REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA

La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es considerada la tcnica

ms revolucionaria de las ltimas dcadas. Con ella se consiguen millones de copias
de una secuencia especfica de ADN en pocas horas. La cantidad necesaria de
ADN, en principio necesitara slo una molcula de ADN, aunque habitualmente se
toman cantidades alrededor de un microgramo. La molcula de ADN es muy estable,
por lo que puede ser recogida generalmente, sin mtodos purificadores, a partir de
productos biolgicos diversos, como tejidos frescos, incluidos en parafina, esperma,
lavados bronquiales, pelos, sangre, extendidos citolgicos, material desecado de
momias, entre otros. Permitiendo un muestreo no invasivo o poco destructivo de
organismos vivos y el anlisis de restos.
La tcnica de PCR fue descubierta en el ao 1983 por Kary Mullis y por ella le
fue concedido el premio Nobel de Qumica en 1993. Con la PCR se realiza in vitro el
proceso de replicacin del ADN. Este proceso est basado en la accin de la
polimerasa, una enzima capaz de dirigir la sntesis de ADN, y sintetizar a partir de
una cadena simple de ADN la complementaria. Para iniciar la sntesis se necesita al
menos una pequea fraccin de cadena doble de ADN. Esto hace posible, si de
forma voluntaria le proponemos una pequea fraccin de oligonucletidos que sean
complementarios de una porcin, se unir despus de la desnaturalizacin de la
doble cadena y mediante el crecimiento hacia el extremo 3 del ADN por aposicin
de los nucletidos correspondientes suministrados y, a travs de la accin de la
polimerasa, se hace la amplificacin del fragmento deseado.
La reaccin consta, por lo general, de unos 20 ciclos repetitivos. Bsicamente
cada ciclo de amplificacin est constituido por tres reacciones que se hacen a
diferentes temperaturas.

Un ciclo de PCR

La primera reaccin consiste en la desnaturalizacin del ADN,
separndose las dos cadenas por ruptura de los enlaces de hidrgeno a una
temperatura de 95 C a 98 C durante, por lo menos, un minuto. El calor rompe las
uniones de hidrgeno que mantienen unidas las dos cadenas de ADN exponiendo
las bases nitrogenadas del ADN blanco. Si la muestra tiene alto contenido de GC
se debe aumentar el tiempo de reaccin
La segunda reaccin consiste en la hibridacin de estas cadenas con
los denominados oligonucletidos iniciadores o primers, que son fragmentos
complementarios que se van a unir a cada una de las dos cadenas separadas del
ADN. Para ello se debe bajar la temperatura (entre 50 C y 80 C) y para facilitar la
unin de los primers a las cadenas. Estos iniciadores no deben ser complementarios
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entre s, ni encontrarse demasiado cerca para que no se hibriden entre ellos, y
deben corresponder a los extremos de la porcin de DNA que queremos amplificar.
La tercera reaccin, de extensin, se efecta a los 72 C, temperatura
a la que, la polimerasa lleva a cabo su accin, concretamente la ADN polimerasa
Taq que va actuar engarzando los diferentes nucletidos complementarios en el
orden que le va indicando la cadena que acta como molde. La ADN polimerasa Taq
deriva de una bacteria Thermus aquaticus que se encuentra en las aguas termales y
su principal caracterstica es que resulta estable al calor ya que vive a ms de 70 C
y su temperatura ptima e actuacin es a 72 C, pero es estable a temperaturas
superiores a 90C, que son necesarios para realizar la desnaturalizacin. Tambin
pude emplearse la enzima Vent de la bacteria Thermococcus litoralis, la cul ofrece
igualmente resistencia a la temperatura.




Para hacer la reaccin se debe de aportar en un tubo:
El ADN que contiene la secuencia a amplificar.
Los primers, o cebadores, que se anillarn a las cadenas simples de DNA.
Grandes cantidades de los cuatro desoxinucletidos trifosfatos (dATP,
dCTP, dGTP y dTTP).
Enzima ADN polimerasa termoestable (ADN polimerasa Taq).


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Adems se requiere la incorporacin de una solucin amortiguadora (buffer),
magnesio y agua pura que acta como solvente del resto de los ingredientes.
Una vez que hemos sintetizado in vitro una secuencia de ADN debemos
reconocerla. Para detectar el producto lo podemos hacer por diversos mtodos. Uno
de los ms frecuentes es mediante la actuacin con enzimas restrictazas que
rompen el ADN en fragmentos de diferentes tamaos. A continuacin pondremos
estos fragmentos en un gel de agarosa en el que haremos que se desplacen
mediante electroforesis. Para visualizar el ADN en el gel se le aade bromuro de
etidio que fluoresce con luz ultravioleta.




Tambin se utilizan controles de pesos moleculares conocidos que permiten
reconocer los fragmentos sintetizados. En todos los casos se deben incluir controles
negativos para detectar contaminaciones. Los materiales biolgicos habitualmente
para hacer la PCR se fijan en formol tamponado o en alcohol de 95.
La PCR es una reaccin en cadena porque el nmero de cadenas nuevas de
ADN se dobla en cada ciclo y las nuevas cadenas y las viejas sirven de molde para
el siguiente ciclo. Cada ciclo dura unos 5 minutos y en menos de tres horas la
cantidad de ADN aumenta ms de un milln de veces. Este proceso est
automatizado y lo realiza un termociclador. Los segmentos especficos obtenidos
se pueden usar para muchos propsitos, incluyendo la clonacin en vectores
plasmdicos, la secuenciacin de ADN, diagnsticos clnicos y rastreos genticos.
Aunque la PCR es una tcnica muy valiosa y una de las tcnicas ms
verstiles de la gentica moderna tiene ciertas limitaciones, por ejemplo: se debe
disponer de alguna informacin sobre la secuencia de nucletidos del ADN diana, y
cualquier contaminacin de la muestra con ADN de otras fuentes, por pequea que
sea, puede alterar los resultados causando diferentes inconvenientes.

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EVOLUCIN DE LA TCNICA DE PCR


La tecnologa de la PCR es una de las tcnicas ms ampliamente utilizada en
gentica y biologa molecular por lo que est experimentando continuas mejoras.
Algunas de las principales variantes de esta tcnica son las siguientes:


PCR con retrotranscriptasa (RT-PCR):
En este procedimiento, se utiliza la retrotanscriptasa para generar copias de
ADNc de cadena sencilla a partir de molculas diana de ARN (tanto ARNm como
ARN total). A esta reaccin le sigue una PCR que copia el ADN de cadena sencilla
en molculas de doble cadena y luego estas se amplifican para producir un nmero
elevado de copias. Se utilizan tambin, en este caso enzimas termolbiles (por
ejemplo la transcriptasa reversa del virus de la mieloblastosis aviaria) o
termoestables (por ejemplo la transcriptasa reversa de la eubacteria Thermus
thermophilus y cebadores aleatorios en lugar de cebadores especficos para un gen
concreto. La RT-PCR es una herramienta muy valiosa para identificar ARNm de los
que pueda haber una o ms copias por clula.



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La reaccin en cadena de la polimerasa en tiempo real
Es un mtodo que permite la cuantificacin de cidos nucleicos con gran
exactitud y fiabilidad. En la PCR a tiempo real, los procesos de amplificacin y
deteccin se producen de manera simultnea, sin necesidad de ninguna accin
posterior. Adems, mediante deteccin por fluorescencia se puede medir durante la
amplificacin la cantidad de ADN sintetizado en cada momento, ya que la emisin de
fluorescencia producida en la reaccin es proporcional a la cantidad de ADN
formado. Esto permite conocer y registrar en todo momento la cintica de la reaccin
de amplificacin. Los termocicladores para llevar a cabo la PCR a tiempo real
incorporan un lector de fluorescencia y estn diseados para poder medir, en
cualquier momento, la fluorescencia emitida en cada uno de los viales donde se
realice la amplificacin. Los sistemas de deteccin por fluorescencia empleados en
la PCR a tiempo real pueden ser de dos tipos: agentes intercalantes (por ejemplo,
bromuro de etidio) y sondas especficas marcadas con fluorocromos, los cuales
aumentan notablemente la emisin de fluorescencia.
La primera gran ventaja de la PCR a tiempo real es su rapidez, puesto que no
se necesita ningn proceso adicional de deteccin. Otra ventaja muy importante de
la PCR a tiempo real es que al utilizar sistemas cerrados, el riesgo de contaminacin
disminuye de forma muy importante. Los sistemas a tiempo real permiten cuantificar
la concentracin inicial de cido nucleico presente en las muestras de manera
mucho ms sencilla, ms precisa y sobre todo en un rango mucho mayor. Asimismo,
la determinacin de mutaciones puntuales que pueden estar relacionadas con
resistencias a medicamentos antimicrobianos o con factores de virulencia, es mucho
ms fcil. Los equipos para PCR a tiempo real tienen una capacidad muy elevada ya
que en el mismo instrumento se pueden llevar a cabo ensayos cualitativos,
cuantitativos, determinacin de mutaciones, PCR mltiple, etc., mientras que para
los procedimientos convencionales se requieren mltiples equipos.
Esta tcnica ofrece una gran cantidad de aplicaciones al ser capaz de
cuantificar de manera absoluta o relativa molculas molde de DNA o RNA. De este
modo, se usa para determinar la carga vrica, el ttulo de grmenes y contaminantes
en la comida, sangre u otro tipo de muestras, la expresin gnica en distintos tejidos,
tratamientos o estadios del desarrollo, la discriminacin allica, y la deleccin o el
grado de amplificacin de los genes. Adems, tiene aplicaciones clnicas muy
importantes, como el diagnstico de tumores, la respuesta a medicamentos en
cnceres humanos y el perfil de citocinas en la respuesta inmune. Tambin el
genotipado de muestras se puede realizar a travs de la cuantificacin y
diferenciacin de alelos y la deteccin de polimorfismos, llegando incluso a detectar
los SNP (polimorfismos mononucleotdicos, del ingls single nucleotide
polymorphism).
Especficamente en el campo de la microbiologa la aplicacin ms importante
se basa en la identificacin y cuantificacin de determinados agentes infecciosos. Es
el caso de muchos virus (familia de los Herpesvirus, virus respiratorios, enterovirus,
virus J C, virus BK, etc.) o de bacterias que no crecen en medios de cultivo como
Tropheyma wippeli, o que crecen mal como Bordetella pertussis o muy lentamente
como Mycobacterium tuberculosis. Tambin, de micosis invasivas, especialmente
por Aspergillus ssp. o de infecciones parasitarias como las ocasionadas por
Toxoplasma gondii en lquido amnitico o en lquido cefalorraqudeo (LCR).
Otro campo potencial de aplicacin de la PCR a tiempo real es en la
identificacin de organismos fcilmente cultivables, cuya deteccin rpida sea
beneficiosa por algn motivo. Por ejemplo, la identificacin de Streptococcus del
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grupo B en frotis vaginales ya que la colonizacin del tracto genital de mujeres
parturientas por este agente se relaciona con un mayor riesgo de infeccin grave
neonatal.


PCR Mltiple
Desde hace algunos aos se desarroll una tcnica molecular denominada
PCR mltiple mediante la utilizacin de PCR en tiempo real. Es una tcnica que
combina la PCR con el uso de marcadores fluorescentes de forma que se pueda
monitorear la cintica de la reaccin, reconocer la cantidad de ADN molde y detectar
la presencia de variaciones genticas. Consiste en reacciones que permiten
amplificar simultneamente y en un nico tubo diferentes secuencias diana,
permitiendo la deteccin e identificacin simultnea de diferentes genes de inters.
Esto implica que los reactivos mezclados y el programa utilizado sean suficientes y
adecuados para permitirla deteccin de cada diana y no inhibir a las dems. Con
este fin, algunos parmetros, como la concentracin de magnesio y de cebadores, el
tipo y cantidad de ADN polimerasa pueden ajustarse experimentalmente. Por lo tanto
se deber tener en cuenta ciertas pautas:
Escoger o disear oligonucletidos que no interacten entre s.
Que tengan temperaturas de anillamiento similares.
Que cada pareja amplifique una nica secuencia diana.
Que generen ampliaciones de tamao suficiente que permita su separacin y
diferenciacin.
Los aportes de esta tcnica son muy importantes en el campo de la
microbiologa. Bsicamente se desarrollan para el diagnstico de bacterias por
ejemplo Escherichia coli y otras de diagnstico difcil, como ser microbacterias,
clamidias, pseudomonas como as tambin hongos, virus y parsitos. Se utiliza
tambin para el diagnstico de la meningitis bacteriana y para detectar la presencia
de genes que codifican para la resistencia a antibiticos o los que confieren mayor
virulencia a los organismos que los portan.


Nested PCR (PCR interna, PCR anidada)
Esta tcnica se realiza mediante dos reacciones en cadena de la PCR
sucesivas, con dos pares de cebadores distintos, de tal modo que los cebadores
utilizados en la segunda PCR (internal o nested PCR) flanqueen una regin
genmica amplificada en la primera reaccin (external PCR). Este mtodo se utiliza
sobre todo cuando se tienen pequeas cantidades de ADN de inters o cuando se
quieren evitar amplificaciones inespecficas que a veces se observan con la PCR
clsica. Por lo tanto, al comparase con la PCR clsica, la reaccin nested PCR
incrementa la sensibilidad y la especificidad debido a que se trata de una segunda
amplificacin por PCR utilizando cebadores internos a los extremos 5 y 3 del primer
producto, es decir excluyendo los cebadores de la primera amplificacin. De este
modo solo hibridan con secuencias especficas. Adems en cada etapa de la PCR
nested se realiza un nmero menor de ciclos, lo que conlleva a reducir el nmero de
errores de lectura y de sntesis producidos en la PCR clsica por la falta de
fidelidad de la polimerasa Taq. El empleo de esta tcnica es importante en el caso
de la hepatitis C ya que en estos casos la viremia es baja.

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Bosster PCR
Es otra variante de la PCR en la cual se utilizan dos amplificaciones sucesivas
con idnticos cebadores dando origen a reacciones menos especficas ya que en la
segunda amplificacin los cebadores hibridan siempre con los extremos 5 y 3 del
primer producto obtenido (regin de cebadores) independientemente del producto
sintetizado.


PCR asimtrica
Esta tcnica es muy utilizada para estudios de secuenciaciones nucleotdicas,
ya que permite obtener predominantemente una cadena, en lugar de dos, como en
la reaccin habitual. Esto se logra cuando uno de los cebadores est presente en
mnima concentracin, con lo cual se amplifica escasamente una cadena y
masivamente la complementaria.


PCR reversa
En esta variante el fragmento a amplificar est delimitado por los extremos 5
opuestos entre s, a diferencia de la reaccin habitual donde son los extremos 3 los
que se encuentran enfrentados. Es empleada en el caso de amplificacin de
genomas circularizados.


PCR larga
Mediante esta tcnica es posible amplificar secuencias de hasta 40.000 bases
de longitud, lo cual facilita el desarrollo de proyectos genmicos.

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ADN Polimrfico Amplificado al Azar (RAPD; del ingls, Random Amplified
Polymorphic ADN)
Es un marcador molecular basado en PCR que presenta la ventaja de no
requerir conocimiento previo de la secuencia. Es por ello particularmente til en
aquellas especies cuyo genoma es poco conocido. Sin embargo, puede resultar una
tcnica poco consistente, a menos que se controlen las diferentes condiciones
experimentales (enzima polimerasa de ADN empleada, perfiles de amplificacin,
soporte electrofortico, etc.). En esta tcnica se realiza con cebador aleatorio (AP-
PCR), en la que se utilizan mltiples copias de un nico cebador en condiciones
poco rigurosas. El cebador inespecfico se une a muchos sitios del genoma y los
fragmentos obtenidos son el resultado de la amplificacin de regiones cercanas del
ADN plantilla flanqueadas por dos copias del cebador orientadas en la direccin
correcta. (2 y 5 para el producto A y 3 y 6 para el producto B representado en la
imagen). Esta tcnica puede presentar problemas de reproducibilidad.





APLICACIONES DE LA PCR


Las aplicaciones de la PCR son mltiples, abarcando desde la evolucin
hasta la clnica, pasando por la gentica, la biologa molecular y la biotecnologa;
adems de aplicaciones en la agricultura y la ganadera.


INVESTIGACIN (SIMPLIFICACIN DE EXPERIMENTOS DE INGENIERA GENTICA)


Mutagnesis dirigida
La tcnica PCR puede ser utilizada para cambiar la informacin contenida en
un segmento de ADN, pues permite alterar su secuencia de bases. Esta
"mutagnesis dirigida" consiste en el reemplazo de la secuencia gnica original por
otra, que puede diferir, por ejemplo, en una base respecto de la original. Esto se
logra usando primers que, a pesar de portar la mutacin, son igualmente capaces de
aparearse con el molde y dar lugar a productos de amplificacin con la secuencia
cambiada.

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Secuenciacin de ADN
Las tcnicas de secuenciacin de ADN han estado disponibles desde 1977.
Sin embargo, su aplicacin a estudios poblacionales ha estado limitada por la
dificultad en la produccin de cantidades suficientes del ADN a secuenciar. La
introduccin de la PCR salv esta dificultad y actualmente resulta viable la
secuenciacin de fragmentos de ADN de un nmero considerable de individuos,
muchos ms si se dispone de secuenciadores automticos. Para este objetivo, la
PCR simplemente proporciona cantidades suficientes de DNA molde de cada
individuo.
Una de las razones mas comunes para el uso de la PCR es la formacin de
suficiente cantidad de ADN molde para su secuenciacin. Es mucho ms sencillo y
rpido que la clonacin en clulas.


Amplificacin de Minisatlites
La visualizacin de los fragmentos amplificados tras electroforesis puede ser
en s misma informativa cuando a partir de distintos genotipos se obtienen patrones
de bandas diferentes. Los minisatlites son repeticiones cortas en tndem de 2 a
1000 nucletidos, ampliamente dispersas en el genoma de los organismos
eucariotas. El nmero de repeticiones en cada locus es variable; estos locis se
conocen con el nombre de repeticin en tndem de nmero variable (VNTR).
La amplificacin de estos loci mediante PCR con cebadores flanqueantes a la
repeticin genera fragmentos cuyo tamao depende del nmero de repeticiones de
esta secuencia, caracterizndose e manera sencilla y sensiblemente los alelos de
estos loci en un nmero considerable de individuos. Tanto la simpleza tecnolgica
(de la aplicacin, no tanto del desarrollo) como la cantidad y calidad de la
informacin que genera (hipervariabilidad, anlisis locus a locus) han convertido al
anlisis de minisatlites en una de las tcnicas mas poderosas para la identificacin
de individuos, los anlisis de parentesco y la gentica de poblaciones.

En verde claro se indican dos cromosomas homlogos con
minisatlites (VNTR) en sus extremos. El locus correspondiente
a la regin del minisatlite (banda cromosmica amplificada
arriba en color anaranjado) es heterocigoto con respecto a la
longitud de la regin (un alelo dispone de tres y el otro de cinco
repeticiones en tndem). La digestin con HinfI (flechas negras)
escinde y separa los minisatlites del resto de la molcula.


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Las VNTR (los minisatlites en este caso) procedentes de muchos locus se
separan por electroforesis y se transfieren a una membrana de nylon o
nitrocelulosa. La hibridacin posterior con una sonda que reconoce una
secuencia en comn de estas VNTR (sonda multilocus o MLP) revela una
pauta de distribucin de fragmentos de ADN semejante a un cdigo de barras.
Si en cambio se utiliza una sonda que reconoce la secuencia especfica de un
locus dado (sonda unilocus o SLP), slo se observan dos bandas
correspondientes al minisatlite especfico, una del alelo materno y la otra del
paterno.



APLICACIONES EN EL DIAGNSTICO MDICO


Estudio del HLA (complejo mayor de histocompatibilidad)
La determinacin de la secuencia de nucletidos de varios alelos HLA
permiti el diseo de nuevas estrategias de tipificacin molecular de los genes HLA
basadas en la amplificacin por PCR y en la posterior hibridacin con sondas
constituidas por oligonucletidos de secuencia especfica que reconocen las
variantes de alelos llamadas de riesgo. Se han desarrollado recientemente pruebas
de tipificacin por PCR de los alelos HLA que han indicado la existencia de
susceptibilidad gentica en relacin con la enfermedad celaca, esclerosis mltiple y
la diabetes tipo I (insulinodependiente), permitiendo adoptar conductas teraputicas
tempranas.
Otra de las aplicaciones es en el estudio del CMH que determina los
antgenos (HLA clase II) que establecen la compatibilidad en los trasplantes de
rganos.



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Diagnstico de enfermedades hereditarias
La tcnica PCR ha facilitado enormemente el diagnstico de enfermedades
hereditarias como hemoglobinopatas (talasemias y anemia falciforme), la
fenilcetonuria, las hemofilias A y B, la deficiencia de alfa 1 antitripsina, la distrofia
muscular y la fibrosis qustica. Esta ltima es la ms comn de las enfermedades
autosmicas recesivas severas que afectan a la poblacin blanca.
Un fragmento obtenido por PCR puede ser utilizado directamente para
clonacin, para ser secuenciado, o para ser utilizado como sonda en hibridaciones
en filtro tipos Southern o Northern. Tambin mediante una simple electroforesis en
gel se puede estudiar, a nivel de ADN genmico, la existencia de deleciones e
inserciones en un gen determinado. Enfermedades cuya base es una mutacin
puntual pueden ser diagnosticadas por PCR, si luego se trata con una enzima de
restriccin cuyo sitio se ve afectado por dicho cambio puntual en la secuencia
nucleotdica. Incluso, puede estudiarse a los descendientes del paciente en cuestin
que an no han desarrollado la enfermedad, para ver si han heredado la mutacin
responsable (portadores) de la enfermedad. Aunque controversial por no disponer,
hasta el momento, de cura, ya es posible estudiar tambin si un determinado gen
causante de una enfermedad de la madurez est latente desde la niez, como en el
caso de la corea de Huntington y la enfermedad de Alzheimer.


Diagnstico prenatal
Las tcnicas de diagnstico preconcepcional o preimplantacional se pueden
utilizar en aquellas parejas que tienen un riesgo de transmitir a la descendencia un
defecto gentico recesivo por ser ambos portadores (heterocigotos) del mismo, o
solamente la mujer si se trata de una enfermedad producida por un gen dominante.
Por ejemplo estos tipos de anlisis pueden ser de mucho valor para el caso de
trastornos heredados ligados al cromosoma X.

Diagnstico preconcepcional: En la primera divisin
meitica femenina se origina el ovocito secundario (que
constituir posteriormente el gameto femenino) y el primer
cuerpo polar. El diagnstico preconcepcional se realiza
sobre el primer cuerpo polar. El corpsculo polar es
aspirado por micromanipulacin y posteriormente se lleva
a cabo una amplificacin de su ADN mediante la tcnica
PCR (reaccin en cadena de la polimerasa) para analizar
su contenido gentico, de cuyo anlisis podr deducirse
cmo es el ovocito secundario correspondiente y, por
tanto, ser aceptado o rechazado en el proceso de FIV en
caso de que pudiera dar lugar a un gameto portador del
gen deletreo. La ventaja de esta tcnica es que, al
realizar la seleccin en el estadio de ovocito, y no de
embriones, se evita cualquier reparo tico que pudiera
tener la pareja portadora del defecto gentico frente a la
eliminacin de embriones.

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La fotografa muestra un ovocito secundario
humano y el primer cuerpo polar (mucho
ms pequeo). La aspiracin mediante una
micropipeta del cuerpo polar permite aislar
su ADN mediante la tcnica de reaccin en
cadena de la polimerasa (PCR) y realizar el
diagnstico preconcepciona, indicando si el
ovocito secundario debe ser utilizado en la
fecundacin in vitro.



Diagnstico preimplantacional: Se realiza extrayendo
una (excepcionalmente dos) clula (blastmero) de un
embrin (sin afectar su viabilidad) en estadio de 6-8
clulas que puede ser analizada posteriormente mediante
tcnicas cromosmicas (por ejemplo, hibridacin in situ
con fluorescencia, FISH) o moleculares (PCR). Una vez
realizado el diagnstico se decide su eliminacin si es
desfavorable o su transferencia al tero de la mujer si es
favorable. Es importante sealar que puede existir un
error en el diagnstico pues, por ejemplo, en el caso de
utilizar la tcnica PCR se estima que puede haber hasta
un 8% de fallos.









La separacin por microsuccin de un blastmero de un embrin humano permite realizar el
diagnstico preimplantatorio cromosmico mediante la tcnica FISH (hibridacin in situ con
fluorescencia) o molecular (PCR).



Estudio de enfermedades infecciosas
Mediante PCR es posible monitorear infecciones bacterianas y virales Los
procedimientos convencionales de deteccin se basan en la posibilidad de crecer los
microorganismos en cultivo o en detectar su presencia en el paciente mediante
anticuerpos.

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La desventaja de estos mtodos es que pueden tardar semanas. La PCR
detecta directamente los patgenos tradicionalmente difciles de cultivar, tales como
Chlamidia trachomatis, Legionella pneumophila y Mycoplasma pneumoniae. As
como a aquellos que requieren de largos perodos para su cultivo y que se
encuentran en muy baja concentracin en los lquidos biolgicos, como el caso del
Mycobaterium tuberculosis, enfermedad en la que muchas veces el tratamiento
emprico tiene que iniciarse antes del diagnstico definitivo, apoyndose hasta hace
poco nicamente en el cuadro clnico (ver PCR mltiple).
En este caso el examen muestra si el ADN de un agente infeccioso est
presente en la sangre o en una muestra de tejido. Una cadena de cebador
compatible con el ADN del agente patgeno se agrega a la muestra. Si el patgeno
est presente, su ADN va a servir de molde del cebador y ser amplificado. Debido
a que se requiere muy poco de la secuencia blanco, y a que puede lograrse que los
cebadores se unan a un genoma viral o bacteriano especfico, el examen basado en
PCR es extremadamente sensible. Si un organismo est presente en pequeas
cantidades, la PCR lo detectar.
Por lo tanto mediante el PCR es posible amplificar secuencias
correspondientes al virus o a la bacteria de una manera especfica y muy sensible,
pudiendo llegar a detectar un microbio entre 106 clulas infectadas con agentes
infecciosos como el del SIDA, hepatitis B, tuberculosis, herpes, brucelosis, malaria,
etc. Dentro del campo del SIDA se est utilizando para el diagnstico prenatal, y
para cuantificar la carga y la actividad viral mediante la obtencin de ADNc y
amplificacin de secuencias especficas del virus. Esto ltimo se utiliza para dar
seguimiento del xito de los tratamientos.


Deteccin de enfermedades oncolgicas
La PCR permite estudiar alteraciones genticas en proto-oncogenes y en
genes supresores de tumores que estn involucrados en el origen de las neoplasias.
El seguimiento de los resultados obtenidos con un tratamiento puede ser
monitoreado mediante la deteccin por PCR de clulas malignas; es posible llegar a
detectar hasta una clula cancergena en 106 clulas normales, siendo la
sensibilidad alcanzada ms que la de cualquier otra tcnica. Esto es ampliamente
aplicado en patologas malignas hematopoyticas para la deteccin de enfermedad
mnima residual, como as tambin para la deteccin de carcinomas de colon, de
pncreas y leucemias mieloides entre otros.



HUELLAS DACTILARES DEL ADN

La determinacin de las huellas dactilares genticas constituye una de las
aplicaciones ms interesantes de la PCR. Mediante esta tcnica es posible comparar
muestras diferentes de ADN para comprobar si pertenecen al mismo individuo o no,
o si existe parentesco entre ellas. Esta tcnica se aplica actualmente en Medicina
forense e investigaciones policiales, con el fin de identificar individuos a partir de
muestras biolgicas, como sangre, semen, piel o cabellos. Tambin se utiliza en las
pruebas de paternidad.
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Las pruebas genticas de identificacin han revolucionado la medicina
forense. El mtodo de tipificacin del ADN desarrollado hace varios aos por el
profesor Alec J . J effreys (1983), se basa en la misma metodologa desarrollada para
estudiar las patologas hereditarias, identificando los genes causantes de
enfermedades en familias portadoras de un trastorno congnito y prediciendo el
riesgo que puede correr el individuo de portarlo.
Comparativamente a la eficiencia de los marcadores de protenas, en la
identificacin forense la tipificacin del ADN posee dos ventajas: puede utilizarse en
el anlisis de muestras pequeas y antiguas, y su nivel de certeza de probabilidad
es triple a cudruple que la anterior. Para determinar si dos muestras de ADN
poseen el mismo origen, se examinan las regiones variables de los pares de bases
del ADN. Estas regiones pueden segmentarse mediante enzimas de restriccin y se
les denomina RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms). Para la
identificacin del ADN se requiere que los RFLP sean altamente variables, es decir,
polimrficos, con un gran nmero de variantes o locus en la poblacin.
En el genoma humano existen regiones de gran variabilidad que difieren en
cada persona (salvo entre gemelos). Cada una de esas regiones son conocidas
como minisatlites de ADN (ver: Amplificacin de minisatlites).
Despus de purificar el ADN y cortarlo con enzimas de restriccin que dejan
intactos los minisatlites, los fragmentos polimrficos obtenidos se separan por
electroforesis y se hibridan con una sonda radiactiva complementaria, ya sea de las
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regiones comunes (multi-locus probe, MLP) o bien de las regiones especficas de las
VNTR (singlelocus probe, SLP). Las autorradiografas resultantes revelan, en el
primer caso, una serie de bandas en escalera (cada una correspondiente a una
regin hipervariable o a un minisatlite en particular), y en el ltimo caso, slo dos
bandas, una que corresponde al alelo paterno y otra al alelo materno del minisatlite
especfico. En castellano, la tcnica de J effreys se conoce con diversos nombres, a
saber: huella digital, impronta de ADN, huella genmica, identificacin dactilar, huella
dactilar del ADN e impronta gentica, por citar los ms usuales.
Para determinar si dos muestras de ADN poseen el mismo origen, se
examinan las bandas identificadas y se comprueba su nivel de coincidencia. Los
resultados se confrontan con la informacin existente sobre la caracterizacin
gentica de cada poblacin para averiguar la frecuencia de aparicin del tamao de
ese alelo en particular. Al considerar los alelos de varios sitios distintos disminuye la
posibilidad de coincidencia de dos o ms individuos. La posibilidad de que
cualesquiera personas puedan tener la misma huella dactilar de ADN es de 1 entre
10 000-30 000 millones.


Las diferencias de la longitud del fragmento
de restriccin proporcionan una huella digital
de ADN individual y nica. En esta
ilustracin del anlisis de huellas digitales
de ADN se muestra claramente que slo la
sangre de uno de los sospechosos coincide
con la que se encontr en la escena del
crimen.

Una limitacin del anlisis de huellas moleculares de ADN con VNTRs es que
precisa una muestra relativamente grande de ADN (aproximadamente 10.000
clulas) y no debe estar degradado. En consecuencia, la huella molecular es ms til
en pruebas de paternidad que en casos criminales.
Para superar el problema de tamao de la muestra y de las condiciones
necesarias para el anlisis con VNTR, se usan como sondas un conjunto de
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secuencias diferentes pero relacionadas que se analizan mediante PCR. Estas
secuencias se denominan repeticin cortas en tndem (STR) o microsatlites. Son
parecidas a los VNTR pero la secuencia repetida es de 2 a 9 pares de bases. El
anlisis de STR por PCR se usa de manera rutinaria en casos forenses para generar
perfiles de ADN a partir de trazas de muestras de distintos orgenes.
Los resultados de los anlisis de STR se analizan e interpretan usando
estadstica, probabilidades y gentica de poblaciones.

El anlisis de huellas dactilares tiene adems diversos usos: permite evaluar
la compatibilidad de donantes potenciales de rganos, supervisar las afirmaciones
de pedigr respecto de animales de cra, examinar las relaciones entre antiguas
poblaciones humanas y determinar si cumplen las leyes referentes a especies en
peligro de extincin.



ARQUEOLOGA Y PALEONTOLOGA

Estudios evoluti vos
La PCR ha sido utilizada para generar secuencias de genes a lo largo de la
evolucin y establecer el grado de relacin entre especies y poder construir as
rboles filogenticos. La homologa se mide comparando cambios nucleotdicos en
el mismo gen entre diferentes especies o por comparacin de genes mitocondriales
(ADNmt-ADN mitocondrial antiguo) que no se recombinan durante la meiosis y
tienen un alto porcentaje de puntos de mutacin. Incluso se pueden estudiar
especies extintas (por ejemplo el mamut) o fsiles (se ha logrado amplificar ADN de
hasta millones de aos de antigedad), extrayendo el ADN de piezas que se
encuentren en los museos.

Debido a que las muestras antiguas generalmente rinden ADN altamente
degradado, el mismo es amplificado por PCR. Las pruebas citogenticas han
revolucionado la paleontologa tradicional al posibilitar la extraccin de ADN de
tejidos antiguos, incluyendo especimenes de varios centenares de aos. Se han
recuperado, por ejemplo, secuencias de ADN nuclear de la piel de una antigua
momia egipcia y ADN mitocondrial de un cerebro humano de 7 000 aos de
antigedad, analizados mediante el PCR.
Reaccin en cadena de la polimerasa 16
Tambin se han realizado estudios de evolucin entre poblaciones humanas,
llegando a la conclusin del origen africano de nuestra especie, gracias al estudio
del ADN mitocondrial.

Gracias a la estabilidad del ADN mitocondrial (heredado solamente de la
madre, tiene una tasa de mutacin estable) se han podido reconstruir lneas
maternas hasta llegar a la llamada Eva mitocondrial.


CIENCIAS AGROPECUARIAS

La PCR tambin ha facilitado la obtencin y, de paso, la modificacin (va
oligonucletidos mutagnicos) de secuencias gnicas para su integracin en
vectores de expresin, dndole mayor versatilidad a las tcnicas de ingeniera
gentica que han hecho posible la biotecnologa moderna. Igualmente, es la base de
mtodos para diferenciar variedades vegetales, as como para identificar si un
organismo, ya sea animal o vegetal, corresponde a uno genticamente modificado.
Pero quiz el mayor impacto en las ciencias agropecuarias se ha dado en el
campo diagnstico, donde la PCR es la base de innumerables mtodos de deteccin
de plagas y parsitos. Finalmente, tambin se ha visto cmo en aos recientes,
mtodos de PCR para determinar la .huella gentica en humanos, son ahora
aplicados con xito en el ganado.


ECOLOGA Y MEDIO AMBIENTE

Las aplicaciones de la PCR en la biologa de la conservacin se utiliza para:
Entender los cambios genticos que afectan a la supervivencia de
especies amenazadas.
Proporcionar informacin gentica utilizable para la mejor gestin de
las especies amenazadas.
Estos propsitos se logran mediante el conocimiento de la:
Reaccin en cadena de la polimerasa 17
Identificacin de unidades de conservacin. Al permitir analizar las
relaciones filogenticas entre grupos de individuos, los marcadores
moleculares pueden ser clave a la hora de decidir si una poblacin concreta
merece proteccin.
Documentacin de fenmenos de hibridacin e introgresin. Una de las
amenazas para especies en peligro es la perdida de identidad gentica
mediante hibridacin extensiva con grupos relacionados.
Aplicacin de la legislacin medio ambiental y utilizacin forense. Por
ltimo, los anlisis moleculares estn siendo, y sin duda lo sern cada vez
ms en el futuro, utilizados como herramientas para la deteccin de delitos
contra el medio ambiente.



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