I.

OBJETIVO:
Determinar la presencia de coliformes totales y fecales en el efluente de la PTAR
de la UPEMOR por el mtodo del Nmero Ms Probable, utilizando la tcnica de
tubos de fermentacin mltiple.

II. INTRODUCCION:
Debido a que las aguas residuales son de composicin variada provenientes de descargas de usos
municipales, industriales, comerciales, de servicios, agrcolas, pecuarios, domsticos, incluyendo
fraccionamientos y en general de cualquier uso,as como la mezcla de ellas, contienen diferentes
tipos de microorganismos contaminantes y las diferentes concentraciones, dependiendo de su
fuente. La variada poblacin de microorganismos en esta agua, proviene del suelo y de origen
intestinal, incluyen aerobios y anaerobios estrictos y facultativos as como tambin numerosos virus
como: Poliovirus y virus de la hepatitis. Igualmente pueden contener formas parasitarias variables
como quistes de Protozoarios y huevecillos de Helmintos (Metazoarios).

Asimismo, existe en nuestro pas el grave problema de contaminacin de ros, lagos acuferos y
costas debido a que estos son utilizados como depsito de todos los desechos generados por las
actividades humanas. Estos microorganismos pueden sobrevivir al tratamiento, por lo que su reso
p.ej., en riego agrcola, actividades recreativas: Aguas de piscinas, baos de hidromasaje, aguas
potables naturales, actividades pisccolas y aguas marinas superficiales (playas),
representan un riesgo potencial a la salud pblica.

La presencia y extensin de contaminacin fecal es un factor importante en la determinacin de la
calidad de un cuerpo de agua. Las heces contienen una variedad de microorganismos y formas de
resistencia de los mismos, involucrando organismos patgenos, los cuales son un riesgo para la salud
pblica al estar en contacto con el ser humano. El examen de muestras de agua para determinar la
presencia de microorganismos del grupo coliforme que habitan normalmente en el intestino
humano y de otros animales de sangre caliente, da una indicacin, pues dada la limitada capacidad
de algunos miembros del grupo de organismos coliformes para sobrevivir en agua; sus nmeros
tambin pueden emplearse para estimar el grado de contaminacin fecal.

Son Organismos coliformes aquellos capaces de crecimiento aerbico ya sea 35 37 1C en un
medio de cultivo lquido lactosado con produccin de acido y gas dentro de un periodo de 48 h.

El mtodo de la NPM es un mtodo robusto por lo que puede aplicarse en cualquier tipo de agua,
an aquellos que contienen gran cantidad de materia orgnica.

Para la determinacin del NMP de Coliformes Totales y Fecales en este tipo de aguas, es necesario
proceder a preparar diluciones decimales de la muestra, debido a que se espera que la concentracin
de coliformes sea superior en stas que en un agua potable.

El nmero de diluciones vara mucho, dependiendo del origen de la muestra a tratar. Por lo dems,
para su anlisis de procede en la misma forma que para una muestra de agua potable.







III. MATERIAL Y SUBSTANCIAS
Muestra de agua de del efluente de la PTAR de la UPEMOR.

encendedor.



estril de concentracin sencilla.
n campana Durham, conteniendo Caldo Lactosa
Bilis Verde Brillante estril.


o inclinado estril.





IV. METODOLOGA PARA LA PREPARACIN DE MEDIOS Y
SOLUCIONES.
MEDIOS DE AISLAMIENTO:
-Caldo lauril triptosa (CLT).
Triptosa 40.0g
Lactosa 10.0g
Cloruro de sodio (NaCl) 10.0g
Fosfato monobsico de potasio (KH2PO4) 5.5g
Fosfato dibsico de potasio (K2HPO4) 5.5g
Lauril sulfato de sodio 0.2g
Agua para llevar a 1000 cm3
Aadir la triptosa y el cloruro de sodio al agua, calentar para disolver y aadir el
lauril sulfato de sodio. Disolver el resto de los componentes por separado y
agregarlos a los anteriores mezclando suavemente para evitar la formacin de
espuma.
-Caldo bilis lactosa verde brillante:
Peptona 10.0g
Lactosa 10.0g
Bilis de buey (deshidratada) 20.0g
Verde brillante (1% m/m en solucin acuosa) 13 cm3Agua para llevar a 1000 cm3
-Medio EC:
Triptosa o tripticasa 20.0g
Lactosa 5.0g
Mezcla de sales biliares 1.5g
Fosfato dibsico de potasio (K2HPO4) 4.0g
Fosfato monobsico de potasio (KH2PO4) 1.5g
Cloruro de sodio (NaCl) 5.0g
Agua para llevar a 1000 cm3
Distribuir el medio de simple concentracin en volmenes indicados en cada tubo
que debe contener un tubo de fermentacin invertido (Durham). Colocar en
autoclave y esterilizar. Disolver los componentes por separado y agregarles
agitando suavemente y esterilice.
Nota:
Como medio confirmativo para coliformes totales, el ms generalizado es el caldo
de bilis lactosa verde brillante (BLVB). Para confirmar la presencia de coliformes
fecales se utilizan tanto el BLVB como el caldo EC.
V. TECNICA
PRUEBA PRESUNTIVA
Todas las operaciones debern efectuarse en absolutas condiciones de
asepsia.
1. Agitar vigorosamente la muestra por lo menos 20 veces para lograr una
distribucin uniforme de los microorganismos.
2. Dependiendo del origen de la muestra y el contenido bacteriano esperado
preparar diluciones.
3. Para preparar las diluciones, con una pipeta estril tomar una alcuota de 1
mL de la muestra original y llevarlo a uno de los tubos conteniendo 9 mL de agua de dilucin estril,
obteniendo de esta manera una dilucin de 10-1
.
(Fig. 7.1)
4. Agitar el tubo de la dilucin 10-1
y con otra pipeta estril tomar una alcuota
de 1 mL y llevarlo a otro tubo con 9 mL de agua de dilucin estril para
obtener una dilucin de 10-2
.
5. Proceder de la misma manera hasta obtener una dilucin de 10-3
o hasta
donde sea necesario.
6. Inocular aspticamente con 1 mL de muestra por triplicado, tubos de
fermentacin conteniendo caldo lactosado o caldo lauril triptosa, a partir de
las ltimas 3 diluciones y conservar todas las anteriores en refrigeracin por
si se requiere su utilizacin posterior.
7. Incubar todos los tubos a una temperatura de 35 C durante 24horas.
8. Despus de 24 horas de incubacin efectuar una primera lectura para
observar si hay tubos positivos, es decir, con produccin de cido, si el
medio contiene un indicador de pH, turbidez y produccin de gas en el
interior de la campana Durham.
9. Al hacer esta verificacin es importante asegurarse que la produccin de
gas sea resultado de la fermentacin de la lactosa, en cuyo caso se
observar turbidez en el medio de cultivo, y no confundir con burbujas de
aire.
10..Para evitar este tipo de confusiones es recomendable revisar las
campanas Durham antes de proceder a la inoculacin y desechar aquellos
tubos cuyas campanas contengan burbujas de aire de alguna manera
eliminar stas y as poder utilizarlos.
11.De los tubos que en la primera lectura den positivos, ya se pueden hacer
las pruebas confirmatorias para coliformes totales y coliformes fecales.
12.En caso de no apreciarse crecimiento en el resto de los tubos, continuarn
en incubacin 24 horas ms.
13.Despus de 48 horas ( 2h) a partir de la inoculacin, se hace la lectura
final. 14. Si pasadas 48 h tampoco se aprecia crecimiento ni produccin de
gas, los tubos se toman como negativos.
INTERPRETACIN:

reportando la AUSENCIA DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES en
la muestra analizada.

anotarn convenientemente y se proceder a realizar la PRUEBA
CONFIRMATORIA para Coliformes Totales y Fecales.PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES
TOTALES:
1. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba
presuntiva, agitndolos para homogeneizar, inocular con tres asadas tubos
conteniendo caldo Lactosa Bilis Verde Brillante (LBVB).
2. Incubar durante 48 3 h a 35 0.5 C.
3. Despus de la incubacin observar la presencia de turbidez y de gas.
INTERPRETACIN:

POSITIVA, debiendo anotar el nmero de tubos positivos para
posteriormente hacer el clculo del NMP.

se observe turbidez: Se consideran NEGATIVOS, establecindose el
Cdigo 0,0,0 para efecto del clculo del NMP

los grados de dilucin analizados, considerar la necesidad de repetir el
anlisis a partir de grados de dilucin menores (mayores volmenes de
muestra) mayores (menores volmenes de muestra), respectivamente.
PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES FECALES:
1. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba
presuntiva, agitndolos para homogeneizar, inocular con tres asadas tubos
conteniendo caldo E.C. (Escherichia coli).
2. Incubar durante 24 horas a 44.5 0.2 C. y despus de este perodo,
observar presencia de turbidez y gas.
INTERPRETACIN:
bidez y produccin de gas: La prueba se considera
POSITIVA, debiendo anotar el nmero de tubos positivos y establecer el
cdigo para posteriormente hacer el clculo del NMP, (Figs. 7.2 y 7.3)
rbidez:
Se consideran negativos, establecindose el Cdigo 0,0,0 para efecto del
clculo del NMP.

los grados de dilucin analizados, considerar la necesidad de repetir el
anlisis a partir de grados de dilucin menores (mayores volmenes de
muestra) mayores (menores volmenes de muestra), respectivamente.VI. CLCULOS
De acuerdo a los tubos positivos en las pruebas confirmativas para Coliformes
Totales y Fecales, establecer los cdigos correspondientes para calcular por
referencia en las tablas estadsticas (Tablas 7.1) el NMP de Coliformes Totales y
Fecales en 100 mL de agua.
En caso de no encontrar en las tablas la combinacin de tubos adecuada, emplear
para los clculos la siguiente ecuacin:



VII. ELABORACIN Y PRESENTACIN DE RESULTADOS.
Los resultados se elaboran de la siguiente manera:

cero.
res correspondiente a las tres
series anteriores a la del valor cero que podr ser leda en la tabla del
NMP.

muestra habr de dividirse el resultado de la tabla por el volumen real de
muestra inoculada en cada tubo de la serie central de cada triplete
escogido.
En general se tiene:



Los resultados obtenidos se expresarn de la siguiente manera:
NMP DE COLIFORMES TOTALES: __________ / 100 mL
NMP DE COLIFORMES FECALES: __________ / 100 mL