LAPORAN PEWARNAAN BAKTERI ( Pewarnaan Bakteri E. Coli,B.

Subtilis,Staphulococcus aureus )
BAB I PENDAHULUAN 1.1
Dasar Teori

Bakteri mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas. Bakteri merupakan mikroorganisme yang berukuran mikroskopik. Selain mikroskopik, bakteri juga hampir tidak berwarna atau transparan dan kontras dengan air. Sehingga melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri. Ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Hal itu untuk mempernudah proses identifikasi bakteri. Untuk mengidentifikasi suatu biakan murni bakteri hasil isolasi mula-mula diamati morfologi sel secara mikroskopik melalui pengecetan atau pewarnaa, salah satunya adalah dengan pewarnaan gram. Pewarnaan gram merupakan salah satu prosedur yang paling banyak digunakan untuk mencirikan banyak bakteri. Dari pewarnaan gram dapat diketahui morfologi sel antara lain sifat gram, bentuk sel, dan penataan sel. Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, Gram positif dan gram negatif, berdasarka sifat kimia dan fisika dinding sel mereka, metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan denmark hans Christian gram 1884. Pewarnaan Gram dibagi menjadi dua yaitu pewarnaan majemuk karena menggunakan lebih dari satu macam zat warna. Dan pewarnaan diferensial karena pewarnaan ini mampu mengdeferensiasi atau membedakan bakteri, sehingga bakteri dapat digolongkan menjadi dua yaitu Gram negatif dan Gram positif. Selain dengan pewarnaan atau pengecatan, identifikasi bakteri dapat berupa melihat morfologi koloni dan uji biokimia bakteri. Morfologi bakteri meliputi bentuk, ukuran, tekstur, warna koloni,dll. Semantara uji biokimia dilakukan untuk memastikan jenis/spesies bakterinya. Oleh karena itu, dilakukan praktikum ini untuk mengetahui teknik pewarnaan bakteri, morfologi koloni, dan uji biokimia sehingga dapat mempernudah untuk isdentifikasi bakteri. BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Identifikasi bakteri dengan pewarnaan Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak bakteri yang tidak mempunyai zat warna (Waluyo, 2007) . Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba banyak dilakukan baik secara langsung (bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan murni). Tujuan dari pewarnaan tersebut ialah untuk : 1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, ataupun fungi. 2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad. 3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik dan kimia yang ada akan dapat diketahui. (Suriawiria, 1999)

4.

Ada tiga macam prosedur pewarnaan, yaitu pewarnaan sederhana (simple stain), pewarnaan diferensial (differential strain), dan pewarnaan khusus (special strain) (Pratiwi, 2008). Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Prosedur Pewarnaan sederhana mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini sering digunakan untuk melihat bentuk ukuran dan penataan pada mikoorganisme bakteri pada bakteri dikenal bentu yang bulat (coccus), batang (basil), dan spiral (Lay, 1994). Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam. Pewarnaan gram adalah salah satu teknik pewarnaan diferensial yang paling penting dan paling luas digunakan untuk bakteri. Bakteri yang diwarnai dengan metode gram ini dibagi menjadi dua kelompok, salah satu diantaranya bakteri gram positif dan bakteri gram negatif (Pelczar & Chan, 1986). Pada pewarnaan gram, bakteri yang telah difiksasi dengan panas sehingga membentuk noda pada kaca objek diwarnai dengan pewarna basa yaitu crystal violet. Karena warna ungu mewarnai seluruh sel, maka pewarna ini disebut pewarna primer. Selanjutnya noda dicuci dan pada noda spesimen ditetesi iodin yang merupakan mordant. Setelah iodin dicuci, baik bakteri Gram Positif maupun Gram Negatif tampak berwarna ungu. Selanjutnya noda spesimen dicuci dengan alkohol yang merupakan decolorizing agent (senyawa peluntur warna) yang pada spesies bakteri tertentu dapat menghilangkan warna ungu dari sel. Setelah alkohol dicuci, noda spesimen diwarnai kembali dengan safranin yang merupakan pewarna basa berwarna merah. Bakteri yang tetap berwarna ungu digolongkan ke dalam Gram Positif, sedangkan bakteri yang berwarna merahdigoongkan ke dalam Gram Negatif (Suriawiria, 1999). Perbedaan warna antara bakteri Gram Negatif dan bakteri Gram Positif disebabkan oleh adanya perbedaan struktur pada dinding sel nya. Dinding Gram Positif mengandung banyak peptidoglikan,sedangkan dinding bakteri Gram Negatif banyak mengandung lipopolisakarida(Suriawiria, 1999). Pewarna yang digunakan antara lain : kristal violet sebagai gram A, iodine sebagai gram B, alkohol sebagai gram C, serta safranin sebagai gram D. Bakteri tahan asam merupakan bakteri yang kandungan lemaknya sangat tebal sehingga tidak bisa diwarnai dengan reaksi pewarnaan biasa, tetapi harus dengan pewarnaan tahan asam. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA) karena dapat mempertahankan zat warna pertama sewaktu dicuci dengan larutan pemucat. Golongan bakteri ini biasanya bersifat patogen pada manusia contohnya adalah Mycobacterium tuberculosis (Pelczar & Chan, 1986). 2.2 Morfologi Koloni dan Uji Biokimia Pengamatan morfologi bakteri meliputi bentuk, ukuran, tekstur, dan warna koloni. Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung (Hadioetomo, 1993). Ciri fisiologi ataupun biokimia merupakan kriteria yang amat penting di dalam identifikasi spesimen bakteri yang tak dikenal karena secara morfologis biakan atau pun sel bakteri yang berbeda dapat tampak serupa, tanpa hasil pengamatan fisiologis yang memadai mengenai organik yang diperiksa maka penentuan spesiesnya tidak mungkin dilakukan. Karakteristik dan klasifikasi sebagian mikroba seperti bakteri berdasarkan pada reaksi

enzimatik ataupun biokimia. Mikroba dapat tumbuh pada beberapa tipe media memproduksi tipe metabolit tentunya yang dideteksi dengan interaksi mikroba dengan reagen test yang mana menghasilkan perubahan warna reagen. Koloni-koloni terpilih dimurnikan dengan cara goresan berulang pada medium NA+0,5% NaCl hingga diperoleh isolat murni. Isolat murni diidentifikasi dengan mengenali karakternya, yaitu dengan mencatat karakter koloni, pengamatan morfologi sel dengan pewarnaan Gram, dan pewarnaan endospora menggunakan malachite green.

BAB III METODE KERJA 3.1 Alat dan Bahan Alat Kaca objek Lap kertas kertas serap mikroskop botol pijit Bahan isopropil alkohol 95% biru metilan karbol fuksin iodium safranin air E. coli B. subtilis Staphylococcus aureus 3.2 Cara Kerja 3.2.1 Pembuatan Preparat Oles

1. 2. 3. 4. 5. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

1. 2. 3.

4. 5. 6.

Bersihkan kaca objek sehingga bebas dari lemak dan kotoran Teteskan beberapa tetes isopropil alkohol 95% pada kedua permukaan kaca objek dan keringkan dengan lap kertas. Buatlah lingkaran di tengah-tengah permukaan bawah kaca objek. Hal ini untuk membantu meletakkan olesan mikroba dengan tepat. Ambil inokulum bakteri dan sebarkan olesan tersebut hingga merata Biarkan olesan tersebut kering udara hingga betul-betul kering. Lakukan ksasi panas dengan melayangkan kaca objek di atas panas api 3.2.2 Pewarnaan Sederhana
Siapkan preparat olesan bakteri B. subtilis dan E. coli yang telah diksasi panas dimana dibuat 2 preparat untuk tiap bakteri

1. 2.

6.

Letakkan kaca objek di atas bak pewarnaan dan genangi olesan tersebut dengan zat warna biru metilen untuk preparat pertama dan zat warna karbol fuksin untuk preparat kedua. 3. Biarkan terwarnai biru metilen selama 1-2 menit atau selama 1530 detik untuk pewarnaan dengan karbol fuksin 4. Peganglah kaca objek dengan penjepit dan miringkan kemudian bilas dengan air hingga zat warna hilang atau sedikit sekali 5. Keringkan air pada permukaan preparat dengan kertas serap. Amati morfologi spesien pada masing-masing preparat di bawah mikroskop. 3.2.3 Pewarnaan Gram Buat preparat oles dari bakteri E. coli dan S. aureus Beri kristal ungu selama 1 menit Buang kelebihan kristal ungu dengan memiringkan kaca objek di atas bak pewarna Bilas dengan air menggunakan botol pijit Tiriskan kaca objek dan kembalikan ke atas rak pada bak pewarna Beri larutan iodium gram selama 2 menit Buang kelebihan iodium dengan memiringkan kaca objek Bilas dengan air memakai botol pijit Cuci dengan etanol 95% setetes demi setetes selama 30 detik atau sampai zat ungu kristal tidak tampak lagi mengalir dari kaca objek. Cuci dengan sir lalu tiriskan Beri safranin selama 30 detik Buang kelebihan safranin lalu bilas dengan air Tiriskan kaca objek dan serap kelebihan air dengan menekankan kertas serap di atasnya Amati di bawah mikroskop.

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13.

BAB IV HASIL DAN PENGAMATAN

4.1 Hasil Pengamatan Pada praktikum kali ini, dilakukan perwarnaan gram dan pewarnaan sederhana serta morfologi koloni yang ada pada bakteri. Pada pewarnaan Gram, bakteri yang digunakan yaitu Esterichia coli, Staphylococcus aureus dan Bacillus subtillis. Sedangkan pada pewarnaan sederhana, menggunakan bakteriEsterichia coli dan Bacillus subtillis. Dari hasil pewarnaan Gram dan setelah diamati dengan bantuan mikroskop elektron dapat diketahui bahwa : Esterichia coli merupakan bakteri gram negatif karena berwarna merah, morfologinya kokobasil, dan bentuk yang cenderung ke batang panjang. Bakteri ini ada yang soliter, namun ada juga yang tampak bergerombol atau berpasangan. Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif karena berwarna ungu, morfologinya stafilokokus, dan berbentuk bulat. Bakteri ini umumnya tumbuh bergorombol sehingga tampak seperti anggur. Bacillus subtillis merupakan bakteri gram positif karena berwarna ungu, morfologinya basil, ada yang tebal dan yang tipis. Biasanya bentuk rantai atauterpisah. Sedangkan hasil dari pewarnaan sederhana dan setelah diamati dengan menggunakan mikroskop elektron sama dengan hasil pengamatan pada pewarnaan gram diatas yang dapat diketahui bahwa : Esterichia coli termasuk dalam bakteri gram negatif karena berwarna merah. E.coli memiliki morfologi kokobasil, dan bentuknya yang cenderung ke batang panjang. Bakteri ini ada yang soliter, bergerombol atau berpasangan. Bacillus subtillis merupakan bakteri gram positif karena berwarna ungu. Bakteri ini memiliki morfologi basil. Biasanya bentuk rantai atau terpisah. Dari pengamatan yang telah dilakukan, juga dapat diketahui bahwa bentuk Bacillus subtillis lebih panjang dibandingkan dengan bentuk E.coli. Berikut hasil pengamatan berupa gambar : Gambar Pewarnaan Gram Esterichia coli Bakteri

Staphylococcus aureus

Bacillus subtillis

Pewarnaan Sederhana

Bacillus subtillis

4.2 Pembahasan Untuk mengamati bakteri di bawah mikroskop, kita memerlukan pewarnaan bakteri dengan menggunakan pewarna karena sebagian bakteri tidak berwarna. Tujuannya adalah untuk memudahkan dalam mengidentifikasi bakteri. Ada 3 macam pewarnaan yang bisa digunakan untuk mengidentifikasi bakteri, yaitu pewarnaan sederhana (simple stain), pewarnaan diferensial (differential stain), dan pewarnaan khusus (special stain).Namun dalam praktikum ini kami hanya melakukan pewarnaan sederhana dan pewarnaan diferensial yaitu pewarnaan gram. Hal pertama yang harus dilakukan sebelum melakukan pewarnaan adalah pembuatan preparat oles. Caranya adalah dengan membersihkan kaca objek dengan alkohol sehingga bebas dari lemak. Kemudian membuat sediaan preparat dalam bentuk suspensi. Lalu

memijarkan ose dan didinginkan. Setelah itu mencelupkan ose ke dalam suspensi bakteri dan goreskan pada kaca objek. Jika bakteri yang akan diperiksa terdapat pada medium padat(media agar), maka meneteskan NaCl Fisiologis terlebih dahulu pada kaca preparat kemudian menggoreskan bakteri tersebut dengan ose. Dan yang terakhir adalah mengeringkan preparat dan melakukan fiksasi. Mengeringkan preparat dilakukan dengan mengangin anginkan pada suhu ruang dan fiksasi dilakukan dengan cara melewatkan preparat di atas api sebanyak tiga kali. Fiksasi dilakukan agar bakteri tetap berada di kaca preparat dan tidak berpindah kemana-mana. Karena ada kemungkinan besar bakteri yang sudah di fiksasi itu mati dan tetap tinggal di kaca preparat. Setelah pembuatan preparat oles selesai, dilanjutkan dengan prosespewarnaan. Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam pewarna dan bertujuan mewarnai seluruh sel mikroorganisme sehingga bentuk seluler dan struktur dasarnya dapat terilihat.
Contoh zat warna seperti: Metilen Blue, Karbol Violet dan Air Fucshin.

Dalam praktikum ini bakteri yang digunakan dalam pewarnaan sederhana adalah E.coli dan B.subtilis dan pewarna yang digunakan adalah kristal ungu. Pertama adalah meletakkan kaca objek di atas bak pewarnaan dan mengggenangi olesan tersebut dengan zat warna kristal ungu lalu mendiamkan hingga 1 menit. Kemudian memiringkan preparat dan membilas dengan air hingga zat warna hilang atau sedikit sekali. Setelah itu mengeringkan air pada permukaan preparat dengan kertas serap. Preparat pun siap diamati di mikroskop.
Bacillus subtillis berwarna ungu setelah penambahan zat warna kristal ungu. Dan setelah diamati dengan mikroskop, bakteri ini memiliki morfologi basil.Biasanya bentuk rantai atau terpisah. Eschericia coli setelah penambahan zat warna kristal ungu warnanya menjadi ungu. Dan setelah diamati dengan mikroskop E.coli memiliki morfologi kokobasil, dan bentuknya yang cenderung ke batang panjang. Bakteri ini ada yang soliter, bergerombol atau berpasangan.Pada Bacillus subtillis dan Eschericia coli saat penambahan zat warna menghasilkan warna yang sama yaitu ungu sehingga tidak bisa membedakan ciri bakteri yang satu dengan yang lain misalnya apakak termasuk bakteri gram positif atau gram negatif. Hal ini dikarenan pewarnaan ini hanya untuk mewarnai seluruh sel mikroorganisme sehingga bentuk seluler dan struktur dasarnya dapat terilihat dan tidak untuk membedakan bakteri. Pewarnaan gram menggunakan lebih dari satu pewarna dan memiliki reaksi yang berbeda untuk setiap bakteri sehingga digunakan untuk membedakan bakteri. Pewarnaan gram ini mampu membedakan dua kelompok besar bakteri, yaitu Gram positf dan Gram negatif. Pada praktikum ini bakteri yang digunakan dalam pewarnaan gram adalah Bacillus subtillis, Eschericia coli, dan St.Aureus menggunakan zat warna kristal ungu, larutan iodium, alkohol, dan safranin. Hal pertama adalah membuat preparat oles dari bakteri Bacillus subtillis,Eschericia coli, dan St.Aureus. Setelah pembuatan preparat dan proses fiksasi selesai maka dilanjutkan dengan proses pewarnaan. Zat warna pertama yang digunakan adalah kristal ungu. Preparat diberi kristal ungu dan didiamkan selama 1 menit. Kelebihan kristal ungu dibuang dan membilas preparat dengan air. Lalu mengeringkan dengan tissue. Hasil yang terjadi adalah ketiga bakteri menjadi berwarna ungu. Tidak ada perbedaan antar ketiganya. Kemudian preparat ditetesi iodin yang merupakan mordant (penajam). Setelah iodin dicuci, baik Bacillus subtillis, Eschericia coli, dan St.Aureus tampak berwarna ungu. Selanjutnya preparat diberi alkohol yang merupakan decolorizing agent (senyawa peluntur warna) pada spesies bakteri tertentu. Setelah alkohol dicuci, bakteri Bacillus subtillis dan St.Aureus tampak masi berwarna ungu. Namun untuk bakteri Eschericia coli menjadi tidak berwarna. Warna ungu nya telah hilang. Zat warna terakhir yang diberikan adalah safranin. Safranin merupakan zat warna basa berwarna merah. Preparat kemudian dicuci dan dikeringkan. Hasilnya adalah bakteri Bacillus subtillis dan St.Aureus tetap berwarna ungu sedangkan bakteri Eschericia coli menjadi berwarna merah.Dari hasil pewarnaan gram, dapat diketahui bahwa Bacillus subtillis dan St.Aureus digolongkan ke dalam Gram Positif dan bakteri Eschericia coli digolongkan ke dalam Gram Negatif.

Perbedaan warna antara bakteri Gram positif dan Gram negatif disebabkan oleh adanya perbedaan struktur pada dinding sel nya. Dinding bakteri Gram positif banyak mengandung peptidoglikan sedangkan dinding bakteri Gram negatif banyak mengandung lipopolisakarida.Kompleks kristal ungu-iodin yang masuk ke dalam dinding sel bakteri Gram positif tidak dapat dicuci oleh alkohol karena adanya lapisan peptidoglikan yang kokoh pada dinding sel; sedangkan pada bakteri Gram negatif, alkohol akan merusak lipopolisakarida. Kompleks kristal ungu-iodin yang pada dinding sel bakteri Gram negatif dapat tercuci dan menyebabkan sel bakteri tampak transparan yang akan berwarna merah setelah diberi safranin. Untuk melihat morfologi bakteri, kita harus mengamatinya di bawah mikroskop. Ada beberapa bentuk dasar bakteri yaitu bulat (tunggal: coccus, jamak: cocci), batang (tunggal: bacillus, jamak: bacilli), dan spiral yaitu batang melengkung atau melingkar-lingkar. Bentuk bulat dibedakan menjadi coccus, diplococci, streptococci, tetrad, sarcina, dan staphylococci. Sedangkan bentuk batang dibedakan menjadi bacillus, diplobacilli, streptobacilli, dan coccobacillus. Dan bentuk spiral dibedakan menjadi vibrio, spirilla, dan spirochaeta. Sebelum pengamatan dengan mikroskop, preparat di tetesi oleh oleum emersi dahulu. Dari pengamatan yang terlihat bahwa Esterichia coli morfologinya kokobasil, dan bentuk yang cenderung ke batang panjang. Bakteri ini ada yang soliter, namun ada juga yang tampak bergerombol atau berpasangan.Staphylococcus aureus morfologinya stafilokokus, dan berbentuk bulat. Bakteri ini umumnya tumbuh bergorombol sehingga tampak seperti anggur. Dan Bacillus subtillis morfologinya basil, ada yang tebal dan yang tipis. Biasanya bentuk rantai atauterpisah.

BAB V PENUTUP 1. 2. 3. 4. 5.1 Kesimpulan Ada tiga macam prosedur pewarnaan, yaitu pewarnaan sederhana (simple stain), pewarnaan diferensial (differential strain), dan pewarnaan khusus (special strain). Esterichia coli merupakan bakteri gram negatif karena berwarna merah, morfologinya kokobasil, dan bentuk yang cenderung ke batang panjang. Staphylococcus aureus merupakan bakteri gram positif karena berwarna ungu, morfologinya stafilokokus, dan berbentuk bulat. Bacillus subtillis merupakan bakteri gram positif karena berwarna ungu, morfologinya basil, ada yang tebal dan yang tipis. 5.2 Saran Untuk praktikum berikutnya supaya alat disediakan lebih banyak, sehinggatidak menghabiskan banyak waktu saat bergantian alat. Dan alangkah baiknya jika ada asisten dosen yang menjaga sehingga praktikan lebih mudah bertanya saat mendapati kesulitan dalam melakukan pengamatan.

DAFTAR PUSTAKA Hadioetomo, R. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Gramedia. Lay, B. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta : Rajawali. Pelczar & Chan. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi Jilid 2. Jakarta : Universitas Indonesia. Pratiwi, S. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta : Erlangga. Suriawiria, U. 1999. Mikrobiologi. Jakarta : Universitas Terbuka. Waluyo. 2004. Mikrobiologi Tanah. Jakarta : CV Rajawali. Waluyo, L. 2007. Mikrobiologi Umum. Malang : UMM Press.