Prosiding Skripsi Semester Genap 2008 / 2 0 09

SK - 34

HIDROLISIS SUKROSA DENGAN ENZIM INVERTASE UNTUK PRODUKSI ETANOL MENGGUNAKAN Zymo m o n a s mobilis Nuzula Awwalurrizki*, Surya Rosa Putra 1 Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahua n Alam Institut Teknologi Sepuluh Nopember
ABSTRAK

Produksi etanol langsung dari substrat sukrosa oleh bakteri Zymo mo nas mobilis , menunjukkan konversi etanol yang lebih rendah daripada menggunakan campuran glukosa dan fruktosa. Pembent uka n hasil samping (sorbitol dan levan) dapat turun secara signifikan ketika menggunaka n sumber karbon campura n antara glukosa dan fruktosa. Untuk itu perlu dilakukan hidrolisa terhada p substrat sukrosa menggunakan enzim invertase sebelum fermenta si. Enzim invertase didapatka n dari ekstrak kasar ragi roti (Saccharom ycer cerevisiae ) yang di inkubasi selama 24 jam pada suhu 40 o C. Proses hidrolisis dengan enzim invertase dilakukan pada keadaan dimana aktivitas enzim mencapai maksimu m, yaitu pada pH 4,5 dengan inkubasi pada suhu 30 o C dan waktu inkubasi selama 5 jam. Besarnya gula reduksi hasil hidrolisis sebanyak 10,22 gram. Sumber karbon hasil hidrolisis inilah yang akan digunakan dalam ferment asi etanol pada pH 5,5. Fermentasi berjalan efektif selama 120 jam dengan jumlah sel bakteri awal sebanyak 2,6 x 10 10. . Pada kondisi tersebut, kadar etanol maksimu m yang dihasilkan adalah sebanyak 4,87 gram / 1 0 0 mL dengan yield etanol sebesar 92,89% jika dibandingkan dengan hasil teoritis. Kata kunci : Zymo mo n as mobilis , enzim invertase , yield etanol, ferment a si etanol ABSTRACT Ethanol production from sucrose by Zymomonas mobilis shows lower conversion into ethanol than from glucose and fructose. By- product formation (sorbitol and levan) was greatly reduced when an equimolar mixture of glucose and fructose was used as carbon source in culture. Cause of that sucrose needs to be hydrolized using invertase before ferment ation. Invertase enzymes obtained from yeast (Saccarom yces cerevisiae ) with incubation at temperat ure 30 o C for about 24 hours. Hydrolysis process using invertase were be done when the enzyme activity reached maximum at pH 4,5 with temperatur e incubation at 30 o C and incubation time for 5 hours. The amount of reduction sugar fron hydrolysis is 10,22 grams. This fraction will be used as carbon source in ethanol ferment ation at pH 5,5. Fermentation runs effefctively for 120 hours with initial bacterial cell as 2,6 x 10 10 (cell / mL). In this case, highest value of ethanol is 4,87 g/ 100 mL with 92,89% ethanol yield when compared in theoretical. Keywords : Zymo mo n as mobilis , invertase , ethanol yield, etanol ferment ation.

PENDAHULUAN Akses masyarakat Indonesia terhada p energi masih terbatas. Meskipun variasi sumberdaya energi dalam negeri beraga m dan cadangan minyak diperkirakan hanya mamp u mensu plai 18 tahun lagi, namun kenyataan nya, pangsa konsum si bahan bakar minyak mencapai proporsi tertinggi sekitar 63%. Tingkat konsum si yang tidak sebanding dengan tingkat pembent uka n menyebabka n kelangkaan terhada p bahan bakar tersebut.

Sumber bahan bakar merupaka n produk yang renewable sehingga tingkat recovery nya membut uh ka n waktu yang sangat lama (Mukhtasor, 2009).

Selain itu pembakaran bahan bakar fosil telah memberikan dam pak negatif terhada p lingkungan. Kualitas udara yang

Prosiding KIMIA FMIPA - ITS

semakin menur un ditambah adanya efek gas rumah kaca, indikasi ini sebagai penyebab peruba ha n iklim di muka bumi (Sri Utami, 2007). Sumber energi terbar uka n yang berpotensi besar untuk dikemba ngka n adalah sumber daya hayati atau biofuel . Salah satu teknologi yang dilakukan untuk menduku ng pengadaan energi ini yaitu produksi bietanol . Bakteri Zymo mo n as mobilis diyakini sebagai mikroorganis m e paling ideal penghasil etanol karena mem pro d u ksi etanol terbanyak, toleran terhada p etanol konsent ra si tinggi dan pH rendah. Zymo mo nas mobilis merupaka n bakteri anaerob fakultatif yang memanfaatkan glukosa, sukrosa dan fruktosa untuk menghasilkan etanol dengan jalur metabolisme Enter - deudor off Pathway (Tano dan Bozato, 2003). Selama ini, penggunaa n substrat gula yang sering digunakan untuk fermenta si yaitu glukosa atau sukrosa. Sukrosa lebih mudah didapatkan daripada glukosa karena sukrosa merupakan gula meja yang dikonsu m si sehari - hari. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Hani, 2009, produksi etanol dengan substrat sukrosa menghasilkan produk etanol sebanyak 61,18%. Rendahnya nilai ini disebabkan akibat adanya produk samping yang ikut dihasilkan selama proses fermenta si, contohnya levan dan sorbitol (Swing and Deley, 1977). Pembent uka n levan dan sorbitol, dapat menurunk a n ethanol yield sampai 80% dari teoritisnya (E. Favela, 1987). Berangkat dari masalah ini, sukrosa perlu dipecah terlebih dahulu menjadi gula sederhan a sebelum difermenta sikan. Enzim invertase merupaka n enzim yang memiliki efisiensi tinggi yang spesifik dalam menguba h sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa (dikenal dengan gula invert). Enzim invertase dapat diambil dari ekstrak kasar ragi roti (Saccharo m yces cerevisiae ). Khamir ini memiliki aktivitas invertase yang tinggi sehingga sukrosa dengan cepat diubah menjadi glukosa dan fruktosa untuk keperluan metabolisme nya. Dengan adanya enzim invertase, penggunaa n sukrosa akan lebih efektif dan diharapka n mam pu menur unka n produk samping yang terbent uk sehingga dapat meningkatkan kadar etanolnya. METODOLOGI PENELITIAN Alat dan Bahan

Alat Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah fermentor sistem batch yaitu menggunaka n erlenmeyer untuk fermenta si, ultrasonikator, cawan petri, tabung reaksi, laminar y air flow , autoclave , inkubat or, rotary shaker , centrifuge Thermo IEC CL40R, kromat ografi gas Shimadzu GC- 14B, spektronik Genesys 20, termom e ter, neraca analitik mettler AE 200, pH meter 510, homogenizer, penangas serta peralatan gelas lain. Bahan Mikroorganism e yang digunakan dalam penelitian ini adalah biakan Zymo mo n as mobilis dari Jepang. Media Zymo mo nas mobilis yang digunakan untuk regenerasi dan penum b u h a n (agar miring) adalah Nutrient Agar (NA) 5%. Media untuk starter terdiri atas KH2 PO 4 1,0 g/L, (NH 4 )2 SO4 1,0 g/L, MgSO 4 .7H 2 O 0,5 g/L, yeast extract 5g/L, dan glukosa 100g /L. Media untuk fermentasi terdiri atas sukrosa 100g /L, yeast extract 5g/L, KH2 PO 4 1,0g /L, (NH 4 )2 SO4 1,0g /L, MgSO 4 .7H 2 O 0,5 g/L. Crude invertase dibuat dari ragi roti (Saccharo m yces cereviciae ). Reagen lain yang dibutuhka n diantaranya ; NaHCO 3 , asam sitrat dan na- sitrat untuk buffer sitrat, reagen bradfod, BSA, reagen Somogy - nelson A dan B, reagen arseno molybdad. PROSEDUR KERJA Isolasi Ekstrak Kasar Invertase dari Ragi Roti (Saccharo m y c es cerevisiae) Ragi roti sebanyak 55 gram ditimbang, dimas ukkan kedalam beaker gelas kemudian ditambahkan 150 ml NaHCO 3 dan diaduk sampai menjadi bubur. Bubur ragi yang didapat dimas ukkan ke dalam homogenizer dan diputar pada 7500 rms selama 5 menit. Bubur yang telah di homogenizer dituang ke dalam erlenmeyer. Mulut erlenmeyer ditutup dengan kapas yang sudah dibalut kasa - aluminium foil. Selanjut nya diinkubasi pada suhu 40 o C selama 24 jam. Hasil inkubasi diautolisis dengan menggunaka n ultrasonifikator pada 16 rms selama 20 menit. Setelah proses autolisa ini, campura n disentrifuge selama 15 menit pada suhu 10 o C dengan kecepatan 3500 rms. Proses ini terbent uk filtrate dan residu, filtrat yang terbent uk didekanta si dan diperoleh super nata n nya. Supernat a n

Prosiding KIMIA FMIPA - ITS

yang diperoleh merupakan preparat enzim invertase. Penentuan Kurva Standar Gula Invert secara Spektrofotom etri Penentua n gula invert secara spektrofoto m e t ri dilakukan dengan pembuat a n kurva standart gula invert yang menghub u ngka n antara konsentra si dengan absorbansi. Standart gula invert dibuat dengan cara: Larutan gula invert 0,0025M dibuat variasi konsentr asi yaitu 1; 1,25; 1,5; 1,75; 2; 2,25 dan 2,5 (x10 - 3 M) dengan pelarut aquades. Selanjutnya masing masing dimas ukkan dalam tabung reaksi sebanyak 0,5 ml. Kadar gula reduksinya ditentuka n dengan menggunakan metode Somogy - Nelson. Pengukura n secara spektrofoto m e t ri dilakukan pada panjang gelomba ng 540 nm. Penentuan Kandungan Protein Invertase Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Bradford Panjang gelombang maksimu m ( maks) ditentuka n dengan menggunaka n larutan standart Bovine Serum Albumine (BSA) yang ditambah dengan reagen Bradford kemudian ditentuka n serapannya menggunaka n spektrofoto me t er. Larutan Bradfod dibuat dengan cara: 25 mg coomise brilliant blue G- 250 dilarutkan dalam 12,5 ml etanol 95% (v/v dan ditambahka n dengan 25 ml asam fosfat 85%(w/v). Larutan yang di dapat diencerkan dengan aquadest sampai 250 ml. Larutan stok BSA 2000 ppm (dibuat dari 100 mg BSA dalam 25 ml aquades, diaduk perlahan - lahan, setelah itu diencerkan sam pai 50 ml). Selanjutnya diambil sebanyak 5 ml dan ditambahka n 3 ml reagen Bradford dan diencerkan sampai 10 ml. Larutan ini diaduk dan diinkubasi selama 5 menit pada temperat ur 37 0 C. Larutan standart BSA diukur absorbansinya menggunakan spektrofoto m e t er pada panjang gelombang 560 - 620 nm dengan interval 5 nm sebanyak tiga kali untuk masing - masing panjang gelombang, kurva dibuat antara panjang gelomb ang () terhada p absorba nsi (A) sehingga diperoleh maks . Pembuatan Kurva Standar BSA Kurva standart BSA dibuat dengan membua t beberapa konsentr asi yaitu: 100 ppm, 200 ppm, 300 ppm, 400 ppm, 500 ppm, 600 ppm, 700 ppm. Variasi konsent ra si larutan tersebut dibuat dengan menggunaka n larutan standart BSA 2000

ppm dengan cara diambil sebanyak 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5 ml lalu diencerkan dengan aquades t sampai 10 ml. Selanjutnya diambil 7 ml dan ditambahka n 3 ml reagen bradfod. Larutan diaduk dan diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37 0 C. Pengukura n absorba nsi dilakukan dengan menggunaka n spektrofot o m e ter pada panjang gelombang maksimu m yang telah didapatkan pada prosed ur sebelum nya. Blanko dibuat dengan 7 ml aquades yang ditam ba h 3 ml reagen Bradford. Penentuan Kandungan Protein Invertase Penent ua n kandunga n protein pada crude invertase dilakukan dengan mengencerkan 1 ml enzim invertase dengan aquadet sam pai 10 ml. Hasil pengenceran diambil 7 ml dan ditam ba hka n 3 ml reagen Bradfod, lalu diinkubasi selama 5 menit. Setelah waktu inkubasi, adsorba nsi larutan enzim invertase ditentukan pada panjang gelombeng maksim um dan diukur secara duplo. Hasil adsorbansi yang diperoleh dikonversikan pada persam aa n garis dari kurva standar t BSA yang telah dibuat sehingga didapatka n konsentra si enzim invertase. Penentuan Kondisi Optimum Invertase Kondisi optimu m reaksi enzim meliputi suhu, pH dan lama inkubasi. Kondisi ini di tentuka n melalui serangkaian percobaan yang kondisinya divariasikan. Penent ua n suhu optimu m dilakukan dengan cara sebagai berikut : Larutan sukrosa 0,25 M sebanyak 2 mL dengan pH 4,5 dimas ukkan kedalam 6 tabung reaksi. Masing- masing tabung diatur suhunya (20 o C, 25 o C, 37 o C, 60 o C, 80 o C, 100 o C). Selanjutnya ditamba hka n 1 mL enzim invertase pada tiap tabung dan diinkubasi selama 20 menit (selama inkubasi suhu tetap dalam keadaan terjaga). Tabung tabung tersebut dipanaskan dalam air mendidih selama 10 menit. Setelah dingin, gula reduksi yang terbent uk diukur menggunaka n metode Somogy- Nelson. Sebelum diukur perlu dilakukan pengenceran agar serapannya dapat terbaca. Penent ua n pH optim um dilakukan dengan cara sebagai berikut : larutan sukrosa 0,25 M sebanyak 2 mL dalam tabung reaksi dibuat dengan variasi pH (3; 4; 4,5; 5; 5,5; 6 dan 7). Masing- masing fraksi ditambahkan 1 mL enzim invertase dan diinkubasi selama 20 menit pada suhu

Prosiding KIMIA FMIPA - ITS

ruang. Kemudian dipanaskan dalam air mendidih selama 10 menit. Selanjut nya didinginkan. Gula reduksi yang terbent uk diukur menggunakan metode Somogy Nelson. Sebelum diukur perlu dilakukan pengenceran agar serapannya dapat terbaca. Lama inkubasi reaksi enzimatis ditentuka n dengan cara sebagai berikut : disediakan beberapa labu erlenmeyer. Masing - masing diisi dengan larutan sukrosa 10% sebanyak 100 mL dalam buffer sitrat dengan pH 4,5. Ke dalam masing masing erlenmeyer ditambahka n 5 mL enzim. Perbandi ngan enzim dengan substrat sukrosa 10 % adalah 1:20. Kemudian diinkubasi pada suhu optimu m selama beberapa jam dengan kecepatan 60 rpm. Setiap interval waktu 1 jam reaksi dihentikan dengan pemana sa n dalam air mendidih selama 10 menit. Kadar gula reduksi ditentukan dengan metode Somogy - Nelson. Sebelum diukur perlu dilakukan pengenceran agar serapannya dapat terbaca. Regenerasi Zymo m on a s mobilis Biakan murni Zymo mo nas mobilis diremajakan pada agar miring (media NA) pH 5,5 yang telah disterilisasi pada suhu 121 o C dan tekanan 1 atm selama 30 menit, selanjut nya diinkubasi pada suhu 30 o C selama 24 jam. Zymo mo n as mobilis pada agar miring (media NA) ini menjadi stok kultur yang diregenerasi pada media NA yang baru sebelum digunakan. Kultur baru diinokulasikan pada 10 ml media kompleks pH 5,5 sebagai starter awal dan diinkubasi dengan shaker selama 20 jam suhu 30 o C yang selanjutnya akan ditransfer ke media yang lebih besar yaitu 90 ml media kompleks dengan perlakuan dan inkubasi yang sama setelah media menunj ukkan keadaan yang keruh menandaka n bakteri mem perba nyak diri. Sebanyak 100 ml starter selanjut nya ditransfer dengan perlakuan yang sama sampai volume 1000 ml. Penentuan Kurva Petumbuhan Zymo m on a s mobilis . Sebanyak satu ose Zymo mo n as mobilis dari media padat (NA) agar miring diinokulasi pada 10 mL media dan diinkubasi pada suhu 30 o C selama 20 jam dengan di shaker 120 rpm. Setelah 20 jam, starter ini ditransfer ke 90 mL media kompleks dan diinkubasi pada kondisi yang sama. 100 mL starter ini selanjut nya

ditransfer lagi ke dalam 900 media kompleks dan diinkubasi pada suhu 30 o C dan di shaker 120 rpm. Selama inkubasi, pertam bah a n biomas sa setiap jam dimonitor dengan pengukur an turbiditas menggunaka n Spektronik Genesys 20 pada 540 nm. Pembuatan Media Fermentasi (Hidrolisat) Media Fermentasi dibuat sebanyak 800 mL untuk 8 proses fermentasi. Enzim invertase yang ditambahka n dengan perban dingan 20 : 1. Sukrosa 10 % dilarutkan dalam larutan buffer dengan pH optimu m yang akan dicari. Kemudian ditam ba hka n 5 mL enzim dalam 100 mL larutan substrat. Selanjutnya diinkubasi berdasarkan waktu optimu m. Enzim yang ada dimatikan dengan cara dipanaskan pada air mendidih selama 10 menit. Larutan yang terbent uk disentrifuse. Filtrat yang didapat diuji kadar gula invertnya menggunaka n metode Somogy- Nelson. Filtrat ini yang akan digunakan sebagai media ferment asi. Penentuan Pola Fermentasi Fermentasi menggunakan bakteri Zymomonas mobilis dilakukan dalam 8 labu erlenmeyer yang diisi dengan 100 mL media ferment asi yang telah dihidrolisis oleh enzim invertase dalam kondisi suhu, pH dan lama inkubasi optim u m (hidrolisat) ditam ba h biomas sa hasil sentrifuse 200 mL inokulum. Fermentasi ini dilakukan pada inkubator shaker 50 rpm. Hasil ferment a si diambil setiap 15 jam sekali sampai 120 jam untuk disentrifuse (memisahkan filtrat dengan biomass a) sehingga filtratnya dapat diuji kualitatif etanol, residu glukosa dan kadar etanolnya. HASIL DAN DISKUSI Isolasi Ekstrak Kasar Invertase dari Ragi Roti (Saccharo m y c e s cerevisiae ) Ragi roti sebanyak 55 gram dilarutkan kedalam larutan NaHCO 3 0,1 M sebanyak 150 mL. NaHCO 3 ini berfungsi untuk melarutkan sel ragi sehingga pada akhirnya enzim invertase akan berada pada filtratnya. Selanjutnya larutan ini diaduk sampai menjadi bubur. Buburan ragi dimasukka n ke dalam homogenizer pada 7500 rpm selama 5 menit. Homogenizer berfungsi untuk menghom oge nk an larutan dengan ragi. Bubur yang didapat dituang dalam 3 erlenmeyer 250 mL. Penutup erlenmeyer dibuat dari kapas yang dibalut kasa - aluminium foil. Pada penutu p ini

Prosiding KIMIA FMIPA - ITS

diberi beberapa lubang kecil yang berfungsi untuk mengura ngi tekanan udara didalam nya apabila adonan mulai mengem bang. Bubur ragi dalam erlenmeyer diinkubasi pada suhu 40 o C selama 24 jam. Inkubasi ini diperlukan untuk mengeluarkan enzim dari ragi. Setelah inkubasi, pada bubur dilakukan pemecahan sel menggunakan ultrasonifikator pada kecepatan 16 rms selama 20 menit. Larutan hasil autolisa selanjutnya disentrifuge pada suhu 10 o C dengan kecepatan 3500 rpm. Filtrat yang terbent uk didekanta si dan diperoleh supernata n nya. Supernata n inilah yang disebut sebagai crude invertase yang berwarna kuning. Ekstrak kasar invertase dapat dilihat pada gambar berikut: Penentuan Kurva Standar Gula Invert Secara Spektrofotom etri Penentua n kurva standart gula invert ini bertujuan untuk menent u ka n persa m aa n yang nantinya akan digunakan untuk menghitung konsent ra si gula reduksi (gula invert) yang terbent uk dari hasil hidrolisis sukrosa oleh enzim invertase. Standart gula invert dibuat dengan cara membua t larutan gula invert 0,0025 M yang kemudian diencerkan dalam pelarut aquades sehingga didapatkan beberapa variasi konsentra si 1; 1,25; 1,5; 2; 2,25 dan 2,5 (x 10 - 3 M). Masing - masing larutan dimasukka n dalam tabung reaksi sebanyak 0,5 mL. Karena fruktosa dan glukosa merupakan gula reduksi sehingga analisa gula invert dilakukan dengan menggunaka n metode Somogy- Nelson. Kurva standar guls invert dibuat dengan mengalurkan nilai absorban si terhada p konsentr asi larutan. Dari hubunga n keduanya, didapatkan grafik sebagai berikut:

bahwa nilai absorbansi mengalami kenaikan sejalan dengan semakin besarnya konsentra si gula invert dalam larutan, sehingga didapatkan persa m a an kurva yang memenu hi hukum Lambert - Beer y = 977.231 x Nilai R2 dari kurva diatas adalah 0,998, hal ini menunjukkan bahwa kelinearan kurva standart baik karena hampir mendekati +1, yang mana titik- titik pada kurva standart melewati garis lerengnya. Penentuan Kandungan Protein Ekstrak Kasar Invertase Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Bradford Larutan stok BSA 2000 ppm dapat dibuat dengan cara: 100 mg BSA dilarutkan dalam 25 mL aquades kemudian diaduk perlahan sampai larut setelah itu diencerkan dengan aquades sampai 50 mL. Larutan ini diambil sebanyak 5 mL dan ditam ba hka n 3 mL reagen Bradford lalu diencerkan dengan aquades sampai volume 10 mL. Larutan ini dibiarkan selama 5 menit pada suhu ruang untuk menyem p u r n a kan reaksi antara Bradford dengan protein pada enzim. Reagen Bradford dibuat dengan cara : coomise brilliant blue G- 250 sebanyak 25 mg dilarutkan dalam 1,5 mL etanol 95 % (v/v) dan ditamba hka n asam fosfat 85 % (w/v). Larutan ini diencerkan sampai volume 250 mL. Setelah dicampur dengan reagen Bradford, larutan diukur absorban si nya menggunaka n spektrofot o m e ter pada kisaran panjang gelomba ng 560 - 620 nm karena warna yang diserap oleh larutan adalah biru sedangkan warna biru memiliki panjang gelombang antara 580 - 595 (Khopkar, 1995). Untuk larutan blanko yang digunakan dibuat dengan menam b ahka n 3 mL reagen Bradford dan 7 mL aquades. Dari nilai pengukuran absorbansi didapatkan grafik sebagai berikut.

Gambar invert Dari

Kurva

standart

gula

grafik

diatas

dapat

dilihat

Gambar 2 Kurva Absorban si dalam Variasi

Prosiding KIMIA FMIPA - ITS

Gelombang () Gambar 2 menunj ukkan bahwa puncak absorbansi tertinggi dicapai pada panjang gelombang 595 nm. Setelah itu turun seiring menjauhnya puncak serapan. Serapan ini dihasilkan karena terjadi absorbsi sinar tampak oleh kompleks com m assie brilliant blue- kasein pada panjang gelombang maksi mu m nya akan diperoleh kepekaan analitis yang tinggi. Hasil yang didapat ini didukung oleh penelitian yang dilakukan AA. Bradford (1976), yaitu serapan maksim um terletak pada 595 nm. Panjang 4.1.1 Pembuatan Kurva Standar BSA Kurva standart BSA dibuat dengan membua t beberapa pengenceran dari larutan induk BSA 2000 ppm menjadi beberapa konsent ra si yaitu: 100 ppm, 200 ppm, 300 ppm, 400 ppm, 500 ppm, 600 ppm, 700 ppm. Variasi konsentra si larutan tersebut dibuat dengan menggunaka n larutan standart BSA 2000 ppm, larutan tersebut diambil sebanyak 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5 mL lalu diencerkan dengan aquades sampai 10 ml. Selanjut nya diambil 7 ml dan ditambahka n 3 ml reagen bradfod. Masing masing larutan diaduk dan diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang. Kemudian pengukura n absorba nsi dilakukan dengan menggunaka n spektrofoto m e t er pada panjang gelombang maksi mu m yang telah ditentuka n sebelum nya yaitu pada = 595 nm . Blanko yang digunakan adalah 7 ml aquades yang ditam ba h dengan 3 ml reagen Bradfod. Kurva standar dibuat dengan mengalurkan absorbansi sebagai ordinat (sumbu y) dan konsent rasi sebagai absis (sumbu x).

hingga diperoleh persa maa n garis antara konsentra si BSA dan absorba nsi yaitu: y = 0,001339x Koefisien korelasi dari kurva pengama t a n adalah R2 = 0,998 hasil

Penentuan Kandungan Protein Ekstrak kasar Invertase Crude diambil sebanyak 1 mL kemudian diencerkan menjadi 10 mL, setelah itu hasil pengenceran tersebut diambil sebanyak 7 mL dan ditam ba hka n 3 mL reagen Bradford. Larutan ini dibiarkan selama 5 menit untuk menyem p ur na ka n reaksi yang terjadi. Larutan yang telah diinkubasi diukur serapan nya menggunaka n spektrofot o m e ter pada panjang gelombang maksimu m yang didapat, yaitu 595 nm. Absorbansi yang dihasilkan adalah sebesar 1,112 dan 1,114 sehingga diambil rata - ratanya sebesar 1,113. Hasil absorbansi ini dimas ukka n kedalam persa ma a n reaksi y= 0,001339 x. Dari perhitungan diperoleh konsent rasi crude invertase yang terukur sebesar 831,217 ppm sedangkan konsent ra si crude invertase sebenarnya yaitu sebesar 11.874,533 ppm didapatkan dengan cara mengalikan konsentr asi terukur dengan faktor kali 100 / 7 (10/1 x 10/ 7), dimana pengenceran dengan aquades (10/1) dan pengenceran akibat penam ba ha n reagen Bradford (10/7). Hasil ini kemudian dikonversikan dalam mg sehingga diketahui dalam 1 mL crude invertase mengand u n g 11,87 mg protein. Penentuan Kondisi Optimum Ekstrak Kasar Enzim Invertase Perbedaan pH berpengaru h terhada p 2 jenis, yaitu struktur enzim dan gugus fungsional enzim. Suatu enzim dapat menghasilkan produk yang maksimal pada pH optim u m nya. Dari hasil penentua n pH optimu m crude invertase diperoleh gambar 4. 7

Gambar 3 Kurva Standart Larutan BSA Nilai absorbansi mengalami kenaikan seiring bertam bah nya konsentr asi BSA

Prosiding KIMIA FMIPA - ITS

Gambar 4 Pengaruh pH terhada p Aktivitas Enzim Invertase Gambar diatas menunjukkan aktivitas maksimu m crude invertase yaitu pada pH 4,5 dengan aktivitas sebesar 49,63 unit. Unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai, sebanyak 49,63 mol gula dihasilkan oleh setiap mL enzim per menitnya. Hasil pH optimu m ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh (Bergamasco et al, 2000; Akgol et al., 2001; Bayramolu et al., 2003), yang melaporka n bahwa aktifitas enzim terjadi pada range pH 3,0 - 5,0 dengan aktivitas maksim u m terjadi disekitar pH 4,5. Diatas skala tersebut aktivitas enzim mengalami penur una n. Semakin basa kondisi hidrolisis menyebabka n semakin rendahnya harga aktivitas enzim crude invertase. Perubahan pH dapat menyebabkan turunnya aktivitas enzim akibat perubaha n ionisasi gugus gugus fungsionilnya karena gugus ionik berperan penting dalam menjaga konform a si sisi aktif enzim untuk mengikat dan mengubah substrat menjadi produk. Perubaha n pH juga dapat menyebabkan enzim terdenat ura si sehingga menyebabka n penuruna n katalitik enzim. Denaturasi enzim dakibatkan karena terjadinya pemutu s a n ikatan penstabil struktur (seperti ikatan ionik, hidrogen, hidrofobik) yang menghub ungka n antar polimer protein. Pemutus an tersebut dapat terjadi pada protein kwartener, tersier ataup u n sekunder. Pada protein kwartener terjadi pemut u sa n ikatan penstabil struktur karena bentuknya yang merupakan gabungan antara globular satu dengan globular lainyya sehingga dapat terjadi pemut us an ikatan tersebut pada protein tersier satu dengan protein tersier lainnya dan terjadi seterus nya, pada protein tersier membent uk protein sekunder. Penentua n suhu optimu m juga ditentuka n berdasarka n data yang telah didapatka n. Variasi suhu yang dibuat yaitu 20 o C, 25 o C, 30 o C, 60 o C, 80 o C dan 100 o C. Pengaturan ini dengan cara dipanaskan dalam air mendidih ataupu n di inkubasi dalam penangas es. Ketiga optimasi baik pH, suhu serta lama inkubasi, kadar gula reduksinya dianalisa menggunakan metode Somogy - Nelson. Metode tersebut khusus untuk penent uan gula reduksi. Dari perhitunga n diperoleh gambar 5

Gambar 5 Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Enzim Invertase Enzim memiliki temperat ur optimu m dalam melakukan fungsinya, sehingga diperoleh aktivitas enzim maksim u m. Gambar 4.8 menunjukkan bahwa aktivitas optimu m crude invertase dicapai pada suhu 30 o C dengan aktivitas sebesar 46,66 unit. Hasil suhu optim u m ini sedikit berbeda dengan hasil penelitian yang dilakukan oleh (Bergamasco et al, 2000; Akgol et al., 2001; Bayramolu et al., 2003), yang menyatakan suhu optim um enzim invertase dicapai pada 40 - 60 o C. Perbedaan ini kemungkinan disebabkan ketidakm urnian enzim invertase sehingga lebih tidak tahan terhada p panas. Meningkatnya suhu menyebabka n aktivitas enzim meningkat. Hal ini disebabka n karena ketika suhu naik, energi kinetik juga meningkat sehingga mena mba h intensitas tumbukan antara substrat dan enzim. Tumbukan yang sering terjadi akan memper m u d a h pembent ukan kompleks enzim - substrat, sehingga produk yang terbent uk makin banyak. Sedangkan suhu yang terlalu tinggi akan mem pe ngar u hi perubaha n konform a si substrat sehingga sisi reaktif substrat mengalami hambatan untuk memas uki sisi aktif enzim dan hal ini menyebabkan aktivitas enzim akan rendah. Selain itu, tingginya suhu akan menyebabkan rusaknya interaksi nonkovalen (ikatan hidrogen, vander waals, hidrofobik dan elektrostatik) yang menjaga strukt ur tiga dimensi enzim sehingga enzim akan terdenatu ra si. Dari data tersebut, hidrolisis sukrosa dilakukan dalam pH 4,5 dan pada suhu 30 o C. Untuk mengetah ui waktu inkubasi atau hidrolisis yang optimu m dapat dilihat dari gambar berikut :

Prosiding KIMIA FMIPA - ITS

Gambar 4.9 Pengaruh Waktu Hidrolisis Terhada p Kadar Gula Reduksi Waktu inkubasi merupaka n waktu yang dibutuhka n oleh enzim untuk berikatan dengan substratnya. Penentua n waktu inkubasi optimu m pada crude invertase dilakukan pada pH optim u m nya yaitu 4,5 dan suhu optimu m 30 o C. Dari gambar diatas, menunj ukka n bahwa penam ba ha n waktu inkubasi akan meningkat kan jumlah produk yang terbent uk. Dengan kata lain aktivitasnya juga meningkat sampai ia mencapai waktu optim u m yaitu pada jam ke 5 setelah inkubasi.Saat inkubasi optimu m ini, sisi aktif enzim akan terikat secara optimal. Apabila waktu yang dikondisikan pada enzim dan substrat kurang dari cukup, maka sisi aktif enzim belum optimal dalam mengikat substrat sehingga menyebabkan produk yang terbent uk masih sedikit ketika reaksi dihentikan. Pada jam ke 5 sampai 7, tidak terlihat adanya perbedaa n yang besar, ini menand aka n bahwa kemungkinan sisi aktif enzim telah jenuh oleh substrat sehingga produk yang dihasilkan hanya mengalami peningkata n ataupu n penur una n yang relatif kecil. Penentuan Kurva Pertumbuhan Zymo m on a s mobilis Pengukuran jumlah bakteri dapat ditentuka n secara tidak langsung dengan mengukur turbiditas cairan medium tumbu h menggunaka n spektrofoto me t e r (Optical Density atau absorba nsi). Unit OD ini akan propor sional atau sebanding dengan massa sel dan jumlah bakteri. Meningkatnya turbidimet ri dalam media adalah indeks lain dari pertu m bu ha n bakteri serta jumlah biomassa bakteri. Apabila sinar yang ditrans mi sikan atau diteruska n itu menurun artinya terjadi peningkat an populasi pada media tersebut. Dengan kata lain absorbansi yang tebaca dari sinar yang dihambur kan oleh partikel partikel bakteri akan memberikan nilai yang besar. Gambar 6 Kurva pertum b u h a n Zymo mo n as mobilis dalam media pH 5,5 Dari kurva pertu m b u h a n Zymo m o n as mobilis dalam media dengan pH 5,5 diatas, dapat dilihat bahwa bakteri Zymo m o n as mobilis melakukan adaptasi pada fasa lag selama 4 jam pertam a. Pada fase ini, bakteri tidak mengalami pertu m b u h a n yang signifikan, jumlahnya cenderung tetap karena belum mengalami pembelaha n. Bakteri memerlukan waktu untuk beradapt a si, selnya akan mengalami perubaha n komposisi kimiawi dan ukuran serta berta mba h nya substan si intraseluler sehingga siap untuk membelah diri. Waktu adaptasi ini tergolong singkat. Hal ini dikarenaka n sebelum nya telah dilakukan transfer dari starter 20 mL ke starter 200 mL dengan waktu inkubasi yang sama. Fase log berakhir setelah 18 jam inkubasi. Jumlah sel yang hidup pada fase ini merupakan jumlah sel yang hidup optimal dan memiliki aktivitas yang sangat aktif dalam mengkonversi substrat menjadi etanol. Oleh karena itu pemane na n bakteri dilakukan sekitar waktu tersebut. Diatas 20 jam, bakteri sudah masuk fase stasioner. Berdasarkan teori, jumlah sel yang mati pada fase stasioner sama dengan jumlah sel hidup yang membelah sehingga seolah olah pertu m b u ha n nya adalah nol. Apabila waktu pengama t an diperpanja ng akan didapatkan penuruna n jumlah bakteri yang dapat mencapai maksimal disebabkan berkurangnya nutrisi yang tersedia sehingga jumlah sel yang mati lebih banyak. Pada waktu ini disebut sebagai fase kematian.

Penentuan Pola Fermentasi Dari 100 mL larutan sukrosa 10% yang dihidrolisis dengan 5 mL enzim invertase selama 5 jam pada pH 4,5 dan suhu inkubasi 30 o C menghasilkan gula invert dengan konsentra si 0,2906 M atau sebanyak 10,46 gram. Sebelum dilakukan

Prosiding KIMIA FMIPA - ITS

hidrolisis, sukrosa memiliki absorban si awal sebesar 0,067, artinya dalam larutan sukrosa tersebut terdapa t 0,247 gram gula reduksi (gula invert). Hal ini menand aka n bahwa sukrosa yang digunakan tidak murni. Dengan melakukan penguranga n, didapatka n massa gula hasil hidrolisis sebesar 10,22 gram. Apabila hasil tersebut dikonversikan dengan sejumlah sukrosa melalui persa m aa n stoikiomet rinya dapat diketahui banyaknya sukrosa yang terhidrolisis, yaitu sekitar 9,712 gram. Enzim yang digunakan mengandu ng 11,87 mg protein / mL dan menghasilkan aktivitas sebesar 18,91 unit. Hidrolisat yang didapatka n dari hasil hidrolisis akan digunakan sebagai media fermentasi, dimana gula reduksinya akan diubah menjadi etanol oleh Zymomonas mobilis melalui jalur Entner Doudoroff. Data dari penelitian sebelum nya, hasil etanol optimu m terjadi pada fermenta si dengan pH 5,5 sehingga fermenta si kali ini dilakukan pada pH tersebut dan dalam kondisi anaerob yang diletakkan pada shaker dengan kecepatan 50 rpm. Karena semakin anaerob keadaan fermenta si maka semakin maksimal pula glukosa atau fruktosa yang dapat terferm e nta si. Pola produk si etanol serta konsu m si gula selama fermenta si oleh sel bebas Zymomonas mobilis diperoleh dengan melakukan monitoring terhada p kadar etanol dan kadar gula invert sisa terhada p fungsi waktu selama 120 jam setiap 15 jam sekali. Jumlah awal sel Zymo mo nas mobilis yang digunakan sebesar 2,6 x 10 10 sel/ mL. Zymo mo nas mobilis memp u nyai laju pertum b u h a n yang tinggi dan tahan terhada p konsent ra si etanol sekitar 10%. Bakteri ini dapat memferm en t asikan gula menjadi etanol dan CO 2 melalui jalur glikolitik Entner - Doudoroff, dimana oksigen tidak ikut serta dalam proses fermenta si. Oksigen akan menekan fermenta si dan mengunt u ngkan respirasi (Schlegel, 1994). Dibawah ini disajikan grafik pola produksi etanol beserta konsum si gula selama 120 jam.

Gambar 7 Pola Produksi Etanol dan Gula Residu pada pH 5,5 Dari gambar diatas, dapat dilihat bahwa semakin lama jumlah etanol mengalami peningkat an sedangkan jumlah gula residu semakin berkurang dari gula awalnya, ini menand aka n adanya konsu m si gula oleh bakteri. Jumlah etanol dan konsu m si gula mengalami perubaha n yang signifikan setelah ferment asi selama 75 jam. Hal ini dimungkinkan karena sudah tidak ada pertum b u h a n bakteri Zymo m o n as mobilis sehingga kondisinya dioptimalkan untuk berlangsu ngnya pembent uka n etanol. Menurut Mc Gill (1965) , Zymo mo n as mobilis lebih menyukai glukosa daripada fruktosa. Sehingga bakteri ini akan memakai glukosa sebagai subst rat untuk fermentasi pertam a kali. Setelah glukosa habis, maka bakteri ini akan memakai fruktosa. Indikasi terjadinya ferment asi adalah terdapat nya gelembung busa pada perm ukaa n media. Jumlah etanol terbesar dihasilkan pada 120 jam sebesar 6,17 % (v/v) atau 4,87 gram etanol dengan yield etanol 92,89%. Nilai ini lebih besar apabila dibandingkan dengan hasil penelitian yang dilakukan Hani (2009) yaitu mengenai fermenta si menggunakan substrat sukrosa yang hanya menghasilkan etanol sebesar 0,412 gram, yield etanol yang dicapai 61,18%. Nilai yield yang rendah ini, diakibatkan karena dengan menggunaka n substrat sukrosa akan terbent uk 2 jenis hasil samping yang utama yaitu levan dan sorbitol. Levan terbent uk akibat adanya enzim levan sukrase yang dihasilkan oleh bakteri Zymo mo nas mobilis hanya pada substrat sukrosa sedangkan sorbitol terbent uk akibat adanya reduksi oleh enzim glukose - fructose oxidareduktase. Dimana hasil samping keduanya dapat menur unka n jumlah etanol yang terbent uk sampai 80% secara teori (E, favela, 1987). Akan berbeda apabila substrat yang digunakan merupakan hasil hidrolisis sukrosa, kemungkinan produk mayor yang terbent uk hanya sorbitol. Yield etanol yang terukur dihitung berdasarkan akum ulasi etanol pada setiap waktu pengukuran. Yield etanol dari hasil ferment asi dapat dilihat pada gambar 8

Prosiding KIMIA FMIPA - ITS

reactive film composed of 2hydroxyethyl methacrylate and glycidyl methacrylate, Biochemical Engineering Journal , 14:117 - 126 Favela, E Torres, (1987), Continuous Ethanol Production by Zymo mo n as mobilis from an Equimolar Mixture of Glucose and Fructose, France Mukhtasor, (2009), Agenda Energi Terbaruka n dalam Konteks Kebijakan Energi Berkelanjuta n, ITS Press, Surabaya Swing, J. Dan De Ley, J.,(1977), The Biology of Zymomona s, Laboratory of Microbiology and Microbial Genetic, Faculty of Science, USA Tano, M. S. & Buzato, J. B., (2003), Effect of The Presence of Initial Ethanol on Ethanol Production in Sugar Cane Juice Fermente d by Zymo mo nas mobilis. Braz. J. Microbiol. 34: 242 244 Utami, Sri, (2007), Pengelolaan Energi Nasional 2005 - 2025, Staf Ahli Menteri Bidang Ekonomi dan Keuangan, Departe me n Energi dan Sumberdaya Mineral,Jakarta
BIOGRAFI PENULIS Penulis dilahirkan di Surabaya pada tanggal 3 Desembe r 1987, sebagai anak perta ma dari dua bersa u da r a. Penulis adalah alumnu s dari TK Aisyah, SD Muham m a diyah V, SLTP Negeri 1 Porong dan SMA Negeri 3 Sidoarjo. Setelah lulus mene m p u h Pendidikan Menengah atas, penulis melanjutka n Pendidikan Tinggi di Jurusa n Kimia Fakultas MIPA Institut Teknologi Sepuluh Nopembe r (ITS) Surabaya melalui jalur SPMB (Seleksi Penerima an Mahasiswa Baru) pada bulan Agustus 2005. Selama mene m p u h pendidikan tinggi di ITS, penulis perna h aktif dan berpartisipa si dalam organisa si pada HIMKA- ITS. Penulis juga aktif mengikuti bebera pa pelatiha n, seminar dan Study Lapangan. Penulis sempa t mene m p u h Kerja Praktek di PT. Nestle - Kejayan, Pasurua n. Penulis mena m a tk a n studi S1 di Jurusa n Kimia MIPA dengan menga m bil Tugas Akhir pada bidang Biokimia dan berhasil lulus dengan predikat yang Memuaska n.

Gambar 8 Yield Etanol Terhadap Waktu Pengukuran Pada fermenta si selama 60 jam terlihat adanya penurun a n yield etanol menjadi 79,81%. Hal ini disebabka n karena sejumlah gula dipakai bakteri untuk regenerasi sehingga etanol yang dihasilkan tidak sebanding dengan banyaknya gula yang terkons u m si.
KESIMPULAN

Berdasarkan hasil penelitian, diperoleh kesim pulan bahwa aktifitas optim u m crude invertase dalam mendegrada si sukrosa menjadi gula invert didapatka n pada kondisi pH 4,5 dengan temperat ur 30 o C dan waktu inkubasi selama 5 jam. Inkubasi selama 5 jam pada kondisi optimum mampu mnghidrolisis sukrosa sebanyak 9,712 gram dan menghasilkan campura n glukosa serta fruktosa sebanyak 10,22 gram. Aktivitas enzimnya sebesar 18,91 unit. Selain itu, pada fermenta si dengan pH 5,5, Zymo mo nas mobilis mam p u menghasilkan etanol sebesar 4,87 g/100 mL dengan yield etanol mencapai 92,89%. UCAPAN TERIMA KASIH 1. Bapak Surya Rosa Putra, selaku dosen pembim bing atas segala diskusi, bimbingan, arahan dan semua ilmu yang bermanfaat. 2. Bapak dan Ibu selaku orang tua terbaik di dunia atas segala doa, dorongan materiil dan spiritualnya. Rekan - rekan tugas akhir dan thesis S1 dan S2 Kimia ITS serta para analis khusus nya di Laboratorium Biokimia Serta pihak - pihak lain yang tidak dapat disebutkan satu persatu.

3.

4.

DAFTAR PUSTAKA Bergamasco, G., Akgol, S., Bulut, A., Denizli, A. And Yakub, A.M. (2003), Covalent immobilization of inverase onto a

Prosiding KIMIA FMIPA - ITS