badijonare cu un tampon cu alcool 70% sau alt dezinfectant uzual (alcool iodat). f. Se terge cu un tampon uscat (locul de nepat s fie uscat). g. Se neap cu un ac steril n unghi de 45 fa de linia median a pulpei degetului sau cu o lanet special de unic folosin la lobulul urechii. h. Prima pictur de snge se terge cu un tampon uscat. i. Se recolteaz picturile urmtoare, care apar spontan sau prin uoar apsare (strngere) a degetului pn la o distan de cel mult 2 cm de locul nepturii (pn la falanga a 2-a). j. Este interzis strngerea energic i/sau pn la locul nepturii, pentru a nu dilua sngele cu lichid intersial (dac obinerea sngelui capilar este dificil se nclzete zona sau se las s atrne extremitatea cteva minute). Proba biologic = fluide biologice (snge, urin, LCR, lichid amnioc, aspirate), colectate evitnd riscul contaminrii
2.2.1. Snge pentru explorarea elementelor figurate i a matricei proteo-saline Pregtirea pacientului Pacientului i se explic procedura la care va fi supus i se obine ntreaga lui complian. a. Recoltarea probelor se face cu pacientul n condiii bazale, naintea oricrei proceduri diagnosce sau terapeuce (ideal ntre orele 7 i 9 dimineaa, n condiii a jeun pe nemncate); pentru evaluarea metabolismului lipidic se recomand ca recoltarea s se efectueze dup 12 ore de la ulma mas. b. Cnd probele de snge nu sunt recoltate n condiii bazale, trebuie inut seama de efectele adiionale pe care le pot produce efortul fizic (chiar i efortul fizic moderat poate determina o cretere a glucozei, acidului lacc, proteinelor serice, CK), precum i a strii emoionale sau ritmului circadian care poate afecta anumii parametri. c. Recoltarea probelor biologice se poate face sub forma unei probe unice (de exemplu, pentru determinarea glicemiei bazale) sau sub forma probelor mulple (de exemplu, testul de toleran la glucoz). d. Asigurai-v c pacientul st ntr-o poziie comod (n poziie eznd sau n decubit dorsal). e. Verificai cu mare atenie ca toate datele demografice ale pacientului s fie corect scrise pe formularul cu care este nsoit acesta la punctul de recoltare a sngelui i echetai corect recipientul de recoltare. Tehnica recoltrii sngelui venos pentru determinri serologice /plasmatice a. Recoltarea se face de regul dimineaa (ntre orele 7,00-9,00), pe nemncate (a jeun) cu excepia urgenelor medicale. b. Se noteaz numrul setului i numele bolnavului pe echeta recoltorului (sau se lipete echeta cu cod de bare)
FACTORI PREANALITICI CU IMPACT ASUPRA ANALIZELOR DE LABORATOR
c. Se recolteaz din venele antecubitale (sau din v. jugular sau venele epicraniene la copiii mici sau din alte vene superficiale de la bolnavi la care este imposibil de gsit o ven accesibil la plica cotului). d. Se aplic garoul la cel puin 2-3 laturi de deget (3-5 cm) deasupra locului de nepare (maximum 1 MINUT nainte de recoltare). Bolnavul va strnge pumnul pentru a creea o presiune venoas crescut i o distensie maxim a venelor acelui segment de membru. e. Se dezinfecteaz cu un tampon cu alcool 70% sau cu nctur de iod. f. Se ptrunde cu un ac steril cu calibru adecvat cantii de snge necesar s fie recoltat, cuplat apoi la un container vidat, etan, cu marcher de nivel (Fig.2.1.). g. Sngele se recolteaz ca atare (fr adivi) pentru testele de biochimie, imunologie, serologie, hormoni, toxicologie i pe ancoagulant pentru testele hematologice, de coagulare i VSH. h. Pentru testele de coagulare, este preferabil s se ndeprteze garoul dup puncionarea venei (nainte de recoltarea n vacutainer), iar dac se recolteaz mai multe tuburi, cel pentru hemostaz va fi al doilea n care se recolteaz. Evitarea hemolizei Majoritatea cazurilor de hemoliz pot fi evitate dac se respect urmtoarele: a. Folosii un ac standard nu mai mic de 21-22 G (uneori poate fi necesar s se foloseasc ace de mrimea 22-23 G pentru pacieni vrstnici sau copii, cu vene dificil de puncionat). b. Dac aerul poate intra pe lng ac sau n tubul de recoltat, nlocuii vacutainerul. c. Dac folosii propriul echipament de recoltare i nu cel furnizat de laborator, asigurai-v c folosii materiale curate, uscate, sterile (tuburi, seringi, ace). d. Recoltai sngele n vacutainere inute la temperatura camerei. e. Cnd vacutainerul se umple prea greu cu snge datorit unei venopuncii dificile, acest fapt poate determina spargerea hemailor. Alegei un alt loc de recoltare i un alt vacutainer i recoltai al doilea specimen. f. Nu retragei acul din ven pn n momentul n care vacutainerul nu este complet umplut. Retragerea prematur a acului poate determina intrarea aerului n tub cu distrugerea hemailor. g. Executai manevre ct mai blnde cu pun n mpul recoltrii sngelui. h. Permitei uscarea dup dezinfectarea locului de recoltare. i. Nu recoltai snge dintr-o zon cu hematom. j. Cnd folosii vacutainere cu substane ancoagulante sau diferii adivi, percutai uor tubul imediat sub capac pentru a nu lsa adivul s adere de pereii vacutainerului sau de capac. k. Permitei tubului s se umple complet pentru a fi asigurat proporia corect ntre sngele recoltat i adivul din vacutainer. l. Asigurai-v c s-a produs amestecul sngelui cu ancoagulantul / conservantul / adivul, rond uor vacutainerul cu o micare de rotaie din ncheietura minii sau agitai uor pe vercal tubul de 5-6 ori. Agitarea energic poate determina hemoliza sau formarea de cheaguri. m. Verificai dac adivul / ancoagulantul s-a dizolvat. Dac mai este vizibil, connuai agitarea blnd pn este complet dizolvat.
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR n. Pentru vacutainerele fr ancoagulant, lsai proba s sedimenteze cca. 30-45 minute nainte de centrifugare. Aceasta permite coagulului s se formeze. o. Centrifugai proba folosind centrifugi calibrate, n conformitate cu instruciunile de durat i vitez cerute de centrifugare (de obicei 10-15 minute). (Ulmele dou puncte, vor fi respectate de laborator.)
2.2.2. Snge pentru explorarea microscopic a elementelor celulare ale sngelui Tehnica executrii frotiurilor de snge a. Se pregtete ntocmai ca i pentru tehnica recoltrii sngelui capilar. b. Se noteaz cu un creion grafit, numele pacientului i data recoltrii, pe marginea lefuit a lamei c. Se recolteaz din pictura de snge bine exprimat, cu marginea unei lame de scl, de preferat lefuit (lam de recoltare). Lama cu pictura de snge se aeaz oblic (n unghi de 45) pe lama de frou, degresat n prealabil cu alcool-eter i uscat bine prin tergere cu un tampon uscat i fluturare n aer. Se ine lama de recoltare cteva secunde pn pictura de snge se etaleaz complet spre cele dou margini ale lamei de baz. d. Se deplaseaz apoi lama de recoltare prin nndere spre captul opus al lamei de frou, pn pictura de snge se epuizeaz. Un frou corect trebuie s se termine nainte de captul opus al lamei, s fie uniform i ct mai subire. e. Frourile se usuc la temperatura camerei pe un rastel de lame. Se fixeaz i se coloreaz ulterior dup diferite tehnici. Lamele de frou se pstreaz ferite de cldur, umezeal, chimicale i insecte. 2.2.3. Recoltarea urinei Pentru examinri calitative Dup toaleta minilor i regiunii genito-urinare (splare cu ap i spun,tergere cu prosop curat i clcat) se recolteaz ntr-un vas curat (steril pentru urocultur) prima urin de diminea (10-15 ml din jetul mijlociu).Se noteaz pe recoltor numele pacientului i data/ora recoltrii. Instruciuni de recoltare la adult a. Curai zona genito-urinar cu ap i spun;la brbat se cur meatul i glandul iar la femeie dac exist o secreie genital abundent pe lng toaleta obinuit a vulvei se introduce n vagin un tampon steril. b. Se usuc zona cu o compres steril. c. Pentru a se recolta jetul mijlociu se urineaz o cantate mic n toalet i restul n recipientul special. d. Pentru a nu contamina proba se evit angerea recipientului de zona genital. e. Se echeteaz proba i se refrigereaz .Proba se trimite la laborator respectnd intervalul de mp menionat la fiecare p de test.
FACTORI PREANALITICI CU IMPACT ASUPRA ANALIZELOR DE LABORATOR Instruciuni de recoltare la sugar
a. Se cur zona genito-urinar cu ap i spun,nu se usuc zona i nu se aplic creme,uleiuri sau pudre. b. Se ataeaz ferm de zona genito-urinar punga pediatric de recoltare asel:se dezlipete banda de pe partea inferioar a pungii i se fixeaz pe perineu apoi se dezlipete partea superioar i se fixeaz asigurndu-ne c orificiul urinar a fost inclus n pung. c. Imediat dup ce copilul urineaz se dezlipete punga i se transport la laborator. Pentru examinri cantitative Dup toaleta manal a regiunii genito-urinare , se arunc prima urin de diminea, se noteaz ora i apoi se recolteaz ntr-un vas mai mare, curat, volumele de urin rezultate pe parcursul zilei i nopii care urmeaz, i prima urin din dimineaa urmtoare.Pe parcursul recoltrii, vasul se ine la rece iar n unele cazuri se adaug conservani pentru a evita descompunerea unor substane (acid 5-hidroxi indol acec). Se recomand ca bolnavul s nu foloseasc nici un fel de medicaie , dac este posibil, cu 3 zile naintea recoltrii.n unele cazuri se face acidifierea urinii ( pentru determinarea acidului vanil mandelic) cu HCl 25 ml 6N sau alcalinizarea cu 25 ml NaOH 6N.Se masoar volumul urinar recoltat n cele 24 ore cu cilindrul gradat, se omogenizeaz i se trimite la laborator un eanon de 10-15 ml ntr-un recipient echetat. Pentru determinarea Clearance-ului de creatinin Se aplic frecvent metoda prescurtat de recoltare: se arunc prima urin de diminea, apoi se recolteaz ntr-un vas volumele de urin rezultate pe parcursul a 3 ore (7-10 a.m). La mijlocul intervalului se recolteaz o proba de snge pentru determinarea creaninei serice. Se msoar volumul de urin recoltat n cele 3 ore, se omogenizeaz i se trimite la laborator un eanon de 20-25 ml. 2.3 TRANSPORTUL PROBELOR BIOLOGICE 2.3.1. Transportul probelor de snge Timpul de transfer al probelor ctre laborator poate fi: a. scurt, cnd locul de recoltare/clinica este n acelai loc cu laboratorul; b. mediu, cnd locul de recoltare/clinica este n aceeai localitate cu laboratorul, dar nu n acelai loc. c. lung, atunci cnd specimenul recoltat trebuie trimis spre un laborator medical din alt localitate. Exist mai multe puri de transport al probelor, n funcie de natura produsului i de stabilitatea analiilor care trebuie testai: a. transport n condiii ambientale; b. transport la rece (probe refrigerate la 4-12C, prin poziionarea n cuile de transport termoizolatoare a unor baterii refrigerabile care vor fi rencrcate zilnic). Reguli generale: n cazul unui mp de transfer scurt sau mediu, toate probele de snge vor fi transportate ambiental n containere/geni speciale (dac nu exist recomandri specifice de refrigerare a probelor);
10
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR probele transportate ambiental trebuie protejate de temperaturi extreme, prin ambalarea n materiale termoizolante (containere de polisren); probele refrigerate trebuie plasate n apropierea bateriei refrigerabile i nu direct pe acestea; vor fi folosite dispozive de monitorizare a temperaturii pe durata transportului. Este foarte important ca separarea serului de pe cheag s se fac rapid (n 10-15 minute dup recol-
tare), n cazul dozrii hormonului pararoidian (PTH), Cross-laps, Calcitoninei, hormonului de cretere (GH/STH) i factorului de cretere Insulin-like (IGF). Foarte important este ca prepararea froului de snge venos s fie fcut n maximum 3 ore de la recoltarea sngelui. De asemenea sngele recoltat pe citrat (pentru testele de coagulare) la pacienii care nu sunt heparinizai este stabil mp de 8 ore la temperatura camerei pentru determinarea mpului de protrombin (PT), mpului de trombin (TT), mpului protromboplasna acvat (aPTT), proteinei C i factorului V al coagulrii. Nu este valabil ns pentru determinarea factorului VII i proteinei S care au o stabilitate mult mai redus. n cazul pacienilor heparinizai sngele poate fi pstrat la temperatura camerei sau la frigider mp de 4 ore din momentul recoltrii probelor. Dac acest lucru nu este posibil, plasmele se separ i se stocheaz la -20C. 2.3.2. Transportul probelor de urin Pentru biochimia urinei i examenul microscopic al sedimentului urinar se recomand ca urina s fie examinat n maximum 2 ore de la recoltare.Cu ct urina este lsat mai mult mp la temperatura camerei, cu att devine mai pun valoroas pentru aceast analiz. Dac nu se poate asigura transportul n laborator n acest interval, urina trebuie s fie pstrat la frigider (4-8C ) sau tratat cu anumii conservani sau fixatori.Aceste msuri mpiedic sau ncenesc mulplicarea bacterian pn n momentul efecturii testelor. Pentru determinrile urinare cantave ale diverilor analii urinari, se recomand ca probele s fie procesate imediat dup ce au ajuns n laborator.Dac acest lucru nu este posibil, probele vor fi pstrate la frigider (4-8C ), dup ce n prealabil au fost adugai urmtorii stabilizatori: acid clorhidric-pentru determinrile de calciu, magneziu, fosfor, acid vanilmandelic, metanefrine; hidroxid de sodiu- pentru determinrile de acid uric. 2.4 TRIERE PRIMAR I DISTRIBUIE PE COMPARTIMENTE; CRITERII DE RESPINGERE A PRODUSELOR PATOLOGICE Trierea primar se produce n cadrul dispeceratului, de ctre dispeceri care verific corespondena dintre Formularul de monitorizare a transportului probelor primare i probele aduse, precum i integritatea recipientului, dac s-a recoltat n recipientul corespunztor i n cantate suficient. Laboratorul i rezerv dreptul de a refuza prelucrarea specimenelor recoltate i echetate impropriu. Laboratorul admite c exist situaii cnd unele specimene sunt mai puin obinuite, provin din proceduri invazive sau nu au putut fi uor recoltate i n aceste cazuri se pot aplica excepii de la regulile stricte ale
FACTORI PREANALITICI CU IMPACT ASUPRA ANALIZELOR DE LABORATOR
11
respingerii probelor. Excepiile sunt aplicate n concordan cu procedurile de lucru n uz. n general, probele biologice impropriu recoltate nu sunt aruncate pn n momentul n care unitatea sau persoana care a recoltat proba nu sunt anunate. 2.5 PRELUCRAREA PRIMAR Sngele pacientului, recoltat ntr-un tub fr substane ancoagulante, cu sau fr gel separator, este lsat s sedimenteze/s coaguleze, dup care va fi centrifugat i se separ serul, care conine toi componeni serici, mai puin fibrinogenul. Plasma este obinut din sngele recoltat ntr-un tub cu ancoagulant i apoi centrifugat. Ancoagulantul inhib formarea coagulului. Plasma conine toate purile de proteine. Prin centrifugare se pot separa att plasm, ct i ser (vezi Fig.2.2.). Diferena dintre plasm i ser este c plasma reine fibrinogenul, care este nlturat din ser. Pentru anumii analii exist diferene semnificave ntre rezultatele obinute la testarea din ser i cea din plasm: potasiu, magneziu, fosfor, proteine totale, lactat etc. Diferenele dintre valorile obinute din ser i din plasm se datoreaz unor factori ca: analitul poate fi consumat n mpul procesului de coagulare: fibrinogen, trombocite, glucoz; analitul poate fi eliberat din celule n mpul coagulrii: potasiu, LDH, fosfor, lactat; ancoagulantul poate interfera cu metoda de determinare n cazul GT, Li;
Snge integral
Ancoagulant
Fr ancoagulant
Centrifugare imediat
Stocai 30 min la temperatura camerei i dac e posibil la ntuneric
Centrifugai
Plasm
Ser
Figura 2.2. Obinerea plasmei i serului prin centrifugarea sngelui integral
2.5.1. Faza pre-centrifugare Serul sau plasma trebuie separate fizic de celulele sanguine ct mai repede posibil, pentru a nu exista riscul producerii unor rezultate eronate; se recomand asel o limit maxim de 2 ore din momentul recoltrii probei. Un contact mai redus cu celulele sanguine (sub 2 ore) este recomandat pentru potasiu, glucoz, ACTH, corzol, catecolamine, acid lacc i homocistein.
12
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR Refrigerarea probelor de snge inhib metabolismul celulelor sanguine i stabilizeaz anumii con-
stueni termolabili. Nu se recomand ca probele de snge integral s fie refrigerate dect dac exist recomandri specifice n acest sens. Asel, este contraindicat refrigerarea n cazul probelor pentru determinarea potasiului, deoarece temperatura sczut inhib glicoliza i favorizeaz eliberarea potasiului din celule, obinndu-se asel rezultate fals crescute. Pe de alt parte, probele din care se vor testa ACTH, PTH, acid lacc, catecolamine i gastrin vor fi rcite prin plasarea ntr-un recipient ce conine un amestec de ap cu ghea. 2.5.2. Centrifugarea Centrifugarea probei n vederea obinerii serului trebuie efectuat numai dup ce se constat c sngele a coagulat complet. n mod normal coagularea se produce dup cca. 30 minute, ns n cazul pacienilor care primesc tratament ancoagulant sau prezint defecte de coagulare aceasta se produce cu ntrziere. 2.5.3. Criterii de respingere a produselor patologice la prelucrarea primar a. Probe recoltate n recipiente improprii sau avnd conservani inadecvai b. Cantate insuficient a probei c. Specimen recoltat inadecvat d. Specimen transportat/stocat inadecvat e. Probe hemolizate 2.6 STOCAREA PROBELOR Dup ncheierea procesului analic, o parte din probe vor fi pstrate o anumit perioad de mp (vezi Tabel II.2), n condiii bine stabilite, asel nct s permit confirmarea rezultatelor, verificarea identii probelor sau efectuarea unor teste suplimentare. Probele de plasm desnate determinrii ncrcturii virale B i C, precum i probele de toxicologie (metale) sunt consumate de obicei aproape integral n procesul analic, de aceea nu vor mai putea fi disponibile pentru retestri (se va solicita repetarea recoltrii). Tabel 2.II. Proceduri de arhivare a probelor Probe pentru: Hematologie Biochimie i imunochimie (excepie fac probele menionate mai sus) Determinare hormoni i markeri tumorali Screening prenatal TORCH, serologie sifilis la care s-au obnut rezultate pozive Alergologie si boli autoimune ncrctur viral HIV, HCV, HBV Coagulare Examen de urin Tipul probe Snge pe EDTA Ser Ser Ser Ser Plasm Plasm Urin Perioada arhivrii 72 ore 1 sptmn 2 luni 1 an 2 luni Indefinit 5 - 10 ore 5 - 10 ore Temperatura 2-4C 2-4C -20C -20C -20C -70C 2-4C 2-4C
FACTORI PREANALITICI CU IMPACT ASUPRA ANALIZELOR DE LABORATOR 2.7. IMPACTUL VARIABILELOR PREANALITICE ASUPRA CALITAII REZULTATELOR DE LABORATOR Factori care afecteaz rezultatul n faza de recoltare a lichidelor biologice
13
Recomandare: Pentru a evita interpretarea eronat a rezultatelor analizelor de laborator, procedura standard de recoltare a probele de snge prevede 10-12 ore de repaus alimentar, lipsa acvitii fizice prealabile i poziia eznd. Ingerarea de alimente nainte de recoltare duce la valori crescute: cu pn la 50% ale trigliceridelor; pn la 15-20% ale glicemiei, transaminazelor, bilirubinei, fosfailor anorganici; pn la 10% ale potasiului; cu pn la 5% ale aminoacizilor, proteinelor, ureei, acidului uric, sodiului, calciului, fierului, colesterolului (variaiile mai mici de 5 % pot fi considerate neglijabile, fiind irelevante clinic!) nfometarea De scurt durat (pn la 48 de ore) duce la scderi uoare ale prealbuminei, proteinei transportoare a renolului i creteri uoare ale corpilor cetonici. De durat medie (dup 48 ore) duce la creteri nsemnate ale corpilor cetonici, lactatului, piruvatului i acizilor grai liberi (acidoz metabolic). De lung durat (sptmni) duce la scderea semnificav a: -GT, trigliceridelor, colesterolului, GPT, ureei, glucozei i creterea semnificav a: GOT, creaninei, acidului uric. Ingestia de alcool Ingesa acut de alcool (2-12 ore nainte de recoltare) duce la creteri ale trigliceridelor i GT (pn la +50%), a aldosteronului (pn la +150%) duce la scderi ale colesterolului (-10-20%), ADH, Corzol, Prolacnei (-40-50%) Ingesa cronic de alcool duce la creteri ale acvitii GT (+1000%), GOT (+200-300%), trigliceridelor, GPT, estradiol, corzol (+50%), volumului corpuscular mediu (MCV) i colesterolului (+10%) duce la scderi ale LDL-colesterolului(-20%) i acidului vanil mandelic (-15%) Trecerea din clinostatism n ortostatism duce la creteri: de pn la 15% ale parametrilor corpusculari - hemai, hemoglobin, hematocrit de pn la 10% ale substanelor macromoleculare - proteine, lipoproteine, enzime de pn la 5% ale leucocitelor, calciului total, imunoglobulinelor Efectul poate fi mai accentuat la pacienii cu tendina de a face edeme (ciroz hepac, insuficien cardiac). Aplicarea prelungit a garoului nainte de recoltarea sngelui Duce la creteri cu mai mult de 5% ale concentraiei: proteinelor, enzimelor, lipidelor, parametrilor corpusculari
14
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR Duce la scderi cu pn la 5% ale parametrilor cu greutate molecular mic, nefixai pe transportori: potasiul, clorul, creanina, ureea, glucoza, fosfaii anorganici i cu mai mult de 10% ale mpilor de coagulare Recoltri de pe catetere se recomand a nu se recolta de pe catetere de perfuzie, preferndu-se braul opus este preferabil s treac cel puin 1 or dup terminarea perfuziei i pn la recoltarea de snge dac nu se poate punciona o alt ven, recoltrile de pe cateter se vor face cu aruncarea primilor 5 ml de snge i abia apoi umplerea tuburilor de recoltare pentru testele influenate de heparin (APTT, mp de trombin), nainte de recoltarea de pe catetere heparinizate n tubul cu citrat, se recomand s se recolteze mai nti pentru alte determinri (biochimie, hematologie) se recomand de asemenea s nu se recolteze snge care a staionat n cateter Activitatea fizic Acvitatea fizic intens naintea recoltrii poate duce la creteri ale transaminazelor, CPK, ureei, glu-
cozei. Variaii diurne semnificative se pot observa la determinrile: hormonale catecolamine, corcosteroizi, prolacna, aldosteronul, testosteronul, T4 (prezint nivele maxime n general dimineaa orele 4,00-9,00 a.m.), n mp ce TSH i hormonul somatotrop prezint concentraia maxim n mpul somnului (ntre orele 21,00 2,00) electroliilor urinari concentraia sodiului urinar este cu 20-40% mai mic dup masa dect dimineaa fierului seric ntre orele 14,00-18,00 concentraia este cu 50-70% mai mare dect dimineaa eozinofilele ntre orele 18,00-20,00 sunt cu 30-40% mai sczute dect dimineaa Interferene medicamentoase Medicamentele pot exercita att efecte in vivo (influene biologice), ct i in vitro (interferene fizicochimice) Fumatul n dimineaa recoltrii - duce la creteri ale concentraiei multor hormoni (adrenalin, aldosteron, corzol) i acizilor grai. Fumatul cronic duce la: creteri ale carboxihemoglobinei, angenului carcinoembrionar (CEA+50%), leucocitelor (+3040%), fibrinogenului (+15-20%) scderi ale prolacnei, carotenoizilor (-20%), HDL-colesterolului (-10-15%)
FACTORI PREANALITICI CU IMPACT ASUPRA ANALIZELOR DE LABORATOR Aspecte particulare legate de tehnica de recoltare Parametrii biochimici pot fi influenai de:
15
pul de ancoagulant folosit - n determinarea glicemiei trebuie s se aib n vedere c fr un inhibitor al glicolizei (fluorura de Na, Iodoacetat), rata acesteia este de 7% pe or la determinrile glicemiei n ser, este important ca analiza s se efectueze n prima or dup recoltarea probei determinarea din ser sau plasm influeneaz rezultatele anumitor parametri - potasiul, fosforul anorganic, LDH, fibrinogenul n caz de trombocitoz (>800.000/mm3) se recomand ca determinarea potasiului s se fac n plasm (snge heparinizat) i nu n ser Parametrii hematologici pot fi influenai de : pul de ancoagulant folosit: pentru determinri corpusculare se recomand EDTA K3, ali ancoagulani - oxalaii, citratul, etc - influennd forma, volumul, adezivitatea, dispunerea pe frou a elementelor figurate. este preferabil ca frourile de snge s se efectueze din snge capilar Testele de coagulare pot fi influenate de : mpul de aplicare al garoului s nu depeasc 1 minut; garoul trebuie scos nainte de intrarea sngelui n vacutainer dac se recolteaz mai multe tuburi, cel cu citrat va fi recoltat al doilea pentru recoltare se vor folosi ace 19-21 G pentru aduli i 22-23 G pentru copii pul de ancoagulant folosit i proporia cu sngele se recomand citratul de sodiu 3,8% (0,109 mM/L) n proporie strict 1:9 cu sngele recoltat; oxalatul sau EDTA determin o mai rapid inacvare a factorilor labili (V i VIII) ai coagulrii se va evita formarea spumei la recoltare (agitarea tuburilor se va face delicat) rezultatele din probe hemolizate, icterice sau lipemice vor fi compromise (se recomand repetarea recoltrii) Factori care afecteaz rezultatul n faza de transport i stocare a materialelor biologice Recomandm trimiterea probelor biologice n laborator pe msur ce sunt recoltate (n grupuri de 1020 tuburi) i a nu se colecta pe secii pn la terminarea tuturor recoltrilor. Prelucrarea serului trebuie s se fac n maximum 1 or de la recoltare, pentru rezultate ct mai corecte. Se recomand centrifugarea n decurs de maximum 1 or a probelor pentru determinrile din ser sau plasm, ns nu nainte de 30 minute de la recoltare (pentru a preveni hemoliza i formarea tardiv a cheagului de fibrin n supernatant fenomen care CONDUCE LA ERORI DE PIPETARE I LA BLOCAREA SISTEMELOR DE ASPIRARE ALE ANALIZOARELOR). Ulizarea unor tuburi cu gel de separare a serului de elementele figurate antrenate n cheag (mult mai cossitoare ns), previne eliberarea n ser a unor constueni ai elementelor figurate. Factori care influeneaz parametrii biochimici-imunologici cu excepia fosfatazei acide, amoniacului, gazelor sanguine i lactatului, restul parametrilor de p substrat sunt stabili n serul separat de pe cheag, 1 zi la temperatura camerei (ATENTIE: enzimele la
16
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR 4C) i pn la 4 zile la 4C (acvitatea enzimelor scade cu 5-10%/zi); pentru o mai lung conservare se recomand congelarea la 20C n recipiente nchise (cu excepia enzimelor, a cror acvitate se reduce cu 5-10%/zi de stocare). pentru determinarea glicemiei, se recomand ca probele recoltate fr ancoagulani specifici (fluorur, iodoacetat), s fie centrifugate i serul separat n decurs de 30 minute de la recoltare; probele recoltate pe ancoagulanii amini, pot fi stocate la 4C, n recipiente nchise, pn la 7 zile. elementele celulare din LCR trebuie analizate pe parcursul a 1 or de la recoltare. gazele sanguine trebuie determinate imediat (dac nu este posibil, se recomand ca probele s fie colectate n recipiente de scl i plasate la ghea, pn la 2 ore de la recoltare). sedimentul urinar se recomand a fi analizat n maximum 2-3 ore de la recoltarea urinei;refrigerarea nu este recomandat, deoarece duce la precipitarea srurilor. Factori care influeneaz parametrii hematologici n recipiente nchise, componenii celulari i hemoglobina sunt stabile o zi, tuburile fiind pstrate la temperatura camerei, n poziie orizontal. se recomand prepararea frourilor n decurs de 3 ore de la recoltarea sngelui. Factori care influeneaz parametrii hemostazei determinrile trebuie fcute ct mai repede posibil (dac nu este posibil, se recomand stocarea plasmei srace n plachete imediat la 20C). plasma pentru determinarea mpilor Quick (PT), de trombin i a APTT, poate fi stocat 4 ore la temperatura camerei sau mai corect n frigider (la 4C); determinrile mai tardive de 4 ore conduc la scurtarea valorilor PT sau APTT. pentru determinarea proteinei S i a factorilor V i VIII, plasma poate fi stocat maximum 4 ore.
2.8 FACTORI CARE AFECTEAZ REZULTATUL N FAZA DE ANALIZ PROPRIUZIS Hemoliza determinarea LDH, potasiului, GOT i a CPK sunt influenate ( ) chiar i de o hemoliz uoar; concentraia potasiului crete dup 1 or de la recoltare, chiar fr hemoliz hemoliza scade concentraia fosfatazei alcaline, amilazei i GT. hemoliza masiv (>0,5 g/dL) influeneaz toate determinrile enzimace, microelementele, hormonii, markerii tumorali i serologici virali !!! Absena culorii roii a serului nu nseamn lipsa hemolizei. n momentul n care serul apare hemolizat cu ochiul liber, nivelul hemolizei este cel puin 0,03 g/dL. Hiperbilirubinemia influeneaz determinarea acidului uric (dac Bi > 5 mg/dL), a trigliceridelor (dac Bi > 10 mg/dL), a creaninei (dac Bi > 25 mg/dL)
FACTORI PREANALITICI CU IMPACT ASUPRA ANALIZELOR DE LABORATOR Lipemia
17
serurile lactescente interfer cu toate determinrile fotometrice (enzime, substrate, elemente minerale, proteine speciale - teste turbidimetrice) i testele de coagulare. Substanele hidrofile (electrolii, substrate) vor apare n concentraii fals crescute, datorit efectului hidrofob al lipidelor (nlocuitor de ap). 2.9. INFLUENA UNOR FACTORI BIOLOGICI ASUPRA REZULTATELOR Vrsta Cele mai nsemnate modificri fiziologice legate de vrst: La nou-nscut Hemoglobina, bilirubina i acidul uric: concentraia Hb, este mult mai mare la nou-nscut dect la adult; n zilele imediat urmtoare naterii hemoliza fiziologic (asociat imaturitii funciei de glucuronoconjugare hepac) duce la creteri nsemnate ale bilirubinei; concentraia acidului uric la natere este similar cu a adultului, descrescnd semnificav dup ziua a 2-a. n copilrie / adolescen Modificri semnificave ale fosfatazei alcaline i imunoglobulinelor: acvitatea fosfatazei alcaline serice n copilrie/adolescen, oglindete acvitatea osteoblalor (spre deosebire de adult, unde predomin izoenzima secretat de epiteliile canaliculelor biliare), fiind ceva mai sczut la sexul feminin. Concentraia imunoglobulinelor sufer modificri dramace, n special n primele luni de via, Ig A fiind deficitar pn n adolescen. La adult Concentraia colesterolului total i a fraciunii din LDL crete cu vrsta. Sarcina Interpretarea rezultatelor de laborator la femeia gravid trebuie s in cont de vrsta sarcinii. Tabel 2.III. Mecanisme care modific unii parametrii plasmaci la femeia gravid Mecanism Inducie Creterea concentraiei plasmace a proteinelor transportori Hemodiluie Creterea masei corporale i a metabolismului Deficien relav prin creterea necesarului Creterea proteinelor de faz acut Ciclul menstrual n mpul ciclului menstrual FSH, LH, estradiolul i progesteronul prezint variaie ciclic. Fe i fosforul scad la menstruaie, iar colesterolul scade la ovulaie. Teste modificate Fosfataza alcalin, Factorul VII al coagulrii Lipide, roxina, ceruloplasmina, cuprul Proteine totale, albumina Clearance-ul de creanin Fe, Ferina VSH
18 Intervenii chirurgicale
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR
n faza postoperatorie imediat cresc valorile de VSH, CRP (protein C reacv), fibrinogen, uree, numrul de leucocite i scad albumina i colesterolul. LA SFRITUL ACESTOR CAPITOLE VEI PUTEA S: a. Descrii principalele puri de recoltoare pentru produse patologice. b. Explici tehnica recoltrii sngelui venos cu sistemul vacutainer i tehnica recoltrii sngelui capilar. c. Descrii tehnica executrii frourilor de snge. d. Cuno criteriile de respingere a produselor patologice. e. Explici modul de transport i condiiile de stocare ale probelor biologice. f. Recuno factorii care afecteaz rezultatul analizelor n faza de recoltare, transport i stocare i n faza de analiz propriu-zis. g. S recuno i s evii hemoliza. h. Discui despre posibilitatea influenei unor factori biologici asupra rezultatelor.
19
Capitolul 3 METODE OPTICE DE ANALIZ
3.1. BAZELE TEORETICE ALE METODELOR OPTICE n laboratoarele clinice determinrile cantave prin metode de analiz opce se bucur de o larg ulizare. Acestea sunt metode fizico-chimice care se bazeaz pe determinarea spectrelor de absorbie sau de emisie ale substanelor i au avantajele de a fi simple, rapide i relav precise. Majoritatea substanelor au proprietatea de a absorbi selecv radiaii electromagnece de o anumit lungime de und (monocromace), permind asel, determinarea concentraiei substanei n proba de analizat. Pentru a nelege acest principiu de baz al determinrilor opce, trebuie mai nti s nelegem natura culorilor i a luminii. 3.1.1. Fotonul Lumina exist sub forma unor pachete de fotoni (foton; phos = lumin, n greac). La definiia modern a conceptului de foton a contribuit ntr-un mod esenial Albert Einstein a crui observaii experimentale nu puteau fi ncadrate n modelul clasic al luminii considerate und. De fapt, fotonii au att proprieti de und ct i de parcule. Aceasta calitate este denumit dualitatea und-parcul a luminii. De exemplu, un foton poate fi refractat de o lenl dar n acelai mp se poate comporta ca o parcul, deoarece masa sa poate fi msurat. Fotonii sunt emii n numeroase procese naturale, cum ar fi tranziia molecular, atomic sau nuclear pe un nivel energec inferior. n acest caz sunt emii fotoni de diferite energii, de la lumina infraroie la radiaii gamma. Pentru a nelege mai bine modul n care putem s determinm concentraia substanelor prin emisia i absorbia de lumin, trebuie s privim substana prin prisma celor mai mici elemente constuente ale acesteia i anume atomii. Atomii sunt formai din nucleu i electroni care orbiteaz n jurul nucleului, avnd anumite orbite stabile ( pe care se pot mica fr s cedeze sau s absoarb energie). Exist mai multe asel de orbite (orbitali electronici) fiecare cu un alt nivel energec - ceea ce nseamn c electronul trebuie s aib un anumit nivel energec care s-i permit s stea pe acel orbital.Trecerea de pe un nivel energec pe altul se face ntotdeauna cu schimb de energie, adic pentru a trece de pe un nivel energec inferior pe un nivel energec superior electronul trebuie s primeasc energie i acest lucru este posibil prin absorbia unei cuante de lumin (foton). Un asel de electron care a trecut de pe un nivel energec inferior pe un nivel energec superior se spune c se afl ntr-o stare excitat. n aceast stare ns, electronul este instabil, ntruct tendina oricrui sistem este s aib energie minim. n consecin electronul va nde s revin pe nivelul energec inferior, revenire care are loc prin emisia unei cuante de lumin cu energie, i deci frecven care depind de diferena energec dintre cei doi orbitali. ntruct
20
pn la urm nivelele energece ale orbitalilor depind de pul atomului sau a moleculei, nseamn c atunci cnd iluminm o substan cu o anumit radiaie ea va nde s absoarb i s emit radiaii cu lungimi de und caracterisce substanei respecve. 3.1.2. Lumina Este un p de radiaie electromagnec cu o lungime de und care o face vizibil pentru ochiul uman (aproximav 400-750 nm). Principalele proprieti ale luminii sunt: a. INTENSITATEA -msoar fluxul energec n unitatea de mp b. FRECVENA ()- numrul de evenimente n unitatea de mp c. LUNGIMEA DE UND () - se poate msura ntre oricare 2 puncte cu aceeai faz; distana dintre dou unde (vezi Fig. 3.1.) d. POLARIZAREA - caracterisc a undelor care descrie orientarea oscilaiilor acestora e. FAZA - o fraciune dintr-un ciclu complet Figura 3.1. Reprezentare schemac a unei lungimi de und () (Cu permisiunea autorului Sursa: hp://en.wikipedia.org/wiki/Wavelength; Autor: Dicklyon (Richard F. Lyon)
Figura 3.2. Unde sinusoidale de diferite frecvene. Undele din partea de jos a imaginii au frecvene mai mari dect cele de sus. (Cu permisiunea autorului -Sursa: hp://en.wikipedia.org/wiki/Frequency) Lungimea de und i frecvena sunt caracterisci ale radiaiilor care determin culoarea acesteia i sunt legate prin relaia:
=c
unde c = viteza luminii (c = 300.000 km/s) Lumina alb este un amestec de culori (vezi Tabelul III.1.). O soluie apare colorat pentru ochiul uman deoarece absoarbe toate radiaiile incidente ,cu excepia acelora care au culoarea soluiei.n fotometria de absorbie se folosesc radiaii incidente complementare culorii soluiei de analizat (vezi Tabelul III.1. ).
METODE OPTICE DE ANALIZ Tabel III.1 . Componentele luminii albe i complementarele lor Culoarea Violet Albastru Verde Galben Portocaliu Rou Lungimea de und (nm) 400-430 430-500 500-570 570-600 600-650 650-750 Culoarea complementar Galben-albastru Galben Rou Albastru Verde-albastru Albastru-violet
21
Radiaia monocromac este compus teorec dintr-o singur lungime de und; pracc ns, prin radiaie monocromac se nelege un domeniu foarte ngust de lungimi de und, izolat din spectrul unei surse de radiaii. 3.1.3. Spectrul electromagnec Spectrul electromagnec este un domeniu al tuturor frecvenelor posibile ale radiaiilor electromagnece. Spectrul electromagnec al unui obiect (n cazul nostru substan chimic) reprezint distribuia caracterisc a radiaiei electromagnece emise sau absorbite de acel obiect. Acest spectru se exnde de la frecvene joase folosite de transmisiunile radio moderne pn la radiaiile gamma cu lungime de und scurt. Cuprinde radiaii cu lungimi de und de mii de kilometrii pn la fraciuni din dimensiunea unui atom. (vezi Fig 3.3.).
Penetreaz atmosfera Pmntului?
Da
Nu
Da
Nu
Tipul radiaiei Lungimea de und (m) Scala aproximav a lungimii de und
Radio
Microunde
Infraroii
Sp. vizibil
UV
Gamma
Frecvena (Hz)
Temperatura obiectelor la care aceast radiaie este cel mai intens emis
Figura 3.3. Spectrul electromagnec (Cu permisiunea autorului -Sursa:hp://en.wikipedia.org/wiki/File:EM_Spectrum_Properes_edit.svg; AutorInducveload, NASA)
22 3.1.4. Legile fotometriei
Pentru ntelegerea acestora este necesar clarificarea a doi termeni: a. Lungimea de und opm determinrii (max) este lungimea de und la care absorbia substanei este maxim (se determin din spectrul de absorbie al substanei respecve).Prin absorbia energiei radiaiei se produce o excitare a componentelor structurale ale substanei (electronii atomilor, ionilor, moleculelor trec pe nivele energece superioare); substanele absorb energia sub form de cuante (pachete de energie E): unde h=constanta lui Plank Deci pentru fiecare substan exist o radiaie (de o anumit lungime de und max) care are energia opm pentru acest proces. b. Radiaia monocromac care strbate mediul opc omogen (soluia substanei de analizat), este parial absorbit de ctre moleculele substanei :
E= h = h c
I0= intensitatea radiaei incidente It = intensitatea radiaei transmise Ia =intensitatea radiaei absorbite
transmisie.
I0 = It + Ia
Raportul ntre intensitatea luminii transmise i intensitatea luminii incidente poart denumirea de
T=
It I0
, (0<T<1)
T% =
It I0
100, ( 0 < T < 100 )
Intensitatea radiaiei este atenuat (absorbit) proporional cu concentraia soluiei (c) i cu grosimea stratului de soluie strbtut (d); expresia matemac a acestui proces este dat de legea lui LambertBeer:
It = I0 10- c d
adic intensitatea luminii transmise scade n progresie logaritmic cu creterea concentraiei i grosimii stratului de soluie n progresie aritmec; = coeficientul molar de exncie (absorbana unei soluii a substanei de analizat, cu concentraia de 1 mol/L; depinde de natura substanei i de max). Aceast lege creeaz o relaie ntre absorbia luminii i proprietile materialului prin care trece lumina. Prin rearanjarea i logaritmarea ecuaiei de mai sus se obine legea de baz a fotometriei (Legea lui Bouguer-Lambert Beer):
-IgT = c d = E
unde E = Exncie = Absorban = Densitate opc n concluzie, condiiile necesare pentru orice determinare fotometric, sunt urmtoarele: 1. substana de analizat s formeze sau s elibereze un compus colorat stabil care s respecte Legea lui Bouguer-Lambert-Beer (colorantul s fie dispersat la nivel molecular).
METODE OPTICE DE ANALIZ 2. s se cunoasc max 3. reacia de culoare s fie specific substanei de analizat 3.2. METODE OPTICE DE ANALIZ A. METODE BAZATE PE DETERMINAREA SPECTRULUI DE ABSORBTIE, folosind proprietatea substanelor de a absorbi o parte din lumina care trece prin ele. 3.2.1. Fotometria
23
Fotometria este sina care msoar lumina, care este definit ca fiind radiaia electromagnec perceput de ochiul uman. Este aadar limitat la lungimi de und cuprinse ntre 360 i 830 nm. Msurtorile fotometrice se bazeaz pe fotodetectoare (construite n aa fel nct s mimeze rspunsul spectral al ochiului uman), dispozive care produc curent electric n momentul expunerii la lumin. Fotometria, determin concentraia unei soluii pe baza msurrii extinciei acesteia, la o anumit lungime de und . Radiaia monocromac se obine prin filtrarea luminii albe (filtre de interferen, prisme). 3.2.2. Spectrofotometria Spectrofotometria este un proces n care lumina, de intensitate i lungime de und cunoscut, este trecut printr-o soluie, i are rol n esmarea nivelului substanelor dizolvate n acea soluie. Diferitele substane, absorb radiaii de lungimi de und care sunt specifice fiecrei substane n parte. Cu ct substana de determinat va fi n cantate mai mare n soluie, cu att va fi absorbit mai mult lumin. Principiu: radiaiile luminoase trec printr-un sistem opc complex (de difracie), fiind descompuse n radiaii monocromace de diferite lungimi de und; piesele opce ale monocromatorului care asigur difracia luminii, permit msurtori n domeniul vizibil (prismele de scl i reele de difracie) i ultraviolet (prismele de cua). Radiaia monocromac selectat cade pe cuva cu soluia de analizat, iar intensitatea luminii transmise se msoar cu ajutorul celulelor fotoelectrice; fotocurentul generat intr ntr-un galvanometru, etalonat n uniti de exncie. Componentele de baz ale spectro- /fotometrelor sunt redate n Figura 3.4.
Apertura ajustabil Sursa de lumin
Fotorezistor
Rezultat
Proba Monocromator Cuveta
Amplificator
Figura 3.4. Schema de principiu a unui spectro-/fotometru

(Cu permisiunea autorului Sursa: hp://en.wikipedia.org/wiki/File:Spetrophotometer-en.svg)
24 3.2.3. Spectrofotometria de absorbie atomic (SAA)
A fost introdus ca o variant a fotometriei de flacr, care corecteaz neajunsul c majoritatea atomilor rmn n stare fundamental i doar o parte sunt excitai la un nivel energec superior, emind apoi prin revenirea la nivelul energec iniial, o radiaie corespunztoare liniei de rezonan. Spre deosebire de flamfotometrie , SAA - se bazeaz pe prima parte a procesului de excitare - care se refer la faptul c electronii atomilor, n urma absorbiei unei canti de energie trec pe nivele energece superioare. Cu ajutorul acestei metode se determin prezena i concentraia metalelor n probele lichide (n jur de 70 de metale). Proba este atomizat nspre o flacar. n forma lor elementar metalele vor absorbi radiaia luminoas n momentul acvrii cu ajutorul cldurii. Fiecare metal absoarbe radiaia de o anumit lungime de und. Instrumentul detecteaz un anumit metal prin concentrarea unei raze de lumin de o anumit lungime de und prin flacar i ntr-un detector. Dac metalul este prezent n prob va absorbi o parte din lumin reducndu-i aadar intensitatea. Analizatorul computerizat va transforma diferena de intensitate n absorban (aceasta este direct proporonal cu concentraa atomilor n flacr i cu grosimea stratului strbtut de radiaia monocromac). Detaliere: Principiul de baz al msurtorilor de absorbie atomic este atenuarea radiaiei de fundal specific unui anumit element datorit absorbiei suferite de aceasta n proba atomizat. Ca atare, atomii liberi sunt iluminai de ctre o radiaie monocromac (numit radiaie de rezonan) care are energia necesar pentru a produce saltul electronilor pe nivele energece superioare. Doar atomii de examinat pot absorbii aceast radiaie. Ca rezultat al acestei absorbii, intensitatea luminii scade proporional cu numrul de atomii de determinat prezeni n prob. Pentru a produce radiaia monocromac adecvat, se folosesc ca surse de radiaie aa numitele lmpi cu catod gol. Catodul acestor puri de lmpi, este alctuit din metalul pe care dorim s-l determinm, ceea ce nseamn c pentru fiecare element pe care vrem s-l invesgm se folosesc lmpi diferite. Anodul este alctuit din wolfram. Ace doi electrozi sunt nconjurai de un gaz nobil. La tensiuni nalte catodul produce electroni care sunt accelerai n cmpul electric cauznd ionizarea gazului nobil din interiorul tubului. Atomii de gaz nobil sunt la rndul lor accelerai i lovesc catodul provocnd dislocarea atomilor de pe suprafaa acestuia. Electronii accelerai, excit ace atomi liberi, care revin n starea fundamental prin emisia de lumin care are un spectru caracterisc elementului din care este alctuit catodul. n consecin, sursa de radiaie (denumit i radiator de fundal) emite energie Lenle Selector al lungimii de und Atomizator Procesor de semnal Amplificator
Sursa de radiaie
Detector
Prob
Figura 3.5. Schema de principiu n SAA

(Cu permisiunea autorului Sursa: hp://en.wikipedia.org/wiki/Atomic_absorpon_spectroscopy)
METODE OPTICE DE ANALIZ
25
radiant (spectru de linii) specific unui anumit element, care traverseaz comparmentul probei. Aici radiaia este atenuat datorit absorbiei de ctre proba atomizat. Spectrul de emisie al radiatorului de fundal prezint mai multe linii. Msurarea absorbiei cauzate de prob trebuie s se fac folosind o singur linie de spectru. Rolul monocromatorului este de a suprima toate liniile de spectru cu excepia uneia singure, asel nct fotodetectorul s primeasc numai radiaia de o anumit lungime de und specific elementului de determinat.. Semnalele primite de la fotodetector sunt amplificate i procesate pentru determinarea unei valori i afiate pe ecranul computerului sau, eventual, imprimate pe hre. Aplicaii ale msurtorilor fotometrice: a. Stabilirea spectrelor de absorbie ale substanelor. b. Determinarea concentrailor substantelor n diferite soluii. 3.2.4. Modaliti de determinare a concentraiilor necunoscute ale substanelor: a. Prin folosirea coeficientului de exncie:
Ep c = d diluia
Se poate pracca n situaiile n care: Legea lui Lambert-Beer este valabil; Cnd substana de analizat este colorat sau produsul colorat este n relaie stoechiometric i reproducbil cu substan de analizat; Cnd se ulizeaz cuve cu perei plani-paraleli i grosime exact cunoscut; b. Uliznd o curb de etalonare: Curba de etalonare urmrete stabilirea corelaiei dintre concentraie i exncie pe domeniul n care legea Lambert-Beer este valabil; pracc, se prepar o serie de etaloane cu maximum de precizie posibil n laborator, se efectueaz reacia de culoare pentru aceste etaloane i se determin exncia lor; se reprezint grafic pe hre milimetric (sau i mai bine uliznd un computer) exnciile cite (pe ordonat) fa de valorile teorece de concentraie ale etaloanelor lucrat corect, se obine o dreapt care trece prin origine. Concentraia necunoscut a unei probe se obine prin interpolarea valorii de exncie a probei pe graficul efectuat anterior. Se poate lucra doar n domeniul de linearitate al graficului; la concentraii mari ale Figura 3.6. Exemplu de etalonare uliznd sau nu radiai monocromace Concentraie Radiaie monocromac Radiaie nemonocromac Exncie (pe abscis)-vezi Fig 3.6. Dac s-a
26
substanei de analizat sau n situaia n care nu pot fi obinute radiaii strict monocromace, legea Lambert-Beer nu mai este respectat. c. Ulizarea unui standard livrat de laboratoare de referin sau firme de reacvi; n aceast situaie este aplicabil relaia de calcul:
E Cp = Ep Cs s
Avantajele spectrofotometriei: a. precizie de determinare; b. necesit o cantate mic de soluie de analizat; c. permite automazare i determinare rapid;
B. METODE BAZATE PE DETERMINAREA SPECTRULUI DE EMISIE Se concrezeaz prin excitarea atomilor substanei de analizat i nregistrarea intensitii radiaiei emise la revenirea atomilor n starea fundamental. 3.2.5. Fotometria de flacr (flamfotometria) Este o metod spectroscopic de emisie ulizat mai ales pentru dozrile electroliilor (metalelor alcaline i alcalino-teroase) n lichide biologice. Principiu: serul diluat se introduce prin pulverizare fin (aerosol) ntr-o flacar aer/acelen, bogat n electroni; apa din prob se evapor, iar ionii sunt redui la atomi aflai ntr-o stare energec mai ridicat:
A+ Ion poziv
t + e-
-h >A Atom n Atom n stare stare excitat fundamental

> A*
Revenirea lor la starea energec inial are loc cu degajarea energiei acumulate anterior, sub form de radiaie luminoas cu lungimi de und care deriv din diferena energec E (= h ) dintre starea excitat i cea fundamental (caracterisc pentru fiecare element chimic): pentru sodiu - 589,592 nm pentru potasiu - 769,896 nm pentru magneziu -515,517 nm pentru calciu - 621,498 nm pentru liu - 670,784 nm n principiu toate elementele emit bazal o band comun larg, peste care se suprapun benzile nguste specifice fiecrui element; aceste benzi individuale sunt selectate cu ajutorul filtrelor de interferen. Intensitatea radiaiei emise este direct proporonal cu concentraia elementului de analizat n prob. Metoda poate fi ulizat doar pentru dozri de metale alcaline i alcalino-teroase deoarece acestea necesit o energie de recombinare/acvare mai mic, posibil de obinut prin arderea acelenei.
METODE OPTICE DE ANALIZ Elementele structurale eseniale ale flamfotometrului i rolul lor (vezi Fig.3.7. ):
27
a. Pulverizator (atomizor, nebulizator): proba este aspirat ntr-o camer nchis, unde se formeaz aerosolii, care sunt condui mpreun cu combusbilul spre sistemul de ardere. b. Sistemul de ardere. c. Sistemul opc (oglinzi, lenle, filtre de interferen) care concentreaz i filtreaz lumina flacrii. d. Receptorul (celula fotoelectric) care genereaz un fotocurent (de intensitate corespunztoare intensitii luminoase rezultate de la prob), detectabil cu un e. Galvanometru (etalonat n uniti de concentraie !!! Paravan cu fant Fotoelement
Nori de atomi n flacr Atomizator Proba diluat Tub aspirator Filtru de interferen Galvanometru
Figura 3.7. Schema de principiu a unui flamfotometru Mersul determinrii: a. se introduce filtrul opc corespunztor ionului dozat b. se aprinde flacra c. se regleaz presiunea aerului i a combusbilului i se las aproximav 10-15 minute pentru stabilizarea intensitii fotocurentului. d. se introduce ap bidislat n aparat pentru etalonarea concentraiei 0 (zero) e. se introduce n aparat o soluie standard i se ajusteaz afiajul, n cazul n care nu corespunde cu concentraia standardului f. se introduce proba necunoscut i se citete indicaia instrumentului g. se introduce din nou ap bidislat pentru splarea aparatului h. se nchid robinetele de la sursele de combusbil i aer comprimat Calitatea determinrii depinde de: a. meninerea constant a presiunii aerului i combusbilului pe parcursul determinrii. b. temperatura constant i suficient de ridicat a flcarii: rata atomizarii (eficiena recombinrii) este cu att mai mare i limita de detecie este mai mic cu ct temperatura flacrii este mai mare; limitele de detecie pentru ionii metalelor alcaline i alcalino-teroase sunt ntre 0,0001 0,1 mg/L. (folosind aceasta metod!) c. vscozitatea probelor influeneaz debitul aerosolului, deci viteza de introducere a probei; de obicei serul se introduce diluat n aparat (de 20 40 de ori)
28
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR d. intensitatea curentului pe retea trebuie s fie constant, pentru a asigura un afiaj constant i corect al galvanometrului.
3.2.6. Fluorimetria Este un p de spectroscopie electromagnec ce analizeaz fluorescena unei probe. Fluorescena este fenomenul emisiei de lumin sub aciunea unei radiaii absorbite. n majoritatea cazurilor absorbia de lumin avnd o anumit lungime de und determin emisia de lumin cu o lungime de und mai mare (i energie mai mic). Emisia dureaz att mp ct dureaz i absorbia (vezi Fig.3.8.).
Figura 3.8. Schema de principiu a unui fluorimetru
3.2.6 Chemiluminiscena Este fenomenul emisiei de lumin n urma unei reacii chimice (de obicei de p redox ), intensitatea emisiei este direct proporonal cu concentraia elementului de analizat din prob (vezi figura 3.9.).
Figura 3.9. Schema de principiu a unui aparat care are la baza chemiluminiscenta.
3.3. ANALIZORUL AUTOMAT DE BIOCHIMIE n epoca modern a laboratorului medical, acum cnd ntreaga acvitate este reglementat, standardizat i acreditat de instuii internaionale de profil, accesul rapid i uor la rezultatele analizelor a devenit o realitate codian. Binenteles c i industria productoare de tehnic medical specific unui
METODE OPTICE DE ANALIZ
29
laborator medical i-a ndeplinit cu succes datoria i a reusit s pun la dispoziie un numr impresionant de aparatur, tehnic de calcul i soware-ul aferent. n ceea ce privete capitolul de biochimie din cadrul acvitii laboratorului avem numeroase opiuni care concentreaz toate purile de teste biochimice ntr-un singur sistem: enzime, substrate, electrolii. n analizor pot fi introduse n orice moment zeci de probe de ser, plasm, urin i lichid cefalorahidian. Stavele pentru probe permit accesul connuu n aparat, asel nct atunci cnd o serie de teste este analizat o alt serie i ia locul avnd un volum de lucru de sute-mii de teste/or. Instrumentele pun la dispoziie 4 metode de detecie : a. Fotometrie; b. Turbidimetrie; c. Poteniometrie cu electrozi ion selecvi ( ISE ); d. Polarimetrie de fluorescen. Are n component un spectrofotometru cu monocromator, diod i lamp cu halogeni de 100W ca surs de lumin cu un spectru de lungimi de und msurabile ntre 340 si 660 nm. Toate acestea sunt integrate i controlate folosind o unitate central de control computerizat. LA SFRITUL ACESTUI CAPITOL VEI PUTEA S: Descrii legile fotometriei. Explici care sunt condiiile necesare pentru orice determinare fotometric. S descrii principiul metodelor bazate pe determinarea spectrului de absorbe. Descrii flamfotometria, chemiluminescena, fluorimetria, ca metode bazate pe determinarea spectrului de emisie.
30
Capitolul 4 CONTROLUL DE CALITATE N LABORATOR

4.1. NOIUNI GENERALE Asigurarea calitii muncii de laborator este esenial pentru ca rezultatele obinute s fie realmente valoroase pentru medicul clinician, evitnd asel tratamente inule sau eronate, precum i cheltuieli suplimentare prin repetarea analizelor. Analizele sunt solicitate din patru considerente: a. pentru punerea sau confirmarea unui diagnosc; b. pentru depistarea unor factori de risc, respecv a bolilor subclinice (screening); c. pentru monitorizarea unui tratament; d. pentru stabilirea prognoscului. Pentru aprecierea cantav a performanei unui test diagnosc este necesar explicarea i calcularea parametrilor: a. Sensibilitatea ( Se ) unui test diagnosc - este probabilitatea ca un individ bolnav s aib rezultatele testului pozive (real pozive RP); uneori, n pracca de laborator, testrile pot da ns i rezultate fals negave (FN) pentru persoane bolnave
Se =
RP 100 RP + FN
b. Specificitatea ( Sp ) unui test diagnosc - este probabilitatea ca un individ fr boala respecv s aib rezultatele testului negave (test real negav - RN); dar n pracca de laborator, testrile pot da ns i rezultate fals pozive (FP) pentru persoane sntoase
Sp =
RN 100 RN + FN
Tipuri de erori: a. ntmpltoare, numite i erori subiecve-depind de atenia i corectudinea persoanei care efectueaz analiza. b. Sistemace, numite i erori obiecve-depind de calitatea reacvilor i aparaturii cu care se lucreaz. c. Grosolane, se datoreaz de cele mai multe ori unor confuzii de prob (prin greeli de recoltare, transport sau transcriere). Exactatea (Acurateea) este proprietatea unei metode analice de a da un rezultat ct mai apropiat de cel veridic. O metod este cu att mai exact cu ct are erori sistemace minime. Acest parametru de-
CONTROLUL DE CALITATE N LABORATOR
31
pinde de calitatea aparaturii i materialelor (tehnicilor) cu care se lucreaz, dar bineneles i de calificarea personalului. Precizia este dat de mrimea diferenelor obinute prin examinarea repetat a unei singure probe; precizia bun a unui sistem analic este calitatea de a da rezultate cu erori ntmpltoare ct mai mici. Expresiile matemace ale preciziei sunt deviaia standard (DS=s) i dispersia (s2) rezultatelor n jurul mediei. Unde:
DS = S =
(x -x) i=1
i
xi = valoarea unei determinri oarecare x = media aritmec a tuturor determinrilor n = numrul total de determinri = sum
n-1
Coeficientul de variaie (CV) este exprimarea procentual a DS din valoarea medie obinut. Repetabilitatea exprim precizia unui set de msurtori efectuate prin testarea repetat a unei singure probe, n acelai laborator, n aceeai zi, de aceeai persoan. Reproducbilitatea este precizia obinut prin testarea unei probe, n zile diferite, de persoane diferite. 4.2. DIAGRAMELE DE CONTROL Diagramele de control, asigur o evideniere a erorilor (obinuite sau ntmpltoare), prin reparzarea i plasarea rezultatelor obinute n urma testrii serurilor de control (Materialelor de Referin), n form grafic. Este necesar s se defineasc linia central a diagramei (cu ajutorul valorilor indicate de productorul materialului de referin) nainte ca liniile de control s fie trasate. Se recomand ca limitele pentru variaie, acceptate de productorul materialului de control, s fie trasate la 3s sau 2s (unde s este deviaia standard). Dac se presupune c distribuia fundamental a msurtorilor fcute este normal, aceste limite pot include 99,7% din ele, atta mp ct procesul este sub controlul valorii centrale. Atunci, 0,3% din rezultate vor depi limitele, ele semnalnd o eroare prin mesajul n afara controlului. Pentru o mai bun precizie, se adaug diagramei de control i limitele de atenie 2s, pe lng limitele de control 3s. Se fac un numr de determinri pe un material de control. Se calculeaz media rezultatelor obinute. Se calculeaz diferenele dintre fiecare valoare individual i medie, apoi suma acestor diferene, iar n final se calculeaz abaterea (deviaia) standard. Se calculeaz 2s i 3s. Se calculeaz limita de atenie superioar, respecv inferioar 2s. Se calculeaz limita de control superioar, respecv inferioar 3s. Se traseaz diagrama.
32
Liniile deviaiilor standard Zilele
Media
Valorile
Figura 4.1. Elementele constuve ale unei hri Levey-Jennings Cu ocazia fiecrei serii de determinri se va analiza materialul de control, iar valoarea obinut se va nregistra pe diagrama trasat. Se va urmri ncadrarea datelor obinute n limitele de atenie i de control ale diagramei. Diagrama se va reface de fiecare dat cnd se va schimba lotul de reacvi, dup repararea unui echipament de msurare ce a fost defect, dac rezultatele nregistrate pe diagram trezesc suspiciuni, etc. 4.2.1. Interpretarea diagramei de control Deviaia standard ofer imaginea preciziei unei metode, sau, alel spus, determin pentru o populaie de p Gaussian imprecizia metodei (figura 4.2.) . n consecin, valoarea medie a unei populaii de p Gaussian permite compararea valorii unei msurri punctuale i exprimarea diferenei fa de medie ca mulplu al deviaei standard, cunoscut n literatura de specialitate sub numele de reprezentarea distribuiei Levey-Jennings (figura 4.3.) . Acest p de reprezentare Levey-Jennings permite vizualizarea n form condensat i reprezentav a tuturor rezulatelor obinute prin examinarea unui material de referin, ntr-o perioad dat. Pentru interpretarea rezultatelor de control al calitai, este necesar s fie definite criteriile obiecve de decizie cu ajutorul crora s se poat valida o serie de msurtori. Figura 4.2. Distribuia normal a valorilor rezultate prin examinarea repetat a aceluiai material de referin
CONTROLUL DE CALITATE N LABORATOR Pentru a facilita interpretarea i a avea o reprezentare care ine cont de istoricul msurtorilor este preferabil ns o reprezentare n puncte, n funcie de ecartul fa de medie, raportat la deviaia standard, conform figurii 4.3. Presupunem c avem un set de date, n cazul nostru un set de valori reprezentnd concentraiile zilnice ale aceluiai produs de control de calitate. Calculm media i deviaia standard. Pe abscis se pun zilele sau numrul Figura 4.3. Reprezentarea n puncte a distribuiei Levey-Jennings
33
probei. Paralel cu abscis se nscriu drepte reprezentnd valorile mediei i a +1DS, +2DS,+3DS, -1DS,-2DS,3DS. Fiecare punct este reprezentat direct pe graficul asel obinut. Imagini de hri Levey- Jennings sunt prezentate n figurile 4.1. i 4.3. Se observ cu uurin elementele enumerate mai sus. 4.2.2. Interpretarea i validarea seriei de msurtori (Regulile Westgard) Pentru interpretarea rezultatelor de control al calitai, este necesar s fie definite criteriile obiecve de decizie cu ajutorul crora s se poat valida o serie de msurtori. Regulile Westgard constuie reguli ce stabilesc limitele de performan ale unei metode, i se constuie n norme de acceptabilitate a rezultatelor controlului de calitate. Regulile Westgard ofer criteriile obiecve de validare tehnic a unei serii de msurtori. Aceste criterii se codific sub forma A:L sau A L unde A reprezint numrul msurrilor luate n calcul, iar L reprezint limitele ulizate. Spre exemplu, 1:2S indic o msurare care excede 2s (de dou ori deviaia standard). Este posibil s combinm dou sau mai multe reguli prin separare cu o bar de fracie, de exemplu 1:3S / 2:2S, fapt ce indic c se aplic regulile 1:3S i 2:2S. Tabelul IV.1. Descrierea principalelor Reguli Westgard folosite n laboratorul de analize medicale
1:3S Aceast regul implic respingerea seriei de msurtori dac rezultatul nu se ncadreaz ntre limitele valoare medie i 3 deviaii standard. nclcarea acestei reguli poate scoate n eviden o eroare aleatoare (ntmpltoare). Vezi Fig.4.4. Regula este nclcat atunci cnd dou rezultate consecuve se afl de aceeai parte a uneia dintre limitele medie -2S sau medie +2S. nclcarea acestei reguli detecteaz erori sistemace.- Vezi Fig.4.5. Regula este nclcat atunci cnd patru rezultate consecuve sunt sub 1s sau peste linia de +1S. nclcarea acestei reguli nu implic neaprat respingerea rezultatelor din cadrul seriei de msurtori, ci poate indica faptul c este necesar o ntreinere sau o recalibrare a analizorului. Vezi Fig.4.6. Regula este nclcat dac 10 valori consecuve se afl pe aceeai parte fa de medie. nclcarea acestei reguli nu implic neaprat respingerea rezultatelor din cadrul seriei, ci poate indica faptul c este necesar o ntreinere sau o recalibrare a analizorului.- Vezi Fig.4.7.
2:2S
4:1S
10:med
34
nclcarea regulii 1:3S
Figura 4.4. nclcarea regulii 1:3S

Sursa: hp://www.westgard.com/westgard-rules-and-mulrules.htm Reparit cu permisiunea Westgard QC, Inc


CONTROLUL DE CALITATE N LABORATOR
35
nclcarea regulii 10:med
Figura 4.7. nclcarea regulii 10:med

4.2.3. Rezolvarea problemelor semnalate De fiecare dat cnd se efectueaz controlul se verific urmtoarele: a. Se determin pul de eroare, pe baza regulii nclcate. O eroare de precizie (de exemplu creterea impreciziei metodei) este semnalat pe baza regulii 1:3S , n mp ce o eroare sistemac (creterea inexactii) este semnalat prin regulile 2:2S, 4:1S sau 10:med. b. Se inspecteaz tot procesul de analiz pentru a se stabili care este cauza problemei semnalate. c. Se corijeaz problema constatat, dup care se analizeaz din nou eanoanele de control i se obine o nou interpretare a diagramei. d. Se repet sau se verific toate rezultatele pacienilor o dat ce problema a fost corectat. e. Se consult persoana responsabil pentru fiecare decizie privind un eventual raport al unui rezultat obinut obinut n afara seriei de control. Eliminarea erorilor ntmpltoare Analiza probelor de control este repetat la fiecare serie de determinri, urmnd strict metoda analic i evitnd erorile ntmpltoare. Dac un rezultat nu respect regulile de interpretare, analiza se repet din acelai eanon al materialului de control. Dac cel de al doilea rezultat arat c metoda este sub control din nou, putem presupune c n determinarea anterioar a aprut o eroare ntmpltoare. Dac totui, rezultatul analizei probei de control este eronat, dar reproducbil, este foarte probabil s existe o eroare sistemac, care impune corecia acesteia. ntreaga seria de determinri trebuie refcut. Eliminarea erorilor sistemace Pentru a verifica erorile sistemace sunt analizate cteva materiale de control diferite. Pentru a detecta erorile ce depind de reacvi sau de metod, trebuie s se foloseasc probe de control ale cror concentraii s acopere ntregul domeniu de lucru. Trebuie s se foloseasc minim o prob de control n partea inferioar i una n partea superioar a domeniului de lucru. n eventualitatea unei erori sistemace cu rezultate predominant superioare sau
36
inferioare valorilor actuale, trebuie s se efectueze o examinare pas cu pas pentru a gsi movul acestor tendine. Schimbri majore n mersul determinrii, cum ar fi schimbarea reacvilor, a aparatului sau personalului, poate ajuta la idenficarea rapid a acestui p de eroare. mbuntairea preciziei Precizia poate fi de asemenea mbuntit printr-o abordare pas cu pas n scopul de a gsi cauzele erorilor ntmpltoare. Precizia total a unei metode analice poate fi mbuntit prin examinarea pailor individuali de procedur, pentru a-l gsi pe cel care contribuie n mod esenial la eroarea total. LA SFRITUL ACESTUI CAPITOL VEI PUTEA S: Discui despre rolul diagramelor de control n laborator i modul n care acestea sunt construite. Descrii Regulile Westgard i s discui despre modul n care se rezolv problemele semnalate n urma efecturii unui control intern de calitate. Recuno i s descrii principalele puri de erori n laborator.
37
Capitol 5 METODE POTENIOMETRICE PARAMETRII ECHILIBRULUI ACIDOBAZIC

5.1 ECHILIBRUL ACIDOBAZIC PARAMETRI INTRODUCTIVI n procesele metabolice din organismele vii sunt produi connuu acizi organici sau anorganici, care nd s scad pH-ul organismului (Tabel 5.I.). Meninerea constant a pH-ului este ns o condiie esenial pentru homeostazie (variaii minore ale concentraiei H+ afecteaz acvitatea enzimelor i prin aceasta procesele metabolice). Concentraia sanguin a H+ este cuprins n limitele 35 - 45 nmol/L (exprimarea uzual se face ca logaritm zecimal negav din concentraia H+: pH = 7,35 - 7,45); intracelular pH-ul este mai acid (~ 6,9). Organismul dispune de mecanisme imediate - biochimice (sistemele tampon) i ulterioare - fiziologice (respiraia, funcia renal) pentru meninerea pH-ului n aceste limite. Valori ale pH-ului sanguin < 6,8 sau > 7,8 sunt incompabile cu viaa. Tabel 5.I. Structuri cu caracter acid produse n organism Acidul Dioxidul de carbon Acizi organici Acid Lacc Corpi Cetonici Acizi anorganici Fosfai acizi Sulfai acizi 5.1.1. Sisteme Tampon Sunt soluii obinute din amestecul unor acizi sau baze slabe cu srurile lor cu baze sau acizi tari i au proprietatea de a se opune variaiei pH-ului mediului la adugarea de acizi sau baze tari: 1. HA + H2O 2. KA Sursa Respiraia celular Glicoliza anaerob Spirala Lynen Compui cu fosfor Aminoacizi cu sulf Calea de eliminare Pulmonar Gluconeogenez Oxidare celular Renal Renal Cantatea produs 20.000 mM/zi 1.000 mM/zi Concentraia plasmac 21-30 mM/L 1 mM/L 1 mM/L
70 mM/zi
A- + H3O+ A- + K+
Rearanjnd i logaritmnd expresia matemac a constantei de echilibru a primei ecuaii se obine ecuaia Henderson - Hasselbalch pentru sistemele tampon:
38
k=
[A-] [H3O+] [H2O] [HA]
k [H2O]= Ka =
[A-] [H3O+] [HA]
Ka = constanta de aciditate a componentei acide a tamponului.
[A-] pH = pKa + lg [HA]
pH = - lg [H3O+] pKa = - lg Ka
Acidul slab i sarea sa se gsesc concomitent n aceeai soluie; deoarece sarea se gsete n form aproape complet disociat (echilibrul reaciei 2 deplasat la dreapta), conform legii aciunii maselor echilibrul reaciei 1 va fi deplasat la stnga, sau ecuaia Henderson - Hasselbach pentru sistemele tampon se poate scrie n forma urmtoare:
pH = pKa + lg
[sare] [acid]
determinnd direct doi dintre parametrii ecuaiei, prin calcul se poate obine al treilea. Capacitatea de tamponare (CT) a unui tampon este definit ca fiind acea cantate de H+ sau HO- care adugat la un litru de tampon modific pH-ul soluiei cu 1 unitate de pH; CT este maxim dac concentraiile celor doi componeni ai tamponului sunt egale (la pH-ul soluiei egal cu pKa); prin diluie pH-ul soluiei rmne acelai, CT ns scade; tamponul acioneaz opm n intervalul de pH = pKa 1 (Fig. 5.1.): CT 120 100 80 60 40 20 0 -2 -1 -0,5 pKa 0,5 1 2 pH
CT 1 C 1/2
Fig.5.1. Capacitatea de tamponare a unui sistem tampon n funcie de pH-ul mediului i de concentraia componenilor tamponului n organism funcioneaz patru sisteme tampon: tamponul bicarbonat / acid carbonic (HCO3- / H2CO3) - pK H2CO3 = 6.1; hemoglobina (Hb- / HHb) - pK HHb = 7.2; proteinele (Prot- / HProt); tamponul fosfat (HPO42- / H2PO4-) - pK H2PO4- = 6.8; Primele dou sunt tampoane predominent extracelulare, iar ulmele dou tamponeaz mai ales n spaiul intracelular.
METODE POTENIOMETRICE PARAMETRII ECHILIBRULUI ACIDOBAZIC
39
1.Tamponul bicarbonat / acid carbonic - este cel mai important tampon sanguin, att prin capacitatea mare de tamponare (asigur~52 % din CT a sngelui), ct i prin rapiditatea regenerrii componentelor sale (CO2 se elimin respirator, iar HCO3- se recupereaz i se formeaz la nivel renal). Ecuaia Henderson - Hasselbalch pentru acest sistem tampon:
pH = 6,1 + lg
[HC03-] pCO2 0,03
Concentraia H2CO3 este exprimat prin produsul dintre presiunea parial a CO2 (pCO2 ~ 40 mmHg) i coeficientul de solubilitate al acestuia n ap (0,03). Avnd n vedere faptul c pKa pentru acest tampon este destul de deprtat de pH-ul fiziologic, raportul ntre componenta metabolic (HCO3-) i cea respiratorie (CO2) a tamponului n plasm este 20; deci concentraia HCO3- este 23 - 25 mEq/L. pH-ul sngelui i lichidului extracelular depinde de reglarea raportului HCO3-/H2CO3, reglaj realizat rapid de plmn prin eliberarea CO2 i mai lent de rinichi, prin eliminarea H+ (sub form de NH4+ i H2PO4-), reabsorbia i neoformarea HCO3-. 2. Hemoglobina asigur ~ 31 % din CT a sngelui, capacitatea sa de tamponare fiind dat de gruprile polare ale aminoacizilor din structura globinei; este o cromoprotein cu rol tampon important datorit concentraiei mari pe care o are n snge, rolului de transportor al gazelor sanguine i abundenei hisdinei n structura sa (pKHis 7). 3. Proteinele plasmace (altele dect hemoglobina), asigur 15 % din CT sanguin (17 mEq/L), fiind importante mai ales ca tampon intracelular. 4. Tamponul fosfat este modest reprezentat n snge (~ 2 % din CT sanguin). 5.1.2 Parametrii echilibrului acido-bazic (EAB) Servesc la aprecierea statusului acid-baz n snge i depind de locul de recoltare al sngelui (arterial / capilar / venos = A / C / V): 1. pH-ul actual - valoarea pH-ului sngelui recoltat n condiii de anaerobioz; depinde de temperatura la care se lucreaz; pH 37 C = 7,45 / 7,40 / 7,35 (A/C/V). 2. presiunea parial a CO2 (pCO2), servete la determinarea componentei acide a tamponului; pCO2 = 35 / 40 / 45 mmHg (A / C / V). 3. bicarbonatul actual (BA), este concentraia bicarbonatului la 37 C, n sngele recoltat anaerob; normal: 24 2 / 252 mEq/L (A / V) 4. bicarbonatul standard (BS), este concentraia n bicarbonat a plasmei echilibrate la 37 C, cu pCO2 = 40 mmHg (valoarea din alveolele pulmonare) i o saturaie n O2 = 100%; la pH = 7.4, BS = 24 mEq/L 5. CO2 total, reprezint coninutul n CO2 al BA i H2CO3 din plasma separat anaerob la 37 C; normal: 25 2 / 26 2 mEq/L (A / V) sau 55 vol.% CO2 6. bazele tampon (BT = BB - buffer base), reprezint suma anionilor tampon (BA+Hb+Prot); normal: 48 2 mEq/L 7. baze exces (BE), reprezint abaterea poziv (exces de baze, +BE) sau negav (deficit de baze, -BE) a BBactual de la BBstandard (BBst= BS+Hb+Prot); normal: 2 mEq/L
40
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR 8. saturaia n oxigen a hemoglobinei: 94-100% / 60-85% (A / V) 9. lacuna anionic (anion gap), reprezint suma anionilor plasmaci, alii dect Cl- i HCO3-; se calculeaz prin relaia:
[Na+]+[K+]-[Cl-]-[HCO3-]; n sngele venos = 5 - 14 mEq/L.

5.2. VARIAII FIZIOLOGICE / PATOLOGICE ALE PARAMETRILOR EAB 5.2.1. Fiziologice legate de vrst: persoanele n vrst au pH-ul organismului n general mai acid dect nerii; perioadele zilei: dimineaa, jeun pH-ul este mai acid (datorit respiraiei supeficiale din mpul nopii); fazele digesei: digesa gastric crete pH-ul sanguin prin reinerea H + la nivelul stomacului, iar digesa intesnal scade pH-ul sanguin prin mecanism invers; starea de efort: efortul muscular intens, produce o scdere trectoare a pH-ului sanguin prin acidul lacc eliberat n glicoliza anaerob. 5.2.2. Patologice Acidozele i alcalozele sunt definite ca scderi, respecv creteri ale pH-ului avnd diverse cauze; clasificarea tulburrilor EAB n funcie de originea lor, precum i mecanismele compensatorii imediate (respirator sau renal), sunt redate n tabelul 5.II. Tabel 5.II. Tulburri ale echilibrului acido-bazic i compensarea lor imediat Tulburri ale EAB 1.Acidoz metabolic necompensat compensat 2.Alcaloz metabolic necompensat compensat 3.Acidoz respiratorie necompensat compensat 4.Alcaloz respiratorie necompensat compensat pH pCO2 N HCO3BE Observaii * Stare cu pH i HCO3- sczute i cu valori negave ale BE * pCO2 scade pn la pH normal * Stare cu pH i HCO3- crescute i cu valori pozive ale BE * pCO2 crete pn la pH normal * Stare cu cretere primar a pCO2 fr modificri ale BE i HCO3* HCO3- crete pn la pH normal * Stare cu scdere primar a pCO2 fr modificri ale BE i HCO3* HCO3- scade pn la pH normal
N N

N N

N N
N N
1. Acidoza metabolic poate apare n diverse situaii patologice nsoite de: acumulri de acizi (insuficiene renale, cetoacidoza diabec, acidoza lacc, metabolism anaerob), sau pierderi de baze (diaree, acidoz tubular renal); 2. Alcaloza metabolic, situaie mai rar ntlnit, se poate datora: pierderilor de acizi (vom, pierderi de suc gastric), sau
METODE POTENIOMETRICE PARAMETRII ECHILIBRULUI ACIDOBAZIC administrrii de baze n exces; 3. Acidoza respiratorie poate fi determinat de: depresia centrilor respiratori (supradozri de barbiturice, anestezice) obstrucii ale cilor respiratorii (astm bronic, bronite, tumori)
41
afeciuni deformante ale peretelui toracic, care mpiedic venlaia (cifo- scolioza, deformri ale cuei toracice) boli circulatorii (insuficiena cardiac congesv, ocul) 4. Alcaloza respiratorie poate apare n urma: hipervenlaiei (crize isterice, frica) lipsei de oxigen smularea toxic a centrilor respiratori (salicilai, hemoragie cerebral, respiraie arficial excesiv, febr rebel) 5.3. EXPLORAREA N LABORATOR A ECHILIBRULUI ACIDOBAZIC 5.3.1. Determinarea rapid a dioxidului de carbon i bicarbonatului plasmac (TCO2) metoda trimetric Scribner Reprezint o evaluare aproximav a echilibrului acido-bazic (determin doar bicarbonatul actual, CO2 i H2CO3), fiind folosit mai ales n urgen (in trecutul apropiat); a fost denumit impropriu rezerv alcalin (nu ia n considerare hemoglobina i proteinele). Principiu: Bicarbonaii din plasm sunt descompui cu acid azoc concentrat, al crui exces este trat cu NaOH n prezena indicatorului Rou Fenol. Reacvi: Soluie HNO3 0.1N; Soluie NaOH 0.1N; Soluie Rou Fenol 0,04% (n etanol 60). Tehnic: ntr-o eprubet curat, la 1 ml ser nehemolizat se adaug 0,7 ml HNO3 0.1N i 2-3 picturi de indicator; se agit 3 minute pentru a se elibera CO2; se treaz cu NaOH 0.1N: ntr-o pipet de 1 ml se aspir soluie pn la gradaia 0,7ml i se las pictur cu pictur soluia de baz n amestecul de reacie pn la virajul indicatorului din galben n portocaliu; se noteaz volumul rmas n pipet, acesta fiind egal cu volumul de HNO3 0.1N consumat de 1 ml de ser pentru eliberarea CO2. Calcul: ml NaOH 0.1N x 100 = TCO2 mEq /L, Valori normale : 25,5 2 mEq/L, 5.3.2. Determinri poteniometrice Sunt puri de determinri care au la baz msurtori electrometrice = determinarea forei electromotoare a elementelor galvanice (pilelor electrice de concentraie). Acestea sunt echipamente care transform energia chimic liber n energie electric. sau
vol.% CO2 =
TCO2 (mEq/L) 0,45
sau: 555 vol.% CO2.
42
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR Considerm oportun clarificarea unor termeni cu care opereaz poteniometria: 1. Energia liber: cantatea teorec maxim de energie care poate fi eliberat dintr-un sistem pentru ca acesta s ajung la echilibru 2. Oxidare: proces n care o specie chimic pierde electroni 3. Reducere: proces n care o specie chimic cg electroni 4. Anod: electrodul la care survine oxidarea 5. Catod: electrodul la care survine reducerea 6. Potenial de electrod: este dependent de energia electronilor ce intr sau prsesc un electrod 7. Electrod ion - selecv (ISE): electrod poteniometric care dezvolt un potenial n prezena unui anumit ion, dar nu i n prezena unei concentraii similare a altor ioni 8. Electrod de referin: electrod care are un potenial bine stabilit i este ulizat ca referin la care un alt potenial poate fi msurat 9. Electrod normal de hidrogen: electrod de referin pentru care este ncredinat (desemnat) valoarea de 0 voli 10. volt (V): unitatea potenialului electrostac (1V = 1 Joule/Coulomb) 11. Electrod saturat de calomel: electrod de referin ulizat deseori n poteniometrie, potenialul cruia se bazeaz pe reacia Hg2Cl2 + 2e- 2Hg + 2 Cl- (n prezena KCl saturat) 12.Punte de sare: un dispoziv care are rolul de a conduce ionii ntre dou comparmente de electrolii separate, care sunt conectate i prin conductori metalici (pentru transportul electronilor). Selecvitatea unui ISE este proprietatea acestuia de a dezvolta un gradient de potenial datorat unei
diferene de concentraie a unui ion oarecare ntre dou comparmente separate printr-o membran ion selecv. Abilitatea ionului n cauz de a se dizolva n membran, de a se mica relav liber prin membran, condiioneaz dezvoltarea gradientului de potenial.
Electrod ion selecv
Electrozi de referin Ag/AgCl Soluie de umplere KCL
Valinomicina
Referin intern Soluie intern

Prob
Membran potasiuselecv
Electrod de referin
Jonciune lichid
Electrod de referin
Faza ion selecv
Electrod indicator
Fig. 5.2. a. Schema de principiu a unui electrod ion-selecv; b. electrodul de potasiu
METODE POTENIOMETRICE PARAMETRII ECHILIBRULUI ACIDOBAZIC Comportarea electrozilor unei pile de concentraie este definit de Legea lui Nernst :
43
E = E0 + RT/zF x ln [X+]cunoscut / [X+]necunoscut

unde: E = fora electromotoare a elementului galvanic E0 = potenialul standard al electrodului de referin R = constanta gazelor perfecte (8.314 joules/(mole)(K)) T = temperatura absolut (K = 273 + C) z = numrul de electroni schimbai F = numrul lui Faraday (96,487 coulombs/mol electroni) 5.3.3. Determinarea parametrilor echilibrului acido-bazic cu microechipamente ASTRUP Datorit faptului c determinrile trimetrice de bicarbonai necesit volume relav mari de snge i au valoare informav redus (nu in cont de celelalte tampoane sanguine), Astrup a imaginat o micrometod (ulizeaz maximum ~0,1 ml snge), care are la baz relaia de invers proporionalitate ntre pH i pCO2 n fiecare eanon de snge (Fig.5.3.): pH1 pH2 pH3 pH4
log pCO2
Fig.5.3. Relaia liniar ntre log pCO2 i pH A. Tehnica echilibrrii - ASTRUP Primele echipamente erau dotate doar cu pH-metru (microelectrod de scl + electrod de calomel), dispoziv ultratermostat pentru meninerea temperaturii constante i dispozivul de echilibrare cu amestecul de gaze O2 - CO2 (nu aveau posibilitatea determinrii directe a pCO2 i pO2). Dup determinarea pH-ului actual, pentru reprezentarea relaiei de mai sus era necesar definirea a cel puin dou puncte: se echilibra (tonometra) sngele pacientului (recoltat n condiii anaerobe) cu dou amestecuri de gaze cu concentraii diferite, cunoscute ale CO2 (30 i respecv 60 mmHg), msurndu-se pH-ul amestecului n cele dou situaii. Se trasa graficul de mai sus (l inia tampon ) i ulterior, prin interpolare din punctul pH actual de pe abscis, se afla pe ordonat pCO2 (componenta respiratorie a tamponului HCO3-/H2CO3) n sngele pacientului; din ecuaia Henderson - Hasselbalch se putea calcula componenta metabolic (BA - HCO3-). Diagrama de mai sus a servit lui Siggaard i Andersen pentru construirea unei nomograme de calcul, prin trasarea unor scri adiionale (Fig.5.4.):
Fig.5.4. Influena hemoglobinei asupra capacitii de tamponare a sngelui (la pacientul anemic: B, C, bazele tampon sunt semnificav sczute)
44
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR linia izocarbonatului (sau a bicarbonatului standard -BS) - se traseaz prin punctul de pe ordonat pCO2 = 40 mmHg o linie paralel cu abscisa, care definete relaia HCO3-/pH pentru o valoare dat (40 mm Hg) a pCO2. curba excesului de baze (BE) - definit prin numrul de mEq de baz sau acid necesari readucerii pH-ului deviat la pH = 7,4 (sau prin variaia pH-ului sngelui la adugarea unor canti limitate de acid sau baz); la punctul definit pe abscis prin pH = 7.4, valoarea 0 de pe curba BE intersecteaz linia izocarbonatului la BS = 24 mEq/L. curba bazelor tampon (BT=BB) - definit de Singer i Hasngs ca fiind suma anionilor de bicarbonat i proteine n plasm; HCO3- + Prot. = 24 + 17 = 41 mEq/L. scar adiional a concentraiei hemoglobinei a fost adugat la partea inferioar a curbei bazelor tampon, pornind de la valoarea de 41 mEq/L, pentru a obine capacitatea de tamponare a sngelui (care depinde i de concentraia hemoglobinei) (Fig.5.4.); BT crete cu 0,4 mEq pentru fiecare gram de Hb%. n diagram se folosete o prob de snge fr tulburri ale echilibrului acido-bazic: linia A se obine
pentru snge integral - Hb=15 g%, linia C pentru plasma pacientului - Hb=0 g%, iar linia B pentru un amestec de snge cu plasm - Hb=5 g%). Mod de lucru: Etalonarea pH-metrului: se face la nceputul zilei de lucru, uliznd dou soluii tampon (fosfat) cu pH cunoscut; se ajusteaz afiajul pn cnd instrumentul indic pH-ul tampoanelor. Recoltarea sngelui: se recolteaz de obicei snge arterial n seringi heparinate (sau n capilare heparinate) etane, fr bule de aer. Determinarea propriu-zis: se aspir sngele cu ajutorul unei pompe de vid n capilarul pH-metrului, determinnd pH-ul actual; se spal electrodul cu ser fiziologic; se introduce un eanon din acelai snge n vasul de echilibrare cu CO2 (p1=30 mmHg), determinndu-se apoi pH1; se face o nou echilibrare a sngelui cu o presiune mai mare de CO2 (p2=60 mmHg), determinnd pH2; se spal electrozii pH-metrului cu ser fiziologic. Calculul parametrilor EAB (Fig.5.5.): cele trei valori de pH obinute anterior (pHa, pH1 i pH2) se transpun pe nomograma Siggaard-Andersen: se traseaz linia tampon prin punctele A i B ale sistemului de coordonate, reprezentate cu ajutorul pH1 i pCO2 = 30 mmHg, respecv cu pH2 i pCO2 = 60 mmHg; din punctul corespunztor pe abscis pHa se duce o paralel la ordonat, locul de intersecie cu linia tampon fiind notat cu C; presiunea parial a CO2 n sngele Fig.5.5. Exemplu de determinare a parametrilor echilibrului acido-bazic cu ajutorul nomogramei Siggaard-Andersen (explicaia n text)
METODE POTENIOMETRICE PARAMETRII ECHILIBRULUI ACIDOBAZIC bolnavului (pCO2) se citete pe ordonat n locul corespunztor proieciei punctului C; excesul de baz (BE) se citete la intersecia liniei tampon cu curba BE; bazele tampon (BT) se citesc la intersecia liniei tampon cu curba respecv; bicarbonatul standard (BS) se determin la intersecia liniei tampon cu linia izocarbonatului;
45
bicarbonatul actual (BA) se obine ducnd din punctul C o dreapt oblic la 45 pe linia izocarbonatului; CO2 total se calculeaz nsumnd (BA + pCO2 x 0,03) Datele din figura 5.5. indic o acidoz metabolic (pH, BA, BS, BT sczute i deficit de baze - BE), cu tendin de compensare respiratorie (scderea pCO2 prin hipervenlaie). B. Determinarea parametrilor echilibrului acido-bazic prin msurarea concomitent a pH-ului, p CO2 i pO2 Aceast metod, folosit n prezent, se bazeaz pe determinarea direct a pH-ului, dar i a pCO2 i pO2 cu ajutorul electrozilor gaz selecvi. Electrodul de CO2 (Fig. 5.6.) este n principiu un electrod de scl pentru pH, dar care este acoperit de un film subire de soluie de bicarbonat (meninut printr-o membran subire, permeabil pentru CO2); la introducerea acestui electrod ntr-o soluie cu CO2, acest gaz se echilibreaz pe cele dou fee ale membranei, modificnd pH-ul filmului de bicarbonat i genernd o diferen de potenial msurabil cu un poteniometru calibrat direct n mmHg; relaia ntre pH, concentraia HCO3- i pCO2 a fost redat anterior prin ecuaia Henderson-Hasselbalch; deoarece concentraia HCO3- nu variaz n cazul electrodului descris mai sus (fiind mare se poate considera c este constant), se poate afirma c ntre pH i lg pCO2 exist o relaie de invers proporionalitate (vezi figura 5.2.). Deteminarea prin msurtori directe a pH-ului i pCO2 permite calcularea celui de al treilea parametru din ecuaia Henderson-Hasselbalch. Nomograma de linii (figura 5.7.) permite acest calcul, precum i derivarea celorlali parametri ai echilibrului acido-bazic. Electrodul de O2 (Clark): se bazeaz pe o form special de electroliz, msurnd variaii de intensitate ale curentului (Amper, A) la o tensiune constant (metod amperometric); O2 este redus conform reaciei: Fig. 5.6. Electrodul de CO2 Membran semipermeabil
HCO3- + H+
HCO3- + H+
H2CO3
H2CO3
Electrod indicator Electrod de referin
CO2
Soluie eanon
CO2
Soluie tampon
O2 + 2H+ + 2 e- H2O2
Acest proces de reducere genereaz un curent proporional cu presiunea parial a O2 din camera de reacie; metoda permite msurtori rapide n canti mici de lichide.
46
Fig.5.7. Exemplu de determinare a parametrilor echilibrului acido-bazic cu ajutorul nomogramei de linii Siggaard-Andersen
METODE POTENIOMETRICE PARAMETRII ECHILIBRULUI ACIDOBAZIC 5.4. PREZENTRI DE CAZ 5.4.1. Coma acido-cetozic
47
O tnr de 20 ani cu mas corporal de 50 kg, este diagnoscat cu diabet zaharat de p I n urm cu 4 luni. Ca urmare a unei infecii urinare, pacienta renun la tratamentul cu insulin; trece i printr-o perioad de stres intens (sesiunea de examene). Este gsit n stare comatoas de familie. La examenul obiecv pacienta este inconent, cu tegumente uscate, este tahipneic i cu halen acetonic, presiunea arterial = 80/50 mmHg. Examinrile de laborator arat: Glicemie: 580 mg/dL Parametrii EAB: pH = 7,0; pCO2 = 30 mmHg; BB (buffer base) = 36 mmol/L, HCO3- = 15 mmol/L, BE= -12 mmol/L, LA= 27 mmol/L Ionogram: Na+: 147 mmol/L K+: 5,0 mmol/L Cl-: 110 mmol/L Comentariu: Acidoza metabolic decompensat este diagnoscat pe baza valorilor pH-ului i BE. LA confirm tulburarea echilibrului acido-bazic: se datoreaz creterii acizilor nevolali (corpi cetonici n cazul nostru). Infeciile i stresul (datorit eliberrii excedentare de hormoni cu efect hiperglicemiant) cresc necesarul de insulin la diabeci. Scderea dozelor de insulin, sau chiar oprirea tratamentului, favorizeaz apariia cetoacidozei. Pacienii cetoacidoci sunt deshidratai i hipotensivi. Administrarea de lichide parenteral i insulin, sunt obligatorii. Insulina smuleaz trecerea K+ n celule, de aceea concentraia potasiului trebuie strns monitorizat n cadrul tratamentului comei cetoacidoce. La pH sub 7,1 se adaug bicarbonat de sodiu. Cantatea administrat se calculeaz pe baza formulei: BE (mmol/L) x 0,3 x kg (mas corporal). Pe perioada tratamentului trebuie monitorizai parametrii echilibrului acido-bazic. 5.4.2. Acidoz respiratorie O pacient de 57 ani, fumtoare de peste 30 de ani a peste 20 igarete / zi, cu frecvente infecii ale cilor respiratorii n antecedente, se prezint n serviciul de urgen cu dispnee acut. Examinarea parametrilor acido-bazici a artat: pH: 7,35 pO2: 46 mmHg pCO2: 55 mmHg bicarbonat: 36 mmol/L Comentariu: Pacienta prezint o acuzare a patologiei pulmonare obstrucve cronice, nsoit de acidoz respiratorie compensat metabolic. Hipoxia este un factor important n meninerea venlaiei, de aceea administrarea oxigenului la aceast pacient trebuie fcut cu precauie, sub monitorizare atent a presiunii pariale a gazelor sanguine.
48 5.4.3. Alcaloz respiratorie cauzat de hipervenlaie
Un tnr de 25 ani se prezint n serviciul de urgen n criz de astm bronic. Parametrii EAB determinai la sosire au artat urmtoarele valori: pO2 = 70 mmHg, pCO2 =30 mmHg, pH = 7,5. Pacientul a fost tratat cu salbutamol aerosol (smulant adrenergic 2), sub efectul bronhodilatator al acestuia starea lui ameliorndu-se. Comentariu: Gazele sanguine ale acestui pacient arat o uoar alcaloz respiratorie, datorat probabil hipervenlaiei (n cursul creia CO2 se elimin, fr o oxigenare eficient ns). Alcaloza determin o cretere a gradului de legare a ionilor de calciu la proteinele plasmace, ceea ce va crete excitabilitatea neuro-muscular la pacientul n cauz. Acidoza respiratorie datorit incapacitii de eliminare a CO2, apare doar n formele foarte severe de criz astmac. 5.4.4. Alcaloz metabolic Pacient de sex masculin, muncitor, 59 de ani, 178 cm, 52 kg, acuz jen epigastric de aproximav 6 luni, greuri, inapeten, scdere n greutate - 15 kg. De cinci zile, pacientul prezint vrsturi abundente postprandiale (la cca. 2 ore dup alimentaie); vomismentele conin resturi alimentare nedigerate. La examinare se constat tegumente i mucoase uscate, palide. Pacientul prezint de asemenea spasme musculare i hiperexcitabilitate neuromuscular. Ganglion limfac mrit n zona supraclavicular stng. Durere epigastric la palpare, TA: 110/60 mmHg. La endoscopie se constat o formaiune tumoral conopidiform pe curbura mic, exns la nivelul pilorului. Examinrile de laborator arat: Parametrii EAB: pH = 7,5; pCO2 = 45 mmHg; BB (buffer base) = 56 mmol/L, HCO3- = 35 mmol/L, BE= 8 mmol/L, LA= 4 mmol/L Ionograma: Na+: 145 mmol/L K+: 3,0 mmol/L Cl-: 115 mmol/L Ca total: 2,5 mmol/L Ca2+: 0,9 mmol/L Comentariu: Voma prelungit, datorit obstruciei de pilor ca urmare a unei tumori gastrice, poate conduce la alcaloz metabolic. Consecina deficitului de protoni este modificarea raportului ntre componenta liber i cea legat de proteinele plasmace a calciului seric; simptomatologia secundar caracterisc hipocalcemiei, se datoreaz scderii componentei libere. Scderea potasiului se datoreaz orientrii spre spaiul intracelular la schimb cu protonii, iar creterea clorurilor eliminrii prefereniale a bicarbonatului la nivel renal.
METODE POTENIOMETRICE PARAMETRII ECHILIBRULUI ACIDOBAZIC 5.4.5. Anemia ca i cauz de dispnee
49
O persoan de sex masculin de 36 ani se prezint la un consult medical n urma constatrii c la urcarea scrilor dintre dou etaje, are dispnee acut i oboseal marcat. Radiografia toracic i electrocardiograma nu au evideniat nimic semnificav; gazele sanguine au fost n limite normale. Din anamneza atent se deduce c pacientul a folosit mp ndelungat aninflamatorii nesteroidice pentru dureri arculare cronice. Hemograma efectuat a artat urmtoarele rezultate: hemoglobina 10g/dL (normal 13-17 g/dL), volumul corpuscular mediu 70 fL (normal 80-100 fL), iar ferina seric 10 g/L (valoarea normal 30-300 g/L). Comentariu: Simptomatologia i rezultatele de laborator orienteaz diagnoscul spre o anemie cu deficit cronic de fier, datorat unui ulcer gastric cu pierderi sanguine (cauzat de ulizarea ndelungat a terapiei aninflamatorii nesteroidice). LA SFRITUL ACESTUI CAPITOL VEI PUTEA S: 1. Descrii coninutul i modul de funconare a unui tampon fiziologic 2. Structura i modul de funcionare al ISE electrodul de pH 3. Cuno parametrii echilibrului acido-bazic al organismului 4. Descrii principalele dezechilibre acido-bazice i modul lor de compensare
50
Capitolul 6 EXPLORAREA METABOLISMULUI CARBOHIDRAILOR

Glucidele (carbohidraii, hidraii de carbon) sunt macronutrieni cu un rol important metabolic i structural. Se prezint sub form simpl sau polimerizat, iar n funcie de gradul de polimerizare, se clasific n monozaharide (ex. glucoza, fructoza, galactoza), dizaharide (ex. zaharoza, lactoza), oligozaharide i polizaharide (ex. amidonul, glicogenul). Glucoza este cel mai important monozaharid din snge i principala form sub care sunt absorbii, ulizai i depozitai hidraii de carbon, fiind o surs energec esenial care susine acvitatea celulelor organismului. Metabolismul carbohidrailor este constuit din totalitatea reaciilor biochimice de sintez i catabolism al glucidelor, i poate fi alterat prin mai multe mecanisme, cum ar fi deficit de substrat (malabsorbie), defecte de stocare, modificarea concentraiei sau aciunii homonilor implicai n reglarea metabolismului glucozei (cum ar fi, scderea concentraiei de insulin i/sau insulinorezisten, care au ca rezultat diabetul zaharat). Metabolismul glucidic poate fi explorat cu ajutorul mai multor parametri: unii dintre acea permit evaluarea statusului curent al metabolismului (glicemia, glicozuria), alii ofer o esmare retrospecv a echilibrului metabolic (hemoglobina glicat, fructozamina). 6.1. GLICEMIA Glucoza din snge este preluat i metabolizat rapid de ctre esuturi, i de aceea glicemia (concentraia glucozei din snge) reflect controlul metabolismului glucidic pe termen scurt. Sursa de glucoz din snge este alimentar i endogen (prin glicogenoliz hepac sau muscular i gluconeogenez hepac), iar degradarea sa se produce prin procese de glicoliz. Homeostazia glucozei este asigurat n primul rnd la nivel hepac i este reglat de hormoni hipoglicemiani (insulina) i hiperglicemiani (glucagon, catecolamine, corzol, somatotrop). n condiii fiziologice, dup ingesa alimentar, nivelul glicemiei ncepe s creasc n aproximav 15 minute, ange un maxim al concentraiei n 30-45 minute, iar n aproximav 1-2 ore revine la nivelul bazal i rmne stabil pna la urmtoarea mas. Nivelul maximal al concentraiei de glucoz depinde de cantatea i pul de carbohidrai ingerai. Aceast dinamic este oglindit de secreia prandial de insulin: exist o faz iniial, cu un peak la 2-3 minute i o durat de aproximav 10 minute, i o a doua faz, dup 10 minute, care dureaz ct mp glicemia rmne crescut, iar cantatea de insulin secretat este proporional cu cantatea de carbohidrai absorbii. ndat ce glicemia scade, secreia de insulin revine la valorile bazale (preprandiale), pentru a se preveni apariia hipoglicemiei n perioada postabsorbv (figura 6.1.).
EXPLORAREA METABOLISMULUI CARBOHIDRAILOR Metodele de determinare: ne-enzimace (metoda Nelortho-toluidin) - abandonate n prezent enzimace (metodele cu hexokinaz / G-6-P dehidrogenaz, glucozo-oxidaz / peroxidaz) rapide, specifice Principiul metodelor enzimace: ntr-un amestec coninnd glucozooxidaz, peroxidaz i un cromogen Timp Insulinemia (U/ml) son-Somogyi i metoda cu Glicemia (mg/dl)
51
Figura 6. 1. Dinamica glicemiei i insulinemiei postprandiale
(ex. tetramelbenzidina) se adaug produsul biologic (serul) cu o concentraie necunoscut a glucozei. n urma reaciilor de mai jos (oxidarea glucozei n acid gluconic, sub aciunea glucoz-oxidazei) se formeaz peroxid de hidrogen (apa oxigenat), ntr-o cantate proporional cu concentraia glucozei. n etapele urmtoare, sub aciunea peroxidazei, peroxidul de oxigen oxideaz o substant cromogen ntr-un produs colorat. Intensitatea culorii este proporional cu concentraia iniial a glucozei.
Glucoza + O2 Glucozo-oxidaz acid gluconic + H2O2 H2O2 Peroxidaz H2O + O* compus colorat (verde-albastru)
Tetramelbenzidina + O*
Determinarea glicemiei din ser:
serul trebuie separat imediat dup coagulare sau analizat n prima or dup recoltare, ntruct n sngele integral, glucoza este degradat de ctre enzimele glicolice din elementele figurate (la temperatura camerei, scderea medie a concentraiei de glucoz este de circa 5-7 % pe or). Alternav, se pot folosi tuburi de recoltare cu inhibitori de glicoliz. determinarea din ser are acuratee mai mic dect cea din plasm. Determinarea glicemiei din plasm (metoda considerat standard) sau snge integral: valorile determinate din sngele integral sunt mai mici dect cele din plasm, ntruct volumul de distribuie al glucozei este mai mare (hemaile conin mai puin ap liber dect plasma); valorile determinate din snge capilar sunt mai mari dect cele din snge venos (deoarece la nivel capilar o parte din glucoz este extras); recoltarea sngelui trebuie fcut pe ancoagulant + inhibitori de glicoliz (fluorura de sodiu) sau separarea plasmei trebuie fcut imediat dup recoltare.
52
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR Determinarea glicemiei (din sngele capilar) cu ajutorul testelor rapide (glucometre) nu este utiliza-
t pentru stabilirea unui diagnostic (ex. de diabet zaharat), ci pentru urmrirea evoluiei bolii (monitorizarea i automonitorizarea echilibrului glicemic) . Factori care interfereaz cu dozarea glicemiei: rezultatele pot fi fals crescute n cazul n care exist valori ridicate ale bilirubinei, hemoglobinei, acidului uric i creaninei. Valori normale (bazale): 70-99 mg/dl (plasm). Unitatea de msur n Sistemul Internaional este mmol/L, ns n pracca clinic se folosete pe scar larg exprimarea n mg/dl (1 mmol/L = 18 mg/dl). Factori care pot influena rezultatele: dieta anterioar, perioada din zi (testul se face dimineaa, deoarece glicemia n jurul amiezii este mai mare), medicaia (diurece azidice, -blocante, steroizi etc.). Valori crescute: diabetul zaharat p 1, diabetul zaharat p 2, sindrom Cushing, gigansm/ acromegalie etc., pancreat, stress acut emoional sau fizic. Valori sczute: hiperplazii insulare, tumori secretante de insulin, boli endocrine (insuficien hipofizar, hipotalamic sau corcosuprarenalian), intoxicaie etanolic, boli hepace sau renale (ciroza hepac (faz avansat), nefropai avansate). Pentru diagnoscul diabetului i prediabetului (glicemie bazal modificat sau scderea toreranei la glucoz), dozarea glicemiei se efectueaz n condiii bazale i/sau la 2 ore dup administrarea de glucoz (testul de toleran la glucoz oral). Testul de toleran la glucoz oral (TTGO) Indicaii: Valori glicemice jeun ntre 100- 125 mg/dl sau orice situaie care ridic suspiciune de diabet zaharat, n special dac exist factori de risc* pentru diabet Pentru diagnoscul diabetului gestaional Glicozurii sau hipoglicemii repetate, inexplicabile Factori de risc (pentru diabetul zaharat p 2): Suprapondere sau obezitate Sedentarism Rude grad I cu diabet Ras/etnicitate cu risc crescut Istorie de diabet gestaional sau naterea unui copil macrosom Hipertensiune arterial (TA 140/90 sau tratament pentru hipertensiune) HDL colesterol < 35 mg/dl i/sau TG > 250 mg/dl Istoric de boli cardiovasculare Sindrom de ovar polichisc Alte condiii clinice asociate cu insulinorezisten GBM / STG / HbA1c 5,7% Contraindicaii: Nu se recomand efectuarea testului:
EXPLORAREA METABOLISMULUI CARBOHIDRAILOR dac sunt ndeplinite deja criteriile de diagnosc pentru diabetul zaharat
53
imediat dup infarct miocardic, natere, intervenii chirurgicale, n caz de infecii sau alte situaii de stress acut n prezent se consider c TTGO nu aduce beneficii notabile fa de glicemia bazal ca metod de screening a diabetului zaharat, pentru a fi jusficat ulizarea sa de run. Pregrea pacientului: Diet liber, cu un aport de minim 150 g carbohidrai n cele 3 zile premergtoare testului; Repaus alimentar de minim 8 ore (se poate consuma ap); Evitarea fumatului nainte i n mpul testului; Nivel obinuit al acvitii fizice cu 24 ore naintea testului; evitarea efortului fizic naintea (dimineaa) i n mpul testului.
Efectuarea testului: Testul se efectueaz dimineaa (ntre 7:30 10:00); Se efectueaz cu subiectul n poziie seznd; n mpul testului nu se vor consuma alimente sau lichide (apa este permis); Se recolteaz o proba de snge venos pe ancoagulant pentru dozarea glicemiei bazale din plasma rezultat, apoi se administreaz oral 75 g glucoz dizolvat n 300 ml ap, care se consum n maxim 5 minute; Se recolteaz o nou prob de snge la 120 minute dup administrarea glucozei. Interpretarea rezultatelor: Glicemia bazal: < 100 mg/dl : normal 100-125 mg/dl : glicemie bazal modificat (GBM) 126 mg/dl : diabet zaharat Glicemia la 2 ore: < 140 mg/dl : normal 140-199 mg/dl : scderea toleranei la glucoz (STG) 200 mg/dl : diabet zaharat Criteriile ADA (American Diabetes Associaon) de diagnosc pentru diabetul zaharat: 1. HbA1c 6,5%. Testul trebuie efectuat printr-o metod cerficat i standardizat* 2. Glicemie bazal plasmac 126 mg/dl (7,0 mmol/L) (dup un repaus alimentar de minim 8 ore)* 3. Glicemie plasmac 200 mg/dl (11,1 mmol/L) la 2 ore dup TTGO 75 g glucoz* 4. Glicemia plasmac random (n orice moment, indiferent de intervalul de la ulma ingese alimentar) 200 mg/dl la un pacient cu simptome clasice de hiperglicemie (polidipsie, poliurie, scdere ponderal inexplicabil) * n absena hiperglicemiei neechivoce, criteriile 1-3 se vor repeta pentru confirmarea diagnoscului Criteriile ADA de diagnosc pentru diabetul gestaional: La prima vizit prenatal se va efectua screeningul pentru diabetul zaharat p 2 nediagnoscat anterior, pentru toate persoanele asimptomace, aflate la risc, folosind metodele standard. Diagnoscul stabilit n acest moment va fi de diabet zaharat clinic manifest, nu diabet gestaional.
54
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR Gravidele fr diagnosc anterior de diabet, vor fi testate n sptmnile 24-28 de sarcin, prin
efectuarea unui TTGO cu 75 g glucoz, dimineaa, dup un repaus alimentar de minim 8 ore, cu msurarea glicemiei bazale, la 1 or i la 2 ore. Diagnosticul de diabet gestaional se va stabili dac oricare din valorile urmtoare sunt depite: Bazal 95 mg/dl (5,1 mmol/L) 1 or 180 mg/dl (10,0 mmol/L) 2 ore 153 mg/dl (8,5 mmol/L) 6.2. GLICOZURIA Glicozuria reprezint prezena glucozei n urin. n mod obinuit (la valori normale ale glicemiei), urina nu conine glucoz, ntruct rinichiul are capacitatea de reabsorbie a glucozei filtrate. n cele mai multe cazuri, apariia glucozei n urin este determinat de depirea pragului renal, adic o cretere a glicemiei peste o valoare de aproximav 180 mg/dl, cnd glucoza filtrat nu mai poate fi n totalitate reabsorbit. Pragul renal de reabsorbie a glucozei poate fi mai sczut n anumite condiii (n sarcin, la copii). Rareori glicozuria se datoreaz unei cauze tubulare renale i poate aprea n condiiile unei glicemii nomale (glicozuria renal). n prezent, determinarea glicozuriei nu este recomandat pentru diagnoscul sau monitorizarea diabetului zaharat, ntruct nu aduce informaii sau beneficii suplimentare fa de msurarea glicemiei. Detectarea glicozuriei la un examen de urin uzual, impune n schimb o invesgare atent a metabolismului glucidic, prin determinarea glicemiei i eventual a HbA1c. 6.3. CORPII CETONICI SANGVINI I URINARI Corpii cetonici (acetoacetat, aceton, acid -hidroxiburic) sunt produi de degradare ai acizilor grai, produi n special la nivel hepac. Cnd exist un deficit de insulin, ca de exemplu n diabetul zaharat decompensat (n special pul 1), suprimarea lipolizei este diminuat i n consecin crete ulizarea acizilor grai cu producere de corpi cetonici. Indicaii de dozare: evaluarea iniial a pacienilor cu diabet zaharat nou depistat; diagnoscul i monitorizarea cetoacidozei diabece; automonitorizarea (cu ajutorul testelor rapide) n cazul diabetului zaharat p 1, n diabetul gestaional, n cazul n care glicemiile sunt constant > 250 mg/dl, n condiii de stress, infecii intercurente. Metode de determinare: ne-enzimace enzimace cel mai larg ulizate pentru determinarea direct a concentraiei de acid hidroxiburic. Valori normale: <0,5 mmol/L. Valori crescute: diabet zaharat decompensat cu cetoz sau cetoacidoz, post prelungit.
EXPLORAREA METABOLISMULUI CARBOHIDRAILOR 6.4. HEMOGLOBINA GLICAT HbA1C
55
Glicarea reprezint un proces de adiie non-enzimac a unui rest glucidic la nivelul unei grupri NH2 din structura unei proteine. Intensitatea glicrii depinde de concentraia glucozei sanguine. Hemoglobina, proteinele plasmace, proteinele membranare etc. pot suferi un proces de glicare. ntr-o prim etap (rapid i reversibil), glucoza reacioneaz cu grupul amino a lanului pepdic, formnd baza Schiff (aldimina), instabil. Dac glicemia rmne crescut, urmeaz o a doua etap (lent i ireversibil) n care aldimina sufer un proces de rearanjare, sub forma unui compus stabil (cetoamin) (figura 6.2.).
Protein - NH2 +
K+1 K-1
K2
Glucoz
Aldimine (baz Shiff)
Cetoamin
Figura 6.2. Schema glicozilrii neenzimace a proteinelor. HbA este forma nav sub care se gsete Hb la aduli (tetrameri de globin nemodificai). HbA1 este fraciunea glicat total, iar HbA1c este componenta HbA1 format prin ataarea non-ezimac a glucozei la N-terminal al Valinei terminale a lanului al globinei. n condiii de normoglicemie, HbA1c reprezint aproximav 5% din Hb total circulant. Este un indicator retrospecv al valorilor integrate ale glicemiei pe o perioad de 8-12 sptmni: indicator fidel al controlului diabetului, eficacitii tratamentului i al riscului dezvoltrii complicaiilor acute i cronice ale diabetului zaharat. Metode de determinare: cromatografia pe rini schimbtoare de ioni electroforeza teste imunologice Metoda de referin pentru determinarea HbA1c este considerat cromatografia pe rini schimbtoare de ioni (HPLC- high performance liquid chromatography) ulizat n Diabetes Control and Complicaon Trial. Principiul metodei: se bazeaz pe separarea a doi sau mai muli componeni ale unei soluii de analizat pe baza diferenei de afinitate ntre acea i o faz staionar. Metoda permite separarea ionilor sau moleculelor n funcie de ncrcarea lor electric. Determinarea se bazeaz pe ulizarea unor coloane cu polimeri ncrcai electric (faza staionar) peste care este adaugat mixtura de proteine (n acest caz snge hemolizat), iar proteinele (hemoglobina) vor migra n coloane cu viteze diferite n funcie de sarci-
56
na lor electric. Suprafaa de contact a fazei staionare are proprietatea de a reine componenii soluiei analizate pentru un mp care depinde de afinitatea fazei staionare pentru acea. Cu ct afinitatea este mai mare, cu att eluia componentului va avea loc mai trziu. Recoltarea probelor: dozarea HbA1c se face din snge integral (venos sau capilar) recoltarea se poate face n orice moment al zilei. Interval de referin: n general, intervalul de referin este 4-6% (valori la persoanele fr diabet). Exprimarea HbA1c se face n unitile din Sistemul Internaional (mmol/mol) i n unitile derivate din NGSP (Naonal Glycohemoglobin Standardizaon Program) (%). ntre 6-7% controlul metabolic este bun, ntre 7-9% controlul este nesasfctor, iar peste 9% dezechilibrul este major. Tabelul 6.I prezint corelaia dintre valorile HbA1c i valorile medii ale glicemiilor plasmace, rezultat din datele studiului ADAG (A1C-Derived Average Glucose trial). Tabelul 6.I. Corelaia dintre HbA1c i media glicemiilor plasmace (n mg/dl i mmol/L) HbA1c (%) 6 7 8 9 10 11 12 Glicemia plasmac medie mg/dl mmol/L 126 154 183 212 240 269 298 7,0 8,6 10,2 11,8 13,4 14,9 16,5
Factori care interfereaz cu dozarea HbA1c: hemoglobinopaile (valori fals sczute sau crescute; HPLC ns face disncie ntre diferitele puri de Hb), stri care determin creterea turn-overului eritrocitelor (anemii, malarie, splenectomie, hemoragii) (valori sczute), uremia, alcoolismul, tratament cronic cu aspirina, hipertrigliceridemie (valori crescute). Indicaii de ulizare a HbA1c: diagnoscul diabetului zaharat: 6.5%. evaluarea i monitorizarea echilibrului glicemic la persoanele diagnoscate anterior cu diabet zaharat: obiecvul terapeuc recomandat este n general < 7% Exist n prezent sisteme analice Point-of-Care (POC) care permit msurarea HbA1c din sngele capilar n cabinetele medicale, furniznd asel rezultate imediate, ns este imperios necesar ca acestea s fie precise i reproducbile. Chiar i n acest caz, aceste instrumente se pot folosi doar pentru monitorizarea diabetului nu i pentru diagnoscarea sa.
EXPLORAREA METABOLISMULUI CARBOHIDRAILOR 6.5. FRUCTOZAMINA
57
Fructozamina este un produs stabil de glicare a proteinelor serice (n principal albumine) i reprezint o metod alternav de apreciere a echilibrului metabolic. Este un indicator al controlului metabolic pe termen scurt: 2-3 sptmni, ntruct albuminele (i alte proteine) plasmace au un turn-over mai rapid dect cel al Hb. Valori normale: 2,0- 2,8 mmol/L. ntre 2,8-3,2 mmol/L controlul metabolic este bun, ntre 3,2-3,7 mmol/L controlul este nesasfctor, iar peste 3,7 mmol/L dezechilibrul este major. Factori care pot influena rezultatele: hipoalbuminemia, nefropae sau hepatopae sever. Indicaii de ulizare a fructozaminei: monitorizarea echilibrului glicemic pe termen scurt (ex. n diabetul n sarcin, dup iniierea sau intensificarea insulinoterapiei). 6.6. ALI PARAMETRI Insulina Este un hormon esenial pentru reglarea metabolismului intermediar (glucidic, lipidic i proteic), produs n celulele ale insulelelor Langerhans. Are un rol hipoglicemiant prin favorizarea prelurii glucozei de ctre celule i stocrii sale sub form de glicogen. Metode de determinare: RIA, chemiluminiscena, ELISA Valori normale: 5-20 U/ml Pepdul C Este un produs echimolar de scindare a proinsulinei; reprezint un mai bun indicator pentru producia endogen de insulin (mai ales n prezena ancorpilor an-insulin). Valori normale: 0,4- 2 ng/ml Valori sczute: diabetul zaharat, pancreate Valori crescute: insulinom, hiperplazie insular, hiperinsulinism (n insulino-rezisten) Glucagonul Este un hormon hiperglicemiant (efect opus insulinei), produs in celulele ale insulelelor Langerhans. Creterea glicemiei este determinat de ctre glucagon prin favorizarea eliberrii glucozei din rezervele (hepace) de glicogen (glicogenoliz). Metode de determinare: RIA, ELISA Valori normale: 0,2-0,3 ng/ml Valori sczute: epuizarea insulelor Langerhans (cu distrugerea celulelor ) Valori crescute: tumori secretante (glucagonom), diabet zaharat (ocazional) Autoancorpi specifici - markeri ai diabetului autoimun
58
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR n diabetul p 1 se pot determina autoancorpi direcionai mpotriva: a. Componentelor celulelor pancreace: non-specifice, ICA (isletcell anbodies) decarboxilaza acidului glutamic (GAD65) fosforozin fosfataza (IA-2; insulinoma-associated angen-2) b. Proteinelor circulante: insulina (IAA) specific celulei pancreace
6.7. PREZENTRI DE CAZ 6.7.1. Diabet zaharat p 2 nou depistat A.B., 53 ani, obez, sedentar, hipertensiv se prezint la cabinetul medicului de familie acuznd tulburri de vedere, senzaie de sete i de uscciune a gurii, fagabilitate. Din anamnez rezult de asemenea c de aproximav 2-3 luni bea circa 4-5 L ap/zi, urineaz mult, inclusiv noaptea i a avut o scdere ponderal de aproximav 6 kg. Mama are diabet zaharat p 2 cu mulple complicaii. Mediul de familie decide efectuarea imediat a glicemiei i a examenului de urin. Rezultate: glicozurie: 1000 mg/dl, glicemie: 245 mg/dl. Diagnosc: Diabet zaharat nou depistat. Comentariu: Pacientul prezint mai muli factori de risc pentru diabetul zaharat p 2. ntruct valoarea glicemiei > 200 mg/dl e nsoit de simptomele clasice de hiperglicemie (poliurie, polidipsie, scdere ponderal, xerostomie) nu sunt necesare invesgaii suplimentare pentru stabilirea diagnoscului de diabet zaharat, ns acestea sunt indicate pentru evaluarea complet a statusului metabolic. Pacientul trebuie ndrumat ctre un medic specialist diabetolog pentru stabilirea i iniierea terapiei specifice. 6.7.2. Diabet zaharat p 1 nou depistat n serviciul de urgen de prezint pacientul C.D., 16 ani, uor somnolent, acuznd vedere nceoat, dureri abdominale, greuri i vrsturi. Din anamnez nu rezult un istoric personal semnificav, ns de aproximav 3 sptmni a prezentat o scdere ponderal de circa 10 kg n pofida unui apet crescut, acompaniat de polidipsie, poliurie, senzaie de uscciune a gurii. La examenul obiecv se observ tegumente uscate, reci, tensiune arterial: 90/55 mmHg, puls: 100/ min, frecven respiratorie: 26/min, greutate: 57 kg, IMC: 19,5 kg/m2. Analizele de laborator indic: glicemie: 571 mg/dl, Na+: 130 mmol/L, K+: 5,0 mmol/L, pH: 7,18, bicarbonat: 12 mmol/L, pCO2: 25 mmHg; creanina: 1,5 mg/dl, uree: 87 md/dl, examen de urin: glucoz: 2 g/L, corpi cetonici: 40 mg/dl. Pacientul este internat n secia de diabet i se iniiaz reechilibrarea hidroelectrolic i metabolic. La evaluarea din cursul internrii se dozeaz HbA1c: 14,5%, pepdul C: 0,18 ng/ml, precum i ancorpii anGAD: 231 nmol/L, ancorpii ICA: 78 JDFU Diagnosc: Diabet zaharat p 1 nou depistat. Cetoacidoz moderat.
EXPLORAREA METABOLISMULUI CARBOHIDRAILOR
59
Comentariu: Diagnoscul de diabet zaharat se stabilete pe baza valorilor glicemice i a simptomatologiei specifice, confirmat de valoarea HbA1c. Tipul diabetului (p 1) este stabilit cu ajutorul parametrilor imunologici (autoancorpi specifici) i suinut de ali indici clinici i paraclinici (vrsta, modul debutului clinic al bolii - printr-o cetoacidoz pic, valoarea sczut a pepdului C la diagnosc). 6.7.3. Diabet gestaional La cabinetul medicului specialist diabetolog se prezint pacienta E.F., 35 ani, cu sarcin n sptamna 27, datorit depistrii unor glicozurii repetate la examinrile de run. Pacienta nu menioneaz un istoric personal semnificav, ns tatl are diabet zaharat p 2 tratat cu insulin. Din anamnez rezult c este asimptomac, valorile glicemiilor a jeun (msurate dup depistarea glicozuriilor) au fost de 89 mg/dl i respecv 93 mg/dl, repetate la un interval de 1 sptmn, iar HbA1c: 6,1%. La prima vizit prenatal, valoarea glicemiei a jeun a fost de 98 mg/dl. Medicul decide efectuarea unui TTGO cu 75 g glucoz. Rezultate: Glicemie a jeun: 94 mg/dl, la 1 or: 204 mg/dl, la 2 ore: 187 mg/dl. Diagnosc: Diabet gestaional. Comentariu: Diagnoscul se stabilete pe baza glicemiilor de la 1 or i 2 ore post ncrcare. Glicozuriile pot fi explicate prin faptul c n sarcin pragul renal este sczut. Probabil ns, pacienta are pe parcrsul zilei, n special postprandial valori glicemice ridicate (similare cu cele msurate n mpul TTGO). ntruct HbA1c indic valorile integrate ale glucozei sanguine pe o perioad mai lung (8-12 sptmni), aceasta poate fi, la debului unui diabet gestaional, n limite normale sau doar uor crescut. LA SFRITUL ACESTUI CAPITOL VEI PUTEA S: interpretezi parametri de evaluare a metabolismului glucidic s stabile diagnoscul de diabetul zaharat s stabile diagnoscul de diabet gestaional evaluezi controlul metabolic pe termen lung al diabetului zaharat
60
Capitolul 7 EXPLORAREA N LABORATOR A METABOLISMULUI LIPIDIC

7.1. DOZAREA LIPIDELOR SERICE 7.1.1. Dozarea trigliceridelor Trigliceridele, esteri ai acizilor grai cu glicerolul, nu circul libere n plasm, ci sunt legate de proteine i transportate sub forma unor complexe macromoleculare numite lipoproteine. Metodele de dozare a trigliceridelor implic n general hidroliza enzimac sau alcalin a acestora la glicerol i acizi grai, urmat de msurarea, fie chimic sau enzimac, a glicerolului eliberat. n prezent, dozarea trigliceridelor n laboratorul clinic, se face prin metoda enzimatic . Aceast metod implic hidroliza enzimac de ctre lipaz a trigliceridelor (TG) la glicerol i acizi grai liberi (AGL). Glicerolul produs este apoi msurat prin reacii enzimace cuplate. Principiul metodei:
TG
AGL + Glicerol glicerol kinaza Glicerol + ATP Glicerol-3-P +ADP Glicerol-3-P glicerol fosfat oxidaza dihidroxiaceton fosfat + HO HO+ 4-AAP + 4-cloro-fenol peroxidaza produs colorat (rou)
lipoprotein lipaza
Trigliceridele sunt hidrolizate ntr-o prim etap de ctre lipoprotein lipaz la glicerol i acizi grai liberi. Glicerolul este apoi fosforilat de ctre adenozin-5- trifosfat (ATP) ducnd la formarea de glicerol1-fosfat (G-1-P) i adenozin-5-difosfat (ADP), n reacia catalizat de ctre glicerol kinaz (GK) . G-1-P este apoi oxidat dectre glicerol fosfat oxidaza (GPO) la dihidroxiaceton fosfat (DAP) i ap oxigenat (H2O2). Peroxidaza (POD) catalizeaz cuplarea H2O2 cu 4-aminoanpirina (4-AAP) i 4-cloro-fenol pentru a produce un colorant de chinonimin (de culoare roie), care are o absorban maxim la 540 nm. Creterea absorbanei la 540 nm este direct proporional cu concentraia trigliceridelor din prob. Glicerolul liber, endogen, poate fi msurat uliznd aceleai reacii enzimace cuplate, far faza iniial de hidroliz sub aciunea lipazei. Valori: normale: <150 mg/dl (<1,7 mmol/L) intermediare: 150-199 mg/dl (1,7-2,25 mmol/L) ridicate: 200-499 mg/dl (2,26-5,64 mmol/L) foarte ridicate: 500 mg/dl (5,64 mmol/L) 7.1.2. Dozarea colesterolului total (CT) Determinarea cantav, specific a colesterolului total se face prin metoda enzimatic colorimetric.
61
Principiul metodei Colesterolul total este reprezentat colesterolul liber existent n plasm i colesterolul ce se gsete n esterii de colesterol.
Colesterol liber + Esteri de colesterol = Colesterol Total Esteri colesterol + H2O colesterol esteraza colesterol liber+ acizi grai Colesterol liber/total + O colesterol oxidaza 3-colestenona + H O
2
H2O2 + fenol + 4-aminoanpirina (AAP)
peroxidaza chinonimina (rou)
Dup o incubare de 5 minute la 37C (produs stabil mp de 1 or), se citete exncia standardului (Es) i exncia probei (Ep). Valoarea CT va fi data de produsul dintre raportul Ep/Es i concentraa standardului (Cs)(calibratorului), care are o valoare cunoscut. Valoarea obinut va fi exprimat n mmoli/L sau mg/dl.
7.1.3. Valori de referin ale claselor de lipide serice Lipidele sunt un grup heterogen de compui. Acea sunt relav insolubili n ap, dar se dizolv n solveni apolari organici ( cloroformul, tetraclorura de carbon, benzen). Ele includ substane biologic acve care ndeplinesc rol energec (trigliceridele, acizii grai), structural (fosfolipidele) i funcional (acizi biliari, hormoni steroizi, prostaglandine, leucotriene, etc). Din masa corporal a unui adult normal conformat lipidele reprezint 15-20%. Lipidele sunt combinaii ale acizilor grai cu alcooli sau amine.Principalele lipide care se gasesc n snge sunt colesterolul, trigliceridele, fosfolipidele i acizii grai neesterificai. Lipide totale Dozarea lipidelor totale este un test cu valoare orientav (se prefer determinarea individual a claselor de lipide). Metod: fotometric Valori: normale: 400 - 800 mg/dl; crescute: dislipidemii primare i secundare, diabet zaharat, mixedem, sindrom nefroc, alcoolism cronic, pancreat acut, boala Tangier; sczute: hiperreoz, stri careniale, infecii acute, anemii grave. Colesterol total Parametru important n eopatogenia aterosclerozei, 2/3 n form esterificat. Metod: fotometric/enzimac Valori: normale: 3,8 - 6,4 mM/L (140 - 240 mg/dl) - valoarea se interpreteaz n funcie de riscul cardiovascular; crescute: obstrucii biliare, ciroz portal, hepate acute, sindrom nefroc, pancreat cronic, diabet zaharat, hiporeoz, hipercolesterolemie familial, dislipidemii;
62
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR sczute: hepatopai grave, uremii, stri sepce, hiperreoz, boala Tangier, anemii, macroglobulinemie Waldenstrm, an-alfa-lipoproteinemie, stri careniale. Colesterol liber (neesterificat) Metod: fotometric/enzimac Valori: normale: < 1,94 mM/L (< 75 mg/dl); crescute: obstrucii biliare, ciroz portal, colangite, pancreat acut, hipercolesterolemie familiar, sczute: ca i n cazul colesterolului total. Colesterol esterificat Metod: fotometric cuplat cu calcul matemac Valori: normale: 1,55 - 2,59 mM/L (60 - 100 mg/dl); crescute: ca i n cazul colesterolului total; sczute: ciroz hepac, stri sepce. Fosfolipide Metod: fotometric Valori: normale: 2 - 3,7 mM/L (160 - 285 mg/dl); crescute: ciroz biliar, obstrucii biliare, sindrom nefroc, diabet zaharat, hipercolesterolemie familiar. Trigliceride Metod: enzimac fotometric Valori: normale: 0,7 - 2,3 mM/L (62 - 200 mg/dl); crescute: dislipidemii, pancreat, sindrom nefroc, microvasculite, diabet zaharat decompensat, hiporeoz / mixedem, infarct miocardic acut; sczute: stri careniale, hiperreoz, lipodistrofii, anemii grave. Acizi grai liberi (AGL) AGL sunt substrat energetic eliberat din esuturile de depozit, excesul fiind transportat n plasm
de albumin. Metod: fotometric sau electroforec Valori: normale: < 0,7 mM/L (< 20 mg/dl);
EXPLORAREA N LABORATOR A METABOLISMULUI LIPIDIC
63
crescute (parametru de faz acut): vasculite, infarct miocardic acut, infarct pulmonar acut, pancreat acut, pneumonii, colangite, colecist, peritonit; sczute: stri careniale. 7.2. CARACTERIZAREA LIPOPROTEINELOR SERICE 7.2.1. Ultracentrifugarea - metoda de referin Metod a Centrului de Control al Bolilor din Atlanta, SUA [The Centre for Disease Control (CDC)], ultracentrifugarea , este probabil cea mai exact metod de dozare a HDL colesterolului, numeroase studii populaionale folosind valorile CDC ca inte de referin pentru testare. Aceast metod const ntr-o ultracentrifugare n dou etape, urmat de o etap de analiz a colesterolului. Metoda este laborioas, consumatoare de mp, presupunnd un mp ndelungat de prelucrare a probelor. Ultracentrifugarea n gradient de densitate : chilomicroni, VLDL (very low density lipoproteine), IDL (intermediary density lipoprotein), LDL (low density lipoproteins), HDL (high density lipoproteins). Ultracentrifugarea fracioneaz lipoproteinele pe baza densitii lor, care este cu att mai mic, cu ct cantatea lipidelor coninute este mai mare. Spre deosebire de proteinele simple , ntr-un mediu cu o densitate superioar densitii lor, lipoproteinele prezint n cursul ultracentrifugrii fenomenul flotaiei. Unitatea de msur a acestei flotaii este valoarea Sf (S=Svedberg, f=flotaie). Tabelul 7.I. prezint fraciunile lipoproteinelor din plasm n ordinea densitii, respecv a valorii lor Sf. Probele sunt centrifugate pn la 18 ore la 10C, 40.000 rotaii pe minut (rpm). VLDL (very low density lipoproteins), LDL (low density lipoproteins) i chilomicronii plutesc la suprafaa tubului, n mp ce HDL-ul (high density lipoprotein) mai dens, i proteinele serice, sedimenteaz la baza lui. Aceast metod permite separarea componentelor i esmarea consecuv a fiecrei fraciuni a colesterolului. Ultracentrifugarea este considerat a fi metoda de referin pentru dozarea lipoproteinelor. Totui, constrngerile legate de durat i costuri au limitat ulizarea sa de run n laboratoare. Tabelul 7.I. Compoziia LP - caracterisci fizice i chimice Caracterisci Chilomicroni Concentraie plasma0 c jeun (mg%) Densitate (g/ml) Diametru (nm) Sf (1,063)# Migrare electroforec Proteine Trigliceride Colesterol esterificat Colesterol liber Fosfolipide VLDL 0-50 IDL 0 LDL 500-650 HDL 200-300
<0,95 80-100 >400 rmn la pre- ntre i pre- start Compoziie chimic (% relav din total) 1-2 5-10 12-16 90-96 50-65 25-40 1-3 8-14 20-35 1 5-8 7-11 2-6 12-18 15-22
Proprieti fizice <0,95-1,006 1,006-1,019 30-80 25-30 20-400 12-20
1,019-1,063 15-25 0-12
1,063-1,210 5-15
20-25 6-12 35-45 6-10 20-25
45-55 3-6 8-20 1-6 25-40
# Unitatea de flotaie Svedberg =10 3 cm/sec/dyne/g, ntr-o soluie de NaCl cu densitate 1,063 g/ml (26C).
64 7.2.2. Dozarea lipoproteinelor plasmace prin electroforez
n funcie de sarcina lor electric, n cmp electric, lipoproteinele vor migra n gelul de agaroz, producndu-se o separare clar (n ordinea scderii mobilitii) a acestora n 4 fraciuni: - lipoproteine, pre- lipoproteine, -lipoproteine i chilomicroni. Migrarea electroforetic n gel de agaroz permite idenficarea i evaluarea cantav pe lipidogram a lipoproteinelor asel separate. Chilomicronii rmn la linia de start, LDL migreaz mpreun cu -globulinele, VLDL alctuiesc lipoproteinele pre-, iar 1-lipoproteinele reprezint fraciunea cea mai rapid. Valori normale ale fraciunilor lipoproteice: -lipoproteine: 22-46% pre- lipoproteine: 0-27% -lipoproteine: 7-71% Chilomicroni: 0- 1,9%
Fig. 7.1. Exemple de migrare electroforec n gel de agaroz. Traseele 1, 2, 3, 8 aspect normal; 4 dislipidemie p III (fraciunea IDL); 5 dislipidemie p IIb; 6 dislipidemie p IV; 7, 9 dislipidemie p IIa; 10 dislipidemie p IV cu fraciuni. 7.2.3 Valori de referin ale claselor de lipoproteine si apoproteine Lipoproteinele (LP) sunt agregate moleculare complexe, solubile n ap, formate spontan prin autoansamblarea necovalent a diverselor categorii de lipide cu proteine specifice (Apoproteine - ApoP). Rolul lor este de a transporta n mediul apos plasmac moleculele insolubile ale lipidelor, de la locul de absorbie (intesnul subire) sau de sintez (ficatul), la locurile de ulizare i stocare (esuturile periferice). Rolul ApoP nu se rezum la funcia de vehicol, ele servind i ca reglatori ai metabolismului lipidic: acveaz unele enzime (Lipoprotein lipaza LPL, Lecin Colesterol Aciltransferaza - LCAT) i intervin n procesele de recunoatere la nivel celular a LP prin receptori. ntre diversele clase de LP plasmace au loc de asemenea, schimburi neenzimace de ApoP i lipide, fenomen care faciliteaz metabolizarea LP. 1-lipoproteinele (LP cu densitate mare, HDL) Transportorul colesterolului bun, anaterogen.
EXPLORAREA N LABORATOR A METABOLISMULUI LIPIDIC colesterolului din HDL (dup blocarea selecv a LP cu ApoB100). Valori: normale brbai: 20 - 25 % sau > 35 mg% (0,9 mM/L); normale femei: 25 - 30 % sau > 45 mg% (1,2 mM/L);
65
Metod: procentaj relav din lipidogram n gel de agaroz sau determinare indirect enzimac a
patologice/sczute: primar - boala Tangier (epurare accelerat a LP cu ApoAII), secundar - la fumtori, sedentari/obezi, femei postmenopauz, cu tratamente anconcepve, alcoolici, determin ateroscleroz prematur. Pre--lipoproteinele (LP cu densitate foarte mic, VLDL) Transportori ai TG endogene. Metod: procentaj relav din lipidogram Valori: normale: 5 - 15 %; patologice/crescute (n dislipidemiile cu hipertrigliceridemie): hepate cronice, ciroz hepac, sindrom nefroc, diabet zaharat decompensat, hiporoidie, tratamente ndelungate cu diurece de ans, beta-blocante neselecve, corcosteroizi. -lipoproteinele (LP cu densitate mic, LDL) Principalul transportor de colesterol esterificat n organism, este cea mai aterogen dintre LP. Metod: procentaj relav din lipidogram; determinare direct (specific / imunologic) sau din calcul (formula Friedewald) a LP cu Apo B100. Valori: normale brbai: 60 - 75 % sau < 155 mg/dL(4 mM/L); normale femei: 50 - 70 % sau < 155 mg/dL (4 mM/L); patologice/crescute (n dislipidemiile cu hipercolesterolemie): hipercolesterolemia familial sau n cea poligenic, hiporoidie, afeciuni hepato-biliare, tratamente hormonale (anconcepve, corcosteroizi). Chilomicroni exogeni (CM) Chilomicronii exogeni sunt grsimi neutre exogene (din alimentaie), emulsionate n plasm. Metod: electroforec sau nefelometric Valori: normale: < 2% din totalul LP; n condiii obinuite CM apar numai postprandial n ser, n condiii patologice ns persist; crescute: sindromul chilomicronilor (lipsa congenital a LPL sau ApoCII), coma diabec, diabetul zaharat decompensat, ciroza hepac decompensat. Lipoproteina X (LP-X) Lipoprotein patologic, discoidal coninnd lipide biliare, bogat n fosfolipide, colesterol liber i diferite apoproteine.
66
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR Metod: electroforec (n gel de agaroz, migreaz catodic), imunologic (dubla difuziune Ouchterlony) Valori: normal: absent n serul persoanelor sntoase; prezent: exclusiv n serul bolnavilor cu colestaz. Lipoproteina (a) [LP(a)] Factor de risc independent pentru boala ateroscleroc, Lp(a) are o structur idenc cu a LDL i n
plus o Apo(a), cu similitudine structural cu plasminogenul. Fr s aib funcia proteolic a plasminei, Lp(a) se leag compev cu plasminogenul la situsurile de legare la fibrin ale acestuia. Asel Lp(a) este un factor de risc att lipidic ct i tromboc. Metod: electroforec sau nefelometric Valori normale: < 30 mg% (0,3 g/L) Apoproteina AI (Apo AI) Componenta proteic majoritar a HDL, este considerat un factor de prognosc poziv n ateroscleroz, chiar mai important dect HDL. Metod: nefelometric. Valori normale: brbai: 100 - 200 mg% (1-2g/L); femei: 110 - 225 mgdL (1,1-2,25 g/L). Apoproteina B (Apo B) Componenta proteic unic a LDL, este considerat un factor de prognosc negav n ateroscleroz, chiar mai important dect LDL. Metod: nefelometric. Valori normale: brbai: 65 - 135 mgdL (0,65-1,35g/L); femei: 60 - 115 mgdL (0,6-1,15 g/L).
7.3. DOZAREA LIPIDELOR ATEROGENE N STRUCTURA LIPOPROTEINELOR 7.3.1. Metode de dozare a HDL colesterolului Au fost descrise mulple tehnici analice de msurare a HDL colesterolului, acestea incluznd metode directe i indirecte, de exemplu: metode de electroforez, precipitare i ultracentrifugare. Metode directe de dozare a HDL colesterolului Pn la momentul introduceri metodelor directe de dozare a HDL colesterolului, dozarea lipoproteinelor a fost ntotdeauna considerat a fi o metod lung i laborioas datorit necesitii separrii iniiale a lipoproteinelor HDL (metodele indirecte).
EXPLORAREA N LABORATOR A METABOLISMULUI LIPIDIC
67
Ulterior au fost dezvoltate metode pentru dozarea direct a HDL colesterolului. Metodele implic inacvarea sau, mult mai eficient, ndeprtarea n prima etap a lipoproteinelor non-HDL , urmat de dozarea HDL colesterolului n etapa de analiz. Metodele directe ofer mulple avantaje fa de metodele mai vechi, deoarece ele nu necesit o tratare prealabil a probei i fac posibil analizarea rapid a HDL colesterolului pe majoritatea analizoarelor clinice. Metoda imunoseparrii (IS) Un ancorp an-lipoprotein uman se leag i inacveaz chilomicronii, LDL i VLDL. Colesterol esteraza i colesterol oxidaza reacioneaz apoi cu HDL colesterolul ducnd la producerea de ap oxigenat. Aceasta reacioneaz apoi cu cromogeni pentru a forma un produs colorat care absoarbe radiaia luminoas la o lungime de und dat. Polimer/detergent polianionic [Polyanion polymer /detergent (PPD)] - Polianioni sinteci sunt adsorbii pe suprafaa LDL i VLDL, transformndu-i n forme stabile. Parculele libere de HDL sunt apoi solubilizate de detergeni, iar nivelele lor sunt apoi determinate prin aciunea colesterol esterazei i a colesterol oxidazei. Enzima polietilen glicol modificat / sulfat - ciclodextrin [Polyethylene glycol-modified enzyme/ -cyclodextrin sulfate (PEGME)] Ciclodextrina sulfatat i dextran sulfatul formeaz cu LDL, VLDL i chilomicronii complexe solubile n ap , fcndu-le asel rezistente la aciunea enzimelor PEG modificate. n reacia celei de a doua etape nivelele HDL colesterolului sunt msurate prin aciunea colesterol esterazei i a colesterol oxidazei . Deoarece concentraiile -VLDL-ului sunt ridicate n cazul pacieniilor cu hiperlipoproteinemie, i -VLDL interfereaz cu metoda PEGME, aceasta duce la un bias poziv atunci cnd colesterolul este determinat din ser. Metoda clearance-ului (Clearance Method) Un tampon cu putere ionic selecv elibereaz chilomicronii, LDL and VLDL i apoi i ndeprteaz prin aciunea colesterol esteraze i i a colesterol oxidazei . HDL colesterolul este eliberat n a doua etap a reaciei de ctre surfactani i apoi ndeprtat de ctre enzime. Studii efectuate au pus sub semnul ntrebrii specificitatea testelor de imunoinhibiie din cauza interferenei negave produse de concentraiile crescute ale trigliceridelor. Metodele directe permit o evaluare rapid a HDL colestrolului din probe normale ale pacienilor. Totui, performana poate fi compromis n cazul unora dintre aceste metode atunci cand se analizeaz probe cu nivele ridicate ale trigliceridelor i bilirubinei. Principiul metodelor directe de determinare a HDL cu etapa de Clearence const n ndeprtarea lipoproteielor non-HDL, inclusiv a lipoproteinelor anormale din probe, n etapa de clearence a metodei. Tamponul cu putere ionic elibereaz colesterolul de pe parculele non-LDL, acesta fiind apoi hidrolizat de ctre enzime. Asel, interferena determinat de alte sub-puri de lipoproteine nu mai este o problem. Principiul reaciei 1. Etapa de clearance
a. CM - Chol, LDL-Chol, VLDL -Chol colesterol esteraza/colesterol oxidaza Colestenona + HO b. HO

catalaza
HO + O
68
2. Etapa de testare
a. HDL -C
colesterol esteraza/colesterol oxidaza
Colestenona + HO ,
b. HO + 4AAP peroxidaza
4AAPoxidat + HO
Reaca 2.b este inhibat n a doua etap de ctre azida de sodiu, pigmentul chinolonic rezultat fiind responsabil de dezvoltarea culorii roii caracterisce. Prima cire a absorbanei blank-ului se face dup adugarea celui de al doilea reacv. Asel, orice variaii ale absorbanei de fundal datorat probei nu va afecta rezultatul. Disponibilitatea metodelor directe pentru msurarea HDL colesterolului a creat posibilitatea screeningului de run a probelor pacieniilor, precum i a stabilirii unui diagnosc i tratament mai exacte. 7.3.2. Metode de dozare a LDL colesterolului LDL colesterolul reprezint aproximav dou treimi din totalul de colesterol existent n ser i se cunoate faptul c joac un rol important n ateroscleroz. Metode originale de dozare a LDL-colesterolului sunt similare celor de determinarea a HDL-ului, implicnd separarea de alte lipoproteine, VLDL i HDL. Metoda de referin de dozare a LDL colesterolului n prezent nu exist un consens n ceea ce privete metoda aprobat pentru msurarea LDL colesterolului. Totui, poate fi adoptat metoda CDC care implic ultracentrifugarea i precipitarea. Ecuaia Friedewald n multe laboratoare clinice ulizarea ecuaiei Friedewald pentru esmarea nivelelor de LDL colesterol din probele pacienilor, a devenit o pracc comun. Ecuaia Friedewald:
LDL = CT - HDL - TG 5
unde: CT = Colesterolul Total, TG = Trigliceride, HDL = HDL Colesterol (mg/dl) Aceast ecuaie d posibilitatea esmrii LDL-ului atunci cnd valoarea HDL-colesterolului i a trigliceridelor este cunoscut. Totui limitrile ecuaiei sunt bine documentate. Ecuaia este corect doar atunci cnd: nivelul trigliceridelor este sub 400mg/dl (4,5mmol/L), dup alte surse chiar sub 350 mg/dl; chilomicronii nu sunt prezeni; proba nu conine beta-VLDL; necesit probe recoltate dup o perioad de post (8-12 ore). n hiperlipemii probele pacienilor propuse analizrii au n general nivele ridicate ale trigliceridelor i nu ndeplinesc condiiile de aplicare a ecuaiei. Aceasta poate conduce la subesmarea nivelelor de LDL colesterol. Mai multe studii recente au artat c nivele ale trigliceridelor de peste 250mg/dl vor afecta estimarea calculat de ecuaia Friedewald . Esmarea Friedewald a LDL colesterolului n afara limitelor indicate conduce la o sub-esmare semnificav a acestuia.
EXPLORAREA N LABORATOR A METABOLISMULUI LIPIDIC Metode directe de dozare a LDL colesterolului
69
Introducerea tardiv a metodelor directe pentru dozarea LDL-cholesterolului poate fi atribuit ulizrii de run a ecuaiei Friedewald n laboratoarele clinice. Discrepanele datorate aplicrii ecuaiei Friedewald au condus la dezvoltarea mai multor metode directe de dozare a LDL-colesterolului care se bazeaz pe metodologii similare metodelor de dozare direct a HDL-colesterolului. a. Metoda imunoseparrii (IS) Ancorpul an-lipoprotein uman se leag i inacveaz chilomicronii, HDL i VLDL. Colesterol esteraza i colesterol oxidaza reacioneaz apoi cu LDL colesterolul, ducnd la producia de ap oxigenat. Aceasta reacioneaz cu cromogeni pentru a forma un produs colorat care absoarbe radiaia luminoas la o anumit lungime de und dat. b. Detergeni amfiionici [Zwierionic detergents (ZI)] Detergenii amfiionici mascheaz parculele VLDL n prima etap a reaciei. Dup adugarea celui de al doilea reacv, se formeaz un complex poilianionic al LDL care poate fi msurat prin turbidimetrie. Acest test recunoate doar parculele apo-B specifice, fiind cricat deoarece orice alt subform nu va putea fi recunoscut. c. Methoda Clearence-ului - Detergeni selecvi elibereaz colesterol din chilomicroni, HDL i VLDL, care apoi este ndeprtat prin aciunea colesterol esterazei i a colesterol oxidazei . LDL colesterolul este apoi eliberat n reacia celei de a doua etape de ctre surfactani i supus aciunii colesterol esterazei i colesterol oxidazei, ducnd la producia de ap oxigenat i apoi la reacia de culoare caracterisc cu 4-AAP. Principiul metodei directe de dozare a LDL-Colesterolului cu etap de clearance 1. Etapa de clearance
a. CM, HDL, VLDL colesterol esteraza/colesterol oxidaza Colestenona + HO b. HO a. LDL

catalaza
HO + O Colestenona + HO
2. Etapa de testare
colesterol esteraza/colesterol oxidaza
b. HO + 4-AAP peroxidaza
4-AAPoxidat (pigment de chinon) + HO
Reaca 2.b este inhibat n a doua etap de azida de sodiu. 7.4. TULBURRI ALE METABOLISMULUI LIPIDIC 7.4.1. Dislipidemiille Dislipidemiile sunt stri nsoite de modificri cantave sau calitave ale lipoproteinelor. Ele se mpart n primare i secundare. Hiperlipidemiile sunt stri patologice caracterizate prin cretere concentraiei trigliceridelor i/sau colesterolului peste limitele acceptate ca fiind normale pentru vrsta, sexul i starea de sntate a persoanei. Cele mai frecvente forme de hiperlipemii sunt hipercolesterolemia izolat, hipertrigliceridemia i hiperlipemia combinat. Hipercolesterolemia izolat se caracterizeaz prin valori crescute ale LDL, hipertrigliceridemia printr-un VLDL ridicat, i mai rar valori crecute ale chilomicronilor. Hiperlipidemia combinat se manifest prin valori ridicate ale LDL, VLDL i mult mai rar ale IDL.
70 Analiza Lp VLDL IDL N N ++ +/++ ++ ++ -
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR Tabelul 7.II. Clasificarea fenopic a hiperlipidemiilor (Fredrickson) Fenop I IIa IIb III IV V Chilomicroni +++ + ++ LDL N ++ ++ N N Lipidele sanguine Colesterol Trigliceride N/+ ++ ++ ++ N/+ + +++ N ++ ++ ++ +++
7.4.2. Diferenierea simpl i rapid a dislipidemiilor Tipul dislipidemiilor poate fi esmat cu o aproximaie destul de bun cu ajutorul testului serului depozitat la rece. Pentru acest scop se recolteaz 5-10 ml de snge pe nemncate. Serul format se pune la frigider (4C) 18 ore, ntr-o eprubeta aezat vercal. Se apreciaz apoi transparena serului, aeznd un fond ntunecat n spatele eprubetei. Pe baza absenei transparenei, prezenei i aspectului opalescenei, se pot deosebi urmatoarele forme: 1. Ser clar, transparent: lipidemie normal sau prezena unei dislipidemii care nu duce la apariia opalescenei, deci posibilitatea existenei purilor IIa, IIb i IV, cu creterea cantii colesterolului (LDL) i/sau uoar a trigliceridelor serice (VLDL). 2. Strat (inel) lactescent la suprafa, cu serul inferior transparent: chilomicroni exogeni (p I). 3. Opalescen difuz: creterea trigliceridelor endogene (VLDL) sau a rmielor degradrii lipidelor (purile II, IV sau IIb). 4. Strat (inel) lactescent la suprafa, cu serul inferior opalescent: creterea simultan a chilomicronilor i VLDL (purile III sau IV)
Figura 7.2. Aspectul serului recoltat a jeun i pstrat 12 ore la 4C
EXPLORAREA N LABORATOR A METABOLISMULUI LIPIDIC 7.4.3. Algoritmul de diagnoscare al dislipidemiilor
71
I-a etap: se dozeaz colesterolul total i trigliceridele. Etap abordabil de ctre asistena medical primar (medicul de familie) . II-a etap: presupune analiza colesterolului din lipoproteinele serice: LDL i HDL (responsabilitate a medicului specialist). III-a etap: 1. Efectuarea lipidogramei (determinarea proporiei fraciunilor lipoproteice) 2. Diagnoscul diferenial al dislipidemiilor mixte (purile IIb, III i V) 3. Idenficarea prezenei n cantate crescut a Lp(a) Cea de a treia etapa se realizeaz n centrele de specialitate pentru evaluarea tulburrilor de metabolism i a patologiei nutriionale. LA FINALUL ACESTUI CAPITOL VEI PUTEA S: 1. Idenfici parametrii metabolismului lipidic, n special ai acelora cu rol n ateroscleroz 2. Cuno metodele de dozare ale lipidelor i lipoproteinelor 3. Cuno principalele puri de dislipidemii i a etapelor de evaluare ale acestora
72
Capitol 8 ANALIZA IN LABORATOR A PROTEINELOR PLASMATICE

Plasma este un amestec coloidal, n care proteinele reprezint cea mai semnificav component (6080 g/L). Exist dou clase mari de proteine plasmace: albuminele i globulinele, ntre care raportul opm de concentraie este A/G = 0,8 - 1,2 (indexul de disproteinemie ). 8.1. PROTEINEMIA Reprezint concentraia proteinelor totale din plasm; exist mai mult de 100 de specii individuale, mprite n dou clase mari: albumine i globuline. Parametru esenial al homeostaziei, proteinele din plasm ndeplinesc roluri importante n meninerea presiunii coloid-osmoce a plasmei, transport (de metabolii, hormoni, vitamine, minerale), rezerv de aminoacizi, aprarea specific i nespecific a organismului (factori de coagulare, imunoglobuline, anproteaze), meninerea echilibrului acido-bazic, etc. Indicaiile determinrii: VSH modificat, proteinurie, edem, poliurie, afeciuni renale cronice, afeciuni hepace cronice, diaree cronic, tumori maligne, suscepbilitate crescut la infecii, dureri osoase, limfoame, hemoragie, graviditate, traume, stare de oc; Importana clinic. Modificrile concentraiei proteinelor totale denot o disproteinemie sau modificarea echilibrului hidro-electrolic. n ambele situaii se poate stabili diagnoscul prin efectuarea electroforezei proteinelor i determinarea hematocritului. Strile de deshidratare sau hiperhidratare sunt acompaniate de hiper- sau hipoproteinemie. Metode: n ser sau plasm: metoda fotometric: reacia biuretului: n mediu alcalin legturile pepdice reacioneaz cu ionii de Cu(II) cu formarea unui compus colorat n mov, a crei ntensiti se determin la 546 nm; metoda Kjeldahl: se bazeaz pe determinarea coninutului n azot; n urin sau LCR: Metoda Coomassie: ulizarea colorantului Coomassie Brillant Blue; Material biologic : ser, plasm (heparinat), urin, LCR, lichide de puncie; Interpretarea rezultatelor: Valori normale ser sau plasm: 60 - 80 g/L (adult) 45-75 g/L (nou-nscui i sugari) Valori normale urin: < 150 mg/zi; Valori normale LCR: 0,15- 0,45 g/L Valori modificate: disproteinemie modificarea calitav/cantav a coninutului n proteine al plasmei;
ANALIZA IN LABORATOR A PROTEINELOR PLASMATICE Valori sczute (hipoproteinemie):
73
insuficien hepac, sindrom nefroc, arsuri, enteropai, malnutriie / malabsorbie, insuficien pancreac; pseudohipoproteinemie: prin diluie (recoltare de pe branul) Valori crescute (hiperproteinemie): hiperproteinemii absolute: hiperimunoglobulinemie: inflamaii cronice, gamopai monoclonale; hiperproteinemii relave: hemoconcentraie, diabet insipid, diaree. 8.2. PROTEINURIA Indicaiile determinrii: suspiciune de insuficien renal, proteinurii glomerulare sau tubulare, infecii urinare, infecii renale, proteinurie ortostac, graviditate. Clasificarea proteinuriilor:
- proteinurie glomerular: trecerea n urin a proteinelor cu greutate molecular mare; proteinurie selecv: apare doar albumina i transferina; proteinurie neselecv: pe lng albumin i transferin apar proteine cu greutate molecular mare (de ex. imunoglobuline); - proteinurii tubulare: apariia proteinelor cu greutate molecular mic datorit reabsorbiei tubulare deficitare; - forme mixte: n special n cazurile de afeciuni renale avansate apare proteinurie glomerular i tubular; Proteinurii postrenale: infecii i hemoragii urogenitale; Proteinurii prerenale: hiperproteinemii (gamopae monoclonal); 8.3. ALBUMINA Avnd form globular, dimensiune i greutate molecular mic (66.000 - 69.000D), albuminele sunt factori stabilizani ai echilibrului coloidal al plasmei. Indicaiile determinrii: toate strile patologice care se asociaz cu disproteinemii. Metod de dozare: ser: metode fotometrice (verde de bromcrezol), procentaj relav din proteinogram sau cantate absolut calculat din valoarea proteinemiei, imunodifuziune radial, nefelometrie imun, imunturbidimetrie; urin i LCR: nefelometrie, turbidimetrie; Valori normale: Ser: 55-65% din totalul proteinelor plasmace; 34 - 48 g/L. Urin: sub 20 mg/L; LCR: 110-350 mg/L; Valori sczute: insuficien hepac, sindrom nefroc, permeabilitete capilar crescut (sepsis, stri de oc, edem, ascit), arsuri,inflamaii acute i cronice, enteropai, tumori maligne, graviditate, hipoalbuminemie determinat genec.
74
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR Valori crescute: nu exist stri patologice caracterizate de creterea cantii absolute de albumin
n organism. Probe biologice: ser, urin, LCR; 8.3.1. Microalbuminuria Apare n anumite stri patologice: DZ, obezitate, hiperlipidemie, hipertensiune arterial, rezisten la insulin, consum de alcool. Valoare normal: prima urin de diminea: < 20 mg/L urin pe 24 ore: <30 mg/zi; Creteri uoare ale microalbuminuriei caracterizeaz faza reversibil a nefropaei diabece, care rspunde favorabil la terapie. n tabelul nr. 8.I. am reprezentat corelaia dintre gradul albuminuriei i gradul afectrilor renale. Metode de dozare: imunonefelometrie, inmunoturbidimetrie. Tabelul nr. 8.I. Corelaia dintre gradul albuminuriei i afectarea renal. Stadiul I. Hipertrofie i hiperfuncie II. Modificri histologice fr manifestri clinice III. Nefropae incipient IV. Nefropae manifest V. Insuficien renal Interval nceputul DZ. 2-5 ani 5-15 ani 10-25 ani 15-30 ani Albuminuria < 30 mg/zi <30 mg/zi 30- 300 mg/zi >300 mg/zi* >300 mg/zi*
* peste 300 mg/zi se consider proteinurie, evideniabil prin metode convenionale
8.4. GLOBULINE Se compun din aproximav 100 de fraciuni individuale, cu funcii extrem de variate. Metode: procentaj relav din proteinogram sau cantate absolut calculat din valoarea proteinemiei, respecv dozarea fraciunilor individuale (imunodifuziune radiar, nefelometrie, turbidimetrie, RIA, ELISA). La electroforeza n gel de agar/agaroz, se grupeaz n 5 fraciuni: 1, 2, 1, 2 i globuline. Valori normale: 35-45% din totalul proteinelor plasmace, 30 - 40 g/L. Valori crescute: hepat cronic, inflamaii acute i cronice, sindrom nefroc, enteropai, tumori maligne. Valori sczute: deficite imune, arsuri, hemoragii severe. Globulinele pot fi globulare, dar i fibrilare (fibrinogenul), cu dimensiuni i greuti moleculare foarte variabile (70.000 - 800.000 D) i se comport ca i factori destabilizani ai plasmei. Disproteinemia reprezint aadar, o modificare a echilibrului coloidal al plasmei, datorat modificrii raportului A/G n afeciuni hepace, renale, n sindroamele inflamatorii acute sau cronice. n diagnoscul de laborator clinic, disproteinemia se evideniaz prin metode calitave i cantave. Metodele calitave sunt ulizate n scop de screening, iar cele semicantave i cantave au valoare diagnosc.
ANALIZA IN LABORATOR A PROTEINELOR PLASMATICE Proteinuria Bence-Jones
75
Proteinele Bence-Jones reprezint lanurile uoare de p lambda sau kappa din structura imunoglobulinelor care se filtreaz la nivel glomerular i se elimin prin urin. n aproximav 80% din cazuri apare n plasmocitoame, dar au fost descrise i n macroglobulinemia Waldenstrm. Metode de evideniere: imunofixare (prag de sensibilitate: 20-30 mg/L) sau electroforeza urinar (prag de sensibilitate: aprox. 100 mg/L). Testele de disproteinemie (Triada MacLagan, Kunkel, TakataAra) Numite impropriu i teste hepace, aceste teste evideniaz perturbarea echilibrului coloidal al plasmei nu numai n afeciuni hepace (n care sinteza albuminei scade), sau n afeciuni renale (cu creterea permeabilitii filtrului glomerular), dar i n cursul reaciilor inflamatorii acute i cronice, n care clasa globulinelor prezint creteri semnificave. Triada de teste are la baz acelai principiu: precipitarea globulinelor cu o soluie saturat de mol (MacLagan), o soluie diluat de ZnSO4 (Kunkel), sau o soluie HgCl2 + NaCl + Na2CO3 (TakataAra), gradul de turbiditate fiind proporional cu gradul disproteinemiei. Determinarea raportului albumin/globuline are ns o valoare limitat, deoarece nu poate clarifica natura dezechilibrului. Raportul Albumine/Globuline (Indexul de disproteinemie) Indicator important al funciilor hepac i renal. Valori normale: 0,8 - 1,2. Valori sczute: n insuficien hepac, inflamaii acute i cronice, sindrom nefroc, malabsorbie, diaree, arsuri severe. Valori crescute: fiziologic la copii (la care gama globulinele sunt mai sczute dect la aduli) sau n deficitele imune. 8.5. ELECTROFOREZA PROTEINELOR GENERALITI Este metoda cea mai larg rspndit pentru screening-ul disproteinemiilor, fiind esenial pentru depistarea paraproteinelor. Prin definiie, electroforeza este o metod analic i preparav de separare a parculelor sau ansamblurilor de parcule ncrcate electric, sub aciunea unui cmp electric extern. Prima electroforez liber (n mediu lichid) a fost efectuat n 1937 de Tiselius. Actualmente se prefer electroforeza de zon (n mediu solid, poros). Pentru proteinele serice, se aplic metode cu medii suport relav inerte - hre de filtru, amidon, acetat de celuloz, sephadex, agar, agaroz, poliacrilamid. Agaroza se obine din agar, care este un extract de alge. Din punct de vedere chimic, agaroza este un copolimer liniar, cu unitatea repev - agarobioza - format din beta-D-galactopiranoz i 3,6-anhidro-alfa-L-galactopiranoz. n mpul gelificrii catenele de agaroz se asociaz formnd lanuri dublu-elicoidale cu simetrie triaxial. Supranfurarea catenei asigur rezistena crescut a gelului i porii relav mari n care se pot separa parcule cu un diametru de 20-50 nm.
76
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR Sub aciunea unui cmp electric uniform, ntr-un mediu tamponat, o parcul ncrcat electric se va
deplasa cu o vitez constant determinat de aciunea urmtoarelor fore:
fora de atracie electroforec F1, egal cu produsul dintre sarcina (Q) parculei i intensitatea (E)
cmpului electric aplicat,
F1= Q E
fora de frecare Stokes F2, egal cu produsul dintre coeficientul de vscozitate dinamic al mediului
(), raza parculei (r) i viteza electroforec (v),
F2 = 6 r v
fora de frnare electroforec, care rezult din atracia exercitat de cmpul electric asupra ionilor electrolitului,
fora datorat efectului de relaxare, care apare din cauza redistribuirii ionilor electrolitului n apropierea parculei sub aciunea cmpului electric. Suma vectorial a acestor fore este egal cu 0, iar viteza electroforec v devine constant:
v = Q E / 6 r
Parculele separate se vor caracteriza prin mobilitatea electroforec (), care se definete ca raportul dintre viteza electroforec (v) i intensitatea cmpului electric (E):
= v / E,
= Q / 6 r
Din aceast relaie se observ c parculele pentru care raportul Q/r este idenc vor avea mobiliti electroforece idence. Variaiile dimensiunilor parculelor sunt compensate de variaiile densitilor de sarcin electric superficial. Pe baza acestor considerente se poate afirma deci c mobilitatea electroforec a proteinelor depinde de urmtorii factori:
mrimea, forma, sarcina electric, concentraia, gradul de hidratare al parculei vscozitatea, temperatura i pH-ul mediului fora ionic FI = 12 cizi2 intensitatea cmpului electric mpul de migrare
Acestora li se mai adaug i un fenomen electrocinec, reciproc electroforezei, care apare n urma deplasrii fazei lichide de dispersie ntr-un mediu poros, la aplicarea unui cmp electric exterior, n urma dehidratrii tamponului coninut n gelul de suport. Acest fenomen fizico-chimic se numete electroendosmoz. n anumite suporturi (gelurile de agaroz), electroendosmoza este exprimat i determin migrarea spre catod a moleculelor ncrcate poziv i a moleculelor de ap asociate. Prin separarea electroforec se obin fraciuni cu aspect de zone bine delimitate. n laboratorul clinic rolul acestei metode este explorarea raportului procentual al principalelor fraciuni de proteine serice. Acestea din punctul de vedere al mobilitii electroforece constuie 5-6 grupri compacte (Fig.8.1.), dar din punct de vedere biologic, sunt alctuite din cele mai diverse puri de proteine. Fraciunile proteinelor serice separate ntr-un gel de agaroz la pH alcalin (8,6) sunt urmtoarele, n ordine de la anod spre catod, cu meniunea c poziia exact a fiecrei fraciuni depinde de gelul i de tehnica folosite:
ANALIZA IN LABORATOR A PROTEINELOR PLASMATICE albumina este fraciunea care migreaz rapid spre anod (are pHi= 4,2) 1- globuline alctuite din 1-glicoproteina acid i 1-antripsin;
77
2-globuline constuite din haptoglobin, ceruloplasmin, 2-macroglobulin, 1- anchimotripsina, GC globulina, lipoproteina; 1 i 2 globuline:-lipoproteine, hemopexina, factorul C3, transferina, PCR, fibronecna, plasminogenul; fraciunea globulinelor care se caracterizeaz printr-o mobilitate catodic, alctuit din IgM, IgA, IgG, IgD i respecv IgE.
Albumina
1 2 1 2
Figura nr.8.1. Aspectul traseului de migrare electroforec al unui ser normal Electroforeza proteinelor n gel de agaroz materiale i metod Ulizare: depistarea disproteinemiilor, monitorizarea evoluiei anumitor afeciuni. Indicaii: stri disproteinemice, diagnoscul diferenial i monitorizarea inflamiilor acute i cronice, monitorizarea evoluiei afeciunilor hepace i renale, diagnoscul gamopailor monoclonale, suspiciunea deficienelor imune umorale. Valori normale (procentual calculate din densitograme pentru tehnica SEBIA HYDRAGEL 7,15 & 30 1- 2): albumin: 54,3 65,5% 1-globuline: 1,2 3,3% 2-globuline: 8,3 15,0% -globuline: 9,0 17,7% -globuline: 7,1 19,5% Cteva din traseele electroforece clasice se pot observa n figura 8.2. Dintre globulinele 1, 2 i , 1-antripsina, 1-glicoproteina acid, haptoglobina, ceruloplasmina, transferina i C3 sunt proteine caracterisce ale reaciei de faz acut (fig.8.2.b.). Chiar i -lipoproteinele pot suferi variaii cantave datorit reaciei de faz acut (cu dislipidemii consecuve). Totui, cel mai
78
caracterisc marker al acestui fenomen biologic rmne concentraia PCR - proteina C reacv - care poate crete de 100-1000 de ori, n doar 24 de ore. Asel, dup efectuarea metodei screening (electroforez n gel de agaroz), n algoritmul evidenierii fazei acute intr determinarea cantav a acestor puri de proteine. n sindromul nefroc se poate observa o scdere a albuminelor i a 1-, respecv -globulinelor, cu creterea 2 i -lobulinelor (fig.8.2.c.), dar numai n cazuri foarte severe. n inflamaiile cronice este caracterisc creterea -globulinelor (fig.8.2.d.); n ciroza hepac apare i o hipoalbuminemie concomitent, precum i o fuzionare a 2 cu -globulinele, datorit creterii concentraiei IgA. n mielomul mulplu tehnica electroforec este esenial pentru diagnoscul paraproteinei, care apare sub forma gradientului M (monoclonal) band ngust, de intensitate proporional cu concentraia proteinei monoclonale (fig. 8.2.e.) i migreaz n zona , dar poate apare i n zonele 2 sau . De obicei electroforeza se efectueaz din ser, deoarece fibrinogenul (care migreaz n zona 2), poate creea confuzii n diagnoscul paraproteinelor. Deficienele severe de IgG (chiar n lipsa deficienelor de Ig A sau IgM) se pot evidenia prin scderea fraciunii a globulinelor (fig.8.2.f.). 8.6. HIPERIMUNOGLOBULINEMIILE I HIPOIMUNOGLOBULINEMIILE Hiperimunoglobulinemia policlonal reprezint rspunsul umoral la infecii. Infeciile bacteriene se caracterizeaz n primul rnd prin creterea fraciunii IgG. Infeciile acute se asociaz cu creteri ale IgM, iar bolile alergice, parazitozele determin o cretere a imunoglobulinelor de p IgE. Hiperimunoglobulinemia monoclonal. Plasmocitomul (mielomul mulplu, boala Kahler) reprezint o proliferare tumoral a unei singure clone de limfocite B cu producerea unor imunoglobuline nefuncionale (paraproteine). Biochimic se caracterizeaz prin creterea proteinelor totale, pe electroforez se observ creterea fraciunilor beta i gamma. Tipul de imunoglobulin secretat se poate idenfica prin imuno-electroforez (IgG, IgA, IgD sau IgE). n aproximav 50% dintre cazuri apare producia de lanuri uoare de p lambda sau kappa (proteine Bence-Jones). Apare o cretere accentuat a VSH-ului, pe froul periferic se observ agregarea eritocitar cu formare de rulouri. Macroglobulinemia Waldenstrm este un limfom non-Hodgkin cu celule B, cu reducerea concomitent a eritropoiezei. Paraproteinele sunt de p IgM. Se caracterizeaz printr-un VSH foarte crescut, diatez hemoragic. Se poate asocia cu sindrom Sjgren, acrocianoz i o suscepbilitate crescut la infecii, datorit afectrii producieie de imunoglobuline. Hipoimunoglobulinemiile se caracterizeaz prin scderea produciei uneia sau a tuturor izopurilor de imunoglobuline n afeciuni nnscute sau dobndite. Deficiena limfocitelor B se soldeaz cu scderea sau lipsa produciei de imunoglobuline. Hipoimunoglobulinemiile secundare apar ca urmare a unor boli (leucemii), n deficiene imune, dup radioterapie, boli infecioase, arsuri, malnutriie, etc.
ANALIZA IN LABORATOR A PROTEINELOR PLASMATICE a b
79
Fig.8.2. Aspectul proteinogramei serice normale i n diverse patologii: a. Normal; b. Inflamaie acut; c. Sindrom nefroc; d. Hipergamaglobulinemie; e.Paraproteinemie; f. Agamaglobulinemie.
80 8.7. SPECII PROTEICE CU FUNCII SPECIFICE IN PLASM 8.7.1. 1-Antripsina (AAT)
Glicoprotein cu molecul mic, difuzibil, de origine hepatocelular, inhibitorul serinproteazelor, reactant de faz acut. Valori: normale: 2 - 3 g/L crescute: inflamaii (microvasculite), tumori maligne, pielonefrit acut, ulma parte a graviditii. sczute: lipsa ereditar a AAT (emfizemul idiopac al copilului), sindrom nefroc, insuficien hepac grav, pneumopai cronice. 8.7.2. Glucoproteina 1-acid (seromucoidul, orosomucoidul) Reactant de faz acut, bogat n acid neuraminic, cu rol neclar n organism. Valori: normale: 0,5 - 1,2 g/L crescute: inflamaii, tumori maligne sczute: hepate acute, insuficien hepac 8.7.3 2-Macroglobulina (2- Mg) Glucoprotein macromolecular, de origine hepatocelular i granulocitar, inhibitorul serinproteazelor, nu este reactant de faz acut. Valori: normale: 1,3 - 3,2 g/L crescute: sindrom nefroc, tumori maligne, diabet zaharat, tratament estrogenic sczute: insuficien hepac, sepcemii, sprue. 8.7.4 1-C globulina (factorul 3 de complement C3) Valori: normale: 0,5 - 1,2 g/L crescute: n urma vindecrii inflamaiilor (scderea consumului) sczute: din cauza consumului sporit, n inflamaii acute i cronice acve, din cauza sintezei sczute n hepatopai cronice (ciroz hepac) sau pierderilor renale (sindrom nefroc). 8.7.5. 2-Microglobulina (2-g) Lanul pepdic uor (11.000 D) al angenelor de histocompabilitate de clasa I-a (HLA-A, B, C). Valori: normale: 0,8 - 2,4 mg/L crescute: anurie (uremii), respingerea grefelor renale, tumori maligne, microvasculite, boli autoimune.
ANALIZA IN LABORATOR A PROTEINELOR PLASMATICE 8.7.6. Ceruloplasmina
81
2-glicoprotein transportoare de cupru (coninnd 0,32 % Cu; 6 Cu/mol), reactant de faz acut, cu proprieti de oxidaz esenial n meninerea Fe n form redus (Fe2+), n cromoproteinele cu rol n transportul i ulizarea oxigenului (ulma funcie pare s fie esenial, spre deosebire de celelalte), cu proprieti anoxidante (protejeaz membrana celular prin inhibiia oxidrii lipidelor membranare). Valori : normale: 0,25 - 0,60 g/L crescute: graviditate, inflamaii acute i cronice, infarct miocardic acut, anemii feriprive, boala Hodgkin, leuconevraxit, tumori maligne, unele psihoze endogene. sczute: boala Wilson, sindrom nefroc, Kwashiorkor, sprue. 8.7.7. Haptoglobina 2-glicoprotein de origine hepatocelular, reactant de faz acut, fixatoare de hemoglobin liber, avnd mai multe alopuri: HP1-1, HP2-1 i HP2-2. Valori: normale: 0,3 - 2 g/L crescute: inflamaii acute i cronice, tumori maligne, metastaze, necroze, icter mecanic. sczute: ahaptoglobinemie ereditar, anemii hemolice acute i cronice, anemii biermeriene, leziuni hepace acute i cronice, mononucleoz infecioas. 8.7.8. Transferina (siderofilina) -glicoprotein fixatoare/transportoare de fier (2 Fe3+ pe molecul) n snge. Valori: normale: 2 - 4 g/L crescute: caren de fier, graviditate, contracepve, anemii posthemoragice, hemosideroza pulmonar ereditar, sczute: atransferinemia congenital, infecii, inflamaii acute i cronice, anemii hemolice, sindrom nefroc, tumori maligne, insuficien hepac acut i cronic, hemocromatoz, talasemii, anemii hipercrome.
Saturarea Transferinei (%)=

8.7.9. Imunoglobulinele
Fe (g/dL) x 100 Transferina (mg/dL) x 1,41
n cursul fraconrii electroforece n mediu gelificat a proteinelor plasmace, imunoglobulinele migreaz cu -globulinele, n funcie de masa lor molecular: IgM n 1 (cu 2 alopuri: IgM1 i IgM2), IgA n 2 (cu 2 alopuri: IgA1 i IgA2) i IgG n 3 (cu 4 alopuri: IgG1, 2, 3 i 4). Din cauza concentraiilor mici, IgD i IgE nu pot fi idenficate direct n proteinogram, numai n condiii patologice (limfoame maligne), sub forma gradienilor monoclonali (M). Determinarea individual a Ig se poate realiza prin nefelometrie sau turbidimetrie (pentru Ig G, A, M) sau prin tehnici ELISA, imunochemiluminiscen (pentru Ig E).
82 Valori: normale (aduli): IgG = 7 - 16 g/L
crescute: hepat cronic acv, PAR (poliart reumatoid), glomerulonefrit acut, mielom IgG, endocardit bacterian subacut, sczute: agamaglobulinemie (Bruton), lipsa selecv a IgG Valori: normale (aduli): IgA = 1,5 - 4,5 g/L crescute: reacii imune gastrointesnale, respiratorii, hepate vasculobiliare, herpes simplex, dermata herpeform Dhring, mielom IgA, sczute: agamaglobulinemie, lipsa selecv a IgA Valori: normale (aduli): IgM = 0,4 - 2,3 g/L crescute: macroglobulinemia Waldenstrm, viroze, ciroza biliar, LED, PAR, anemii hemolice, limfosarcom sczute: agamaglobulinemie, lipsa selecv a IgM, sindromul Wisco-Aldrich Valori policlonale crescute (IgG + IgA + IgM): ciroz biliar primiv, hepat cronic acv, pielonefrita cronic, poliartrit cronic streptococic. Valori policlonale sczute (IgG + IgA + IgM): lipsa congenital de ancorpi (agamaglobulinemia de p Bruton), hipoplazie sau aplazie mic, imunosupresiune (imunoparalizie) postvaccinic sau medicamentoas temporar. Valori: normale: IgD = 3 - 140 mg/L crescute: vasculite, microvasculite hipersensive, infecii cronice, mielom IgD, Valori: normale: IgE < 240 g/L (ng/ml) crescute: stri alergice, oc anafilacc, boli parazitare, mielom IgE Lanuri uoare izolate (Paraproteine, Proteine Bence-Jones) Lauri uoare izolate de p sau , prezente sub form de gradient M n serul i n urina bolnavilor cu mielom mulplu excretor (boala Kahler, boala lanurilor uoare), cu o frecven de 50 % a apariiei n cazuri de mielom (patognomonic). Lanuri grele izolate Din clasele , , , sau , prezente n plasma (dar i n urina) bolnavilor cu boala Franklin, sub forma unui gradient monoclonal. 8.7.10. Proteina C-reacv (PCR) Reactant proteinic de faz acut, se formeaz n elementele mobile i fixe ale SMM. n cursul electroforezei migreaz cu -globulinele. Inhib manifestarea excesiv a mecanismelor de aprare.
ANALIZA IN LABORATOR A PROTEINELOR PLASMATICE Valori: normale: < 3 mg/L crescute: inflamaii acute i cronice (indiferent de eologie), tumori maligne 8.7.11. Crioglobuline Complexe imune circulante (formate din angen/e/ i ancorp/i/) cu solubilitate redus la rece.
83
Metoda calitav: crioprecipitare, fracionare electroforec n gel, idenficarea angenului i ancorpilor prin imunoprecipitare, stabilind formele monoclonale (cu ancorpi dintr-o singur clas Ig), biclonale (din dou clase Ig) i policlonale (din mai multe clase Ig), coninnd uneori i alte proteine (factori de complement, fibrinogen, fibronecna, etc). Metoda cantav: precipitare cu polielenglicol cu masa molecular de 6.000 D (PEG-6.000). Prezen n ser: sindrom Raynaud, reculoze maligne, artrit reumatoid, leucemia limfoid cronic, ciroza hepac, LED, PAR, nefroscleroz, endocardita bacterian subacut, crioglobulinemia idiopac. 8.8. CAZURI CLINICE 8.8.1. Mielom mulplu Bolnav n vrst de 70 ani, se prezint la ambulatorul de specialitate pentru dureri lombare, pierdere n greutate (6 kg n ulma lun), pneumonie i dispnee. La examenul fizic s-a constatat paloare accentuat a tegumentelor. S-au efectuat urmtoarele determinri de laborator: Uree: 80 mg/dl Creanin: 1,6 mg/dl Proteine totale: 95 g/L Albumin: 31 g/L Acid uric: 9 mg/dl Ca seric: 2,76 mM/L VSH: 100 mm/L Hb: 8,8 g/dl Frou periferic: normocite normocrome, formare de ruloruri Electroforeza proteinelor serice: - Albumin: 30,5% - Alfa1: 2,8% - Alfa2: 8,3% - Beta: 8,2% - Gamma: 50,2% - Raport albumina/ globuline: 0,43 - Gradient monoclonal n gamma1 de aproximav 48,7% din valoarea proteinelor totale.
84 Interpretare:
Imunoelectroforeza a idenficat paraproteinele avnd lanuri grele de p gama i i lanturi uoare de p kappa. n urin s-au evideniat proteine Bence-Jones de p kappa. Examenul radiologic a scos n eviden leziuni cu rarefieri osoase cu aspect perforant la nivelul vertebrelor lombare, a coastelor i sternului. Diagnosc: mielom mulplu cu imunoglobuline de p IgG. 8.8.2. Reacie inflamatorie acut Brbat n vrst de 40 ani se prezint la ORL pentru dureri la nivelul urechii stngi, febr, verj i hipoacuzie. S-au efectuat urmtoarele determinri de laborator: Creanin: 40 mg/dl Proteine totale: 81 g/L Albumin: 35 g/L VSH: 20 mm/L PCR: 15 mg/L Hb: 15 g/dl Frou periferic: neutrofilie Electroforeza proteinelor serice: - Albumin: 49,3% - Alfa1: 7,5% - Alfa2: 15,1% - Beta: 12,6% - Gamma: 15,5% - Raport albumina/ globuline: 0.97 Interpretare: n urma examenului ORL s-a stabilit diagnoscul de ot medie. Electroforeza proteinelor serice evideniaz un sindrom inflamator acut cu hipoalbumniemie, creterea fracunilor alfa1, alfa2 i beta (locul de migrare a proteinelor de faz acut).
8.8.3. Sindrom nefroc Copil de 7 ani se interneaz cu edeme generalizate. Examenul de urin evideniaz proteinurie. Rezultate de laborator: Na: 131 mmol/L K 3,6 mmol/L Uree:40 mg/dl Creanin: 1,1 mg/dl
ANALIZA IN LABORATOR A PROTEINELOR PLASMATICE Ca: 1,70 mmol/L Proteine totale: 35 g/L Albumin 15 g/L TG: 200 mg/dl Colesterol: 240 mg/dl Se constat ser lipemic. Electroforeza proteinelor: - Albumin: 61,1% - Alfa1: 3,7% - Alfa2: 20,2% - Beta: 8,6% - Gamma: 6,4% - Raport albumine/ globuline: 1,57 Interpretare: proteinuria, hipoproteinemia i edemul indic sindrom nefroc. Hipoproteinemia presupune scderea concentraiei albuminei, a transferinei, a AT III.
85
Crete concentraia proteinelor cu greutate molecular mare (alfa2 macroglobulina, factori ai coagulrii, apolipoproteine) n mod compensator. Scderea gamaglobulinelor se datoreaz pierderii imunoglobulinelor i al factorilor de complement prin filtrul glomerular. 8.8.4. Ciroz hepac Femeie de 50 de ani se interneaz cu icter, somnolen, semnele clinice ale unei hepatopai cronice. Se efectueaz urmtoarele analize de laborator: Albumin: 25 g/L Bilirubin: 2,5 mg/dl Fosfataz alcalin: 318 U/L AST 134 U/L GGT: 360 U/L Electroforeza proteinelor serice: - Albumin: 42,1% - Alfa1: 3.1% - Alfa2: 9,3% - Beta: 10,1% - Gamma: 35,4% - Raport albumin/ globuline: 0,73 - Pod beta- gama (creterea fraciunii gama se suprapune fraciunii beta). Interpretare: pe baza datelor anamnesce i a celor de laborator se pune diagnoscul de ciroz hepac.
86 8.8.5. Hipogamaglobulinemie secundar
Bolnav cu leucemie limfac cronic cunoscut se prezint pentru control periodic. Se efectueaz urmtoarele determinri de laborator: Hemoleucogram: WBC: 3,0 x103 /l Frou periferic: microcite hipocrome Uree: 40 mg/dl Na: 131 mmol/L K: 3,4 mmol/L AST: 50 U/L ALT: 48 U/L Proteine totale: 55 g/L Albumin: 23 g/L Electroforeza proteinelor serice: - Albumin: 54,6% - Alfa1: 6,7% - Alfa2: 19,8% - Beta: 14,0% - Gamma: 4,9% - Raport Albumin/ Globuline: 1,20 Interpretare: bolnavul prezint hipogamaglobulinemie asociat leucemiei limface cronice. LA SFRITUL ACESTUI CAPITOL VEI FI CAPABILI S: cunoatei indicaiile efecturii, importana clinic i interpretarea urmtoarelor determinri: proteine totale, albumin, electroforeza proteinelor plasmace interpretai un traseu electroforec
87
Capitolul 9 EXPLORAREA DE LABORATOR A HEMOSTAZEI

Hemostaza face parte din mecanismele de aprare ale organismului, avnd funcia de prevenire a pierderii de snge i de refacere a peretelui vascular lezat. 9.1. ASPECTE PREANALITICE 9.1.1. Indicaiile explorrii hemostazei: monitorizarea terapiilor ancoagulante, fibrinolice sau substuiilor de factori de coagulare; aprecierea pericolului de apariie a hemoragiilor naintea interveniilor chirurgicale; diagnoscul diatezelor hemoragice; evaluarea capacitii de sintez a ficatului; diagnoscul CID; diagnoscul afeciunilor tromboce; diagnoscul trombofiliilor. 9.1.2. Pregrea bolnavului: n vederea dozrii factorului VIII, a factorului von Willebrand i a factorilor fibrinolizei se recomand ca bolnavul s nu consume cafea, alcool, s nu fumeze. naintea explorrii funciei plachetelor nu se consum acid acelsalicilic sau derivai ai acestuia. Nu se consum medicamente care afecteaz funcia plachetar. naintea explorrii trombofiliilor, nu se administreaz bolnavilor derivai de cumarin. Dac ancoagularea este absolut necesr, se trece bolnavul pe ancoagulante injectabile (heparin). 9.2. EXPLORAREA DE LABORATOR A FAZEI VASCULOPLACHETARE 9.2.1. Numrarea plachetelor Se realizeaz prin numrtoare automat (metod recomandat). Valori normale: 150.000 - 300.000 plachete/mm3 Valori crescute: trombocitemii (primive i secundare, boli mieloproliferave) Valori sczute: trombocitopenii (idiopace: b. Werlhof i secundare: consum sporit, hipersplenism, boli autoimune, radiaii). 9.2.2. Morfologia plachetelor Se apreciaz pe un frou colorat MGG aspectul, forma, dimensiunile, gruparea plachetelor.
88 9.2.3. Idenficarea Glicoproteinelor membranare plachetare (GP Ib = CD42b = Receptorul pt F vW , GP IIb-IIIa = CD 41a = Receptorul pt fibrinogen) Principiu: idenficarea se face prin citometrie de flux dup marcarea cu ancorpi monoclonali cuplai cu fluorocromi sau prin electroforez bidimensional a proteinelor membranare plachetare. 9.2.4. Timpul de sngerare (TS) Timpul de sngerare este o metod de explorare a fazei primare a coagulrii (vasoconstricie i formarea dopului primar plachetar). Aceast determinare are doar un rol orientav. Indicaii: Evidenierea afeciunilor fazei vasculo-plachetare; Cnd se suspicioneaz existena unei diateze hemoragipare; Evaluarea funciei plachetare; Se msoar mpul care trece pn la oprirea spontan a unei mici sngerri provocate dup o neptur sau incizie standard: tehnica Duke: neptur cu adncime de 3-4 mm la pulpa degetului sau la lobul urechii; tehnica Ivy: incizie de 1mm /10 mm pe antebra, n mp ce pe bra se aplic maneta tensiometrului cu o tensiune de 40 mmHg. Valori normale: La lobul urechii: 2 - 4 min. (patologic: peste 6 min.) La pulpa degetului: 2 - 3 min. (patologic: peste 4 min) Pe antebra: 6 - 8 min (patologic: peste 10 min) Valori crescute: n trombocitopenii, trombopai ereditare (Glanzmann) sau secundare (imune, autoimune sau toxice), vasculopai. 9.2.5. Timpul de sngerare Ivy modificat: Exploreaz funcia plachetar (adeziunea i agregabilitatea plachetar) dar i afeciunile hemostazei determinate de modificrile rezistenei capilare. Se aplic maneta tensiometrului pe braul bolnavului, se umfl la o presiune de 40 mmHg, se aplic o zgrietur standardizat pe antebraul bolnavului. Se ndeprteaz din 30 n 30 de secunde picturile de snge cu o hre de filtru. Ulma pictur de snge corespunde mpului de sngerare. Valori normale: 2,5-9,5 min. Timp de sngerare crescut: trombocitopenii, trombocitopai (afeciuni ale agregrii, adeziunii trombocitare i ale proceselor de secreie trombocitar), afeciuni ale pereilor capilari. Timpul de sngerare este normal in coagulopai (ex: afibrinogenemii). 9.2.6. Retracia cheagului ntr-o eprubet conic gradat se ntroduc 5 ml snge recoltat prin puncie venoas i se pune imediat n baie de ap la 37 C. Se citete dup 4 i 24 de ore.
EXPLORAREA DE LABORATOR A HEMOSTAZEI
89
Interpretarea: n mod normal, dup 4 ore, cantatea de ser expulzat din ochiurile reelei cheagului prin contracia plachetelor (trombostenina) reprezint cca 30 - 45 % din volumul total al sngelui. Retracie slab sau absent: trombocitopenii, trombocitopai, poliglobulii. 9.2.7. Rezistena capilar a. Metoda prin compresiune (semnul garoului, Rumpell-Leede) Principiu: crearea unei staze venoase favorizeaz extravazarea hemailor prin peretele capilar n esutul subcutanat. Garoul (sau maneta tensiometrului) se aplic deasupra plicei cotului, presiunea iniial mare se scade pn la apariia uoar a pulsului i se menine aa mp de 10 minute. Se noteaz cu 1 - 4 + apariia peteiilor pe o suprafa circular cu R=2 cm, dup numr i intensitate. b. Metoda prin depresiune Se efectueaz cu ajutorul unei ventuze cuplate cu o pomp de vid de mn, care indic i valoarea cifric a presiunii negave. Se produce lent un vid de -400 mmHg (-53.332 Pa) i se menine un minut. Dac sub ventuz apar peteii, se aplic pe o regiune nvecinat un vid de -300 mmHg (39.990 Pa), respecv unul de -200 mm Hg (26.660 Pa). Un numr mai mic de peteii nseamn test negav. Petesii n numr de 3 - 10 se noteaz cu 1 - 2+, iar echimoze cu 3+. Interpretarea: o fragilitate vascular crescut se ntlnete n trombocitopenii, n angiopai diabece, boli hepace, hipofibrinogenemie, avitaminoz (i anvitamine) K, scorbut. 9.3. EXPLORAREA DE LABORATOR A FAZEI PLASMATICE COAGULAREA PROPRIUZIS Testele de coagulare se mpart n teste globale i difereniate pe cele 4 faze ale hemostazei plasmace: prefaza (generarea tromboplasnei plasmace respecv sulare), faza I : formarea trombinei, faza a II-a : formarea cheagului de fibrin, inclusiv stabilizarea cheagului i faza a III-a : fibrinoliza (figura 9.1). Cu excepia determinrii mpului de coagulare venoas, pentru explorarea de laborator a coagulrii, sngele venos se recolteaz pe ancoagulant (citrat de sodiu 3,8%) sau n vase siliconate. 9.3.1. Coagulometre Msoar mpul scurs de la momentul adugrii reacvlui pn la apariia cheagului de fibrin (n general momentul gelificrii i nu cheagul de fibrin stabilizat) Pricipiu: inducie electromagnec 9.4. EXPLORAREA CII EXTRINSECI A COAGULRII Timpul de protrombin TP (mp de tromboplasn, mpul Quick-TQ) / INR Este un test simplu de explorare a cii exogene i a cii comune a coagulrii (factorii II, V, VII, IX, X i I), ulizat pentru monitorizarea tratamentului ancoagulant oral (cu anvitamine K). Principiu: n prezena tromboplasnei sulare (TF = F III = factorul sular), a unor fosfolipide i a clorurii de calciu, plasma normal se coaguleaz rapid (n 10-12), ocolind prefaza.
90 Acvare endogen Contact cu suprafee electronegave
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR Acvare exogen Leziuni sulare Factorul sular FT, III
XII XI
XIIa XIa
Ca2++PL+IX
VII
IXa+VIII+PL+Ca2+
Ca2++PL+VIIa
Ca2++PL+X
Protrombin
Xa+V+PL+Ca2+
Trombin Fibrinogen Fibrin solubil
XIIIa+Ca2+
Fibrin insolubil
XIII
Fibrinopepde A+B
Figura 9.1. Cile fazei plasmace a coagulrii Indicaii: Diagnoscul diferenial al diatezelor hemoragice, Deficiena vitaminei K, Tratament cu anvitamine K (Warfarin, Syncumar), Explorarea funciei sintece a ficatului, Triajul preoperator al coagulopailor. Modaliti de exprimare a rezultatului: Timp de protrombin (TP) Exprim mpul n care apare cheagul de fibrin din momentul constuirii amestecului de reacie (normal n 10-12). Rata protrombinic (PR) Este cea mai sugesv exprimare pentru parametrul de mai sus (normal: 0,8-1,2):
PR = TP plasm bolnav / TP plasm martor

Plasma martor este un amestec de plasme normale.
EXPLORAREA DE LABORATOR A HEMOSTAZEI Raportul normalizat internaional (INR)
91
Datorit proprietilor diferite ale preparatelor comerciale de tromboplasn i a aparatelor ulizate n laboratoare, n vederea uniformizrii rezultatelor OMS a propus introducerea noiunii INR (Internaonal Normalized Rao):
INR = PR ISI
Indicele de sensibilitate al preparatului tromboplasnic, ISI, arat diferena ntre acvitatea preparatului de tromboplasn ulizat i tromboplasna de referin internaional (cu ISI=1). Valori ISI < 1 semnific o acvitate mai slab, valori ISI > 1 arat o acvitate mai puternic a tromboplasnei ulizate. Fiecare lot de tromboplasn comercializat conine valoarea ISI cu care se corecteaz mpii obinui, dup formula de mai sus. INR este deci un indice mai bun dect PR, deoarece este o msur comparabil pe plan internaional (normal INR = 0,8 1,2). Valori crescute: hipocoagulabilitate (ancoagulani, deficiene ereditare i dobndite ale factorilor complexului protrombinic, afeciuni hepace, CID). INR ntre 2,0-3,0: terapie ancoagulant cu doze mici; INR ntre 3,0-4,5: terapie ancoagulant cu doze mari. Valori sczute: hipercoagulabilitate prin transformarea sporit a protrombinei. Activitate protrombinic (indicele protrombinic) Aceast modalitate de exprimare a rezultatului este scoas din uz, se mai ulizeaz doar sporadic. Principiu: se compar mpul de protrombin (TQ) al plasmei cercetate cu mpii obinui cu o plasm normal diluat succesiv de la 9:1 pn la 1:9 (corespunznd acvitii protrombinice de 90, 80....20, 10 % a plasmei normale), exprimndu-se grafic acvitatea (%) n funcie de mpul de coagulare al plasmelor de diverse diluii. Valori normale: 80 - 100 %. 9.5. EXPLORAREA CII EXTRINSECI A COAGULRII 9.5.1. Timpul de tromboplasn parial acvat (APTT) Rol: evideniaz afeciunile cii intrinseci (factorii XV, XIV, XII, XI, VIII) i a cii comune (factorii X, V, II, i I) a hemostazei. Principiu: se msoar mpul de coagulare al plasmei citratate dup adugare de tromboplasn, acvatori de suprafa i ioni de Ca. Cascada coagulrii se acveaz de ctre tromboplasna parial. Lipsa factorului sular (FT = F III) din amestecul de reacie duce la alungirea mpului de coagulare. Coagularea se obine dup adugarea unor acvatori de suprafa (kaolin, celit, etc). Asel acest test ofer informaii i despre acvitatea unor factori cu rol n acvarea de contact: precalicrein sau kininogenul cu greutate molecular mare (High Molecular Weight Kininogen = HMWK). Indicaii: diagnoscul diferenial al diatezelor hemoragice; monitorizarea terapiei cu heparin; monitorizarea terapiei de substuie n hemofiliile A i B; trierea preoperatorie a coagulopailor.
92 Valori de referin: 28-40 s
Valori crescute: lipsa unor factori de coagulare, coagulopae prin consum, terapie cu heparin sau hirudin, prezena ancoagulanilor lupici, hemofiliile A i B. Valori sczute: hipercoagulabilitate. Tabelul nr. 20.I. Cauze posibilie ale modificrii rezultatelor testelor uzuale de coagulare Rezultatul testului Alungire izolat TP Alungirea izolat a APTT Alungire TT Alungire TP i APTT Alungire APTT i TT Alungire TP, APTT i TT Cauze frecvente nceputul terapiei cumarinice, lipsa factorului VII, Ancoagulani lupici, terapie cu heparin fracionat, lips congenital factori de coagulare Hipofibrinogenemie, contaminare cu heparin Hipovitaminoz K, lipsa congenital de factori II, V sau X, coagulopae dobndit Terapie cu heparin convenional Snge heparinat, coagulopae prin consum, hepatopae
TP: mp de protrombin, APTT: mp de protromboplasn acvat, TT: mp de trombin
9.5.2. Diferenierea proconvernei i a factorului X: mpul Stypven. Principiu: veninul de viper Russell are o tromboplasn parial (Stypven), care coaguleaz plasma n absena factorului VII, dar solicit prezena factorilor V, X i PF3. Valori normale: se compar cu cele obinute la plasma normal. Valori alungite: deficien de factor X, trombocitopenii, trombocitopai. Valori scurtate: trombocitoze, hiperlipidemii. 9.6. EXPLORAREA FAZEI A IIA A COAGULRII PLASMATICE 9.6.1 Dozarea fibrinogenului Rol: factorul I al coagulrii. Principiu: n prezena clorurii de Ca, fibrinogenul plasmac se transform n fibrin cu ajutorul unei soluii de trombin n exces Indicaii: Lipsa fibrinogenului n diateze hemoragice, Disfibrinogenemie (hipercoagulabilitate), Coagulopae prin consum, hiperfibrinoliz, Monitorizarea terapiei fibrinolice, Monitorizarea terapiei cu asparaginaz. Valori de referin: 1,5 -3,5 g/L Valori crescute: reactant de faz acut, inflamaii, infecii, arsuri, tumori, stri postoperatorii, hipertonie, uremie, hemoragii; Valori sczute: sintez sczut:
93
Dobndite: afectarea funciei sintece a ficatului, intoxicaii, tratament cu asparaginaz, nou-nscui (fiziologic); Congenitale: dis-, hipo- sau afibrinogenemii (foarte rar). Ulizare crescut: coagulopae prin consum, tratament fibrinolic, hemoragii grave, terapie cu aspraginaz. 9.6.2. Timpul de trombin (TT) Rol: indic mpul necesar transformrii fibrinogenului n fibrin sub aciunea trombinei. Evideniaz afeciunile fazei de polimerizare a fibrinei (formarea produilor de degradare ai fibrinei) i strile caracterizate de creterea acvitii antrombinei III (tratament cu heparin). Indicaii: Afeciuni de polimerizare a fibrinei, Lipsa fibrinogenului, disfibrinogenemiile, Hiperfibrinoliz, Monitorizarea terapiilor cu urokinaz, streptokinaz. Principiu: se adaug trombin la o prob de plasm; asel se poate explora direct fibrinoformarea, primele 2 faze ale coagulrii fiind suprimate. Se determin mpul de coagulare al unei plasme normale n comparaie cu cel provenit de la bolnav. Valori de referin: 14-27 s. Valori crescute (diferene mai mari de 5 ntre martor i plasma de cercetat): hipo- sau afibrinogenemii secundare (de consum) sau congenitale, ancoagulani circulani, tratament cu heparin, afeciuni ale polimerizrii fibrinei. 9.6.3. Cercetarea factorului de stabilizare a fibrinei (FXIII, FSF) Principiu: plasma oxalatat sau citratat este coagulat prin recalcificare, iar cheagul format se trateaz cu o solue de uree 5 mol (sau de acid monocloracec 10 g/L) n care fibrina normal este insolubil, dar fibrina nestabilizat (din cauza scderii sai lipsei FSF) se solubilizeaz. Cu ajutorul metodelor RIA si ELISA, cantatea FSF n plasm poate fi determinat cu mare precizie si exactate. Rezultate: spre deosebire de fibrina stabilizat, cheagul format n lipsa FSF se redizolv complet n 2 - 3 ore n soluiia de uree 5 mol/L i n cca. 15 min. n soluia de acid monocloracec 10 g/L. 9.7. EXPLORAREA FIBRINOLIZEI 9.7.1. Coagularea sngelui integral la 37C i liza cheagului 1. Snge incoagulabil: coagulopae prin consum hiperacut, 2. Coagulare cu liz ulterioar: liza apare la mai puin de o or = sindrom acut; liz parial: sindrom cronic sau latent, 3. Sngele coaguleaz rapid (2 - 4 min): semn caracterisc pentru faza iniial a coagulrii intravasculare diseminate (CIVD).
94 9.7.2. Proba cu trombin
Dac la sngele necoagulabil se adaug cteva picturi de trombin dizolvat i tot nu se coaguleaz, exist dou posibiliti:
Scderea pronunat sau chiar dispariia fibrinogenului n urma unui consum rapid (CID i/sau fibrinoliz),
Prezena unui ancoagulant circulant de pul antrombinelor (de obicei heparina n doze excesive). Aceast deficien se corecteaz printr-un adaos de sulfat de protamin. 9.7.3. Cercetarea produilor de degradare a fibrinogenului (fdp) i a fibrinei (FDP) 9.7.4. Din plasm: Principiu: Plasmina scindeaz att fibrinogenul, ct i fibrina, rezultnd produi de degradare a fibrinogenului (fdp) i a fibrinei (FDP i D-dimeri), care sunt evideniai cu ancorpi monoclonali. Indicaii: Produi de degradare ai fibrinogenului:
Diagnoscul diferenial al coagulrii intravasculare i a hiperfibrinolizei, Hiperfibrinoliz;

Produi de degradare ai fibrinei (D-dimeri):
Coagulare intravascular cu hiperfibrinoliz secundar Embolie pulmonar i tromboze venoaase profunde; Coagulopai prin consum (CID);
Valori de referin (D-dimeri): < 0,5 mg/L; Valori crescute: fibrinoliz intravascular, CID cu fibrinoliz, terapie fibrinolic, tumori, ciroz hepac, tromboze, etc. Produii de degradare a fibrinei (FDP) spre deosebire de fdp, n urma aciunii FSF conn i dimeri ai fragmentelor D (dimeri-D), decelabili n plasm i urin cu ajutorul metodelor RIA sau ELISA. 9.7.5. Din urin: testul fotometric Principiu: fdp, avnd dimensiuni moleculare mici, trec uor prin filtrul glomerular i se elimin prin urin. n urina adunat de 2 - 3 ore, se calculeaz valoarea diurezei pe minut (0,8 - 1,2 ml/min). Proteinele eventual prezente n urin se precipit cu acid tricloracec concentrat la rece, iar din supernatant se determin cantatea fdp cu ajutorul metodei Folin-Lowry. Valori normale: 6 - 12 ng/min. Valori crescute: hiperfibrinoliz (secundar, primar). 9.7.6. Timpul de replaz Replaza este enzima proteolic din veninul de viper brazilian (Bothrops jarararca), care pune n libertate din fibrinogen fibrinopepdul-A i monomeri de fibrin. Spre deosebire de trombin, replaza nu este infuenat de heparin. Se urmrete mpul de coagulare a plasmei n prezena replazei. Valori normale: mp de coagulare = 20 - 30
95
Valori alungite: scderea canti fibrinogenului sub 1 g/L, polimerizarea anormal a monomerilor de fibrin n prezena unor proteine patologice (plasmocitom) sau a unor polimeri arficiali (dextran, inulin),
disfibrinogenemii (cu anomalii structurale), CIVD cu hipofibrinogenemie uoar, n prezena fdp.

9.7.7. Terapia cu Heparin Terapie cu heparin convenional (nefracionat) Mecanism de aciune: complexul heparin-AT-III inhib n primul rnd Fa, dar i FXIIa, FXIa, FIXa. Monitorizarea terapiei se face prin APTT. Se preconizeaz o alungire a APTT de 1,5-3 ori peste valoarea normal. Terapie cu heparin cu greutate molecular mic Heparina cu greutate molecular mic se obine din heparina convenional prin depolimerizare controlat (metode enzimace). Greutatea molecular medie este cuprins ntre 4000- 6000 D. Mecanism de aciune: inhib FXa i FIIa. Monitorizarea nu este necesar, doar n anumite situaii parculare:
hemoragie neprevzut insuficien renal tratamentul trombozelor venoase profunde (pentru prevenirea administrrii de doze insuficiente)
Testul de laborator: testul de inhibiie a factorului X. 9.8. CERCETAREA ANTICOAGULANILOR CIRCULANI FACTORILOR INHIBITORI AI COAGULRII Inhibitorii fiziologici: antrombinele, inhibitorii protromboplasci, tromboplasci i anplasmina, proteina C (PC) i proteina S (PS). Inhibitorii patologici: apar numai n condiii patologice i blocheaz specific acvitatea unui anumit factor, ca ancoagulantul lupic, ancorpii inhibitori ai globulinei anhemofilice (FVIII) etc. 9.8.1. Dozarea proteinei C (PC) Funcia: inhib factorii V i VIII, avndu-l ca cofactor pe proteina S (PS). Favorizeaz fibrinoliza prin neutralizarea inhibitoruli acvatorului plasminogenului-1 (PAI-1). Indicaii:
depistarea strilor de hipercoagulabilitate CID afeciuni hepace grave monitorizarea terapiei cu antagoni ai vitaminei K purpura fulminant a nou-nscuilor
Valori de referin:
concentraia PC: 2-6 mg/L acvitatea PC: 70-100%
96 Valori sczute:
deficien congenital a PC deficien dobndit a PC: afeciuni hepace, CID, deficien de vitamin K
9.8.2. Dozarea Proteinei S (PS) Funcie: cofactor al PC acvate, dependent de vitamina K Indicaii:
depistarea strilor de hipercoagulabilitate afeciuni hepace grave

Valori de referin:
concentraia PS: 17-35 mg/L acvitatea PS (fraciunea liber): 70-150% acvitatea PS (total): 70-140%
Valori sczute:
deficien congenital a PS: sintez sczut sau sintezarea unei proteine deficiente funcional; deficien dobndit: hipovitaminoz K, afeciuni ale parenchimului hepac;
9.9. COAGULOPATIE DOBNDIT: COAGULOPATIA INTRAVASCULAR DISEMINAT CID CID-ul apare ca o consecin al unei stri de acvare a sistemului de coagulare. Exist un numr important de stri patologice care pot declana aceast stare de acvare: boli ginecologice: embolie aminoc, sindrom de ft mort, tumori maligne, traumasme exnse, mucturi de arpe, etc. Starea de acvare a sistemului coagulrii este ntreinut de elibarea de factor sular i a diferitelor citokine din monocite i esuturi subendoteliale. Ca i consecin apare tromboz diseminat, cu tromboembolism diseminat i necroze sulare.Se consm factorii de coagulare cu apariia hemoragiilor. Diagnoscul de laborator n CID - se bazeaz pe urmtorul panel de teste:
mpul de protrombin APTT mpul de trombin testul monomerilor de fibrin evidenierea produilor de degradare ai fibrinogenului/ fibrinei numrtoarea plachetelor sangvine eventual frou periferic cu evidenierea fragmentocitelor din sngele periferic i dozarea antrombinei.
9.10. CAZURI CLINICE 9.10.1. Coagulopae intravascular diseminat (CID) Bolnav de sex masculin, n vrst de 76 ani, primete terapie anbioc pentru sepsis, cu plecare din tractul urinar. La ulma vizit medicul curant observ peteii dispuse simetric la nivelul membrelor i pe
97
corp, iar abdomemul prezint sensibilitate difuz la palpare. Se recolteaz de urgen snge pentru analize de laborator. Determinri de laborator:
Trombocite: 124 x103 /l Frou periferic: anemie hemolic Bilirubin indirect: 8,3 mg/dl (crescut) LDH: 97 U/L Parametri acido-bazici: acidoz metabolic - pH: 7,26 - HCO3-: 19 mmol/L - BE: -4,5 mmoli/L
Timp protrombin: 16 sec APTT: 54 sec Fibrinogen: 0,64 g/L (V.N: 1,5 3,5 g/L) D-dimeri: 4,3 mg/L (V.N: < 0,5 mg/L)
Interpretare: Pe baza acestor rezultate se transfer bolnavul pe secia ATI i se instuie de urgen tratamentul de specialitate pentru reechilibrare hidroelectrolic, terapia acidozei metabolice i a coagulopaei intravasculare diseminate. 9.10.2. Trombofilie Femeie n vrst de 70 ani se prezint la camera de gard neurologie pentru hemiparez instalat brusc. Determinri de laborator:
Hemoleucogram:
- WBC: 5 x103 /l - Plachete: 215 x103 /l
Frou periferic: normocite normocrome Timp de sngerare: 4 min Timpul de protrombin: 9,4 sec APTT: 28 sec Timpul de trombin: 2,3 g/L Fibrinogen: 7,5 g/L (crescut) D-dimeri: 2,58 mg/L (V.N: < 0,5 mg/L) Antrombin III: sczut Plasminogen: normal
Interpretarea cazului: tomografia computerizat a evideniat prezena unui tromb pe artera cerebral medie. Este un caz de trombofilie.
98 9.10.3. Coagulopae asociat afeciunilor hepace
Bolnav cu ciroz hepac n antecedente, se prezint la ambulatoriul de specialitate pentru apariia unor peteii dispuse simetric la nivelul membrelor i a corpului. Se efectueaz urmtoarele determinri de laborator:
Hemoleucogram - WBC: 5 x103 /l - Plachete: 137 x103 /l - He: 3,8 x106/l Frou periferic: anemie normocrom normocitar Timpul de protrombin: 12 sec APTT: 45 sec Fibrinogen: 0,97 g/L (sczut)
Interpretare: bolnavul prezint coagulopae asociat bolii hepace. 9.10.4. Hemofilia A Copil de 4 ani se prezint la serviciul de pediatrie pentru hematoame aprute dup traumasme minore, la nivelul pielii i al musculaturii. Recent a aprut o tumefiere dureroas a arculaiei genunchiului. Determinri de laborator:
Hemoleucogram:
- WBC:7 x103 /l - Plachete: 278 x103 /l - He: 4,7 x106 /l L
Frou periferic: normocite normocrome Timp de sngerare: 8,5 min Timpul de protrombin: 11,2 sec APTT : 31,4 sec dozarea factor VIII: 6% din valoarea normal
Interpretare: copilul sufer de hemofilie de p A (deficitul factorului VIII al coagulrii), forma uoar 9.10.5. Terapie ancoagulant oral Bolnav n vrst de 68 ani, cu nlocuire de valv mitral n antecedente, se prezint la ambulatoriul de specialitate pentru controlul ancoagulrii. Determinri de laborator:
Timp de protrombin: 27,3 sec INR: 2,6 APTT: 50,2sec

Interpterare: INR-ul este alungit corespunztor, nu este necesar modificarea dozei de ancoagulant.
EXPLORAREA DE LABORATOR A HEMOSTAZEI LA SFRITUL ACESTUI CAPITOL VEI PUTEA S:
99
cunoatei indicaiile efecturii, nsemntatea clinic i interpretarea rezultatelor unor teste de

coagulare (mpul de sngerare, testul Rumpell-Leede, mpul Quick, APTT, mpul de trombin, evidenierea produilor de degradare ai fibrinei i fibrinogenului).
punei diagnoscul prezumv de afeciune vasculo-plachetar, afectarea factorilor cii intrinseci,

extrinseci sau comune ale coagulrii
cunotei panelul de teste ulizat n vederea diagnoscului CID
100
Capitolul 10 EXAMENUL COMPLET DE URIN

Compoziia intern a organismului trebuie s ramn constant, n acest scop este necesar excreia connu a apei i electroliilor n exces i a produilor de catabolism. Dei contribuie n acest scop i alte organe (pielea i intesnul) rinichiul este organul care menine compoziia constant a organismului. 10.1. EXAMENUL FIZICOCHIMIC AL URINII 1. Culoarea normal a urinii este de la galben pai la maroniu inchis. n unele cazuri patologice culoarea urinii poate fi modificat: hemoglobinurie-ca zeama de carne hematurie masiv-sanguinolent bilirubinurie-brun ca berea cu spum galben abundent melanurie i alcaptonurie-neagr Unele medicamente modific culoarea normal a urinii:albastrul de melen coloreaz urina n verdealbastru iar analgicele, anpirecele i aninflamatoarele n rou-portocaliu. 2. Transparena normal este transparent. n cursul depozitrii urinii se pot sedimenta diferite elemente care dau un aspect tulbure urinii: filamente de mucus, fosfai amorfi i n unele cazuri carbonaii(n special n urina alcalin). Aspectul tulbure al urinii poate s apar i n cazul bacteriuriei sau existenei fluidului prostac n urin. n urina acid pot sa apar depuneri de urai amorfi sub forma unui nor alb sau roz. Alte cauze ale aspectului tulbure al urinii sunt prezena leucocitelor sau hemailor. 3. Mirosul - urina normal are un miros slab aromac datorit prezenei unor acizi volali. Prin descompunerea ureeii de ctre bacterii urina capt un miros amoniacal. Mirosul de aceton al urinii apare n cetoacidoz iar n cazul unei infecii microbiene urina are un miros neplcut de hidrogen sulfurat. 4. pH-ul - meninerea constant a pH-ului organismului se face de catre plmni i rinichi. Rinichiul elimin n general excesul de acizi din organism asel nct pH-ul normal al urinii este de 5-7. Acidifierea urinii se face n tubii contori distali prin eliminarea ionilor de H+la schimb cu Na+. Dei rolul rinichiului n meninerea pH-ului este unul foarte important msurarea pH-ului urinii se face i din alte considerente: reacia alcalin a urinii indic de obicei prezena bacteriilor i leucocitelor. n urina puternic alcalin elemnetele celulare se lizeaz asel nct analizarea sedimentului urinar trebuie facut ct mai repede. Un pH acid al urinii apare n diferite boli metabolice-coma cetoacidoc dar numai daca funcionarea rinichilor este normal. Msurarea pH-ului se poate face cu pH-metrul, hre indicatoare sau cu stripuri.n cazul folosirii stripurilor pe zona indicatoare exist 3 substane-albastru de brom-mol, fenolaleina i rosumel. n limita de pH de la 5 la 9 se poate obine o culoare care variaz de la portocaliu-galben-verde pn la albastru. 5. Densitatea urinar - se determin pentru a aprecia starea epiteliului renal i starea de hidratare a pacientului. Dac epiteliul renal nu funcioneaz normal rinichiul ii pierde capacitatea de concentrare a
EXAMENUL COMPLET DE URIN
101
urinii. Densitatea normala a urinii (normostenurie ) este de 1,015-1,025 g/cm3. n condiii normale densitatea variaz invers proporional cu canatea de urin i direct proporional cu cantatea de substane coninut. Msurarea densitii urinare se face cu urodensitometrul n mod direct sau cu ajutorul stripurilor. Principiu: se determin concentraia ionic a urinii pe baza eliberrii protonilor n prezena caonilor cu care formeaz un complex. Reacia produce schimbarea culorii indicatorului albastru de brom mol de la albastru la galben.Constuenii neionici ai urinii ca ureea si glucoza nu sunt determinate prin acest test de aceea o cretere a densitii urinare datorit eliminrii unei canti crescute de glucoz nu este detectat. Prezena proteinelor n urin duce la valori fals crescute ca i n cazul urinii cetoacidoce. Patologic exist urmatoarele situaii: Hiperstenuria - densitate mai mare de 1,025-n diabet,proteinurie,aport lichidian sczut,transpiraii abundente, stri febrile. Hipostenuria - scderea densitii sub 1,015-diabet insipid,aport lichidian crescut. Izostenuria - densitatea urinilor emise n 24 h este egal i n jur de 1,002 (densitatea ultrafiltratului glomerular). Apare n caz de insuficien renal grav i arat incapacitatea rinichiului de a concentra urina. n prezent examenul biochimic al urinii se face cu ajutorul strip-urilor (bandelete reacve). Banda de test conine mai multe zone disncte fiecare dintre ele specifice parametrului de testat formate fiecare din 4 straturi: o folie protectoare de nylon, o hre impregnata cu reacvul corespunztor, o hre de filtru absorbant i un suport de plasc. La imersarea stripului n urin apar modificari ale coloraiei n fiecare zona, aceste modificri fiind comparate cu o scara etalon livrat odata cu testul prin comparare direct sau cu ajutorul analizoarelor automate. Folie protectoare de nylon Hre impregnat cu reacv Hre absorbant Suport de plasc Figura 10.1. Schema structural pentru bandeletele cu reacvi solizi ulizai pentru examenul de urin 1. Glucoza n urin apare n momentul n care este depait pragul renal al glucozei (170-180 mg/dl). Alturi de glucoz mai pot fi eliminate i alte zaharuri-pentoz,galactoz,fructoz. La analiza urinii cu ajutorul stripurilor se idenfic numai glucoza eliminat cu ajutorul reaciei specifice cu glucoxidazperoxidaz. Apa oxigenat rezultat din reacie este descompus n ap i oxigen atomic care oxideaz tetramelbenzidina la un derivat verde-albastru. Glicozuria apare cnd crete concentraia glucozei plasmace peste capacitatea de absorbie tubular,scade capacitatea de absorbie tubular(sarcina) sau n defecte de transport tubular al glucozei. 2. Corpii cetonici apar n urin n momentul n care sursa principal de energie a organismului sunt acizii grasi i nu glucoza,exist 2 situai majore n care are loc acest proces-DZ i inaniia.Idenficarea corpilor cetonici n urin se face cu nitroprusiatul de Na prezena corpilor cetonici determin virarea culorii indicatorului n violet, intensitatea culorii fiind direct proporionala cu nivelul corpilor cetonici din prob.
102 alimentar dezechilibrat.
Corpii cetonici mai apar n urin n cazul vrsturilor abundente, efortului muscular intens sau regimului 3. Proteinele - n urina definiv se elimin n mod fiziologic 0,03-0,20 g proteine/24h care nu sunt puse n evidena cu ajutorul metodelor uzuale.Proteinuria poate avea cauza prerenal cnd crete rata filtrarii glomerulare,renal i postrenal. n proteinuria renal se elimina 300mg-20 g/24h - eliminarea se poate face selecv cnd se elimin proteine cu GM mic, semiselecv cnd apar i IgA i M sau neselecv cnd apar toate fraciunile serice inclusiv cele cu GM mare. n cazul proteinuriei postrenale se elimin 1-2 g/24h n special proteine tubulare cu GM mic de pul beta 2 microglobulina. n cazul stripurilor idenficarea proteinelor se face pe baza erorii proteice a indicatorilor de pH zona de test fiind impregnat cu un tampon i un indicator de culoare care vireaz de la galben la verde n prezena proteinelor, proporional cu cantatea de proteine din prob. Proteinuria Bence-Jones - n urin apar lanuri uoare de imunoglobuline. La nclzirea urinii la 70C apare un precipitat iar la nclzirea la 100C acesta dispare.Apariia proteinelor Bence-Jones n urin este specific mielomului mulplu. 4. Urobilinogenul n mod normal doar o mic parte de UBG ajunge n urin restul fiind excretat prin fecale dar n condiiile n care crete degradarea hemului apar n urin canti crescute de urobilinogen. Idenficarea UBG n urin se face cu reacia Ehrlich-fluoroboratul de p-metoxibenezendiazoniu formeaz un compus rou n prezena UBG n mediu acid. UBG crete n suprancrcarea funciei hepace-anemii hemolice,anemie pernicioas,intoxicaii ,infecii acute,accidente transfuzionale sau n alterarea capacitii funcionale hepace-hepate acute i cronice,ciroza hepac,tumori hepace. 5. Bilirubina - n mod normal bilirubina nu este excretat n urin dar dac apare este ntotdeauna vorba de bilirubin conjugat(direct) deorece aceasta prin cojugarea cu acid glucuronic devine hidrosolubil.Idenficarea Bi n urina se face cu o sare de diazoniu (2,6-diclorobenzendiazoniu fluoroborat) care n mediu acid determin virarea culorii indicatoare n violet. Bi conjugat crete n obstrucia ductului biliar de ctre calculi, tumori, spasm sau stricturi, presiune canalicular extrahepac, fibroza hepac. 6. Acidul ascorbic dei nu este un constuent normal al urinii iar prezena lui nu are importan patologic acidul ascorbic interfer cu reaciile de determinare ale glucozei i hemailor fiind un puternic agent reductor. Acidul ascorbic apare n urina persoanelor care consuma canti mari de vitamina C i n unele cazuri poate arta o predispoziie pentru formarea calculilor. 7. Nitriii - Dac n urina recoltat exist bacterii acestea vor transforma nitraii din urina n nitrii care pot fi pusi n eviden cu sare de diazoniu care n prezena nitrailor n mediu acid formeaz un derivat azo de culoare roie.Intensitatea culorii este proporional cu cantatea de nitrii din prob dar nu indic severitatea infeciei pentru c nu toate bacteriile formeaz nitrai iar n cazurile n care exist o poliurie nitraii sunt diluai. 8. Leucocitele - Prezena leucocitelor n urin este pus n eviden cu ajutorul esterazei leucocitare care cliveaz esterul indolic aflat pe zona de test i mpreun cu un derivat diazo formeaz un compus violet. Lecocituria este un indicator al proceselor inflamatorii renale i ale tractului urinar-bacteriene, virale, parazitoze,levuri. Lecocitele mai pot s apar n urin datorit unei contaminari cu secreii genitale sau n cazul unor leucociturii abacteriene ca simptom unic al pielonefritelor cronice.
103
9. Hemaile - Testul se bazeaz pe acitvitatea de p peroxidazic a hemoglobinei i mioglobinei care catalizeaz oxidarea substanei indicatoare (3,3,5,5 tetramelbenzidina) de ctre un hidroperoxid organic la un compus colorat n verde-albastru. Testul este poziv cnd exist hemai n urin dar i dac exist hemoglobin liber diferenierea se poate face pe baza sedimentului urinar dar avnd n vedere ca n urina cu densitate scazut sau n cazul depozitrii mai ndelungate hemaile se lizeaz examenul de urin trebuie efectuat pe urina proaspt emis. Hemoglobinuria este prezent cnd exist hemoliz intravascular, n diferite boli hematologice, boli infecioase grave, hemoglobinuria paroxisc nocturn, intoxicaii. Hematuria apare cnd exist leziuni ale rinichilor sau cilor urinare,calculi,n infecii ale cilor urinare sau rinichilor sau alte patologii renale cnd pe lnga hematurie exist i proteinurie i cilindrii n sedimentul urinar.Mioglobinuria este rar pus n eviden i apare n distrucii musculare masive. 10.2. SEDIMENTUL URINAR 10.2.1. Efectuarea sedimentului Se centrifugheaz 10 ml de urin n eprubet la 2500 rpm 10 minute, se arunc 9,5 ml de supernatant, se aeaz 20 din ultracentrifugat pe o lam, se acoper cu o lamel i se citete la microscopul opc cu obiecvul 20x i 40x. Centrifugarea nu se face la o vitez mai mare de 3000 rpm pentru a evita distrugerea elementelor celulare. Se depune pe o lam o pictur din sedimentul resuspundat Se pune lamela pe pictur i se apas uor
Figura 10.2. Pregrea preparatului nav lam - lamel pentru analiza sedimentului urinar Sedimetul urinar poate fi: organizat: conine celule epiteliale, sangvine, cilindri, microbi, parazii, levuri neorganizat: sruri n stare amorf sau cristalin de origine metabolic, oganic sau anorganic 10.2.2. Sedimetul organizat 1. Leucocitele majoritatea sunt reprezentate de garnulocite neutrofile dar pot s apar i monocite, eozinofile, macrofage. n mod normal exist <5 leucocite/cmp. Sunt prezente n numr crescut n infecii ale tractului urinar, infecii renale, contaminare cu secreie genital. 2. Hemaile - apar ca nite discuri biconcave cu diametrul de 6-7 (isomorfe) sau de mrimi diferite i cu diametru mai mic (dismorfe). Normal sunt prezente <3 hemai/cmp. 3. Celule epiteliale scuamoase - mari, plate provin din segmentele inferioare ale cilor urinare i nu au importana patologic dac nu sunt foarte frecvente
104
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR celule epiteliale tranziionale-fusiforme sau rotunde provin din cile urinare pn la nivelul proximal al uretrei celule epiteliale renale tubulare-cubice sau cilindrice apar n sediment n leziuni tubulare renale a b c
Figura 10.3. a. Mas de leucocite neutrofile n care se observ dou (leucocite) celule Sternheimer-Malbin avnd citoplasma atomizat, marcate prin sgei (1), alturi de un monocit (2). MO x 640 b. Frecvente hemai eumorfe care apar mai ngroate spre periferie i mai subiri spre mijloc (dnd un aspect de dublu contur) (1) alturi de hemai n castan (2). MCF x 640 (coloraie Sternheimer - Malbin) c. Frecvente celule scuamoase (epiteliale plate sau pavimentoase). MCF x 400
Imagini publicate cu acordul chim. Gju Sorin
4. Cilindrii - sunt formaiuni bine conturate cu capetele rotunjite sau rupte care se formeaz n tubul contort distal i colector din proteinele care trec prin membrana bazal glomerular, se coaguleaz i se muleaz pe forma tubilor. Pot fi: hialini-sunt formai numai din proteine,puternic refringeni,nu au importan patologic dac sunt <2/cmp granuloi-au suprafaa acoperit de granulaii de diferite mrimi i sunt condiderai forma de degradare a cilindrilor celulari ceroi-au aspect de cear topit datorit stagnrii ndelungate n tubi,au ntotdeauna importan patologic i arat o afectare tubular de natur cronic celulari-pot fi formai din leucocite,hemai,levuri,bacterii arat o scadere a perfuziei renale i indic o afectare tubular acut 5. Levurile - importan patologic deosebit are Candida albicans care apare sub form oval sau rodund, incolor; pot fi confundate cu hemaile dar nu au dublu contur. 6. Parazii - mai frecvent Trichomonas vaginalis, Enterobius vermicularis, Scistosoma haematobium. 7. Bacteriile - n mod normal pot s apar cteva bacterii datorit contaminrii dar n cazul unei infecii urinare bacteriile apar n numr mare sub forma de coci sau bacili, mobile. n sedimentul urinar organizat pot s mai apar filamente de mucus, spermatozoizi i celule tumorale
EXAMENUL COMPLET DE URIN a cror idenficare se face cu coloraii specifice - MGG sau Papanicolau. 10.2.3. Sedimetul neorganizat Urina este un mediu complex care influeneaz procesul de cristalizare i n care aceeai substan poate cristaliza sub diferite forme. Acidul uric - sunt cristalele cele mai frecvente n urina i pot exista sub diferite forme - lmie, butoia -i au culoare galben-brun. Oxalatul de calciu - poate fi monohidrat cnd apar ca o buturug de copac sau dia
105 b
Figura 10.4. a. Cilindri granuloi cu granulaii fine i grosiere. MCF x 640; b. Cilindru ciros lung cu capt ptrat (1) alturi de un cilindru eritrocitar (2) ntr-o mas de eritrocite. MO x 640; Imagini publicate cu acordul chim. Gju Sorin
hidrat cnd au form de plic de scrisoare.Apar n numr mare sub forma de monohidrat n intoxicaii cu elenglicol i n cazuri de hipercalcemie cnd apariia lor poate indica un risc de nefrocalcinoz. Fosfatul amoniaco-magnezian - cristale birefringente n form de capac de sicriu apar n urina depozitat necorespunztor sau n urina de diminea cnd se asociaz cu infecii urinare. Cristale patologice: rozina-ace fine,glbui sub forma de snopi leucina-cristale sferice galben brune apar n boli hepace grave cisna-tablete hexagonale incolore suprapuse apar n tulburrile metabolismului prodic.
Figura 10.5. a. Microcristale de acid uric de form ovoidal (1) i neregulat ovoidal. MO x 640 b. Un macrocristal de oxalat de calciu dihidrat pe care s-au suprapus grupuri de microcristale de oxalat de calciu monohidrat. MO x 640 c.Macrocristale de fosfat amoniaco-magnezian n form de capac de sicriu. MO x 400;
Imagini publicate cu acordul chim. Gju Sorin
106 10.3. DETERMINRI CANTITATIVE
Acidul 5-hidroxi-indolacec - metabolit al serotoninei, se poate determina calitav prin fierbere cu reacvul Ehrlich sau fotometric. Normal are valoare <100mEq/L iar valorile lui sunt crescute n tumori APUD sau carcinoid intesnal sau dac persoana consum alimente bogate n serotonina (banane, ananas). Acidul vanilmandelic - metabolit al catecolaminelor se determin prin cromatografie i are valori <9 mg/24 h. Valori crescute apar n feocromocitom, neuroblastom sau n consumul de aninflamatoare sau alimente bogate in vanilie, cafea n zilele premergtoare testului. Aldosteronul se determin prin ELISA sau RIA i are valori normale de 97-222mM/24h. Valori crescute apar n boala Conn iar valori scazute n boala Addison. FSH i LH - se determin prin chemiluminiscen i sunt ulizai pentru a stabili dac o disfuncie gonadic este primar sau secundar unei smulri insuficiente hipofizare. Valori normale: FSH:brbai 4-25 UI/ml,femei 4-30UI/ml LH:brbai 7-24 UI/ml,femei 6-30 UI/ml 17-cetosteroizi se determin prin chemiluminiscen i are valori normale de 7-49 M/24h la femei i 24-69 M/24h la brbai.Valori crescute apar n boala Cushing, tumori corcosuprarenale, pubertate precoce, tumor intersial tescular, ovarian, sindrom adrenogenital iar valori sczute n hipofuncie hipofizar, boala Addison, hipogonadism, hiporeoz, mixedem, stri careniale, hipoplazia lipidic a corcosuprarenalelor. 17 hidroxisteroizi se determin prin chemiluminiscen cu valori normale de 5-12 mg/24h la femei i 7-14 mg/24h la brbai i are valori crescute n tumori suprarenale i valori sczute n boala Simmonds,mixedem, reotoxicoz. Estrogenii se pot determina prin chemiluminiscen i au valori normale de 4 - 60 g/zi. Valori crescute apar n tumori ovariene i ale corcosuprarenalei, graviditate iar valori sczute n disfuncii ovariene, agenezie ovarian, menopauz, amenoree. Pregandiolul - se determin prin chemiluminiscen i are valori normale n faza proliferav 0,5 - 1,5 mg/zi, n faza luteal 2-7 mg/zi (n ziua a 21-a a ciclului), n sarcin 5 - 63 mg /zi, n menopauz 0,2 - 1,5 mg/ zi. Valori crescute n corioepiteliom, sindrom Stein-Levental, hipergonadism corco-suprarenal iar valori sczute n amenoreee, disgravidii, ft mort, eclampsie. Alte determinri cantave prin spectrofotometrie se pot determina din urin acidul uric, ureea, creanina, glucoza, alfa-amilazele. IONOGRAMA URINARA prin fotometrie de emisie, flamfotometrie i ISE se pot determina din urin: Calciul - 100-250 mg/24h. Crete n hiperpararoidism, osetoliza, metastaze osoase, boala Paget i scade n sindrom nefroc i hipocalcemii. Clorul - 100-250 mEq/24h. Crete n carena de potasiu, tratament cu diurece i scade n stri careniale, pierderi gastrointesnale, transpiraii excesive. Magneziu - 6-10 mg/24h. Valori crescute n tratament diurec excesiv, medicamente nefrotoxice i sczute n IRA i IRC, pierderi intesnale crescute. Potasiu - 40-80 mg/24h. Valori crescute n sdr. Cushing, tratament corcosteroidic i diurec excesiv, acidoza metabolica i sczute n boala Addison, pierderi intesnale, IRA.
107
Sodiu -130-200 mEq/24h. Valori crescute n hipervolemii, sdr. de pierdere renal de sare i sczute n pierderi intesnale, carena de sare, IRA i IRC. 10.4. CAZURI CLINICE 10.4.1 Infecie de tract urinar inferior Femeie n vrst de 21 de ani, se prezint n Serviciul de Urgen prezentnd urmtoarele simptome i semne: disurie, polakiurie, durere suprapubian. Analizele de laborator au oferit urmtoarele rezultate: Examenul sumar de urin: Parametrul testat Acidul ascorbic Bilirubina Corpi cetonici Densitate Glucoza Hemai Leucocite Nitrii PH Proteine Urobilinogen
Rezultat negav negav negav 1030 normal negav 75 poziv 5 negav normal
Interval biologic de referin/Unitate de msur negav negav; mg/dl negav; mg/dl 1005-1030 negav; mg/dl 0-5/l 0-1/ l Negav 5-7 0-30 mg/dl normal; mg/dl
Sedimentul urinar: 15-20 leucocite/cmp microscopic, cmp plin cu bacterii. Urocultura: Escherichia coli > 100.000 UFC/ml urin. Comentarii: Infeciile urinare sunt mai frecvente la femei comparav cu brbaii. Cel mai frecvent germen implicat n infeciile urinare este Escherichia Coli (80-90% dintre infecii). Nitriii pozivi: enzimele produse de Escherichia coli precum i de alte bacterii implicate frecvent n infeciile urinare (Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, Proteus) reduc nitraii urinari la nitrii. Pentru ca aceast transformare s aib loc este necesar ca urina s rmn n vezica urinar minim 4 ore (perioad de incubare). Acesta este movul pentru care se recomand recoltarea primei urini de diminea. Reacia nitritului urinar are o specificitate foarte nalt (>90%) i un rezultat poziv este foarte ul n confirmarea diagnoscului de infece de tract urinar (ITU). Cu toate acestea ns, sensibilitatea nitritului urinar este redus (aproximav 50%), avnd mult mai puin ulitate ca examinare de screening (un rezultat negav nu exclude diagnoscul de ITU). Prezena n numr crescut a leucocitelor n urin indic de cele mai multe ori existena unei infecii de tract urinar (ITU). Cele mai frecvente puri de leucocite prezente n cazul acestor infecii sunt neutrofilele (acestea exist i la pacienii sntoi n numr redus - 0-1/L). Studiile efectuate n departamentul de urgen au artat o sensibilitate redus (48%) pentru esteraza leucocitar (atunci cnd acest test este folosit ca instrument de screening pentru piuria moderat 6-20 leucocite/cmp microscopic). Specificitatea pentru esteraza leucocitar este ns bun (80-90%).
108
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR n concluzie, un test poziv pentru nitritul urinar pe bandelet sau pentru esteraza leucocitar susine
diagnoscul de ITU, dar un test negav nu l exclude. 10.4.2. Pielonefrit acut Pacient n vrst de 70 ani se prezint n Servicul de Urgen prezentnd urmtoarele semne i simptome: febr, frisoane, durere n flancul stng i sensibilitate n unghiul costovertebral stng. Pacienta prezint n ulmele patru zile disurie i polakiurie (pentru care nu a primit tratament) i relateaz infecii urinare repetate n antecedente. Medicul solicit efectuarea urmtoarelor teste de laborator: examen sumar de urin, urocultur i anbiogram. Analizele de laborator au oferit urmtoarele rezultate: Sumarul de urin: proteine 50 mg/dl, hemai 30/l, leucocite 500/ l, nitrii pozivi, restul parametrilor n limite normale. Sedimentul urinar: 25-50 leucocite/cmp microscopic, 5-10 hemai/cmp, frecvente bacterii, cilindri leucocitari prezeni. Urocultura: Escherichia coli > 100.000 UFC/l urin. Comentarii: Prezena leucocitelor n urin i nitriii pozivi, alturi de simtomele pice sunt suficiente pentru a pune diagnoscul de pielonefrit. Hematuria i proteinuria nsoesc de obicei modificrile de mai sus. Cilindrii leucocitari apar n infeciile acute (pielonefrit acut) i cronice ale parenchimului renal (nu exist la pacienii sntoi). Cel mai frecvent agent patogen implicat n pielonefrit este Escherichia Coli (70-95% din cazuri). 10.4.3. Liaz renal Brbat n vrst de 35 de ani se prezint n Serviciul de Urgen acuznd: durere sever cu debut brutal i origine n flancul drept, cu iradiere anteroinferioar i ctre tesculul drept, vrsturi, anxietate. Examinrile de laborator au artat: Examenul sumar de urin: hemai 50/ L (restul parametrilor erau n limite normale) Sedimentul de urin: cmp plin cu hemai i cristale de oxalat de calciu. Comentarii: Calculii au o inciden de trei ori mai mare la brbaii cu vrste cuprinse ntre 30 i 50 de ani. Cea mai frecvent manifectare clinic n liaza renal este durerea colicav. n cazul pacienilor cu suspiciune de colic renal se recomand efectuarea unui examen sumar de urin pentru a idenfica hematuria. Descoperirea hematuriei susine diagnoscul de colic renal dar nu exist nici o corelaie ntre intensitatea hematuriei i gradul de obstrucie a tracului urinar. Prezena hemailor n urin se datoreaz lezrii tractului urinar de ctre calculii care se mobilizeaz. Examenul microscopic al sedimentului urinar confirm n acest caz hematuria, demonstrnd prezena hemailor n urin. Studiul naturii chimice a calcului este obligatoriu n diagnosc, tratament i pofilaxia recidivelor, unele puri de liaz avnd un determinism endocrin sau metabolic specific. Calculii cu sruri de calciu au o inciden global de aproximav 70%.
109
Capitolul 11 REACII IMUNE METODE DE IDENTIFICARE I DOZARE A COMPLEXELOR IMUNE

11.1. DEFINIII. INTERACIUNILE ANTICORPILOR CU ANTIGENELE Angenicitatea este proprietatea unei molecule de a interaciona specific cu produii finali ai rspunsului imun (ancorpi i/ sau receptori de suprafa ai celulelor). Imunogenicitatea este proprietatea unei molecule de a induce un rspuns imun mediat umoral sau celular. Substana care induce un rspuns imun specific este numit imunogen. Toate moleculele imunogene sunt i angene, dar reversul nu este adevrat. Anumite molecule mici, numite haptene, sunt angenice, dar sunt incapabile de a induce singure un rspuns imun specific, deci le lipsete imunogenicitatea. Celulele imune nu recunosc i nu interacioneaz cu ntreaga molecul a imunogenului. Limfocitele recunosc anumite situsuri ale macromoleculei, numite epitopi sau determinani antigenici . Epitopii sunt regiuni acve imunologic ale unui imunogen, care se leag de receptorii membranari angen-specific ai limfocitelor sau de ancorpii secretai. n accepiunea clasic, termenul de angen (Ag) desemneaz orice substan strin care, n urma ptrunderii sale n organism, este capabil s induc formarea de ancorpi (Ac) i s reacioneze specific cu acea. n accepiunea actual, prin angen se nelege orice substan exo- sau endogen capabil s declaneze un rspuns imun care, n mod obligatoriu, const n smularea i proliferarea celulelor angenspecifice, ct i n sinteza unor molecule de recunoatere a angenului (ancorpi sau receptori celulari) care au capacitatea de a se combina specific in vitro sau in vivo cu angenul inductor. Ancorpii (Ac) sunt glicoproteine/ imunoglobuline (Ig) capabile s interacioneze specific cu angenul a crui recunoatere de ctre sistemul imun a condus la sinteza acestora. Ancorpii secretai circul n snge, unde servesc ca efectori ai imunitii mediate umoral, cutnd i neutraliznd angenele sau marcndu-le n scopul eliminrii. Interaciunea angen-ancorp este o asociere bimolecular similar interaciunii dintre enzim i substrat, dar, spre deosebire de aceasta, nu conduce la modificarea chimic ireversibil nici a angenului, nici a ancorpului, ci la formarea complexului imun (figura 11.1.). Asocierea dintre ancorp i angen implic mulple interaciuni necovalente ntre determinantul angenic (epitop) i domeniul regiunii variabile a moleculei de ancorp: legturi de hidrogen, legturi ionice, interaciuni hidrofobe i fore van der Waals. 11.2. FORMAREA COMPLEXELOR IMUNE Interaciunile ancorpilor cu angenele sau cu haptenele pot fi clasificate ca primare sau secundare. Interaciunile primare implic recunoaterea specific i combinarea epitopului (determinantului an-
110
Angen
Ancorp
CH2OH
...
O C CH2 CH2
-
CH2CH2 NH3+
NH2
Legtur de hidrogen CH2 Legtur ionic
O O
CH2
C CH2
CH CH3 CH3
Interaciuni hidrofobe
CH

O
+
CH CH3 CH3CH CH3
CH2 CH
Fig.11.1. Interaciunea angen ancorp: fore implicate genic) cu paratopul (situsul de legare, situsul combinav) ancorpului corespunztor. Toate interaciunile Ag-Ac ncep cu o reacie primar, care are loc foarte rapid (n interval de ordinul milisecundelor) i este
+
Hapten (angen monovalent) Ancorp
Fig.11.2a. Interaciune primar / Ag monovalent - Ancorp
invizibil macroscopic. Interaciunile primare pot fi studiate cu ajutorul haptenelor, care, datorit caracterului lor univalent, nu permit desfurarea interaciunilor secundare. Reaciile secundare Ag-Ac au loc ca urmare a mulvalenei angenice i au ca rezultat aglunarea sau precipitarea unei reele polimerice Ag-Ac i formarea unui produs vizibil n decurs de cateva minute pn la cteva ore.
CH3
CH3CH CH2
Interaciuni van der Waals
O-
H3N CH3
Legtur ionic
REACII IMUNE METODE DE IDENTIFICARE I DOZARE A COMPLEXELOR IMUNE
111
+
Hapten Ancorp (angen polivalent) Fig. 11.2b. Interacune secundar / Ag polivalent - Ancorp
Att interaciunile Ag-Ac primare, ct i secundare, pot fi ulizate n scopuri analice. Metodele analice cantave se bazeaz n special pe interaciunea primar. Constanta de asociere care caracterizeaz legarea dintre un ancorp i o hapten se numete afinitate.
Ac + H AcH
Afinitatea = K =
[AcH] [Ac] [H]
Valorile pice pentru afinitate sunt foarte mari, variind ntre 105 M-1 i 1012 M-1. prin urmare, reversibilitatea legrii dintre Ac i hapten este posibil numai n condiii estreme: la valori mari sau mici ale pH, la fore ionice mari, n prezena ionilor chaotropici (ex. perclorat) sau a denaturanilor (uree, guanidin) care interfer cu formarea legturilor de hidrogen. Afinitatea ancorpilor monoclonali poate fi determinat cu acuratee, pe cnd afinitatea Ac policlonali este variabil, putnd fi ncadrat ntr-un interval. Pentru acea din urm, n calcule se folosete afinitatea medie. Afinitatea depinde de clasa imunoglobulinic. Astfel, legtura specific IgG-hapten este mai stabil i mai puternic dect legtura specific IgM-antigen (molecula IgG are afinitate mai mare dect molecula IgM). Afinitatea mai depinde i de ali factori, precum caracterul smulrii angenice. Asel, dac smularea se face cu un imunogen puternic i n doze mari, vor fi produi ancorpi cu afinitate mai slab. Dac smularea angenic se face cu doze mai reduse, apar Ac cu afinitate mare. Aviditatea reprezint energia de combinare specific a moleculei de imunoglobulimn cu epitopii angenului corespunztor. Aviditatea depinde de numrul de situsuri combinave per molecul imunoglobulinic, deci de valen. De aceea, moleculele IgM sunt mai avide, ele fiind pentavalente, comparav cu moleculele IgG, care sunt bivalente. Aplicaiile analice ale interaciunilor secundare Ag-Ac sunt reaciile de aglunare i de precipitare. a. Aglunarea apare atunci cnd un ancorp interacioneaz cu un angen mulvalent, insolubil, cu legarea ncruciat a parculelor angenice de ctre ancorp i formarea unor agregate mari, insolubile, vizibile macroscopic sau microscopic. Aglunarea nu are loc n cazul haptenelor. Dimensiunea agregatelor depinde de raportul concentraiilor de angen i ancorp. Aglunarea poate avea loc n dou situaii diferite:
112
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR cnd un angen unideterminat, mulvalent (care conine mai multe copii ale epitopului A) interacioneaz cu un singur p de ancorp (an-A) cnd un angen muldeterminat, univalent (cu epitopii A, B, C etc.) interacioneaz cu cel puin dou puri diferite de ancorpi (an-A + an-B etc.) b. Recia de precipitare se desfoar dup acelai principiu ca i reacia de aglunare, cu diferena c angenul este solubil. La un anumit raport ntre cantatea de Ag i cea de Ac, legarea angenului de ctre ancorp duce la formarea de complexe insolubile. Pentru o concentraie fix a ancorpului, cantatea de precipitat format depinde de cantatea de
angen (fig. 11.3.). La concentraii mici de angen, ancorpul este n exces i se comport univalent. n zona de echivalen, angenul i ancorpul sunt prezente n proporii aproximav egale i se formeaz o cantate maxim de precipitat. La concentraii mari de angen, acesta se comport univalent, excesul su nepermind formarea unei reele mari, insolubile de precipitat.
Dimensiunea complexelor imune (masa precipitatului)
Proporia Ag/Ac
Ag Ac
Figura 11.3. Fazele reacei angen ancorp in funcie de proporia dintre cei doi componeni Specificitatea remarcabil a interaciunilor angen-ancorp a dus la dezvoltarea unei mari varieti de teste imunologice, care pot fi folosite pentru detecia i cuanficarea fie a ancorpilor, fie a angenelor. Aceste teste joac un rol esenial n diagnoscul bolilor, monitorizarea rspunsului imun umoral i n idenficarea moleculelor de interes biologice i medical.

Angen Ancorp
113
+
1 Complex imun
2 2 2
Precipitare
Acvarea complementului
Fagocitoz
Reacii 3
Aglunare
Fig. 11.4. Consecinele formrii complexelor imune angen-ancorp
11.3. PRINCIPII GENERALE ALE TESTELOR ANTIGENANTICORP n orice test bazat pe o reacie angen-ancorp parcip dou elemente, dintre care unul este de referin (cunoscut), iar cellalt, necunoscut, urmeaz a fi msurat n urma interaciunii cu primul. Dac elementul de referin este angenul, atunci poate fi determinat prezena i/sau concentraia ancorpului corespunztor (elementul necunoscut) dintr-un produs biologic. Dac elementul de referin este ancorpul, poate fi idenficat i/sau cuanficat angenul corespunztor. n orice test Ag-Ac trebuie respectat proporia opm ntre cei doi reactani. n caz contrar, rezultate fals pozive pot aprea, de exemplu, n cazul excesului de angen care poate scdea eficiena legrii ancorpilor corespunztori din mediul de reacie. Ulizarea ancorpilor n exces poate duce la rezultate fals pozive, o cantate mare de ancorpi putnd lega n mod nespecific angenele din proba de analizat. Cirea corect a reaciei Ag-Ac se face n prezena obligatorie a martorilor pozivi i negavi. Dac martorii nu dau rezultate conform protocolului, testul nu este valabil. Interpretarea rezultatului unei reacii Ag-Ac depinde i de ali factori eseniali, precum: pul reaciei, natura angenului, puritatea angenului, specificitatea ancorpilor, calitatea recvilor auxiliari (eritrocite, latex etc.), concentraia i puritatea soluiilor de diluie i splare.
114 11.4. CLASIFICAREA TESTELOR IMUNE IN VITRO: I. Teste serologice (angen-ancorp) II. Teste pentru evaluarea cantav a leucocitelor III. Teste pentru evaluarea funciei fagocitare IV. Teste pentru evaluarea funciei limfocitare I. Teste serologice (angen-ancorp) a. Teste de precipitare Metoda dublei difuziuni (tehnica Ouchterlony) Contraimunelectroforeza Imunodifuzia radial Imunelectroforeza cantav Imunonefelometria Imunoelectroforeza Imunofixarea (immunoblong) Western blot b. Teste de aglunare Aglunarea bacterian
Aglunarea parculelor inerte acoperite cu angene sau ancorpi Hemaglunarea c. Teste bazate pe fixarea complementului (reacii lice) d. Reacii cu ancorpi marcai Imunofluorescena direct i indirect Tehnici imunoenzimace testul ELISA (enzime-linked immunosorbent assay) Tehnici radioimune testul RIA (radio immunoassay) II. Teste pentru evaluarea cantav a leucocitelor Citometria in flux III. Teste pentru evaluarea funciei fagocitare a. Numrtoarea neutrofilelor b. Evaluarea adeziunii fagocitelor c. Evaluarea chemotaxiei i migrrii d. Evaluarea capacitii de ingese a parculelor opsonizate e. Teste de degranulare f. Msurarea arderii oxidave (oxydave burst)
REACII IMUNE METODE DE IDENTIFICARE I DOZARE A COMPLEXELOR IMUNE g. Evaluarea capacitii de ucidere a microorganismelor (killing assays) IV. Teste pentru evaluarea funciei limfocitare a. Izolarea celulelor mononucleare b. Teste de smulare cu mitogene c. Raspunsul la smularea angenic d. Determinarea citokinelor i receptorilor pentru citokine n plasm i urin e. Teste de citotoxicitate imun 11.5. REACII DE PRECIPITARE N GEL
115
Reaciile de precipitare au la baz interaciunea ancorpilor cu angene solubile mulvalente. La un anumit raport ntre concentraiile Ag i Ac, se formeaz complexe imune Ag-Ac macromoleculare care i pierd solubilitatea i precipit. Reacia de precipitare poate avea loc n mediu semisolid, cum sunt gelurile de agaroz, care au proprietatea de a lsa soluiile apoase de Ag i Ac s difuzeze liber. Efectuarea acestor reacii n geluri ofer posibilitatea efecturii de teste calitave pentru detectarea prezenei anumitor Ac sau Ag n ser. 11.5.1. Dubla difuziune Metoda dublei imunodifuzii ulizeaz un gel cu dou godeuri dispuse la distan unul fa de cellalt. ntr-un godeu se pune o soluie de Ag, iar n cellalt, o soluie de Ac. Ambele soluii difuzeaz radiar din godeurile n care au fost amplasate i formeaz gradiente de concentraie, cea mai mare concentraie gsindu-se n imediata vecintate a godeului. Ag i Ac se ndreapt unul ctre cellalt, iar pe msur ce moleculele de Ag i Ac se ntlnesc, n gel se formeaz complexe imune Ag-Ac. La o anumit distan ntre cele dou godeuri, unde raportul ntre Ag i Ac este opm (zona de echivalen), se formeaz o reea tridimensional vizibil sub forma unei linii fine de precipitare (Fig. 11.5.). Ancorp Angen
Precipitat Fig. 11.5. Reprezentare schemac a unei reacii de dubl difuziune Dac sunt cunoscute vitezele de difuziune n gel ale mai multor antigene, ntr-un singur gel pot fi efectuate teste multiple, poziiile liniilor de precipitare indicnd care anticorpi sunt prezen n prob (Fig. 11.6.).
116 Lam acoperit cu film de agar a Ac Ag
b 1 2 3
Godeu cu ser
Linia de precipitare?
Ser cu Ac1, Ac2 i Ac3
Soluie cu Ac1, Ac2 i Ac3
Fig. 11.6. Reprezentare schemac a reaciei de dubl difuziune pentru: a. un singur ancorp; b. mulpli ancorpi (n acest caz angenele difuzeaz cu rate diferite 1>2>3) Metoda dublei difuzii poate fi ulizat i pentru testarea identii angenelor. Dac sunt ulizate mai multe godeuri n care sunt plasate angenele, modelul liniilor de precipitare care se formeaz ofer informaii despre diferenele dintre angenele ulizate. Figura 11.7. ilustreaz situaia n care ntr-un godeu a fost amplasat un amestec de ancorpi, iar acea, la contactul cu angenele din cele dou godeuri, genereaz linii de precipitare independente, care se intersecteaz net unele cu celelalte. Un asel de model demonstreaz identatea (figura 11.7a.) sau nonidentatea celor dou angene (figura 11.7b.). n figura 11.7c. este prezent o linie de precipitare similar modelului de identate, dar care prezint un pinten suplimentar. Acesta reflect faptul c cele dou angene au epitopi n comun, dar angenul 1 prezint i epitopi suplimentari, responsabili pentru reacia suplimentar a unor molecule de Ac. Metoda este n mod curent ulizat pentru evaluarea prezenei autoancorpilor an-fibr muscular neted, an-RNP, an-SSA (Sjogren syndrome A), an-SSB (Sjogren syndrome B), an-Scl70 etc. Acest test este simplu de realizat i poate fi pus n lucru chiar i cnd angenele sunt doar parial purificate. Testul este ul ca test de screening pentru prezena unui anumit Ag sau Ac (de exemplu PCR, diverse toxine bacteriene, etc). a Ag1 Ag2 Ag1 b Ag2 Ag1 c Ag2
Ser cu Ac1
Linia de precipitare
Ser cu Ac1 i Ac2
Ser cu Ac1
Fig.11.7. Testul de dubl difuziune pentru stabilirea identii angenului: a. Ag1 i Ag 2 idence; b. Ag1 i Ag2 diferite; c. Ag cu epitopi comuni, dar Ag1 are epitopi suplimentari
11.5.2. Imunodifuzia radial simpl (Mancini) Este un test cantav pentru angene. Acest test este efectuat ntr-un gel care conine n ntregul volum o concentraie constant, uniform de Ac. Diferite concentraii de angen dizolvate n volume
117
standard sunt plasate ulterior n godeurile rotunde realizate n gel. Plcile sunt lsate la incubat cel puin 24 ore, perioad n care Ag difuzeaz n gel. Pe msur ce Ag se deprteaz de godeu, concentraia acestuia scade proporional cu ptratul distanei parcurse. Cnd concentraia Ag ajunge la un raport opm cu concentraia Ac din gel (zona de echivalen), se formeaz o linie de precipitat sub form de inel centrat de godeu. Diametrul inelului (d) este un indicator al concentraiei angenului:
[Ag] ~ d2
Valorile diametrului inelului de precipitare sunt corectate prin scderea diametrului godeului n care a fost pus Ag. Cuanficarea Ag se face cu ajutorul unei drepte de calibrare d2 vs. [Ag].
d2 Inel de precipitare
Godeu cu Ag a
[Ag] b Fig. 11.8. Reprezentare schemac a imunodifuziunii radiale simple, metod ulizat pentru determinarea concentraiilor diverselor angene: a. migrarea in gel; b. dreapta de calibrare Ulizarea cu acuratee a tehnicii difuziei radiale simple presupune tierea reproducbil a godeurilor, care s aib pereii vercali, pentru a produce inele nete. Pentru a facilita msurarea, dup formarea inelului de precipitare, gelurile pot fi splate cu tampon fosfat salin pe mpul nopii pentru a ndeprta Ac liberi din gel i apoi proteinele pot fi colorate cu albastru Coomasie. Cu ajutorul acestei tehnici de colorare, pot fi anse limite de detecie a angenului la concentraii de ordinul 10-7 M. Tehnica Mancini este o metod eficient de cuanficare a imunoglobulinelor serice, inclusiv a subclaselor de IgG, a componentelor sistemului complementului sau a altor proteine serice. 11.5.3. Tehnica Laurell Material si metoda: Gel de agaroz cu ancorpi prencorporai; Decupare godeuri; n care se pipeteaz serurile de control i probele de la bolnavi; Migrare n cmp electric;
118
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR Se formeaz conuri de precipitare cu lungimi proporionale cu concentraia angenului care urmeaz a fi evideniat (figura 11.9.)
Fig. 11.9. Aspectul gelului cu conuri de precipitare caracterisce tehnicii Laurell 11.5.4. Imunelectroforeza Este efectuat, de obicei, cnd este necesar confirmarea prezenei unui component monoclonal detectat prin electroforeza proteinelor serice (vezi capitolul 8). Metoda reprezint o variant a precipitrii n gel, n care unul dintre componentele reaciei Ag-Ac, de obicei angenul, este supus nti separrii n cmp electric. Dup separarea electroforec a fraciunilor angenului, se realizeaz un godeu lung paralel cu direcia de migrare a proteinelor, n care va fi introdus Ac sau amestecul de Ac. Moleculele de Ac i de Ag difuzeaz n gel i, n zona de echivalen apar arcuri de precipitare (figura 11.10.). Imunelectroforeza nu este o metod cantav. a Angene b
Ig A Ig G
Ancorp
Ig M k
Figura 11.10. a. Reprezentare schemac a principiului imunelectrofoerezei; b. imagini ale unor arcuri de precipitare n gel, caracterisce lanurilor grele ( i ) i uoare (k i )
REACII IMUNE METODE DE IDENTIFICARE I DOZARE A COMPLEXELOR IMUNE 11.6. Metode de determinare n suspensie
119
Aglunarea apare cnd un ancorp interacioneaz cu un angen mulvalent, insolubil, cu legarea ncruciat a parculelor angenice de ctre ancorp i formarea unor agregate mari, insolubile, vizibile macroscopic sau microscopic. 11.6.1. Reacia de aglunare latex pe suport solid metod calitav Este ulizat ca i test de idenficare rapid prin aglunare pe suport solid, pentru detecia direct i semicantav a proteinei C reacve n ser (figura 11.11.) sau pentru idenficarea rapid a anumitor specii bacteriene (figura 11.12.).
Figura 11.11. Reacvul coninnd ancorpi specifici an-proteina C reacva uman fixai pe parcule de latex, agluneaz n prezena CRP din serul pacientului (1); controlul negav (2).
Strep B
H. Influenzae B
S. Pneumoniae
N. Meningidis ACY WI35
N. Meningidis B/E coli KI
Control poziv
Figura 11.12. Reacvii coninnd ancorpi specifici an-determinani angenici bacterieni fixai pe parcule de latex, agluneaz n prezena bacteriilor din lichidul cefalorahidian (4 poziv pentru Neisseria Meningidis); controlul poziv (6). 11.6.2. Turbidimetria; Nefelometria metode cantave vezi capitolul 12 11.7. EVALUAREA SISTEMULUI COMPLEMENTULUI Componentele C3 i C4 sunt factorii cei mai abundeni ai sistemului complement plasmac, relav uor de dozat prin turbidimetrie sau nefelometrie. Concentraia fiziologic a C3 este cuprins n intervalul: 0,85-1,93 g/L, iar a C4: 0,12- 0,36 g/L. Concentraii sczute ale C3 n snge se datoreaz fie consumului crescut, fie sintezei diminuate. Consumul crescut poate fi datorat: - Prezenei complexelor Ag-Ac, care pot acva ntregul sistem al complementului -> C3 i C4 sunt sczute.
120
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR - Prezenei endotoxinelor sau a altor produi microbieni, care acveaz calea alternav -> C3 este sczut, iar C4 normal. Sinteza sczut: - Deficitele congenitale homozigote de C3 i C4 sunt rare. Strile heterozigote ns sunt destul de frecvente. Exist o inciden crescut a strii heterozigote pentru C4 la persoanele cu diabet zaharat de p I. Dozarea C3 i C4 poate fi ul clinic n afeciuni renale, arculare, boli mulsistemice cu prezena vas-
culitei i n infeciile sistemice severe. Un nivel sczut al complementului sugereaz prezena bolii acve. Concentraii sczute ale C3 i nivele normale de C4 pot fi ntlnite la pacienii cu sepcemie produs de germeni Gram negavi, n anumite forme de glomerulonefrit (ex. n nefrita acut), n nefrita subacut i proliferav cronic i n nefrita mezangiocapilar.
121
Capitol 12 APRAREA IMUN SPECIFIC UMORAL METODE DE ANALIZ N LABORATOR

Aprarea imun specific umoral se realizeaz prin intermediul imunoglobulinelor i a mediatorilor imuni interleukine, contribuie esenial avnd imunoglobulinele. Rspunsul imun umoral declanat de un angen determin proliferarea i diferenierea limfocitelor B n plasmocite productoare de imunoglobuline (ancorpi). Acea recunosc n mod specific i reacioneaz cu angenul care a declanat rspunsul imun. Imunoglobulinele parcip la aprarea organismului prin mai multe mecanisme: Liza angenului prin acvarea ancorpo-dependent a sistemului complement Opsonizare Neutralizarea angenului Declanarea reacei citotoxice dependente de ancorpi (ADCC) Acvarea mastocitelor. 12.1. CARACTERIZAREA IMUNOGLOBULINELOR Exist cinci clase de imunoglobuline: IgG, IgM, IgA, IgE i IgD. Imunoglobulinele de p IgG reprezint aproximav 75% din totalul imunoglobulinelor; apar n special n mpul rspunsului imun secundar. Marea majoritate al ancorpilor au aciune anbacterian, anviral, dar i hemagluninele incomplete aparin acestei clase de imunoglobuline. Traverseaz placeta prin mecanism de transport acv. Se cunosc patru clase de imunglobuline de p IgG: IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Imunoglobulinele de p IgM au structur pentameric, cu 10 locusuri de legare al angenului (din punct de vedere funcional fiind doar pentavaleni). Apar n mpul rspunsului imun primar, sunt primii ancorpi care se sintezeaz n organismul nou-nscuilor. Marea majoritate a factorilor reumatoizi, izohemagluninele, aglunele la rece au structur de p IgM. Forma monomeric reprezint receptorul membranar al limfocitelor B. Imunoglobulinele de p IgA se gsesc n snge sub form monomeric, iar n secreii sub form dimeric, rar exist i forme trimerice, chiar tetramerice. Reprezint cel mai important component al diferitelor secreii (saliv, lacrimi, bil, colostru, suc duodenal, etc.) Imunoglobulinele de p IgE se gsesc n snge n concentraie mic, deoarece se fixeaz rapid de receptorii IgE. Au rol n aprarea anparazitar i n declanarea reaciilor imune. Imunoglobulinele de p IgD se prezint sub form monomeric i reprezint receptorul limfocitelor B mpreun cu IgM. Concentraii crescute n sngele circulant au fost descrise doar la bolnavii cu mielom mulplu.
122
12.2. METODE DE DOZARE ALE IMUNOGLOBULINELOR Prima metod de evideniere a fost electroforeza proteinelor serice, efectuat de Tiselius, care a obinut cinci fraciuni electroforece. Imunoglobulinele migreaz majoritar n fraciunea gamma, mai puin n fraciunea beta. Ultracentrifugarea a permis separarea imunoglobulinelor pe baza greutii lor moleculare. Imunoelectroforeza asigur o separare a proteinelor pe baza proprietilor fizico-chimice i a structurii angenice. Stabilirea exact a structurii imunoglobulinelor s-a realizat prin metode de separare a proteinelor i mai nou prin metode de biologie molecular . Dozarea cantav al imunoglobulinelor se realizeaz prin imunonefelometrie sau imunoturbidimetrie . 12.2.1. Imunonefelometria Se bazeaz pe formarea complexelor imune (complexe angen- ancorp) ntre angenul din proba de analizat i ancorpii specifici coninui n kitul de reacvi. Prezena complexelor imune n amestecul de reacie determin refracia sub un anumit unghi a radiaei monocromace care este focusat apoi pe cuvet. mprerea luminii de ctre parcule are loc n funcie de dimensiunea i numrul parculelor. Cantatea de lumin mprat este o msur a cantii de angen ce se dorete a fi cuanficat. Etapele reacei angen-ancorp (Fig. 12.1.): n soluia de analizat se adaug ancorpi fa de substana ce urmeaz s fie testat, care determin formarea de complexe imune solubile. Adugarea de anser n cuva de reacie declaneaz reacia angen ancorp. Formarea complexelor imune este semnalat prin creterea intensitii luminii dispersate. Semnalul crete rapid cnd se formeaz reeaua de complexe imune, apoi ange un platou i scade cnd precipitatul se redizolv n soluie. Rata de cretere a semnalului pentru lumina mprat i nlimea platoului sunt direct proporionale cu concentraia angenului.
Cuv Detector (msurarea luminii dispersate)
Figura 12.1. Schema de principiu a unui nefelometru
APRAREA IMUN SPECIFIC UMORAL - METODE DE ANALIZ N LABORATOR Modaliti de msurare a concentraiei de angen:
123
1. Msurarea formrii complexelor la punctul de echilibru (metoda n platou sau cu punct final). 2. Msurarea formrii complexelor n cinec necesit monitorizarea connu a reaciei, ncepnd din momentul adugrii anserului. Avantaj: sensibilitate mare Dezavantaje: 1. costuri ridicate 2. mp de analiza mai mare, comparav cu turbidimetria Aplicaii ale nefelometriei Cuanficarea proteinelor serice ca i: IgG, IgA, IgM i IgE. Componente ale sistemului complement: C3, C4, C1 inhibitor. Haptoglobina. Proteina C reacv. Transferina. Albumina. Alfa1-antripsina. Alfa2-macroglobulina. Fibrinogen. Ceruloplasmina. Factorul reumatoid Cuanficarea proteinelor din LCR : Exemplu: IgG, IgA, IgM Valorile normale in LCR: IgA < 7 mg/L IgG < 60 mg/L IgM < 7 mg/L 12.2.2. Imunoturbidimetria Se bazeaz de asemenea pe formarea complexelor imune dintre angenul din proba de analizat i ancorpii specifici din kitul de reacie, parcule fin suspendate in mediul lichid. Daca o raza trece printr-o proba turbida, intensitatea este diminuat, proporonal cu concentraa si marimea parculelor. Turbidimetria msoar scderea intensiti unei radiai luminoase, care nu i modific drumul opc, la trecerea prin proba de analizat.
124
Soluia de reacie
Fotodetector
Lumina incident Blocarea luminii Figura 12.2. Schema de principiu a unui turbidimetru
12.2.3. ELISA Este o tehnic ulizat n principal n imunologie pentru a detecta prezena unor angene sau a unor ancorpi ntr-o prob biologic. De se numete aceast tehnic ELISA? Angenul de interes este absorbit pe o suprafa din plasc (sorbent ). Angenul este recunoscut de ancorpi specifici (immuno ). Ace ancorpi sunt recunoscui de ancorpi secundari (immuno ), care sunt cuplai cu o enzim ( enzyme linked ). Enzima va transforma substratul rezultnd un compus colorat. Aplicaii n medicin Evaluarea prezenei unui angen/ancorp ntr-o prob. Determinarea concentraei serice a diferiilor ancorpi. n industria alimentar Detectarea alergenelor alimentare (ex:proteine din lapte, arahide, nuci, ou, migdale) n toxicologie Test de screening pentru diferite clase de medicamente. Avantajele tehnicii ELISA : Tehnic sensibil. Echipamentele de lucru sunt larg rspndite. Reacvii au preuri acceptabile i termen de valabilitate lung. Adaptabil la automazare. Calitav i cantav Dezavantajele tehnicii ELISA : Necesit personal instruit n acest sens i echipamente specializate. Acvitatea enzimei poate fi afectat de constuen plasmaci.
APRAREA IMUN SPECIFIC UMORAL - METODE DE ANALIZ N LABORATOR Tipuri de tehnici ELISA: ELISA indirect ELISA sandwich ELISA compev 12.2.3.1. ELISA indirect Scop: Detectarea prezenei unui anumit p de ancorp Principiul metodei: 1. Godeuri acoperite cu angene.
125
2. Se adaug proba n godeuri. Dac ancorpul de interes (primar) este prezent n prob, el se va lega de angen. 3. Incubare, splare. 4. Se adaug conjugatul enzimac: ancorpi monoclonali an-imunoglobulina primara cuplai cu o enzim (conjugat), care se vor lega specific la ancorpul primar. 5. Incubare, splare. 6. Se adaug substratul cromogen care, transformat de ctre enzima cu care este cuplat ancorpul secundar, va genera o reacie de culoare. 7. Incubare. 8. Culoarea rezultat este cit cu ajutorul unui spectrofotometru.
Godeu acoperit cu angene
Ancorpi specifici legai de angene
Splare
Angen Substrat Ancorp Splare Ancorp conjugat
Splare
Se adaug substrat care e convert de enzim ntr-un produs colorat
Ancorpi conjugai legai de ancorpi specifici
Figura 12.3. Schema de principiu a unei determinari ELISA indirecte
126 Exemple de ancorpi care pot fi detectai : Ac an HIV
Ac sinteza mpotriva unor alergene alimentare (IgE,IgG) 12.2.3.2. ELISA directa - sandwich Scop: Detectarea prezenei unui angen ntr-o prob Principiul metodei: 1. Godeuri acoperite cu ancorpi monoclonali specifici pentru angenul de determinat. 2. Se adaug proba n godeuri. Dac angenul de interes este prezent n prob, el se va lega de ancorpi. 3. Incubare, splare. 4. Se adaug conjugatul enzimac: ancorpi monoclonali cuplai cu o enzim, care se vor lega specific la angen. 5. I ncubare, splare. 6. Se adaug substratul cromogen care, transformat de ctre enzima cu care este cuplat ancorpul secundar, va genera o reacie de culoare. 7. Incubare. 8. Culoarea rezultat este cit cu ajutorul unui spectrofotometru. Exemple de angene care pot fi detectate: AgHBs (angenul de suprafa al virusului hepac B) 12.3. APLICATII MEDICALE ALE METODELOR IMUNE DE ANALIZA
Godeuri acoperite cu ancorpi monoclonali Splare
Angenele legate de ancorpi specifici
Angen Substrat Splare Ancorp Ancorp conjugat
Splare
Se adaug substrat care e convert de enzim ntr-un produs colorat
Ancorpi monoclonali conjugai legai de ancorpi specifici
Figura 12.4. Schema de principiu a unei determinari ELISA sandwich
APRAREA IMUN SPECIFIC UMORAL - METODE DE ANALIZ N LABORATOR 12.3.1. Dozarea cantav al imunoglobulinelor din ser Indicaii: Suspiciunea existenei unor deficiene imune nnscute sau dobndite; Boli autoimune; Infecii cronice, boli inflamatorii. Interval de referin:
127
Concentraia seric al imunoglobulinelor serice variaz n funcie de vrsta pacienilor, de aceea valorile normale se raporteaz n mod obligatoriu la valorile de referin n funcie de vrsta pacienilor (vezi tabelul nr.12.I.): Tab. 12.I. Valorile normale ale imunoglobulinelor serice n funcie de vrst. IgA g/L Sub 1 lun 1-6 luni 7-24 luni 3-6 ani 7-12 ani 13-16 ani Peste 16 ani Interpretarea valorilor: La nou-nscui valorile concentraiei de IgG sunt similare celor de la adult, datorit imuoglobulinelor materne care au trecut transplacentar n mpul vieii intrauterine. Aceste imunoglobuline dispar din circulaie n cteva sptmni. Producia de imunoglobuline ange nivele vzute la adult dup vrsta pubertii (dup 16 ani). n deficiene imune nnscute apar diferite modificri ale valorilor Ig: - Lipsa selecv a IgA: lipsa IgA; - Sindromul hiper-IgM: IgM crescut, cu nivele de IgA i IgG sczute, chiar absente; - Sindromul hiper-IgE (sindromul Job): IgE foarte crescut, - Agammaglobulinemie: lipsa imunoglobulinelor; - Imunodeficiena comun variabil cu nivele sczute ale imunoglobulinelor; Deficiene imune dobndite: tumori maligne, sindroame limfoproliferave, sindroame mieloproliferave, tratament cu citostace, malabsorbie, insuficien renal sever, etc. n bolile inflamatorii, n infecii cronice sau boli autoimune cresc nivelele serice ale imunoglobulinelor; n lupusul eritematos diseminat (SLE) i sindromul Sjgren pot s apar creteri policlonale ale imunoglobulinelor; Cresc nivele imunoglobulinelor n hepate acute i cronice, n mod caracterisc ciroza alcoolic se caracterizeaz prin creterea IgA, ciroza biliar prin creterea IgM; Afeciuni renale (pielonefrita acut, cronic) se caracterizez prin creteri ale IgM, respecv IgG; 0,000-0,002 0,003-0,082 0,014-0,108 0,023-0,190 0,029-0,270 0,081-0,232 0,069-0,382 IgG g/L 0,70-1,48 0,30-1,00 0,50-1,20 0,50-1,30 0,70-1,65 0,70-1,55 0,72-1,69 IgM g/L 0,005-0,030 0,015-0,109 0,043-0,239 0,050-0,199 0,050-0,260 0,045-0,240 0,063-0,277
128
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR Gamopai monoclonale: creterea unei singure clase de imunoglobuline, cu scderea celorlalte clase. n tabelul nr. 15.II. am reprezentat cteva stri patologice cu modificrile caracterisce ale nivelelor
serice de Ig. Tabelul 15.II. Variaia concentraiei imunoglobulinelor n ser n diverse patologii
IgA Hepat acut A IgG spt. 1 N spt. 2 Dup spt. 8 N Iniial Dup spt. 8 N N N N N N N N N Nu exist N O clas Ig crescut, N N N Restul sczute N N N N N Nu exist N N N N IgM Spt. 1 Spt. 2 Spt. 4 N Iniial Dup spt. 4 N N N
N
N N N N N N N
Hepat acut B Hep. Cr. Pers. B Hep. Cr. Acv B Ciroz posthep. Ciroz biliar Ciroz alcoolic Obstr. Biliar Pielonefrit ac. Pielonefrit cr. Sindrom nefroc Infecie acut Infecie cronic Artrit reumatoid Lupus eritematos Sindrom Sjgren Malignoame LLC Iatrogen (citostace) Lipsa imunogl. Lips IgA select. Lips select. IgM Paraproteinemie
Algoritm de explorare al unei deficiene imune: Electroforeza proteinelor serice are rol orientav privind modificrile nivelului de imunoglobuline serice; Imunofixare doar dac exist suspiciunea unui mielom mulplu; Dozarea cantav a imunoglobulinelor serice Dozarea subclaselor de IgG: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4;
APRAREA IMUN SPECIFIC UMORAL - METODE DE ANALIZ N LABORATOR
129
Explorarea funcional al imunoglobulinelor: dozarea ancorpilor an- toxoid dieric, toxoid tetanic (angene proteice) sau ancorpi an- Haemophilus influenzae B., an- angene capsulare de Pneumococ (angene de p polizaharidice); 12.3.2. Dozarea nivelelor de IgE angen-specifice Indicaii: n cazurile n care nu se pot efectua testele intracutene: sugari, copii mici, afeciuni dermatologice; nu este permis suspendarea tratamentului (anhistamine, steriozi); nu avem la dispoziie teste cutanate corespunztoare; dac exist pericolul ca testul cutanat s declaneze reacie anafilacc; alergii alimentare; Determinri: dozarea IgE total seric ( turbidimetrie, nefelometrie, ELISA); dozarea IgE alergen-specifice (ELISA, imunoluminiscen, dot blot sau line blot. Tabelul 15.III. Interpretarea valorii IgE serice totale. Alergie Neverosimil <1 U/ml <10 U/ml <25 U/ml Verosimil 1-1,3 U/ml 10-100 U/ml 25-100 U/ml Probabil >1,3 U/ml >100 U/ml >100 U/ml
Nou-nscut (sub 28 zile) Copil sub 4 ani Copil peste 4 ani, aduli
12.3.3. Dozarea imunoglobulinelor din LCR Se efectueaz de obicei paralel cu dozarea proteinelor din LCR i ser, respecv dozarea imunoglobulinelor att din LCR ct i din ser. Se pot uliza variate metode (imunodifuziune radial Mancini, imunoturbidimetrie, imunonefelometrie, ELISA, RIA), rezultatele difer n funcie de metoda ulizat, fiecare laborator trebuie s dispun de propriile valori de referin. Obligatoriu, proba de ser i LCR trebiue recoltate n acelai moment al zilei i determinrile se efectueaz cu aceeai metod. Nivelul imunoglobulinelor din LCR se apreciaz calculnd raportul dintre valoarea seric i cea intratecal. Valori de referin: IgA sub 0,06 mg/L IgG sub 0,40 mg/L IgM sub 0,01 mg/L n tabelul nr. 15.IV. am reprezentat modificrile niveleor de Ig din LCR n cteva stri patologice.
130
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR Tab. 15.IV. Modificrile nivelelor de Ig din LCR, n diverse patologii IgA IgG Polineurit, Meningit acut bacterian Scleroz mulpl Tumori SNC, Encefalit Meningit abacterian Stare postmeningit # # # # # IgM # -
12.3.4. Autoancorpi Autoancorpii pot fi autoancorpi fiziologici sau autoancorpi patologici. Autoancorpii fiziologici au rolul de a proteja organismul de apariia reaciilor autoimune ncruciate ca rspuns la ptrunderea unor ageni patogeni n organism. Ace autoancorpi fiziologici sunt polireacve, cu afinitate redus, de obicei sunt de p IgM, se gsesc n ser n concentraii sczute, de ordinul ng/ml. Exemple: autoancorpi fa de angene de grup sangvin, 2- microglobulin, receptorul de acelcolin, acn, miozin, tubulin, keran, colagen, etc. Autoancorpii patologici sunt de p IgG, IgA, IgM, se caracterizeaz prin afinitate crescut, concentraiilor lor serice sunt de ordinul g/ml. Din punct de vedere funcional pot fi autoancorpi care parcip la patogeneza unor boli autoimune specifice anumitor organe (ancorpi cu afinitate fa de anumite componente celulare, de ex. ancorpi annucleari), sau pot contribui la apariia unor boli autoimune sistemice (ancorpi cu afinitate fa de celulele, componentele celulare ale unui anumit organ) (tabel 15.V). Anumii autoancorpi au rol patogen (contribuie la apariia simptomelor bolii), dar exist un numr important de autoancorpi despre care nu s-a putut demonstra acest lucru. Indicaiile evidenierii autoancorpilor: Stabilirea diagnoscului de boal autoimun; Stabilirea riscului, a prognoscului; Stabilirea stadiului de acvitate/ inacvitate a bolii; Monitorizarea terapiei; Diagnoscarea sindroamelor de coexisten a mai multor boli autoimune (sindroame overlap). Metode de evideniere al autoancorpilor Se folosesc metode calitave i cantave: Imunofluorescena indirect Imunodifuziune, contraimunoelectroforeza Metode de imunoprecipitare Tehnica ELISA cea mai des folosit; Western blot (imunoblot); Tehnicile de latex-aglunare Mediatorii chimici (citokinele) sunt pepde, glicoproteine cu greutate molecular mic, care coordoneaz comunicarea intercelular, rspunsul imun sau acioneaz ca factori de cretere pentru unele puri de celule. Sunt produse de celulele sistemului imun sau de alte specii celulare (celule endoteliale, fibrobla, etc.)
131
Dozarea citokinelor se poate efectua prin metodele ELISA, dozare intracelular prin citometrie in flux sau tehnica ELISPOT. Tabelul 15.V Autoancorpii prezeni n cteva dintre bolile autoimune >50% 30-50% Lupus eritematos diseminat Sindrom pseudo-LE Sindrom Sharp Sclerodermie Dermatomoizit polimoizit Sindrom CREST Sindrom Sjgren Granulomatoza Wegener ANA d-ADN s-ADN AMA ANA ENA n-RNP ANA Pm-1 Centromeri ANA ANA SS A SS B Angene citoplasmace n granulocite s-ADN s-ADN ANA ENA Scl 70 N-RNP SS-A
10-30% Sm SS-B
Not: ANA= autoancorpi annucleari; ds-ADN=ADN dublu catenar; ss-ADN=ADN monocatenar; AMA=ancorpi anmitocondriali; ENA=angene nucleare extractabile; n-RNP=ribonucleoproteine celulare solubile, Sm= Smith; SSA, SSB =complexRNP/Sm stabilizat cu acid ribonucleic; Pm-1=ancorpi anpoliomiozit p I; Scl 70 =ADN-topoisomerasa-1;
12.4. CAZURI CLINICE 12.4.1. Imunodeficiena comun variabil Copil de 2 ani se prezint la medicul de familie cu infecii respiratorii superioare repetate (de peste opt ori pe an), complicate cu pneumonii (de peste dou ori pe an). La examenul bacteriologic se evideniaz prezena Haemophilus influenzae i Streptococcus pneumoniae . n urma examenului clinic general medicul de familie suspicioneaz o deficien imun i ndreapt bolnavul spre un serviciu de alergologie/ imunologie pediatric, unde i se efectueaz urmtoarele explorri paraclinice: Hemoleucogram WBC 6,4 x103 /l Frou periferic - normocite normocrome - IgA- 0,08 g/L (V.N: 0,20-1,00 g/L) - IgG 1,06 g/L (V.N: 4,53 9,16 g/L) - IgM 0,2 g/L (V.N: 0,19 1,46 g/L) Limfogram periferic: - Limfocite B (CD19+ i CD20 +) 17% (18-47%)
132
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR - Limfocite T (CD3+, CD4+/ CD8+) 74% (V.N: 41 -80%) - Limfocite NK (CD16+ CD56+) 35% (V.N: 2- 13%) Titrul de izohemaglunine serice: sczut Test HIV : negav S-a exclus prezena unei deficiene imune secundare. Diagnosc: deficien imun comun variabil.
12.4.2. Agamaglobulinemie total (Bruton) Sugar de 1 an, cu infecii respiratorii superioare repetate de la vrsta de 4 luni, pneumonii, infecii ale pielii, cu ageni patogeni incapsulai. Iniial rspuns bun la terapie anbioc, cu trecerea mpului ns infeciile devin tot mai greu controlabile. Examen clinic: lipsa nodulilor limfaci mrii. Determinri de laborator: Hemoleucogram: WBC - 5 x103 /l Limfogram periferic: - Limfocite B (CD19 i CD20) foarte sczut (sub 0,01%) - Limfocite T (CD3/CD4/ CD8 /) 64% (normal) - Limfocite NK (CD 16 i CD56) 35% (crescut) Proteine serice totale: 50 g/L - IgA 0,02 g/L (V.N: 0,00 -0,83 g/L) - IgG- 1,87 g/L (V.N: 2,32 -14,11 g/L) - IgM sub limita de detecie (V.N: 0,00 -1,45 g/L) Lipsa rspunsului la angene specifice. Diagnosc : boala Bruton (agamaglobulinemie X- linkat) 12.4.3 Sindromul hiper IgE (boala Job) Copil de 5 ani, se prezint la serviciul de pediatrie cu infecii respiratorii repetate. Prinii copilului relateaz c acesta a prezentat numeroase eczeme nc din perioada neonatal, repetate episoade de furunculoz care s-au vindecat cu cicatrizare. n mod caracterisc, aceste infecii nu au fost acompaniate de reacie inflamatorie local, de febr sau durere. Actualmente copilul prezint candidiaz oral. Determinri de laborator: Hemoleucogram - normal Frou periferic: eozinofilie 10% - IgA- 0,37 g/L (V.N: 0,27 -1,99 g/L) - IgG-7,94 g/L (V.N: 5,04 14,64 g/L) - IgM - 1,27 g/dl (V.N: 0,24 2,10 g/L) - IgE- peste 1000 U/ ml (V.N: 25<U/ml)
133
Determinarea capacitii chemotacce a fagocitelor i a producerii de specii reacve ale oxigenului indic lipsa ambelor funcii. Diagnosc: sindrom hiper-IgE. 12.4.4. Boala celiac (intolerana la gluten) Copil de 3 ani, cu deficit staturo-ponderal, se prezint la serviciul de pediatrie pentru prezena unei diarei cronice i lipsa poei de mncare. La examenul clinic s-a constatat anemie i atrofia musculaturii membrelor superioare i inferioare (regiunea fesier). Determinri de laborator: Albumin seric: 30 g/L Hemoglobin 9,7 g/dl Frou periferic: anemie microcitar cu eritrocite hipocrome. Ancorpi an-endomysium (EMA): prezeni Ancorpi an-transglutaminaz (tTG): prezeni Biopsie duodenal: atrezia vilozitilor intesnale. Diagnosc: Boala celiac. 12.4.5. Lupus eritematos sistemic Bolnav n vrst de 25 ani se prezint la ambulatorul de specialitate pentru febr, fagabilitate, pierdere n greutate, slbiciune muscular. La examenul general se evideniaz eritem facial, adenopae generalizat, hepatosplenomegalie. Bolnava relateaz c de aproximav 4 sptmni sufer de dureri arculare i a remarcat o cdere accelerat a prului. Determinri de laborator: VSH: 45 mm/h PCR: 15mg/L Hemoleucogram: - WBC: 2,5 x103 /l - Plachete: 113 x103 /l Frou periferic:anemie normocrom normocitar Creanin: 0,97 mg/dl Na+: 137 mmol/L K+: 4,2 mmol/L Sumar de urin: - Proteinurie ++ - Hematurie : + Imunologie: - An dc- ADN: prezeni - An SM: prezeni
134 - C3: 0,35 g/L (V.N: 0,85-1,93 g/L) - C4: 0,08 g/L (V.N: 0,12 0,36 g/L)
Interpretare: Bolnava prezint o boal autoimun - lupus eritematos sistemic (LES).
135
Capitolul 13 IMUNITATEA CELULAR NNSCUT METODE DE ANALIZ N LABORATOR

Sistemul imun este alctuit din celule i molecule ale unor substane intra i extra celulare, care protejeaz organismul de agresiunea infecioas, tumoral, precum i de autoagresiune (celule proprii transformate - non-self). Att imunitatea celular, ct i cea umoral au fiecare o component nnscut, nespecific i o component specific, dobndit n urma interaciunii cu diferite angene. Imunitatea nnscut este precoce, fr specificitate, fr memorie imun, reprezentnd prima linie de aprare a organismului. Celulele implicate n imunitate celular nespecific se pot grupa asel: Leucocite cu capacitate de fagocitoz: - Neutrofilele - implicate n iniierea i sngerea rspunsului inflamator, au acviate anbacterian (fagociteaz bacterii); - Monocitele fie c sunt celule mobile (monocite circulante), fie c au trecut n esuturi i staioneaz au rolul de a fagocita i digera resturi celulare i ageni patogeni. Deasemenea, smuleaz limfocitele i alte celule imune s rspund adecvat la prezena unui patogen, realiznd asel una dintre legturile cu sistemul imun celular specific. Leucocite non - fagocitante: - Eozinofilele conin i pot secreta enzime caonice cu acvitate anparazitar, implicate n rspunsul alergic, inflamaia sular i modularea imun; - Bazofilele - conin granule toxice al cror coninut poate distruge microorganisme strine. Mastocitele, bazofilele circulante, conin o varietate de substane proinflamatoare (ex. histamin i serotonin) i sunt implicate n rspunsul alergic; - Limfocite Natural Killer (NK) sunt implicate n aprarea anviral, antumoral.
EXPLORAREA DE LABORATOR A APRRII IMUNE CELULARE NESPECIFICE Explorarea de laborator a aprrii imune celulare se face dup o abordare pas cu pas, ncepnd cu analize de run i apoi connund cu unele speciale dac ele sunt necesare (de obicei invesgaiile speciale au i un cost ridicat). n stabilirea diagnoscului se coroboreaz datele clinice, cu cele paraclinice de laborator (determinri biochimice, hematologice, imunologice, microbiologice) sau imagisce. n cadrul Departamentului de Hematologie al Spit. Cl. Jud. De Urgen Mure, explorarea seriei leucocitare urmeaz schema de mai jos.
136
Hemoleucograma automat Examenul microscopic al froului periferic Examenul microscopic al mduvei osoase Coloraii citochimice Citometrie n flux
13.1. HEMOLEUCOGRAMA AUTOMAT Hemograma automat este un test de run ce const ntr-o serie de teste folosite pentru a evalua cantav componentele celulare din snge: numrul de leucocite, numrul de hemai, numrul de plachete, clasificarea leucocitelor (formula leucocitar), msurarea concentraiei de hemoglobin, calcularea hematocritului i a indicilor eritrocitari i plachetari. 13.1.1. Indicaiile testului Indenficarea persoanelor cu poteniale infecii Indenficarea bolilor acute sau cronice (ex. leucemii acute sau cronice) Invesgarea capacitii de transport a oxigenului reflectat n concentraia hemoglobinei (HGB) Diagnoscul sindromului anemic (scderea concentraiei de HGB) Invesgarea hemostazei (numrul trombocitelor) Monitorizarea tratamentului sindromului infecios, anemic i al altor afeciuni hematologice sau non-hematologice Monitorizarea efectului chimioterapiei i radioterapiei asupra produciei medulare de celule sanguine, respecv evaluarea indicaiei de chimio- sau radioterapie. Parametrii hemogramei sunt urmtorii: WBC NEU LYM EOS BASO RBC HGB HCT MCV MCH - White Blood Cell sau numr de leucocite - Neutrofile (numr absolut i procent) - Limfocite (numr absolut i procent) - Eozinofile (numr absolut i procent) - Bazofile (numr absolut i procent) - Red Blood Cell sau numr de eritrocite - Hemoglobin - Hematocrit - Mean Corpuscular Volume ( volumul corpuscular mediu) - Mean Corpuscular Hemoglobin (hemoglobina corpuscular medie)
MONO - Monocite (numr absolut i procent)
MCHC - Mean Corpuscular Hemoglobin Concentraon (concentraa medie de hemoglobina corpuscular)
IMUNITATEA CELULAR NNSCUT METODE DE ANALIZ N LABORATOR RDW CV PLT MPV PDW - Red Cell Distribuon Width (limea distribuiei eritrocitelor) - Coeficientul de variaie - Platelet sau numr de trombocite - Mean Platelet Volume (volumul trombocitar mediu) - Platelet Distribuon Width (limea distribuiei trombocitelor)
137
13.1.2. Recoltare i prelucrare Pentru efectuarea hemoleucogramei se recolteaz snge integral venos sau capilar, pe ancoagulantul K3EDTA (eprubete cu dop mov). Probele recoltate pe heparin sau citrat de sodiu pot fi prelucrate, ns anumii parametrii pot fi afectai datorit ulizrii acestor ancoagulani. ICSH (Internaonal Commiee for Standardizaon in Haematology - Comitetul Internaional pentru Standardizare n Hematologie) prevede ca probele din snge integral proaspt s se prelucreze pe parcursul a patru ore de la recoltare. Parametrii hemogramei: RBC, HGB, HCT, MCV, MCH, MCHC, RDW, PLT i MPV, sunt stabili ( 5%) pn la 24 ore dup recoltare. WBC total este stabil ( 5%) pn la 24 ore dup recoltare. Stabilitatea WBC descrete cu 7% la 24 ore de la recoltare. Parametrii WBC Diferenal - NEU, LYM, MONO, EOS i BASO, sunt stabili ( 10%) pna la 12 ore de la recoltare. O cretere a semnalelor fals pozive pentru populaii suspecte pot fi observate n cazul probelor prelucrate n mai puin de 30 minute dup recoltare sau n mai mult de 4 ore dup recoltare. Probele manifest o cretere a stabilitii dac sunt pstrate la temperatura camerei, comparav cu cele pstrate n frigider (4 - 8C). 13.1.3. Principii de msurare Pentru determinarea numrului de leucocite i a formulei leucocitare se folosete citometria n flux cu laser cu semiconductori. Citometria n flux poate fi definit ca un proces n care celule individuale sunt determinate s treac ntr-un singur ir, fiind suspendate ntr-un lichid care trece n dreptul unor senzori care masoar caracteriscile fizice sau chimice ale celulelor. Celulele sunt hidrodinamic focusate n flux de PBS (tampon fosfat salin), nainte s ntlneasc o surs de lumin opm focusat. Un numr de detectori sunt necesari pentru analiz: cnd fluxul trece prin dreptul razei laser fiecare celul este analizat de detectorii n linie cu raza luminoas (Forward Scaer sau FSC) i de detectori situai perpendiculari pe aceasta (Side Scaer (SSC) i de unul sau mai muli detectori de fluorescen. FSC furnizeaz informaii despre volumul celulei, iar SSC despre complexitatea intern a celulei (forma nucleului, cantatea i pul granulaiilor citoplasmace, rugozitatea membranei). Datele sunt reprezentate grafic ca scaerplot i pot fi, deasemenea reprezentate ca histograme. Fiecare celul analizat este reprezentat printr-un punct pe scaerplot. Analizorul automat de hematologie obine informaii: privind mrimea celulei prin analiza luminii mprate sub unghi mic. Cel mai eficient unghi pentru analiza luminii difractate este de 1 - 6 grade. Lumina mprat de o celul cu dimensiuni mici (ex. limfocitul) are intensitatea redus i genereaz un puls redus, iar lumina mprat de o celul mare (ex. monocitul) genereaz un puls puternic.
138
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR privind nucleul i granulaiile (complexitate intern) prin analiza luminii mprate sub unghi mare. Unghiul potrivit pentru analiza luminii mprate este ntre 8 - 20 de grade. Analiza unei celule cu granulaii puine (ex. limfocitul) genereaz un impuls sczut, iar analiza unei celule cu granulaii multe (ex. granulocitul) genereaz un impuls ridicat. Pentru determinare este necesar o cantate mic de snge intergral, recoltat pe K3EDTA, de aproxi-
mav 40 microL. Pentru realizarea unei formule leucocitare cu reproducbilitate bun se folosesc 2 canale de analiz DIFF i WBC/BASO. Prin combinarea informaiilor despre mrime i complexitate intern analizorul realizeaz numrtoarea leucocitelor i formula leucocitar limfocite, monocite, eozinofile, neutrofile + bazofile. Pe canalul WBC/BASO se determin numrul total de leucocite, numrul i proporia bazofilelor. Proba de snge integral este diluat i apoi hemolizat cu un reacv acid. n mediu acid leucocitele sunt micorate, cu excepia bazofilelor. Numrul neutrofilelor lor se calculeaz pe baza rezultatelor obinute pe cele 2 canale, dup urmtoarea formul de calcul:
Neutrofile = Leucocite (Limfocite + Monocite + Eozinofile + Bazofile) Neutrofile% = 100 (Limfocite% + Monocite% + Eozinofile% + Bazofile%)
RBC i PLT sunt numrate i msurate folosind impedana i focusarea hidrodinamic . La trecerea unei celule prin orificiul detectorului se produce o modificare a impedanei ntre cei doi electrozi ceea ce genereaz un impuls electric proporional cu volumul celulei. Focusarea hidrodinamic permite separarea corect a hemailor mici de plachete, previne dubla numrare a acestora i permite obinerea unei curbe de distribuie pentru mrimea hemailor i plachetelor. Determinarea concentraiei de hemoglobin se face colorimetric folosind metoda cu sodiu lauril sulfat (SLS) . Metoda cu SLS este avantajoas deoarece este rapid, folosete substane netoxice, biodegradabile, fiind potrivit pentru automazare. Surfactanii lizeaz hemaile, elibernd HGB. Globina este modificat prin interaciunea cu gruparea hidrofil a SLS. Acest lucru induce conversia Fe+2 n Fe+3, formnd methemoglobina ce se combin cu SLS i se formeaza SLS-HGB. Aceasta are o curb de absorbie cu un vrf la 535 nm i la 560 nm. Parametri eritrocitari Parametri eritrocitari sunt parametri calculai, nu msurai n mod direct. MCV , volumul corpuscular mediu , este media volumelor individuale ale eritrocitelor. Este derivat din datele distribuiei n funcie de mrime i este exprimat n femtolitri (fl).
MCV (fl) = HCT (%)/RBC (x 106/L) x 10
IMUNITATEA CELULAR NNSCUT METODE DE ANALIZ N LABORATOR
139
MCH, hemoglobina corpuscular medie , este media cantii de hemoglobin coninut ntr-un eritrocit, exprimat n picograme (pg). MCH este calculat din RBC i HGB asel:
MCH (pg) = (HGB (g/dl)/RBC (x 106/L)) x 10

MCHC, concentraia medie de hemoglobin corpuscular , este raportul dintre hemoglobin i volumul mediu eritrocitar, exprimat procentual. MCHC se exprim n g/dl:
MCHC = (HGB (g/dl)/HCT (%)) x 100

RDW, limea distribuiei eritrocitelor , este o msura a heterogenitii populaei RBC. RDW este derivat din histograma RBC. Hematocritul (HCT) HCT este proporia eritrocitelor fa de plasm i este exprimat ca procent din volumul de snge integral. HCT este calculat din numarul RBC i MCV asel:
HCT = (RBC x MCV)/10

n figura 13.1. se poate vedea aspectul unei hemoleucograme automate normale (Sysmex XT 2000i).
Fig. 13.1. Hemoleucogram normal Valorile normale ale parametrilor hemoleucogramei la adult sunt prezentate n tabelul 13.1.
140
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR Tabel 13.1. Valori normale 16 - 99 ani Analize WBC LY LY# MO MO# GR GR# BA BA# EO EO# RBC HGB HTC MCV MCH MCHC PLT Valori Brbai 3,6-10 20,5-51,1 1,2-3,4 1,7-9,3 0,1-0,6 43,2-75,2 1,4-6,5 0-1 0,01-0,08 0-4 0,03-0,04 3,50-6 12-18 36-54 80-95 27-36 31-36 150-450 Valori Femei 3,6-10 20,5-51,1 1,2-3,4 1,7-9,3 0,1-0,6 43,2-75,2 1,4-6,5 0-1 0,01-0,08 0-4 0,03-0,04 3,50-6 11-15 36-48 80-95 27-36 31-36 150-450 UM x103/L % x103/ % x103/L % x103/L % x103/L % x103/L x106/L g/dl % fl pg g/dl x103/L
13.1.4. Intrepretarea parametrilor hemoleucogramei Bulenele de analiz eliberate de un laborator de analize medicale vor conine intervalul normal de referin pentru fiecare parametru n parte. Dac valoarea unui parametru depete limita superioar considerat normal, spunem c acel parametru este crescut. Dac valoarea unui parametru scade sub limita inferioar considerat normal, spunem c acel parametru este sczut. Acolo unde un parametru este exprimat i n valoare absolut, dar i procentual, interpretarea se va face n funcie de valoarea absolut, nu de cea procentual. n ceea ce privete interpretarea numrului de leucocite, acesta se compar cu valoarea normal (msurat n stare de sntate) a fiecrui individ. Avnd n vedere c intervalul considerat normal este destul de larg innd cont de variabilitatea individual, nu este acelai lucru s observm o cretere a numrului de leucocite de la 4000/L la 9000/L sau de la 8000/ L la 9000/L. 13.1.5. Modificri cantave ale celulelor sanguine Numr crescut/sczut de leucocite (leucocitoz/leucopenie): Creterea/scderea numrului de leucocite se bazeaz pe creterea/scderea uneia sau mai multor populaii leucocitare. De aceea este corect s spunem leucocitoz cu neutrofilie sau leucocitoz cu limfocitoz, adic s specificm subclasa de leucocite care crete sau scade. Numr crescut de neutrofile (neutrofilie): nnscut - Neutrofilie ereditar
IMUNITATEA CELULAR NNSCUT METODE DE ANALIZ N LABORATOR - Deficit al receptorilor pentru factorul C3 de complement Dobndit - Sarcin - Efort fizic intens - Stress prelungit - Fumatul
141
- Infecii multe infecii bacteriene acute i cronice, unele infecii virale (ex. infecie herpes simplex, rabie, poliomielit), fungice (ex. acnomicoz) i parazitare (Pneumocyss carinii) - Distrucii sulare - Traum - Intervenii chirurgicale (ex. splenectomie) - Arsuri - Necroze (necroz hepac acut, pancreat acut) - Infarczri (infarctul miocardic, embolie pulmonar cu infarct pulmonar) - Sindrom inflamator acut i inflamator cronic sever (gut, boli de colagen) - Hemoragie acut - Hipoxie acut - Afeciuni metabolice i endocrine (cetoacidoza diabec, sindromul Cushing, criza reotoxic) - Neoplasme (n special n cazurile unde exist necroz tumoral sau unde boala este exns boal Hodgkin, melanom malign, sarcoame, carcinoame) - Afeciuni mieloproloferave i leucemii (leucemie granulocitar cronic, leucemie mielomonocitar cronic, sindrom mieloproliferav mielodispalzic, leucemia cu neutrofile, leucemia acut mieloid) - Rebound post neutropenie (dializ, postchimioterapie) - Eclampsie i pre-eclampsie Indus medicamentos (citokine ca G-CSF, adrenalin, corcosteroizi) Intoxicaii medicamentoase sau cu diferite alte substane chimice, veninuri (scorpion, albin) Numr sczut de neutrofile (neutropenie): nnscute - Sindromul Kostmann (agranulocitoz genec infanl) - Sindromul Shwachman (neutropenie cu deficiena pancreasului exocrin) - Neutropenie familial benign - Neutropenie familial sever - Sindromul Chediak-Higashi (defect de polimerizare a microtubulilor cu afectarea fagocitozei) Dobndite - Infecii bacteriene (unele infecii cu bacterii Gram negave, fos, bruceloz, tularemie, infecii bacteriene severe, infecii bacteriene la nou-nscui) - Infecii virale (rubeol, hepat infecioas, mononucleoz infecioas, infecie cu citomegalovirus, infecie HIV avansat) - Radioterapie
142
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR - Administarea unor droguri (ageni alchilani, interferon, sulfonamide .a.) - Infiltrarea mduvei osoase hematogene cu celule tumorale - Anemie megaloblasc (deficit de folat sau de vitamina B12) - Anemie aplasc - Hipersplenism - Nutropenie autoimun - Anafilaxie - Afeciuni endocrine: acromegalie, boal Addison, reotoxicoz - Alcoolism Numr crescut de eozinofile (eozinofilie): Afeciuni alergice (astm bronic alergic, eczem atopic, rinit alergic, urcarie) Infecii parazitare Sindrom Loffler Hipersensibilate medicamentoas (aspirina, beta-blocante, peniciline, cefalosporine, AINS etc.) Boli ale pielii (pemfigus, dermat herpeform) Boli autoimune i de colagen (sindromul Churg - Strauss, variant a poliarteritei nodoase, lupus eritematos sistemic, fasciita eozinofilic) Boal Hodgkin Leucemie granulocitar cronic, leucemie cu eozinofile, unele forme de leucemie acut mieloid, unele limfoproliferri n special cu limfocite T Administrare de citokine (GM-CSF, IL2, IL3) Sindrom hipereozinofilic idiopac - este diagnosc de excludere Numr sczut de eozinofile (eozinopenie) Stress acut (traumasme, intervenii chirurgicale, infarct miocardic, anoxie, expunere la frig) Sindrom Cushing Administrarea unor droguri (corcosteroizi i ACTH, adrenalin, histamin, prostaglandine) n mpul hemodializei Numr crescut de bazofile (bazofilie): Afeciuni mieloproliferave: leucemie granulocitar cronic, n policitemia vera, trombocitemie esenial, mielofibroz idiopac Leucemie acut mieloid cu bazofile Unele infecii virale (varicela) Hiporoidism Administrare de estrogeni Numr sczut de bazofile (bazopenie) Stress acut incluznd infecii, hemoragie Sindrom Cushing Reacii alergice (anafilaxie, urcarie) Hiperroidie Adinistrare de progesteron
IMUNITATEA CELULAR NNSCUT METODE DE ANALIZ N LABORATOR Numr crescut de monocite (monocitoz): Infecii cronice (tuberculoz, sifilis congenital) Afeciuni inflamatorii cronice (boala Chron, colit ulceroas, ciroz hepac, boli de colagen) Infecii virale (mononucleoza infecioas) Afeciuni hematologice (leucemie mielo-monocitar cronic, boala Gaucher) Hemodializ ndelungat Numr sczut de monocite (monocitopenie) Administrare de prednison Numr crescut de limfocite (limfocitoz):
143
Infecii virale (rubeol, varicel, hepat infecioas, mononucleoz infecioas, infecie cu citomegalovirus, infecie HIV etc.) Unele infecii bacteriene (pertusis, bruceloz, tuberculoz, sifilis, unele infecii bacteriene la copiii mici) Limfocitoz tranzitorie legat de stress: asociat infarctului miocardic, traumasmelor, complicaiilor obstetricale Administrare de adrenalin Splenectomie Status epilepcus Afeciuni endocrine (boal Addison, hiperroidism) Afeciuni limfoproliferave (leucemie limfac cronic, limfoame non Hodgkin, limfom Hodgkin, macroglobulinemie Waldenstrm) Reacii alergice la droguri Exerciiu fizic intens Numr sczut de limfocite (limfocitopenie) Stress acut (traumasme, intervenii chirurgicale, arsuri, infecii acute, insuficien hepac fulminant) Insuficien renal acut i cronic Afeciuni autoimune (boli de colagen, boala gref contra gazd) Sindrom Cushing Terapie citotoxic, imunosupresiv Radioterpaie Afeciuni hematologice (faza avansat a bolii Hodgkin, unele limfoame non-Hodgkin, anemie aplasc, sindroame mielodispalzice) Hipersplenism Stadiul final al infeciei HIV
144 13.2. FROTIUL PERIFERIC
Froul de snge reprezint modalitatea de studiere a morfologiei elementelor sanguine. Formula leucocitar reprezint exprimarea procentual a diferitelor puri de leucocite. Studiul froului de snge face parte integrant din invesgarea incipient obligatorie a oricarui bolnav, pentru c furnizeaz informaii importante asupra tuturor celulelor sanguine. Asel, froul de snge poate s indice fie direct diagnoscul, fie sugesi pentru invesgaii suplimentare. Froul de snge constuie o tehnic de baz a microscopiei clinice, de executarea corect depinznd o interpretare microscopic de calitate, ul diagnoscului. Examenul citologic al froului sanguin presupune colorarea prealabil a acestuia prin metoda May-Grnwald-Giemsa (MGG). Soluia May-Grnwald coloreaz bine citoplasma granulocitelor i granulaiile lor, nu coloreaz bine nucleul, eritrocitul i granulaiile azurofile. Soluia Giemsa coloreaz foarte evident nucleul i granulaiile azurofile, n acelai mp evideniaz eventualii parazii ai sngelui. Se examineaz la microscopul opc 100 leucocite dac numrul total de leucocite este pn la 15000/ microL i mai multe sute dac numrul este peste aceast valoare. n condiii de leucopenie sever se pot examina 50 de elemente, specificndu-se acest lucru. Se urmrete atent morfologia celular. Froul se parcurge n zig - zag, pe dou treimi ale lamei. 13.2.1. Recoltare Pentru examenele morfologice curente se folosete snge venos sau capilar. Se recolteaz snge integral venos, pe ancoagulantul K3EDTA, n vacutainere pentru hemogram (cu dop violet). Frourile trebuie efectuate ct mai repede posibil, pentru a evita liza celulelor sub aciunea ancoagulantului. Sngele capilar se recolteaz prin puncie capilar, la adult din pulpa degetului, iar la copilul mic din suprafaa plantar a calciului sau halucelui. Probele examinate se pastreaz la temperatura camerei 24 de ore. Interferene: Fragilitate leucocitar datorat administrrii de imunosupresoare i anneoplazice Fragilitate leucocitar n leucemia limfac cronic Agregare excesiv a leucocitelor n gamopai monoclonale (mielom mulplu), criofibrinogenemie (LES), n prezenta agluninelor la rece. 13.2.2. Interpretare Examinarea microscopic a granulocitelor urmrete: Formula leucocitar (numaratoare difereniat) Anomalii morfologice (Fig. 2) - de talie
gigantocite granulocite poliploide

- nucleare
hipersegmentare; hiposegmentare anomalie Pelger-Het
145
nuclei picnoci nuclei inelari

- citoplasmace
hipo-, hiper- sau agranularitatea neutrofilelor granule gigante, vacuole granulaii toxice corpi Dhle
Examinarea microscopic a limfocitelor urmrete: Forma, aspectul nucleului Semne de reacvitate (Fig. 3) - Citoplasma bazofil, abundent - Halou perinuclear Valori normale: Granulocite Eozinofile Bazofile Monocite Limfocite a 50 - 75 % 04% 01% 3 10 % 20 - 45 % b c
Fig. 13.2. a. neutrofil nesegmentat hipergranulat, vacuolizat; b. neutrofil intens vacuolizat; c. neutrofil vacuolizat, cu granulaii toxice
Fig. 13.3. Limfocite cu aspect reacv
146
13.3. CAZURI CLINICE INTERPRETAREA HEMOLEUCOGRAMELOR 1. Pacient n vrst de 66 de ani, acuz crampe abdominale, vom, distensie abdominal. Analize Rezultate Valori normale / UM WBC* 17,1 3,6 - 10 / *10/L NEU#* 15 1,4 - 6,5 / *10/L LYM#* 1,08 1,2 - 3,4 / *10/L MONO#* 0,988 0,1 - 0,6 / *10/L EOS#* 0,002 0,03 - 0,4 / *10/L BASO#* 0,062 0,01 - 0,08 / *10/L NEU%* 87,5 43,2 - 75,2 / % LYM%* 6,33 20,5 - 45 / % MONO%* 5,78 3,2 - 8 / % EOS%* 0,013 0-4/% BASO%* 0,36 0-1/% RBC#* 4,36 3,5 - 6 / *106/L HGB#* 12,5 12 - 17 / g/dL HCT* 37,3 36 - 54 / % MCV* 85,4 78 - 95 / fL MCH* 28,7 27 - 36 / pg MCHC* 33,6 32 - 36 / g/dL RDW 17,2 11 - 16,5 / % PLT* 280 150 - 450 / *10/L MPV* 8,68 7,4 - 11 / fL PCT 0,243 0,15 - 0,35 / % PDW 17,2 10 - 22 / fL Interpretare: leucocitoz cu neutrofilie (ocluzie intesnal) 2. Pacient n vrst de 77 de ani, acuz febr, transpiraii abundente nocturne, oboseal persistent, slbiciune, inapeten i pierdere n greutate. Analize Rezultate WBC* 1,13 NEU#* 0,065 LYM#* 0,941 MONO#* 0,052 EOS#* 0,005 BASO#* 0,064 NEU%* 5,8 LYM%* 83,4 MONO%* 4,65 EOS%* 0,45 BASO%* 5,65 RBC#* 2,54 HGB#* 6,82 HCT* 22,3 MCV* 87,7 MCH* 26,8 MCHC* 30,6 RDW 31,4 PLT* 37,5 MPV* ----PCT ----PDW ----Nr. re 16 Valori normale / UM 3,6 - 10 / *10/L 1,4 - 6,5 / *10/L 1,2 - 3,4 / *10/L 0,1 - 0,6 / *10/L 0,03 - 0,4 / *10/L 0,01 - 0,08 / *10/L 43,2 - 75,2 / % 20,5 - 45 / % 3,2 - 8 / % 0-4/% 0-1/% 3,5 - 6 / *106/L 11 - 15 / g/dL 36 - 48 / % 80 - 95 / fL 27 - 36 / pg 31 - 36 / g/dL 11 - 16,5 / % 150 - 450 / *10/L 7,4 - 11 / fL 0,15 - 0,35 / % 10 - 22 / fL 5 - 15 / /1000
147
Interpretare: pancitopenie - scderea tuturor celor trei serii leucocitar, eritrocitar, trombocitar; limfocitoz relav (leucemie acut) 3. Pacient n vrst de 11 de ani acuz lipsa poei de mncare, dureri abdominale, grea, balonare. Analize Rezultate Valori normale / UM WBC 6,42 4 - 12 / *10/L NEUT# 3,41 1,8 - 8 / *10/L LYMPH# 1,93 1,2 - 6,8 / *10/L MONO# 0,5 0 - 0,8 / *10/L EO# 0,53 0,03 - 0,4 / *10/L BASO# 0,05 0,01 - 0,08 / *10/L NEUT% 53 50 - 70 / % LYMPH% 30,1 25 - 40 / % MONO% 7,8 4-8/% EO% 8,3 0-4/% BASO% 0,8 0-1/% RBC 4,47 3,9 - 5,3 / *106/L HGB 12,2 12 - 15 / g/dl HCT 36,5 36 - 46 / % MCV 81,7 80 - 95 / fL MCH 27,3 23 - 34 / pg MCHC 33,4 28 - 35 / g/dl RDW-SD 35,9 37 - 54 / fl RDW-CV% 13,7 11 - 16 / % PLT 333 150 - 450 / *10/L PDW 10,4 12 - 16,5 / fl MPV 9,6 7,4 - 11 / fL P-LCR% 21,3 13 - 43 / % Interpretare: eozinofilie (parazitoz intesnal) 4. Pacient n vrst de 14 ani acuz astenie, febr, contuzii aprute la traumasme minime. Analize Rezultate Valori normale / UM WBC 178,98 4 - 12 / *10/L NEUT# 168,25 1,8 - 8 / *10/L LYMPH# 5,88 1,2 - 6,8 / *10/L MONO# 3,92 0 - 0,8 / *10/L EO# 0,18 0,03 - 0,4 / *10/L BASO# 0,75 0,01 - 0,08 / *10/L NEUT% 94 50 - 70 / % LYMPH% 3,3 25 - 40 / % MONO% 2,2 4-8/% EO% 0,1 0-4/% BASO% 0,4 0-1/% RBC 2,72 3,9 - 5,3 / *106/L HGB 10 12 - 15 / g/dl HCT 30 36 - 46 / % MCV 110,3 80 - 95 / fL MCH 36,8 23 - 34 / pg MCHC 33,3 28 - 35 / g/dl RDW-SD 84,8 37 - 54 / fl RDW-CV% 20,2 11 - 16 / % PLT 68 150 - 450 / *10/L PDW 9,7 12 - 16,5 / fl
148 MPV P-LCR% 8,6 17,8
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR 7,4 - 11 / fL 13 - 43 / %
Interpretare: leucocitoz cu neutrofilie marcat (leucemie granulocitar cronic) 5. Pacient n vrst de 64 de ani acuz afectarea strii generale, cu astenie, anorexie i pierdere n greutate. La examenul clinic se deceleaz ganglioni cervicali mrii i splenomegalie. Analize Rezultate Valori normale / UM WBC* 216 3,6 - 10 / *10/L NEU#* 3,57 1,4 - 6,5 / *10/L LYM#* 208 1,2 - 3,4 / *10/L MONO#* 0,472 0,1 - 0,6 / *10/L EOS#* 1,37 0,03 - 0,4 / *10/L BASO#* 2,98 0,01 - 0,08 / *10/L NEU%* 1,65 43,2 - 75,2 / % LYM%* 96,1 20,5 - 45 / % MONO%* 0,219 3,2 - 8 / % EOS%* 0,633 0-4/% BASO%* 1,38 0-1/% RBC#* 3,37 3,5 - 6 / *106/L HGB#* 9,67 11 - 15 / g/dL HCT* 32,3 36 - 48 / % MCV* 95,8 80 - 95 / fL MCH* 28,7 27 - 36 / pg MCHC* 30 31 - 36 / g/dL RDW 20,5 11 - 16,5 / % PLT* 173 150 - 450 / *10/L MPV* 8,1 7,4 - 11 / fL Analize Rezultate Valori normale / UM PCT 0,14 0,15 - 0,35 / % PDW 16,4 10 - 22 / fL Interpretare: leucocitoz cu limfocitoz (leucemie limfac cronic)
149
Capitolul 14 EXPLORAREA IMUNITII CELULARE NNSCUTE TESTE FUNCIONALE FAGOCITARE

Fagocitoza este un proces acv, determinat de legarea mediat de receptori a agentului patogen cu emitere de pseudopode membranare i internalizarea acestuia. Procesul este nespecific la primul contact cu angenul (prin intermediul receptorilor CD36), indiferent de pul agentului patogen. n cazul unei ntlniri anterioare cu agentul patogen are loc combinarea prealabil a acestuia cu ancorpi specifici i/sau factorul C3b de complement. Etape: 1. Chemotaxia- migrarea fagocitelor la locul inflamaiei 2. Fagocitoza ataarea parculelor la suprafaa celular i ingesa acestora 3. Distrugere intracelular - mecanisme dependente i independente de oxigen Etapa iniial a fagocitozei este determinat chimic, fiind declanat de o serie de reactani ai fazei acute (ageni chemotacci) eliberai n esutul lezat: LT, C5a, IL-1, TNF, IL-8, PAF, lipopolizaharide bacteriene (endotoxine), produi de degradare ai fibrelor de colagen i ai altor constueni celulari. Acea smuleaz producerea unor molecule de adeziune: L-selecne/Integrine (ELAM-1, ICAM-1, VCAM-1) de ctre celulele endoteliale. PMN, Mo i Ly vor adera la celulele endoteliale, vor emite pseudopode i se vor strecura printre spaiile interendoteliale n esuturile invadate/ lezate. 14.1. EVALUAREA CAPACITII CHEMOTACTICE A LEUCOCITELOR TESTUL DE MIGRARE Permite determinarea cantav prin citometrie n flux a funciei chemotacce a PMN i Mo. Sunt ulizate plci cu mulple godeuri n care se aplic pepdul chemotacc N-formil-Met-LeuPhe(fMLP) i dispozive cu filtru permeabil pentru Leu (mimnd camera Boyden) Testul permite determinarea numrului de neutrofile care au migrat prin filtrul permeabil, contra unui gradient de concentraie al chemoatractantului fMLP Prin analiz de citometrie nflux sunt evideniabile i modificarea formei celulare i scderea expresiei moleculelor de adeziune celular L-selecne (evideniate cu un ancorp an L-selecna marcat cu FITC). 14.1.1. Materiale i reacvi Placa cu 24 de godeuri + 24 dispozive cu filtru pentru diapedeza celular (dimensiune pori: 3), se ulizeaz 2godeuri / testare (Control + Smul fMLP) fig. 14.1. Reacvul A : mediu de separare al plasmei bogate in leucocite (12 tuburi, 1ml/tub) Reacvul B : tampon de incubare ( 20ml/flacon)
150
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR Reacvul C : conine pepdul chemotacc fMLP 200x (5l se dilueaz in 1ml reacv B, necesar 350l/test). Reacvul D : conine un ancorp monoclonal an L-selecne-FITC i microparcule autofluorescente (FL3, 670 nm) pentru numrarea celulelor Reacvul E : soluie cu colorant pentru ADN, concentrat 50x (5l se dilueaz n 250l reacv B, necesari 20l/test). Alte materiale: Tuburi colectoare heparinizate Tuburi Eppendorf de 1 sau 2 ml Tuburi Falcon BD pentru citometru 12x75mm Baie de ghea Pipete automate de volume diferite i vrfuri Termostat 37 C Vortex Flowcitometru (488nm) Figura 14.1. Structura plcii speciale cu godeuri i dispozivele cu filtru ulizate pentru testul de migrare al leucocitelor
14.1.2. Procedura a. Izolarea leucocitelor (Fig.14.2.): Se recolteaza cu max 24h inainte de efectuare i se depoziteaz la temperatura camerei 5ml snge integral heparinizat (!!! Nu se foloseste snge recoltat pe EDTA sau citrat) Se transfer 1ml snge integral peste reacvul A (fr amestecare), se las la temperatura camerei mp de 40 min pentru sedimentare spontan a hemailor sub stratul mai dens de tampon. Se colecteaz din partea superioar a tubului 500 microlitri de plasm bogat n leucocite (LRP Leukocyte Rich Plasma) i se transfer ntr-un tub Eppendorf de 2 ml
Se transfer 1ml snge integral peste reacvul A (fr amestecare) Sedimentare spontan, 40 min la temperatura camerei Se colecteaz 500 microlitri de plasm bogat n leucocite
Figura 14.2. Separarea plasmei bogate n leucocite cu ajutorul soluiilor dense saline b. Smularea (Fig. 14.3.) pentru fiecare pacient se realizeaz un test pereche nesmulat/smulat, prin introducerea n dou godeuri a : - Controlului negav (350l reacv B tampon de incubare) - Proba (350l reacv C - pepdul chemotacc fMLP ) adaugm n fiecare godeu cte o sit i n acestea cte 100l LRP, se acoper placa se incubeaz 30min la 37C.
EXPLORAREA IMUNITII CELULARE NNSCUTE TESTE FUNCIONALE FAGOCITARE

Controlului negav (350l reacv B tampon de incubare) Proba (350l reacv C - pepdul chemotacc fMLP ) Se adaug n fiecare godeu cte o sit Se adaug cte 100l LRP Se incubeaz 30min la 37C
151
Figura 14.3. Smularea migrrii leucocitelor c. Marcarea celulelor (Fig. 14.4.) dup incubare se ndeprteaz sitele i plasma din fiecare godeu se transfer n cte un tub de 5 ml (marcate cu 1 i 2) - tuburile se pun pe ghea. din sita godeului 1(controlul negav) se va recolta 20l plasma leucocitar nesmulat peste care se adaug 180l tampon salin (reacv B) = tubul 3- va folosi drept control pentru L-selecne n cele 3 tuburi se adaug 20l ancorp monoclonal an L-selecne-FITC i microparcule autofluorescente ( reacv D omogenizat), vortexare i incubare mp de 10min la ghea i ntuneric.
Figura 14.4. Marcarea L-selecnelor celulare pentru analiza prin citometrie n flux d. Colorarea materialului nucleic i analiza la citometrul n flux In fiecare tub se adaug cte 20l colorant diluat pentru ADN (reacv E), mixare i incubare mp de 5min la 0C n baia de ghea, la ntuneric. Se analizeaz suspensia de celule la flow citometru (488nm) n maximum 120 de minute dup colorare.
Figura 14.5. Colorarea ADN-ului celular n vederea analizei prin citometrie n flux
152 14.1.3. Interpretare rezultate
Tabel 14.I. Parametrii evideniai n cele trei tuburi Parametru 1 2 3 Eprubeta nr. 1 Numr de celule Eprubeta nr. 2 Numr de celule Valoarea medie a semnalului FSC Procentul celulelor acvate Eprubeta nr. 3 Valoarea medie a semnalului FSC Procentul celulelor acvate
Figura 14.6. Analiza citometric a tubului 1 (controlul negav celulele care au migrat chiar n lipsa smulului chemotacc): a. Regiunea R1 demarcheaz leucocitele i microparculele autofluorescente; b. Regiunea R2 demarcheaz microparculele autofluorescente folosite pentru aprecierea cantav a testului, iar R3 demarcheaz leucocitele
Figura 14.7. Analiza citometric a tubului 2 (controlul poziv): a. Regiunea R1 demarcheaz leucocitele i microparculele autofluorescente; b. Regiunea R2 demarcheaz microparculele autofluorescente folosite pentru aprecierea cantav a testului, iar R3 demarcheaz granulocitele care au rspuns masiv smulului fMLP (creterea dimensiunii semnalul pe FSC)
EXPLORAREA IMUNITII CELULARE NNSCUTE TESTE FUNCIONALE FAGOCITARE
153
Figura 14.8. a. Analiza tubului 2 (controlul poziv) histograma populaiei granulocitare din R3 a fig. 14.6 b (celulele acvate au o expresie mai redus a L-selecnei); b. Analiza tubului 3 (controlul negav celulele care nu au migrat prin filtre ) histograma populaiei granulocitare 14.1.4. Aplicaii Chemotaxismul anormal/redus al neutrofilelor s-a observat in diverse afeciuni clinice, nsoite de obicei de infecii recurente ale pielii i ale tractului respirator. Defecte congenitale: deficitul de adeziune al leucocitelor, hiperimunoglobulinemia E sau sindromul Job, sindromul Cediak Higashi. Defecte dobandite: insuficiena renal, diabetul zaharat, ciroza hepac, boala Hodgkin. complexele imune circulante din poliartrita reumatoid inhib de asemenea chemotaxia. Diverse medicamente si imunomodulatoare pot spori sau reduce acvitatea chemotacc a granulocitelor. 14.2. TESTUL DE ENDOCITOZ Sngele proaspt recoltat pe K3EDTA se amestec cu suspensie bacterian concentrat de Staphylococcus aureus, iar dup vortexare uoar amestecul se introduce la termostat mp de 1 or. Din amestec se nnd frouri i se coloreaz MGG (Fig.14.9.). Preparatele se pot pstra i analiza mp ndelungat. Fig.14.9. Endocitoz incubarea cu Staphylococcus aureus leucocit cu bacterii fagocitate, vacuole digesve
154
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR Examinare microscopic se examineaz 25 leucocite, notnd numrul de bacterii coninute n fieca-
re, conform tabelului 14.II. Tabel 14.II. Interpretarea testului de fagocitoz Numr cruci Cotare leucocite Index fagocitar = nr. bacterii x nr. cruci 0 3x0 0 + 4x1 4 ++ 6x2 12 +++ 12 x 3 36 Suma = 52
Nr. bacterii 0 1-24 25-49 > 50
Interpretare index fagocitar: 0-10 organism recepv (deficit de endocitoz) 10-24 organism slab recepv 25-49 organism imun (endocitoz normal) 50-75 organism bolnav (endocitoz accentuat) 14.3. TESTUL DE GENERARE A SPECIILOR REACTIVE ALE OXIGENULUI Speciile reacve ale oxigenului se formeaz din abunden n leucocitele care au endocitat microorganisme, prin Explozia oxidav, care presupune: Creterea consumului de O2 Glicoliza creterea oxidrii glucozei Formarea anionului superoxid, apei oxigenate i a acidului percloric:
2O2 + NADPH 2O2- + NADP+ + H+ O2- + 2H+ H2O2 HO H2O2 + Cl2 2HOCl 2HO + 2Cl
(NADPH oxidaza) (SOD superoxid dismutaza/Fe2+) (MPO mieloperoxidaza)
Radicalii derivai de O2 sunt detoxifiai de ceruloplasmin, transferin, superoxid dismutaz (SOD), catalaz & glutaon peroxidaz (H2O2) 14.3.1. Principiu Determinarea cantav a arderii oxidave leucocitare (capacitatea de a produce speciile reacve ale oxigenului sub aciunea complexului enzimac NADPH oxidaza / SOD/ MPOx) n urma smulrii ex vivo cu o suspensie de bacterii (E.coli) opsonizate Analiza se face prin citometrie in flux a procentului de PMN i Mo care convertesc dihydro-rhodamina redus DHR123 n R123 oxidat (cu capacitate fluorogenic) Control slab poziv = N-formyl-Met-Leu-Phe(fMLP) intens poziv = phorbol 12- myristate 13- acetate (PMA) produce smularea maximal a leucocitului
EXPLORAREA IMUNITII CELULARE NNSCUTE TESTE FUNCIONALE FAGOCITARE 14.3.2. Materiale i reacvi Snge recoltat pe heparinat de Na inut pe pat de ghea 10 min A tampon salin pentru splare (Instamed-Salts + ap dislat) B - suspensie E.coli (gata de ulizare 1-2 x 109 bacterii/ml) pe ghea 10 min C - 200x stoc 1mM fMLP (5 l diluat in 1 ml tampon de spalare) D - 200x stoc 1,62 mM PMA (5 l diluat in 1 ml tampon de spalare)
155
E - disc hare coninnd DHR 123 (se reconstuie prin injectarea 1ml solue de splare, cu 20-30 min nainte de ulizare, fr vortexare, soluie incolor) la ntuneric F - 10x stoc soluie de liz (diluat 1:10 cu ap dislat, se prepar 20 ml) G soluie colorant DNA (gata de ulizare), folosit pentru departajarea Leu de agregatele bacteriene n exces (ne-endocitate de Leu) Materiale suplimentare: tuburi vacutainer heparinizate (dop verde) 12x75mm tuburi de unic folosin pentru citometru baie de ghea ap dublu dislat micropipete 20-200l, 100-1000l i vrfuri baie de ap (termostat 37 C) termometru digital vortex centrifuga cu rotor axilar i rcire flow citometru - 488nm 14.3.3. Preparare reacvi 1. Dizolvare tampon salin n 1 L ap dublu dislat = soluie de splare A 2. Suspensia de E.Coli (B) se vortexeaz se pune pe ghea 3. Diluare fMLP (C) i PMA (D) 1:200 n soluia de splare (5 l n 1 ml), se ulizeaz 20 l/prob 4. Diluare soluie de liz (F) 1:10 n ap dublu dislat (se ulizeaz 2 ml/test) 20 ml 5. Reconstuirea DHR123 (E) prin injectarea 1 ml soluie de splare, repaus 20-30 min nainte de ulizare (se ulizeaz 20 l/test) 6. Pregrea bii de ghea 7. Baie nclzit la 37 C (controlul precis al temperaturii) 8. Pregrea flowcitometrului 14.3.4. Procedura a. Acvarea se ulizeaz doar snge heparinat 100L/tub , rcit in prealabil (incubat n baie de ghea 5-10 min) TUB 1 + 20 l control negav (soluia de spalare)
156 TUB 2 + 20 l E.coli (B) testul propriu-zis TUB 3 + 20 l fMLP (C) Low control TUB 4 + 20 l PMA (D) High control
4 x100L snge heparinat 0C
+ 20 l control negav (soluia de spalare) + 20 l E.coli (B) testul propriu-zis + 20 l fMLP (C) Low control + 20 l PMA (D) High control
la 0C vortex
Se incubeaz 10 min la 37C
Figura 14.10. Reprezentare schemac a etapei de acvare n testul de generare a speciilor reacve ale oxigenului b. Oxidarea + 20 l substrat DHR 123 (E) n fiecare tub, vortexare Incubare 10 min la 37 C
c. Lizare i fixare + 2ml soluie de liz (F) n fiecare tub Vortexare i incubare 20 min la temperatura camerei Centrifugare 5 min, 250 g , 2-8C Aruncarea supernatantului, prin rasturnare tub cu o singur micare d. Splare celule i colorarea ADN + 3 ml soluie de splare(A), apoi centrifugare 5 min, 250g, 2-8C Se arunc supernatantul prin aspirare + 200 l soluie colorare ADN (G) Vortexare i incubare 10 min pe ghea, protejat de lumin Pstrare la 0C protejat de lumin, analiza n 30 min 14.3.5. Analiza la citometrul in flux Se analizeaz 10.000-15.000 PMN i Mo, viabile (colorantul pentru ADN FL 2) Se calculeaz % de celule (att din clasa PMN ct i Mo) care exprim FL1 R123 (au Intensitatea Figura 14.11. Histograma pe FL2 pentru ADN-ul celulelor analizate
Fluorescenei Medii MFI > 10) vezi figura 14.12.
EXPLORAREA IMUNITII CELULARE NNSCUTE TESTE FUNCIONALE FAGOCITARE a b
157
Figura 14.12. Expesia R123 (FL1H) n PMN i Mo din a) controlul negav (tubul 1) i b) poziv (tubul 2) a b
Figura 14.13 Histograme pice pentru FL1 (R123) granulocitelor din a. tubul 2 - smulate cu E.coli, respecv b. tubul 4 smulate maximal cu PMA Rezultate ateptate Tabel 14.III Capacitatea normal (fiziologic) a PMN i Mo de a genera specii reacve ale oxigenului Tipul celulei Granulocite Smul E. coli fMLP PMA E. coli % celule acvate 97-100 1-10 98-100 70-100 Media FL1 150-500 300-1000 50-100
Monocite 14.3.6. Aplicaii clinice
Acvitate oxidazic redus poate apare n: a. Boala granulomatoas cronic: afecune X linkat (tulburare de funcionare a leucocitelor cu eecul fagocitozei - formarea de granuloame ) anomalii ale sistemului oxidav NADPH
158 simptome/semne manifestate n primii 2 ani: - pneumonii repetate - abcese limface, pulmonare, hepace - artrita supurav - osteomielita - bacteriemie/ fungemie
b. Pacieni cu SIDA, persoane n vrst, infecii severe, terapie cu N-acelcisteina, dup transplant de maduv
159
Capitolul 15 EXPLORAREA N LABORATOR A IMUNITII CELULARE SPECIFICE

15.1. INTRODUCERE Celulele implicate n imunitate specific sunt limfocitele T i B. Alturi de NK, acestea totalizeaz 2040% din elementele sanguine ale seriei albe, la adult. Proporia dintre ele este variabil (vezi tabelul 15.I.) Tabel 15.I. Clase de limfocite prezente n organism, markeri de suprafa i funcia acestora Clasa de limfoFuncia limfocitelor Markeri fenopici % cite CD19, CD20, Limfocit B Secree de ancorpi 23% (18-47%) CMH clasa II Liza celulelor infectate viral si a celuleCD16, CD56, NK 7% (2-13%) lor tumorale dar nu CD3 Elibereaza citokine i factori de cresteT helper TCR , CD3 i CD4 46% (28-59%) re ce regleaza alte celule imune Liza celulelor infectate viral, a celuleT citotoxic TCR , CD3 i CD8 19% (13-32%) lor tumorale si alogrefelor T Imunoreglare si citotoxicitate TCR i CD3
Modificri semnificave ale numrului total de limfocite, pot apare n: 1. Limfocitopenie - sepsis, arsuri, administrarea de corcosteroizi sau anneoplazice, radioterapie, imunodeficiene, stadiul final al infeciei HIV, leucemii, boal Hodgkin, hipersplenism, anemie aplasc, pneumonie, boal Gaucher, boala hemolic a nou-nscutului, purpur trombocitopenic, reacie post-tansfuzional. 2. Limfocitoz - infecii bacteriene sau virale, hepat, iradiere, mielom mulplu, leucemie limfocitar, limfoame, boal Addison, malnutriie, rotoxicoz, macroglobulinemie Waldenstrm. Limfocitoza poate fi: Fr modificri morfologice: - Dup efort fizic - Stress - Boli endocrine - Post splenectomie - Tuse convulsiv Cu modificri morfologice: - Modificri reacve: mononucleoz, toxoplasmoz, bruceloz, TBC, lues, HIV, hepate virale, CMV, LED, sarcoidoz - Creterea numrului de limfocite mari granulare apare uneori n infecia HIV, HVB, EBV;
160
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR - Vacuolizri apar la pacieni cu boli metabolice (ex. glicogenoze) - Limfoproliferri maligne: LLC, limfoame
15.1.1. Limfocitele B Au originea, iniial n ficatul fetal i ulterior n mduva hematogen i sunt rspunztoare de imunitatea umoral; n sngele periferic aproximav 10-20 % din limfocite aparin liniei B. Trec prin mai multe stadii de maturare / instruire pn s devin efectori competeni ai imunitii umorale 15.1.2. Limfocitele T Circul n snge, limf, dar cea mai important fracie se gsete cantonat n organele limfoide i sunt rspunztoare de imunitatea celular. Se gsesc n circulaia periferic, n drum spre organele limfoide primare sau n interiorul acestora, aflate n diferite stadii de maturare. Limfocitele T (CD3+) se mpart n mai multe subpopulaii celulare cu funcii specifice. Ele nu se deosebesc din punct de vedere morfologic: A. Limfocitele CD8+ sau citotoxice B. Limfocitele CD4+ sau ajuttoare (helper). Diferenierea limfocitului CD4+ naiv n limfocit efector de p Th1 sau Th2 este influenat de o serie de factori, dintre care cei mai importani par s fie citokinele prezente n fazele precoce de acvare i de expansiune clonal: a. n prezenta IL-12 i a IFN-gamma, CD4+ naive se vor diferenia n limfocite Th1; b. n prezena IL-4, CD4+ naive se vor diferenia n limfocite Th2 Th1: - sunt acvate de semnalele date de virusuri i bacterii intracelulare; - secret IL-2, IL-12, IFN gamma, TNF beta; - acveaz macrofagele, amplificndu-le capacitatea de secreie a citokinelor i potenialul de prezentare a angenelor; - acveaz sinteza ancorpilor IgG, dar nu a IgE; - sunt implicate n reaciile de hipersensibilitate ntarziat; Th2: - sunt smulate de alergene sau componente parazitare; - secret IL-4, IL-5, IL-6, IL-10; - acveaz sinteza de IgE; - smuleaz proliferarea i acvarea eozinofilelor; Creterea CD8 se ntlnete n: boli autoimune, infecii virale, reacii imune patologice de pul Gra versus host disease, rejet de transplant, deficiene imune congenitale sau dobndite (SIDA) Scderea CD8 se ntlnete n: LES sau dup tratament cu corcosteroizi Scderea CD4 apare n: infecii intercurente, leucopenii de diferite eologii, terapie cu steroizi sau cu imunosupresoare, efort fizic excesiv, intervenii chirurgicale, graviditate, stres psihic, variaie diurn CD4 scad spre amiaz i cresc sear. Raportul CD4/CD8 normal este dovada unui sistem imun sntos i are valoarea ntre 1 i 4. n infecia HIV scade numru CD4+ iar raportul devine subunitar.
EXPLORAREA N LABORATOR A IMUNITII CELULARE SPECIFICE
161
C. Celulele T (celule T gamma delta) reprezint un mic subset al celulelor T, care posed un alt receptor T la suprafa (TCR): majoritatea celulelor T au TCR alctuit din 2 lanuri gp - i -. Spre deosebire de acestea celulele T au TCR alctuit dintr-un lan gamma i unul delta; sunt abundente n mucoasa intesnal. D. Celulele T natural killer (NKT) sunt un grup heterogen de celule T, care au proprietile att ale celulelor NK, ct i ale celulelor T ; reprezint doar 0.2% din totalul limfocitelor T circulante n snge. 15.2. EXPLORAREA N LABORATOR A APRRII IMUNE CELULARE PRIN CITOMETRIE N FLUX 15.2.1. Principiile citometriei n flux Citometria n flux este o tehnic folosit pentru numrarea, examinarea i sortarea parculelor microscopice suspendate n fluid. Tehnica permite analiza simultan, mulparametric a caracteriscilor fizice i/sau chimice ale unei singure celule ce trece printrun sistem de detecie opc i/sau elecronic. Parametrii sunt determinai pentru fiecare celul n parte, cu o viteza de analiz de 200 10.000 celule/secund. Celulele aflate n suspensie sunt propulsate hidro-dinamic n flux, nainte s ntlneasc o surs de lumin opm focusat. Ca surs de lumin se folosete cel mai frecvent LASER-ul. Citometria n flux ulizeaz principiile mprerii luminii, excitrii i emisiei de ctre moleculele de fluorocromi, pentru a genera date mulparametrice despre parcule i celule cu diametre ntre 0,5 i 40m (figura 15.1.). Un citometru n flux are 3 componente principale: 1. Sistemul fluidic: a. Asigur trecerea celulelor, una cte una, prin dreptul radiaiei laser. Probele sunt ntotdeauna suspensii celulare b. Focalizare hidrodinamic datorit geometriei camerei de curgere, parculele sunt forate s se alinieze ntr-un flux laminar de dimensiuni relav mici c. Elemente: sistem de presiune, lichid de antrenare cu o compozie i densitate date, etc 2. Sistem opc (figura 15.2), pentru a smula/excita celulele i pentru a recupera semnalele: a. LASER (la citometrele moderne chiar mai multe surse) b. Lenle c. Filtre d. Detectori Figura 15.1. Reprezentare schemac a principiului citometriei in flux Laser Celule n suspensie marcate fluorescent
162
Figura 15.2. Reprezentare schemac a componentei opce/electronice a unui citometru in flux 3. Sistem electronic, pentru conversia semnalului opc n semnal electronic proporional i analiza de ctre un ordinator: a. Detectori care transform semnalele liniar SSC, FSC, sau logaritmic (FL) fluorescente n impulsuri electrice, (fotoelemente, tuburi fotomulplicatoare) b. Amplificatoare c. Convertor analog-digital d. Computer pentru analiza semnalelor Fluorocromii care pot fi ulizai sunt alei n funcie de LASER-ul folosit pentru excitare i de detectorii disponibili. 15.2.2. Parametri celulari determinabili prin citometrie n flux Intrinseci: Dimensiunea relav a celulelor (FSC Forward Scatter ) - lumin transmis inainte (prin mprsere sub unghiuri mici), proporional cu suprafaa (dimensiunea) celulei Complexitatea structural intern (SSC Side Scatter ) - lumin refractat i mprat sub unghiuri mari (la 90), proporional cu complexitatea structural intern a celulei Autofluorescen, pigmentaie
EXPLORAREA N LABORATOR A IMUNITII CELULARE SPECIFICE Extrinseci - msurarea emisiei fluorescente relave: Coninut de ADN, compoziia ADN, sinteza ADN Structura cromanei, ARN, proteine, grupri sulidril Angene (de suprafa, citoplasmace & nucleare) Componente ale citoscheletului, structura membranei (potenial, permeabilitate & fluiditate) Acvitate enzimac, endocitoz Concentraia calciului liber i legat, Apoptoza/necroza, pH, cineca medicamentoas, etc.
163
Datele generate pot fi reprezentate sub form de ploturi , n dou (figura 15.3.) sau chiar trei dimensiuni sau ntr-o singur dimensiune, sub form de histograme (figurile 14.8, 14.11, 14.13). Regiunile din aceste ploturi pot fi separate pe baza intensitii fluorescenei. Citometrele moderne analizeaz cteva sute/mii de parcule pe secund, n mp real i pot separa i izola parcule cu anumite proprieti.
Figura 15.3. Interpretarea co-expresiei a dou angene celulare, prin recunoatere specific cu ancorpi marcai FITC i PE Angene de suprafa: Subseturi limfocitare Imunofenopare : snge periferic & mduva osoas - Diagnoscul leucemiilor - Numrarea celulelor stem (CD34+). Detectarea celulelor rare <1:10.000. Receptori de citokine Diverse molecule speciale (cercetare)
164 Epitopi interni:
Citoplasmaci citokine (funcii celulare), specii reacve ale oxigenului Nucleari 15.2.3. Aplicaii ale citometriei n flux - Imunofenoparea n hematologie, pe lng volumul i complexitatea intern a celulelor, citometria n flux a devenit metoda preferat pentru stabilirea liniei, stadiului de maturaie, a clonalitii, markerilor aberani (imunofenoparea), precum i pentru caracterizarea mulrezistenei la droguri n celulele canceroase. 15.2.3.1. Analiza leucocitelor din snge periferic Amestec de limfocite, monocite i granulocite colorat cu ancorpi monoclonali an-: CD14 prezent pe monocite - marcat cu phycoerythrin (PE). CD45 (LCA) prezent pe toate leucocitele, la diferite densiti de suprafa marcat cu fluorescein isothiocyanate (FITC). Colectarea datelor a 10.000 celule pentru SSC, FSC (high and low angle scaer) & msurarea intensitii a dou fluorescene (FITC & PE) 4 parametri, la rezoluie de 256 canale (figura 15.4.).
Figura 15.4 Interpretarea co-expresiei pe leucocitele sanguine periferice, a dou angene celulare recunoscute specific cu ancorpi CD45 FITC (LCA) i CD14 PE (LPS receptor) 15.2.3.2. Analiza cantav a seturilor i subseturilor limfocitare din sngele periferic (figura 15.5.). CD45 este angenul comun leucocitar folosit pentru invesgarea celulelor hematopoece (toate elementele celulare albe exprim acest marker, cu un grad de intensitate variabil (limfocite > monocite > granulocite). Se folosesc markerii: CD45 (LCA), CD3 (T), CD4 (Th), CD8 (Tc), CD16+56 (NK), CD19 (B), CD14 (Mo). Rezultate - procentul i numrul absolut de limfocite: B totale (CD19+)
EXPLORAREA N LABORATOR A IMUNITII CELULARE SPECIFICE NK (CD3-CD16+/CD56+) T totale (CD3+) T helper (CD3+ CD4+) T citotoxice/supresoare (CD3+ CD8+) Raportul T helper / T citotoxice (CD4+/CD8+)
165
Figura 15.5 Interpretarea limfogramei periferice prin analiza expresiei unor markeri specifici pentru limfocitele T (CD3), B (CD19) i NK (CD16+56) Domenii de interes clinic: Imunodeficiene primare Imunodeficiene secundare Boli cu component autoimun Monitorizarea terapiei imunosupresive 15.2.3.3. Evaluarea hemopailor maligne Rezultate: Idenficarea celulelor maligne Determinarea proporiei acestora Stabilirea liniei lor de difereniere Domenii de interes clinic: Diagnoscul leucemiilor acute i al limfoproliferrilor cronice Markeri prognosci Monitorizarea efectelor terapiei aplicate Depistarea semnelor de boal minim rezidual Boli limfoproliferave cronice: CD5, CD19, an-k, an-l, CD3, CD20, CD23, CD10, CD45 Leucemii acute: CD10, CD19, CD13, CD33, CD34, CD45, CD7, CD14, CD3, An-HLA-DR Boli plasmocitare: CD38, an-k, an-l, CD45, CD56, CD19 15.2.3.4. Numrarea celulelor progenitoare Rezultate: numrul absolut de celule CD34+ din prob Domenii de interes clinic: auto- sau allotransplantul de celule progenitoare hematopoiece 15.2.3.5. Determinarea angenului HLA-B27 Rezultate: prezena / absena angenului HLA-B27 pe limfocitele T ale subiectului analizat Domenii de interes clinic: boli autoimune (spondilit anchilozant, etc)
166 15.2.3.6. Analiza cantav a ADN-ului celular
ADN-ul celular poate fi colorat cu un colorant fluorescent Colorani specifici pentru ADN (de ex. Iodura de Propidium) se leag stoechiometric Rezultate: msurarea cantii de ADN din celul Domenii de interes clinic: msurarea proliferrii liniilor celulare maligne n mduva hematopoiec Cuanficarea ADN+proteine specifice Determinarea ploidiei, detecia clonelor anormale Analiza ciclului celular Apoptoza Cariopul (analiza cromozomial) 15.2. LA FINALUL ACESTUI CAPITOL VEI PUTEA S CUNOTI: clasele i subclasele limfocitare principiile funcionrii citometrului n flux principiile recunoaterii celulelor prin imunofenopare aplicaiile medicale ale citometriei n flux
167
Capitolul 16 REACIA N LAN A POLIMERAZEI PCR

Reacia n lan a polimerazei (polymerase chain reaction , PCR) reprezint o modalitate extrem de sensibil de amplificare a unor canti mici de ADN. Acest metod i multudinea de tehnici derivate au dus la dezvoltarea unei noi ramuri n medicina de laborator, diagnoscul molecular. ntruct aceast tehnic implic amplificarea ADN, cea mai evident aplicaie a metodei reprezint detectarea unor canti minuscule de ADN. Acest aspect este important n detectarea prezenei agenilor patogeni n numr redus sau a modificrilor rapide care pot surveni la nivelul transcripiei unei celule, precum i detectarea unui profil de ADN specific unui individ. Alte aplicaii includ secvenierea ADN, introducerea de mutaii n secvene de ADN, clonarea i subclonarea secvenelor de ADN complementar, screening pentru boli genece etc. PCR este ulizabil pentru efectuarea unui numr mare de teste, un element esenial pentru adoptarea sa n laboratorul clinic. Ulizarea pentru numeroase probe simultan, specificitatea i sensibilitatea excelente i rapiditatea procedurii sunt principalele move pentru care aceast tehnic s-a rspndit att de repede n cadrul laboratoarelor de diagnosc molecular. n PCR, o secven unic a acidului nucleic de interes este aleas pentru amplificare, de exemplu, o mutaie genec, o oncogen, ADN-ul unui agent patogen etc. Specificitatea amplificrii este asigurat de ctre dou oligonucleode scurte, cu lungime cuprins, n general, ntre 15 i 30 baze, denumite primeri (amorse) de PCR. Acea servesc n amorsarea sintezei de ADN mediate de ctre ADN-polimeraz, pornind de la o secven int de ADN ulizat drept matri. Cei doi primeri sunt complementari celor dou catene de ADN, la nivelul extremitilor regiunii int alese pentru amplificare. Succesul amplificrii depinde de modificarea temperaturii mediului de reacie ntr-un mod ciclic. ntr-o prim etap a ciclului, temperatura este ridicat la 95-98C, pentru a denatura (disocia) secvena de ADN int. Dup un interval de pn la 60 secunde, temperatura este sczut pn la 50-70C, n funcie de protocol i este meninut la aceast valoare pentru nc 10-60 secunde. Aceast a doua etap faciliteaz ataarea (hibridizarea) primerilor la regiunile complementare din catenele ADN-ului int. Hibridizarea primerilor este mai eficient dect reataarea catenelor int, ntruct acea sunt n mare exces molar i sunt mult mai scuri i, prin urmare, au mobilitate mai mare. Hibridizarea primerilor duce la apariia unor regiuni dublu catenare, necesare pentru ataarea ADN polimerazei i pentru nceperea sintezei unei noi catene de ADN, uliznd ADN-ul int drept matri. n aceast metod, sinteza unei noi catene de ADN are loc la o temperatur de 65-75C. Dezvoltarea acestei tehnici a fost posibil dup descoperirea unei bacterii termofile, Thermus aquaticus , care triete n apele izvoarelor fierbini. ADN polimeraza acestei bacterii, denumit Taq polimeraz, este stabil la temperaturile ridicate necesare amplificrii, condiii n care alte ADN polimeraze se denatureaz.
168
COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR Succesiunea celor trei etape, denaturarea, hibridizarea primerilor i elongarea acestora reprezint un
ciclu de PCR. Repetarea ciclurilor de temperatur este realizat automat, cu ajutorul unui instrument denumit thermal cycler. Acesta nclzete i rcete ciclic tuburile n care are loc reacia de amplificare. Fiecare tub conine ADN-ul matri, ADN polimeraza (Taq), doi primeri, cele 4 puri de deoxinucleod trifosfat (dNTP), Mg2+ i un tampon necesar meninerii unui pH relav ridicat (aprox. 8,4) necesar acvitii enzimace a Taq polimerazei. Repetarea ciclurilor de temperatur conduce la o amplificare exponenial a regiunii int de ADN, ntruct, fiecare exemplar al ADN dublu catenar int este duplicat dup un ciclu (Figura 16.1.). Apoi,
5 3 3 5
1
5 3 3
3 5
5 3
4
3
5
5 3
3 5
5
5 3 5 3 3 5 3 5
5 3 5 3 3 5 3 5
6
5 3 5 3 5 3 5 3 3 5 3 5 5 3 5 3 3 5 3 5 5 3 5 3 3 5 3 5 3 5 3 5
Figura 16.1. Reprezentarea schemac a etapelor PCR
REACIA N LAN A POLIMERAZEI PCR
169
att ADN-ul original, ct i copia sa, pot servi drept matri n ciclul al doilea, generndu-se asel 4 copii ale regiunii originale. Dup al treilea ciclu, vor exista 8 copii ale ADN, iar aceast cretere exponenial a numrului de copii are loc i n ciclurile urmtoare. Asel, dup 32 cicluri de temperatur, se obin peste un miliard de copii ale regiunii de ADN originale, denumite ampliconi. n ulmele cicluri, amplificarea ajunge la un platou, ntruct cantatea de reacvi disponibili, de obicei dNTP, devine limitant. Asel, dei exist o faz exponenial a amplificrii, amplificarea exponenial pe parcursul tuturor ciclurilor de temperatur este doar teorec. Sensibilitatea i specificitatea PCR sunt influenate de mai muli factori, ntruct producerea de ampliconi specifici se face n funcie de complementaritatea primerilor fa de secvena int i de temperatura de hibridizare din fiecare ciclu. Temperatura de asociere/ disociere a primerilor (melting temperature , Tm) este temperatura la care 50% dintre primeri sunt ataai/ detaai de catena int de ADN. nclzirea mediului de reacie, n etapa de hibridizare, la o temperatur mai mare dect Tm va duce la disocierea primerilor de catenele int i amplificarea este ineficient, rezultnd o sensibilitate sczut. Invers, dac temperatura ulizat este mult mai mic dect Tm, legarea primerilor la catena int este favorizat att n regiunile de complementaritate, ct i n alte regiuni necomplementare, rezultnd o specificitate sczut a amplificrii. Tm pentru un primer anume crete odat cu lungimea acestuia i coninutul acestuia n guanozin-citozin (GC) i scade cu gradul de nepotrivire ntre secvena primerului i cea a ADN int. Temperatura de hibridizare ulizat cel mai frecvent n ciclurile de PCR este uor mai sczut dect Tm a celor doi primeri, iar acea trebuie concepui asel nct s aib temperaturi de disociere (Tm) foarte apropiate. n unele cazuri, temperatura din etapa de hibridizare a PCR este sczut treptat de la un ciclu la altul, de la o valoare mai mare, care favorizeaz amplificarea cu eficien mai mic, dar specificitate crescut, la o temperatur mai mic, ce faciliteaz amplificarea mai eficient a secvenelor specifice obinute n cursul primelor cicluri. n cazul scderii connue a temperaturii de hibridizare de-a lungul ciclurilor, procedura este numit touch-down PCR. Temperatura de hibridizare poate fi sczut mai puin uniform de-a lungul ciclurilor, de exemplu, poate fi sczut la fiecare 5 cicluri, caz n care procedura este denumit step-down PCR. Dei Taq polimeraza este relav tolerant fa de nepotrivirile de secven dintre catena matri i captul 5 al primerilor, enzima este ns foarte sensibil la nepotrivirile care survin la captul 3 al primerilor. Acest fenomen poate fi exploatat n conceperea unor primeri capabili s serveasc la amplificarea unei alele, dar nu a altei alele, cu secven asemntoare, a aceleiai gene. Tipizarea HLA este un exemplu de aplicaie pentru aceast strategie. Concentraia primerilor trebuie opmizat pentru fiecare pereche de primeri n parte. n general, o concentraie de 200 nM poate da rezultate bune i reprezinta un punct de plecare n procesul de opmizare. n cazul unei performane nesasfctoare, modificarea concentraiei fiecruia dintre primeri, independent de cellalt, ntr-un interval de la 50 nM la 500-1000 nM poate mbunti rezultatul amplificrii. n general, excesul de primeri favorizeaz ataarea nespecific a acestora, n mp ce o concentraie prea mic a acestora poate diminua eficiena amplificrii. Magneziul are rolul de cofactor pentru ADN polimerazele termostabile, concentraia ionului liber influennd stabilizarea atarii primerilor. Concentraia ADN int, concentraia dNTP, prezena proteinelor i a agenilor chelatori n prob (ex. EDTA, citrat), toate influeneaz cantatea de Mg2+ din mediul de reac-
170
ie. Excesul de Mg2+ reduce fidelitatea enzimei, promovnd amplificarea nespecific, n mp ce deficitul de Mg2+ scade eficiena PCR. Tamponul de reacie regleaz pH-ul mediului, afectnd att acvitatea, ct i fidelitatea ADN polimerazei. Canti moderate de KCl cresc acvitatea ADN polimerazei cu 50-60% fa de acvitatea acesteia n absena KCl. n general, este preferat o concentraie de KCl de 50 mM. n unele cazuri, adugarea de NH4- n tamponul de reacie crete specificitatea amplificrii, destabiliznd interaciunile nespecifice dintre primeri i catena matri. Ali adivi, precum dimel sulfoxidul i glicerolul, pot mbunti amplificarea secvenelor dificile, bogate n GC sau care prezint structuri secundare (bucle) stabile, prin scderea temperaturii de disociere a ADN. Concentraia opm a acestor adivi trebuie determinat experimental, n fiecare caz. O alt modalitate de cretere a specificitii este ulizarea hot-start PCR (PCR cu iniiere la temperatur nalt), n care un component esenial al reaciei, precum Taq polimeraza este izolat fizic sau chimic de restul constuenilor reaciei, pn n momentul denaturrii ADN. n primul caz, Taq polimeraza este adugat n amestecul de reacie ca ulm component, numai dup ce tuburile de reacie au fost nclzite la 95C. n al doilea caz, se ulizeaz forme modificate de Taq polimeraz, al cror situs acv este blocat la temperatura ambiant i este eliberat prin nclzirea din prima etap de denaturare. Alternav, se pot folosi ancorpi monoclonali care blocheaz situsul acv al enzimei la temperaturi sczute, iar interaciunea acestora cu enzima este diminuat la temperaturile ridicate, specifice procedurii de amplificare. n acest mod, polimeraza nu poate elonga primerii ataai nespecific la catena matri la temperaturi joase. Amplificarea cu succes a matriei de ADN depinde de calitatea i de cantatea acesteia. Reacvii ulizai de obicei pentru purificarea acizilor nucleici (sruri, guanidin, proteaze, solveni organici i sodium dodecil sulfat) sunt inacvatori puternici ai ADN polimerazei. ndeprtarea eficient a acestor compui din ADN-ul extras este esenial. Cantatea de ADN matri necesar ntr-o reacie depinde de complexitatea probei. Asel, analiza ADN-ului genomic necesit o cantate de ADN mai mare dect analiza probelor mai simple, precum ADN plasmidic. O cantate iniial de ADN prea mic va conduce la obinerea produsului de amplificare n cantate insuficient, n mp ce o cantate prea mare de ADN matri va fi nsoit de amplificare nespecific. Dup amplificarea regiunii int a ADN-ului din prob, ampliconii pot fi detectai prin diverse metode. Una dintre ele este electroforeza n gel de agaroz, n prezena unui agent intercalant fluorescent, precum bromura de ediu (EtBr). Acesta este o molecul capabil s se interpun ntre cele dou catene complementare ale ADN (ale ampliconilor, n cazul de fa). n urma acestui proces, EtBr i schimb conformaia i devine fluorescent: n cazul iluminrii gelului cu lumin de o anumit lungime de und din domeniul UV, moleculele de EtBr intercalate n structura ampliconilor emit lumin n spectrul vizibil. Gelul va prezenta asel regiuni luminoase n dreptul fraciunilor de ADN rezultate n urma electroforezei i poate fi fotografiat. Electroforeza ampliconilor n paralel cu un marker de greutate molecular, reprezentat de un amestec de mai multe fragmente de ADN de lungimi cunoscute, permite, de asemenea, calcularea lungimii ampliconilor n scopul verificrii identii sau specificitii acestora. O alt cale este detecia ampliconilor printr-o metod de p sandwich. Asel, ampliconii rezultai din amplificare sunt denaturai i adugai n microplci ale cror godeuri au fost acoperite cu sonde ADN
171
specifice. n cazul prezenei secvenei de interes n prob, ampliconii rezultai se ataeaz la sonde i sunt reinui n godeu n mpul etapelor de splare. Ulterior, sunt ulizate reacii chimice pentru detecia markerilor inclui n ampliconi n mpul PCR, facilitnd detecia colorimetric a ampliconilor. Asel, absena dezvoltrii reaciei de culoare n godeu indic un rezultat negav pentru proba pacientului, cu condiia ca toate controalele pozive i negave s fie valide. Asel de teste au fost ulizate pe scar larg pentru detecia prin PCR a Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae , HIV i HCV. Tehnica PCR mulplex este o metod complex, n care mai multe regiuni de interes sunt amplificate cu ajutorul mai multor perechi de primeri, ntr-o singur reacie. O aplicaie comun a PCR mulplex este verificarea existenei ADN-ului amplificabil sau a prezenei inhibitorilor de reacie ntr-o prob. n primul caz, n paralel cu amplificarea secvenei de interes, este amplificat i o secven dintr-o gen de control, prezent obligatoriu n genomul de analizat, de exemplu, un fragment din gena hormonului de cretere (cu rol de control intern endogen). n al doilea caz, se realizeaz amplificarea simultan a ADN de interes i a unei secvene de control intern, de provenien exogen. n ambele cazuri, absena amplificrii controlului intern, n lipsa amplificrii secvenei de interes, invalideaz rezultatul testului. Condiiile de reacie pentru PCR mulplex necesit opmizare minuioas, pentru a compensa pentru proprietile diferite ale multudinii de primeri existeni n mediul de reacie. Asel, trebuie evitate secvenele de primeri care s interacioneze ntre ele, iar, dac acea au temperaturi de disociere/ hibridizare diferite, se poate uliza touch-down PCR. PCR precedat de revers-transcripie (RT-PCR) este ulizat pentru analiza ARN. ntruct ADN polimeraza ulizat curent n PCR nu poate folosi drept matri o secven de ARN (este o ADN polimeraz ADN-dependent), catena de ARN este nti transcris ntr-o caten de ADN cu secven complementar (ADNc) cu ajutorul unei revers-transcriptaze (ADN polimeraz ARN-dependent). ADNc este mult mai stabil dect ARN i poate fi ulizat direct ca matri n PCR. RT-PCR este larg rspndit n laboratoarele de diagnosc molecular, servind, printre altele, la determinarea ncrcturilor virale pentru virusurile ARN (ex. HCV, HIV), la detecia translocaiei BCR-ABL n diagnoscul leucemiei mieloide cronice etc. PCR cu detecie n mp real (real-time PCR ) este o metod bazat pe generarea unui semnal fluorescent n mpul amplificrii ADN, care este detectat chiar n mpul ciclurilor de PCR (n mp real) i reflect cantatea de ampliconi sintezai dup fiecare ciclu. ntruct amplificarea este monitorizat chiar n mpul PCR, mpul de analiz este semnificav scurtat. Cel mai frecvent, nu mai este nevoie de prelucrarea suplimentar a produsului amplificat, ceea ce nseamn c tuburile de reacie rmn nchise n mpul ntregului proces, scznd drasc riscul de contaminare a altor probe cu ampliconi de la reaciile anterioare i, deci, riscul de rezultate fals pozive. Producerea semnalului fluorescent se poate realiza prin mai multe modaliti: prin ulizarea unui colorant intercalant, precum SYBRGreen, sau a unei secvene oligonucleodice cu rol de primer sau sond marcate cu o molecul fluorescent. Agenii intercalani sunt colorani nespecifici a cror fluorescen crete marcat atunci cnd acea se leag de ADN dublu catenar (Figura 16.2.). Ulizarea agenilor fluoresceni intercalani n real-me PCR este convenabil, datorit costului lor relav sczut. n acest caz, specificitatea este asigurat doar de perechea de primeri ulizai n amplificare. Dezavantajul metodei este nespecificitatea acestor colorani, asel c o cretere a fluorescenei este determinat att de acumularea ampliconului specific, ct
172 i a eventualilor produi de amplificare nespecific i a dimerilor de primeri. Ulizarea agenilor intercalani permite efectuarea analizei de disociere a ampliconilor, cu scopul idenficrii sau verificrii specificitii acestora. Asel, la sfritul ciclurilor de amplificare, temperatura mediului de reacie este sczut i fluorescena este mare, ca urmare a prezenei unui numr mare de produi dublu-catenari de amplificare. n cursul analizei de disociere, temperatura este crescut treptat pn la o valoare la care tot ADN-ul din tub este denaturat (catenele sunt disociate). n acest proces, pe msur ce crete temperatura, tot mai multe catene de ADN vor disocia, iar fluorescena scade treptat. La un moment dat, cnd temperatura mediului ajunge la temperatura de disociere specific ampliconilor (temperatura la care, stasc, 50% dintre ampliconi sunt disociai), viteza de scdere a fluorescenei este maxim, fenomen detectabil prin analiza curbei
SYBRGreen
Primer
Lumin emis
Polimeraz
Figura 16.2. Agenii intercalani fluoresceni sunt ulizai pentru monitorizarea creterii numrului de produi de amplificare dublu-catenari, n mpul ciclurilor de PCR
fluorescenei ca funcie de temperatur. Datorit efectului inhibitor, coloranii de pul SYBRGreen nu pot fi folosii n reacie n concentraii suficient de mari pentru a satura situsurile de legare din structura produilor de amplificare. De aceea, analiza curbei de disociere cu ajutorul SYBRGreen nu are acuratee mare. Au fost sintezai ns ali compui intercalani (ex. EvaGreen, LCGreen) fr efect inhibitor asupra PCR, care pot fi ulizai n concentraie saturant. Asel, n prezent, este posibil analiza de nalt rezoluie a disocierii ampliconilor (high resolution melting analysis , HRM), cu idenficarea variaiei de secven cu un singur nucleod fa de o secven martor. Metoda este ulizabil n idenficarea polimorfismelor puncforme (SNP) i a scanrii genelor pentru descoperirea unor mutaii necunoscute. O aplicaie a tehnicii este reprezentat de scanarea exonilor diverselor gene (KRAS, EGFR etc.) pentru detecia mutaiilor somace din diverse puri de cancer (ex. cancer de sn, de colon, endometrial, ovarian etc).
173
Majoritatea metodelor care ulizeaz oligonucleode marcate fluorescent au avantajul unei specificiti crescute fa de cea a agenilor intercalani. Dezavantajul acestora este dat de costul mai ridicat de sintez a oligonucleodelor fluorescente. Unul dintre cele mai cunoscute puri de oligonucleode fluorescente sunt sondele TaqMan. Acestea sunt oligonucleode scurte, complementare unei regiuni a ampliconului care nu este comun cu cea a situsului de hibridizare a primerilor. Metoda implic o specificitate sporit, prin contribuia suplimentar a sondei. Sonda este marcat la captul 5 cu o molecul fluorescent raportor, iar la captul 3 cu o molecul acceptor, care blocheaz fluorescena raportorului atunci cnd sonda este intact. n mpul fazei de extensie a PCR (elongarea primerilor), sonda hibridizat la amplicon este clivat datorit acvitii 5 nluceazice a Taq polimerazei, eliberndu-se asel molecula raportor de cea acceptor, cu emiterea de semnal fluorescent (Figura 16.3.). Semnalul fluorescent crete proporional cu numrul ampliconilor generai n faza exponenial a amplificrii. Un dezavantaj al metodei este acela c, odat hidrolizat sonda, aceasta nu mai poate fi uliazat n analiza curbei de disociere. Specificitatea excelent a sondelor TaqMan le-a asigurat, totui, un loc important n diagnoscul molecular, cu aplicaii diverse, de la detecia i cuanficarea genomurilor virale, la analiza polimorfismelor genice. Primer PCR Forward Fluorofor Inhibitor
Sond TaqMan
Primer PCR Revers Reacie de amplificare Polimerizare
Deplasarea i clivarea sondei Fluorescen
Rezultat Fluorescen
Produs PCR
Produs de clivare
Figura 16.3. Reprezentarea schemac a principiului funcionrii sondelor TaqMan
174

Compendiu LP MedLab 2013

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Compendiu LP MedLab 2013

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

1

Capitolul 2 FACTORI PREANALITICI CU IMPACT ASUPRA ANALIZELOR DE LABORATOR

FACTORI PREANALITICI CU IMPACT ASUPRA ANALIZELOR DE LABORATOR

FACTORI PREANALITICI CU IMPACT ASUPRA ANALIZELOR DE LABORATOR Instruciuni de recoltare la sugar

FACTORI PREANALITICI CU IMPACT ASUPRA ANALIZELOR DE LABORATOR

Stocai 30 min la temperatura camerei i dac e posibil la ntuneric

Figura 2.2. Obinerea plasmei i serului prin centrifugarea sngelui integral

FACTORI PREANALITICI CU IMPACT ASUPRA ANALIZELOR DE LABORATOR Lipemia

COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR

Capitolul 3 METODE OPTICE DE ANALIZ

COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR

Penetreaz atmosfera Pmntului?

Tipul radiaiei Lungimea de und (m) Scala aproximav a lungimii de und

22 3.1.4. Legile fotometriei

COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR

100, ( 0 < T < 100 )

Apertura ajustabil Sursa de lumin

Proba Monocromator Cuveta

Figura 3.4. Schema de principiu a unui spectro-/fotometru

24 3.2.3. Spectrofotometria de absorbie atomic (SAA)

COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR

Figura 3.5. Schema de principiu n SAA

METODE OPTICE DE ANALIZ

COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR

-h >A Atom n Atom n stare stare excitat fundamental

Figura 3.8. Schema de principiu a unui fluorimetru

METODE OPTICE DE ANALIZ

Capitolul 4 CONTROLUL DE CALITATE N LABORATOR

CONTROLUL DE CALITATE N LABORATOR

COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR

Liniile deviaiilor standard Zilele

COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR

nclcarea regulii 1:3S

Figura 4.4. nclcarea regulii 1:3S

nclcarea regulii 2:2S

Figura 4.5. nclcarea regulii 2:2S

nclcarea regulii 4:1S

Figura 4.6. nclcarea regulii 4:1S

CONTROLUL DE CALITATE N LABORATOR

nclcarea regulii 10:med

Figura 4.7. nclcarea regulii 10:med

COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR

Capitol 5 METODE POTENIOMETRICE PARAMETRII ECHILIBRULUI ACIDOBAZIC

COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR

[A-] [H3O+] [H2O] [HA]

[A-] [H3O+] [HA]

Ka = constanta de aciditate a componentei acide a tamponului.

[A-] pH = pKa + lg [HA]

METODE POTENIOMETRICE PARAMETRII ECHILIBRULUI ACIDOBAZIC

[HC03-] pCO2 0,03

[Na+]+[K+]-[Cl-]-[HCO3-]; n sngele venos = 5 - 14 mEq/L.

TCO2 (mEq/L) 0,45

sau: 555 vol.% CO2.

Electrod ion selecv

Electrozi de referin Ag/AgCl Soluie de umplere KCL

Referin intern Soluie intern

Faza ion selecv

Fig. 5.2. a. Schema de principiu a unui electrod ion-selecv; b. electrodul de potasiu

E = E0 + RT/zF x ln [X+]cunoscut / [X+]necunoscut

Electrod indicator Electrod de referin

COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR

48 5.4.3. Alcaloz respiratorie cauzat de hipervenlaie

COMPENDIU DE MEDICIN DE LABORATOR

METODE POTENIOMETRICE PARAMETRII ECHILIBRULUI ACIDOBAZIC 5.4.5. Anemia ca i cauz de dispnee