PEWARNAAN,

PENANAMAN & MEDIA

PERBENIHAN BAKTERI
Asih Rahayu,drh.,M.Kes.
LAB. MIKROBIOLGI
FK UWKS
IDENTIFIKASI BAKTERI
Identifikasi bakteri penyebab penyakit
infeksi dilakukan di laboratorium
Mikrobiologi dengan mengirimkan sampel
penderita (mengenai sampel dibahas lebih
lanjut pada Bab Pengambilan Spesimen &
interpretasi Hasil Pemeriksaan
Laboratorium Mikrobiologi)
Sampel yang diterima oleh lab akan
dikerjakan sesuai permintaan dokter
pengirimnya

PEMERIKSAAN RUTIN LAB
MIKROBIOLOGI UNTUK BAKTERI
Setiap sampel untuk pemeriksaan bakteri yang
diterima oleh lab Mikrobiologi akan dilakukan
pemeriksaan sbb:
1. Pemeriksaan mikroskopis untuk mengetahui
morfologi & sifat afinitas bakteri terhadap zat
warna
2. Kultur (perbenihan) untuk mengetahui sifat
fisiologis & kimiawi bakteri
3. Hewan coba (bila perlu) ; saat ini sudah sangat
jarang dilakukan
1.PEMERIKSAAN MIKROSKOPIS
Untuk memeriksa bakteri secara mikroskopis
perlu dilakukan pewarnaan /pengecatan
Jenis pewarnaan yang dipergunakan disesuaikan
dengan kebutuhan / permintaan masing masing
spesimen yang dikirimkan
Umumnya dilakukan pewarnaan rutin lab
Mikrobiologi yaitu Pewarnaan Gram, kecuali
terdapat indikasi lain misalnya untuk spesimen
penderita yang diduga TBC atau lepra , tidak
dilakukan pewarnaan Gram melainkan
pewarnaan Tahan Asam
Terdapat banyak jenis pewarnaan, pada kuliah ini
hanya dipelajari beberapa yang dasar & sangat
penting diketahui oleh seorang calon
praktisi/dokter
PEWARNAAN
berdasarkan ikatan zat
warna dengan sito-
plasma bakteri

POSITIF
-Zat warna dapat ber-
ikatan dengan sito-
plasma bakteri
NEGATIF
-zat warna tidak dapat
berikatan dengan sito-
plasma bakteri
Pewarnaan yang bersifat positif
Karena mempergunakan zat warna yang dapat berikatan
dengan sitoplasma bakteri, maka di bawah mikroskop
bakteri akan tampak berwarna sesuai dengan warna zat
yang dipakai
Zat warna yang dipakai harus bersifat basa ( basic dyes)
untuk dapat berikatan dengan sitoplasma bakteri yang
cenderung bersifat asam
Contoh zat warna yang bersifat basa:
Crystal violet berwarna ungu
Safranin berwarna merah
Methylene Blue berwarna biru
Carbol fuchsin berwarna merah
Malachite Green berwarna hijau ; larut dalam air
Neisser AB & Neisser C larut dalam air

Macam Pewarnaan yang bersifat positif
1. Sederhana / simple staining : mempergunakan 1 macam
zat warna basa ; tujuannya hanya untuk mengetahui
bentuk/morfologi & susunan bakteri secara cepat
2. Differential : dapat membedakan sifat sifat bakteri
berdasarkan afinitas terhadap zat warna ;
mempergunakan lebih dari 1 macam zat warna basa ;
selain untuk mengetahui bentuk & susunan bakteri juga
untuk mengetahui sifat bakteri berdasarkan afinitas
terhadap zat warna misalnya sifat Gram,sifat Acid fast
3. Khusus: mempergunakan lebih dari 1 macam zat warna
basa; untuk mengetahui bagian bagian khusus yang
dimiliki oleh bakteri misalnya Granula metachromatic,
endospora / spora, capsule dll

PEWARNAAN YANG BERSIFAT NEGATIF
Karena menggunakan zat warna yang tidak
dapat berikatan dengan sitoplasma bakteri,
maka di bawah mikroskop bakteri akan
tampak bening / tidak terwarnai & hanya
latar belakang / daerah di sekitar bakteri
yang akan terwarnai
Zat warna yang dipakai harus bersifat asam
/ acidic dyes sehingga tidak dapat berikatan
dengan sitoplasma bakteri yang cenderung
bersifat asam
Contoh zat warna yang bersifat asam : tinta
bak, chinese ink, indian ink, nigrosin

MACAM PEWARNAAN YANG
BERSIFAT NEGATIF
Burrie / negative stain :
mempergunakan 1 macam zat warna
asam ; untuk mengetahui morfologi &
susunan bakteri serta umumnya
dipakai untuk mewarnai bakteri
bakteri yang sulit diwarnai ( sulit
menyerap zat warna basa ) atau dapat
juga dipakai untuk mewarnai bakteri
bercapsule
Membuat preparat / sediaan bakteri untuk pewarnaan
Secara detail langkah langkahnya lihat Buku
Petunjuk Praktikum I Mikrobiologi
Yang perlu diingat adalah :
1. Pakai object glass bersih & bebas lemak (baru)
2. Siapkan ose yang lingkarannya menyatu
3. Siapkan nyala api bunsen
4. Bila bakteri diambil dari biakan cair tidak perlu PZ
steril
5. Bila bakteri diambil dari biakan padat perlu PZ steril
6. Selalu bekerja secara ASEPTIS
7. Preparat harus difixasi setelah benar benar kering
PEWARNAAN SEDERHANA
= SIMPLE STAINING
Mempergunakan 1 macam zat warna basa ; zat warna
yang dianjurkan : safranin & methylene blue
Di bawah mikroskop bakteri akan tampak berwarna
merah bila menggunakan safranin ; bila menggunakan
methylene blue, bakteri akan tampak berwarna biru
Secara detail langkah-langkahnya lihat Buku Petunjuk
Praktikum I Mikrobiologi
Informasi yang didapat dari pewarnaan ini hanyalah
morfologi & susunan bakteri
Morfologi : coccus ; batang = bacill panjang, pendek,
sangat pendek, kurus , gemuk, kecil, besar, mempunyai
spora (spora tampak sebagai daerah tak berwarna karena
spora tidak dapat ditembus zat warna) dll
Notes: bentuk batang yang sangat pendek sehingga mirip
coccus disebut sebagai cocoid atau coccobacill
Susunan : bergerombol, membentuk rantai, seperti huruf
cina, berdua, berempat berdelapan, sendiri sendiri dll
PEWARNAAN GRAM
Merupakan pewarnaan differential
untuk membedakan antara bakteri Gram
positif dengan bakteri Gram negatif
berdasarkan afinitas dinding sel bakteri
terhadap zat warna Gram
Gram merupakan nama penemu
pewarnaan ini tulis huruf awal dengan
huruf capital
Secara detail langkah langkahnya lihat di
Buku Petunjuk Praktikum I Mikrobiologi
Mempergunakan 2 macam zat warna basa
yaitu : Crystal violet ( berwarna ungu )
sebagai zat warna utama = main stain &
safranin (berwarna merah) sebagai zat
warna pembanding = counter stain
Mempergunakan zat kimia pelarut organik
: Alkohol absolut = alkohol 95 96 %
sebagai decolorizing agent = peluntur
Mempergunakan zat kimia : lugol (KI
3
3%)
sebagai mordant = pemantek = zat yang
membantu pengikatan zat warna Crystal
violet dengan sitoplasma bakteri (Iodine-
dye complex)
Bakteri yang mempunyai struktur
dinding sel peptidoglikan yang tebal
mempertahankan zat warna crystal
violet pada saat pelunturan warna
tetap ungu Gram POSITIF
Bakteri yang mempunyai struktur
dinding sel peptidoglikan yang tipis
tidak dapat mempertahankan zat
warna crystal violet pada saat
pelunturan akan mengikat zat
warna pembanding ( safranin)
warna merah Gram NEGATIF
PEWARNAAN ACID FAST
= Pewarnaan Tahan Asam = Pewarnaan Ziehl-
Neelsen
Ada beberapa metode , diantaranya Ziehl-Neelsen
, Tan Thiam Hok dari nama orang penemunya
Langkah langkah secara detail lihat Buku
Petunjuk Praktikum I Mikrobiologi metode
Ziehl Neelsen
Merupakan pewarnaan diffrential untuk
membedakan antara bakteri yang tahan asam
(Acid Fast) dengan bakteri yang tidak Tahan
Asam ( Non Acid Fast)
Contoh bakteri Acid Fast adalah : Mycobacterium
leprae & Mycobacterium tuberculosis

Mempergunakan 2 macam zat wana basa yaitu: Carbol
Fuchsin ( wana merah ) sebagai main stain dengan
Methylene Blue ( warna biru) sebagai counter stain
Mempergunakan zat kimia pelarut organik yang kuat
yaitu Alkohol asam (larutan Alkohol + HCl) sebagai
decolorizing agent
Mempergunakan tehnik pemanasan preparat untuk
merenggangkan pori dinding sel / lapisan mycolic acid
bakteri yang bersifat tahan asam , sehingga diharapkan
zat warma Carbol Fuchsin dapat masuk & berikatan
dengan sitoplasma bakteri
Bakteri yang mempunyai struktur dinding sel mycolic acid
akan mempertahakan zat warna Carbol Fuchsin pada saat
pelunturan Bakteri Acid Fast / bakteri tahan Asam
berwarna merah
Bakteri yang tidak mempunyai struktur dinding sel
mycolic acid tidak dapat mempertahankan zat warna
Carbol Fuchsin akan mengikat zat warna pembanding
Methylene Blue bakteri tidak Tahan Asam / Non Acid
Fast berwarna biru
PEWARNAAN SPORA
= Pewarnaan Schaeffer-Foulton nama penemu
pewarnaan ini
Merupakan pewarnaan khusus untuk melihat
spora (endospora) bakteri
Bakteri yang dapat membentuk spora (bentuk
pertahanan diri/tidak aktif) misalnya Bacillus sp
& Clostridium sp
Letak & diameter spora adalah karakteristik
Letak : central, sub terminal, terminal
Diameter : lebih kecil atau lebih besar dari
diameter bagian vegetatif bakteri
Bentuk spora : bulat atau oval
Mempergunakan 2 macam zat warna basa yaitu :
Malachite Green (warna hijau) sebagai main
stain & safranin (warna merah) sebagai counter
stain
Mempergunakan tehnik pemanasan untuk
merenggangkan dinding spora yang tebal &
impermiable sehingga diharapkan zat warna
Malachite Green dapat menembus dinding spora
warna spora hijau
Karena Malachite Green larut dalam air maka
bagian vegetative bakteri akan melepas warna
malachite green & mengikat warna safranin
bagian vegetative berwarna merah

PEWARNAAN NEISSER
Merupakan pewarnaan khusus : untuk melihat
granula metachromatic bakteri
Contoh bakteri patogen yang mempunyai granula
metachromatic adalah Corynebacterium diphteriae
Menggunakan 2 macam zat warna basa Neisser
AB & Neisser C (keduanya larut dalam air)
oleh karena itu selama pewarnaan tidak boleh ada
proses pencucian
Secara detail dapat dilihat pada Buku Praktikum
I Mikrobiologi
Granula metachromatik tampak berwarna biru
gelap & sitoplasma bakteri akan tampak kuning
kecoklatan

PEWARNAAN NEGATIF
= negative stain = Burrie nama penemunya
Menggunakan zat warna asam,umumnya tinta
bak dengan kualitas yang baik
Metode Pembuatan preparat bakteri untuk
pewarnaan negatif berbeda dengan metode
pembuatan preparat bakteri untuk pewarnaan
positif (simple, Gram, Acid Fast, Spora,Neisser)
yaitu dengan tehnik ulas
Bakteri tampak tidak berwarna (transparant)
dengan latar belakang hitam /gelap
Catatan:
Pewarnaan yang menggunakan metode
pemanasan preparat : Acid Fast & Spora
Pewarnaan yang menggunakan metode
pelunturan: Gram (alkohol 95-96%) & Acid Fast
(alkohol asam)
Pada pewarnaan dengan metode pemanasan :
selama pemanasan preparat tidak boleh kering &
tidak boleh mendidih
Semua jenis pewarnaan terdapat tahap pencucian
dengan air (pergunakan air kran) , kecuali pada
pewarnaan Neisser
Staphylococcus sp Gram positif, coccus, umumnya
bergerombol seperti buah anggur
Streptococcus sp Gram positif, coccus , umumnya
berjajar membentuk rantai
Escherechia coli Gram negatif, batang / bacill,
umumnya sendiri sendiri
Bacillus subtilis Gram positif , mempunyai spora (
tampak transparant pada pewarnaan Gram), batang
besar, umumnya berjajar membentuk rantai
Mycbacterium tuberculosis Acid Fast / Tahan Asam,
umumnya bergerombol atau sendiri - sendiri
Mycobacterium leprae Acid Fast / Tahan Asam,
umumnya bergerombol membentuk formasi potongan
melintang cerutu (globi / globus) atau sendiri sendiri
Preparat yang ditemukan bakteri bentuk batang Tahan
Asam disimpulkan sebagai BTA positif