AISLAMIENTO DE LINFOCITOS

Las respuestas inmunitarias contra la mayora

de los antgenos inducen la produccin
especifica de anticuerpos y linfocitos T efectores.
Este reconocimiento entre el antigeno
anticuerpo o linfocito sienta las bases del
diagnostico inmunolgico.

El estudio de las inmunoreacciones se realiza
mediante el empleo de tcnicas inmunolgicas
basadas en la deteccin de y evaluacin de la
respuesta humoral ( anticuerpos y
complemento) o de base celular (linfocitos T y
fagocitos).

Unin antgeno-anticuerpo (Ag-Ac)
Interaccin reversible (enlaces no-
covalentes).
Interaccin primaria no visualizable
Interaccin secundaria visible (ej.:
aglutinacin, precipitacin)
No siempre se produce la
interaccin Ag-Ac
secundaria
SEROLOGIA
La medicin de las interacciones Antigeno-
Anticuerpo con fines diagnsticos.
Se realizan en 2 vas:
Utilizacin de anticuerpos especficos para
detectar el antigeno.(diagnostico directo)

Utilizacin de antigenos especficos para
detectar anticuerpos. (diagnostico indirecto)





Especificidad; capacidad de los anticuerpos de
distinguir y reaccionar con una estructura qumica entre
muchas.
Reactividad cruzada: el anticuerpo reacciona con otro
antgeno, cuando este y el antgeno que estimulo la
produccin del anticuerpo especifico comparten un
epitopo idntico o muy similar.
Afinidad de un anticuerpo es la fuerza o
intensidad de la unin, entre un sitio de unin del
anticuerpo y un determinante antignico.
Avidez: es la fuerza con la que el anticuerpo
multivalente se une a un antgeno multivalente.
Los anticuerpos o antgenos marcados reciben el
nombre de conjugado. Los anticuerpos conjugados
suelen ser monoclonales o antinmunoglobulinas
especificas.
Se les llama sistemas competitivos. Se establece
competencia por los sitos de unin disponibles
entre el reactivo conocido, (ag, o ac) aadido al
ensayo a concentracin limitada, y el elemento a
investigar.
PRUEBAS DE UNION SECUNDARIA
Aglutinacin: en placa, en tubo.
Precipitacin: Inmunodifusion en agar,
inmunoelectroforesis
Hemoaglutinacin.
Inhibicin de la hemoaglutinacin.
Fijacin de complemento.
Neutralizacin y Seroneutralizacion realizadas in
vitro.
Concentracin de Antgeno
Reacciones de precipitacin: antgeno soluble
Inmunodifusin radial (precipitacin)
Concentracin de Ag
Inmunodifusin Radial
Inmunodifusin doble
Inmunoelectroforesis
Inmunoelectroforesis de veneno crudo (VC) y enzima LAO de
serpiente Bothrops atrox, con suero antibothrpico
Reacciones de
aglutinacin: antgeno
particulado
Reacciones con marcadores
Inmunohistoqumica
Trozo de tejido
Se corta en secciones muy
finas y se coloca en un
portaobjetos
Anticuerpo 1 Anticuerpo 2
biotinilado
Avidina-peroxidasa
Revelado
Inmunohistoqumica - Sustratos
Inmunohistoqumica - Revelado
Anti MMP-13 revelado con DAB
Contratincin hematoxilina
Rodamina
Fluoresceina
Ficoeritrina
DAPI
Bromuro
de Etidio
Naranja
de Acridina
Inmunofluorescencia
N-myc/CD56
Rat neurons
Inmunofluorescencia
Inmunofluorescencia - colocalizacin
La colocalizacin permite
determinar si dos antgenos se
encuentran en el mismo lugar
(nucleo, vacuola, retculo, etc)
dentro de una clula
Inmunofluorescencia - colocalizacin
Citometra de Flujo
Citometra de Flujo
Clula Medida En movimiento
Medida de las propiedades de las clulas
mientras estn en un flujo de lquido
Inmunofenotipificacin
Viabilidad/apoptosis/Proliferacin
Ciclo celular
Cambios en la superficie
Actividad enzimtica
Citometra de Flujo
Mezcla de clulas
Marcacin con
anticuerpos
monoclonales
Citometra de Flujo
La presin ejercida por una columna de
fluido obliga a las clulas a enfilarse de
a una
Citometra de Flujo
Columna de clulas
Citometra de Flujo
Laser
Detector
Citometra de Flujo
Tamao
Granularidad
La luz que se detecta en la misma
direccin del laser (forward) es detectada
por el canal Forward Scatter Channel
(FSC).
La intensidad de la seal detectada se
relaciona con el tamao, y el indice de
refraccin de las clulas
La luz que se detecta a 90 grados del haz
del laser (side) es detectada por el canal
Side Scatter Channel (SSC)
La intensidad de la seal es proporcional a
la cantidad de estructuras citoslicas en la
clula (grnulos, inclusiones, etc)
Citometra de Flujo
Dado que FSC es proporcional al tamao y SSC a las
estructuras internas, una correlacin entre ellos permiten la
diferenciacin de los distintos tipos celulares en una poblacin
celular heterogenea
FSC
S
S
C

Linfocitos
Monocitos
Granulocitos
RBCs, debris,
Clulas muertas
Citometra de Flujo - Histograma
Intensidad de fluorescencia
C
u
e
n
t
a
s

Citometra de Flujo - Dot Plot
FL1
F
L
2

Citometra de Flujo - Dot Plot
Citometra de Flujo - Cell sorting
Citometra de Flujo
Citometra de Flujo
Sensible
Especfica
Precoz
Reproducible
Fcil de implementar
Tcnicas inmunolgicas
CELLULAR ANTIGENS
Sensory Adhesion Metabolic
Ejemplo: inmunohistoqumica para HER-2
N de
sujetos
con
resultad
o
positivo
para el
test
N de
sujetos
con
resultad
o
negativo
para el
test
Totales
N de
sujeto
s
enfer
mos
VP FN VP+FN
N de
sujeto
s
sanos
FP VN FP+VN
Totale
s
VP+FP FN+VN
VP+VN+
FP+FN
Sensibilidad diagnstica:
probabilidad de que una persona que
sufre una enfermedad determinada
tenga un resultado positivo en un test.
VP / ( VP + FN)
Enfermos
Test
Positivo
(VP)
Test
Negativo
(FN)
Especificidad diagnstica:
probabilidad de que una persona que no
sufre esta enfermedad tenga un
resultado negativo del test.

VN / ( FP + VN)
Sanos
Test
Positivo
(FP)
Test
Negativo
(VN)
Valor de prediccin positivo de un
test : la probabilidad de que una persona
que tenga un resultado positivo a un test
sufra una determinada enfermedad.

VP / ( VP + FP )
Enfermos
Test
Positivo
(VP)
Sanos
Test
Positivo
(FP)
Prevalencia: 10/1000 hab
Valor de prediccin negativo de
un test : la probabilidad de que una
persona que tenga un resultado
negativo de un test no sufra una
enfermedad determinada.

VN / ( VN + FN )
Enfermos
Test
Negativo
(FN)
Sanos
Test
Negativo
(VN)
Prevalencia: 10/1000 hab
Eficacia del test: fraccin numrica de
pacientes correctamente clasificados

VP + VN / ( VP + FP + FN + VN)
Enfermos
Test
Positivo
(VP)
Test
Negativo
(FN)
Sanos
Test
Positivo
(FP)
Test
Negativo
(VN)
Interpretacin
Reacciones cruzadas
Sensibilidad y especificidad
Grupo poblacional
Etapa de la enfermedad
Presencia de complejos Ag-Ac
Pacientes inmunocomprometidos
Variaciones intra e interlaboratorio
Interferencia de la terapia
Velocidad de depuracin de los Ag
Discriminar colonizacin de infeccin
Ejemplo: Sfilis
Treponema pallidum
Chancro (sfilis primaria)
Roseola (sfilis secundaria)
Ejemplo: fiebre tifoidea
Salmonella typhi
Reaccin de Widal
Zona no endmica:
anti-O y anti-H 50-100

Zona endmica:
anti-O y anti-H 160-200
Infec.
6 das 8 das 6 meses
12 meses
Anti
O
Anti H
Western blot
Western blot

Transferencia
SDS PAGE
Gel
Membrana
Western blot
Bloqueo Anticuerpo 1
Anticuerpo 2
biotinilado
Avidina-peroxidasa
Revelado
Sustrato coloreado que precipita al reaccinar
Sustrato que emite luz al reaccionar con la enzima
Generacin de gene KO
SEPARACIN MAGNTICA DE CLULAS
Microscopa y tcnicas de estudio
a nivel celular
Tipos de
microscopios
pticos
Electrnicos
Campo claro
Campo Oscuro
Contraste de fase
Confocal
Fluorescencia
Transmisin
Barrido
Microscopa
Algunos Conceptos
Resolucin (D) Magnificacin
Aumento que logra el
equipo
Distancia mnima a la cual
el equipo puede mostrar
dos puntos como
entidades separadas
Microscopio ptico - Campo claro
Eosinofilia
Microscopio ptico - Campo oscuro
Observar organismos
vivos sin necesidad
de tincin
Objetos brillantes
sobre un fondo oscuro
Microscopio ptico - Campo oscuro
Treponema pallidum
Aumenta pequeas diferencias en el ndice de
refraccin y densidad en la clula
Microscopio ptico - Contraste de fase
Observar organismos
vivos sin necesidad
de tincin
El anillo forma un cono hueco de luz.
El rayo de luz que atraviese la muestra va a retrasarse
respecto del rayo que siga de largo
luz
sombra
Microscopio ptico - Contraste de fase
Clulas HeLa (Henrietta Lacks) Eritrocitos Humanos
Zygnema Filamentous Algae
Microscopio ptico - Contraste de fase
Microscopio ptico - Interferencia
Permite la visualizacin detallada sin
teir

Maximiza la diferencia entre los
ndices de refraccin entre las partes
de la muestra de forma de hacer
visibles los limites celulares
Mismo principio que el microscopio
de contraste de fase pero utiliza luz
polarizada

Microscopio ptico - Contraste de fase e interferencia
Contraste
de fase
Interferencia
diferencial
Los objetos pueden tambin visualizarse
por la luz que ellos mismos emiten
Microscopio ptico - Fluorescencia
Restringe
infrarrojo
Pasa slo la que
permite la excitacin
del fluorocromo
Aequoria victoria
Microscopio ptico - Fluorescencia
Algunos objetos fluorescentes
GFP
(Green fluorescent protein)
hela
Drpspphila
Clula de cebolla (peroxisomas)
Microscopio ptico - Fluorescencia - Confocal
Microscopio ptico - Fluorescencia - Confocal
Microscopio ptico - Fluorescencia - Confocal
Microscopa electrnica - Microscopio electrnico de transmisin (TEM)
Bacilos en divisin Mitocondria 60.000x
Herpes virus ensamblndose en el ncleo
Bacteria fagocitada por un
macrfago
Microscopa electrnica - Microscopio electrnico de transmisin (TEM)
Microscopa electrnica - Microscopio electrnico de barrido (SEM)
Glomrulo renal 1200x
Clula en corte transversal
Piel humana
Espermatozoides bovinos
Microscopa electrnica - Microscopio electrnico de barrido (SEM)
Clula vegetal con cristales (falsa tincin) Bacterias sobre un estoma
Glb. Rojo
Glb. Blanco
Microscopa electrnica - Microscopio electrnico de barrido (SEM)




Elevados costos de los equipos y una
infraestructura adecuada no permiten el uso de la
tcnica en cualquier laboratorio.
Altos costos de procesamiento de las muestras
La manipulacin de reactivos se torna peligroso por
la elevada condicin toxica de los mismos.
Procesamiento tedioso de la muestra. Creacin de
artefactos
La complejidad de los equipos requiere de personal
tcnico especializado.
Proporciona resultados de amplia resolucin y
magnificacin
Microscopa electrnica - Ventajas y desventajas
Tcnicas inmunolgicas
ELISA
Western blot
Inmunohistoqumica
Inmunofluorescencia
Citometra de flujo
Tcnicas inmunolgicas
Introduccin a las Tcnicas
inmunolgicas
Tcnicas inmunolgicas - Inmunoglobulinas
Anticuerpo
Antgeno
Tcnicas inmunolgicas - Anticuerpos
epitope
Linfocito B
Activacin
Antgeno
Tcnicas inmunolgicas - Anticuerpos
Epitope A
Epitope C
Epitope B
Tcnicas inmunolgicas - Anticuerpos policlonales
Antigeno
Activacin
Linfocitos B
Tcnicas inmunolgicas - Anticuerpos policlonales
Suero
Centrifugacin
Sangre
Purificacin
Tcnicas inmunolgicas - Anticuerpos policlonales
Tcnicas inmunolgicas - Anticuerpos monoclonales
Antgeno
Purificacin de
Linfocitos B
Sangrado
Cultivo de clulas
tumorales
+
Fusin
Hibridoma
Hibridomas
Screening: Bsqueda de hibridoma
positivo y aislamiento
Purificacin de anticuerpos monoclonales
del sobrenadante de cultivo de los
hibridomas
Tcnicas inmunolgicas - Anticuerpos monoclonales
ELISA
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Para detectar
Antgenos
Anticuerpos
ELISA
ELISA Para detectar Anticuerpos

Sensibilizacin Bloqueo
Incubacin con Suero
ELISA
ELISA Para detectar Anticuerpos

Lavado Anticuerpo 2 Revelado
ELISA
ELISA Para detectar Antgenos

Sensibilizacin Bloqueo
Incubacin con Suero
ELISA
ELISA Para detectar Antgenos

Lavado Anticuerpo 2 Revelado
ELISA
Tcnicas inmunolgicas - Deteccin indirecta
Biotina
Avidina
Tcnicas inmunolgicas - Complejo avidina/biotina
Antgeno
Ac. primario
Ac. secundario
Biotina
Cromgeno
Cromforo
Avidina
Peroxidasa
Tcnicas inmunolgicas - Deteccin indirecta
Cultivos Primarios
(El principio de la historia.....)
A- Aislamiento del tejido
B- Diseccin/disgregacin
C- Cultivo celular en recipiente
(Placa Petri) (Cultivo primario)
Aunque potencialmente se puede obtener un cultivo primario a
partir de cualquier tipo de tejido, normalmente los tejidos
embrionarios y tumorales dan los mejores resultados, debido a
que su grado de diferenciacin es menor y su capacidad de
divisin mayor.
Preparacin cultivos
Cultivos secundarios y lneas
estables

1. Si uno o varios tipos de clulas de un cultivo
primario se re-siembran (sub-cultivo), el cultivo
obtenido se denomina cultivo secundario.
2. La heterogeneidad celular es menor: el medio
utilizado determinar qu clulas se desarrollarn.
3. Las lneas estables son las que se obtienen por sub-
cultivo y seleccin de cultivos secundarios.
Tambin se pueden obtener a partir de tejidos
tumorales.

Seleccin de la lnea estable
Lneas celulares estables
Control del entorno
celular

Homogeneidad celular

Conocimiento del tipo
celular

Economa

Ventajas Desventajas
Falta de diferenciacin

Inestabilidad de la lnea
(mutaciones DNA)
Medios de Cultivo: Medios Base
Medios base: Eagles Basal Medium,
Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM),
RPMI1640, etc.
Contienen: Hidratos de Carbono, cidos grasos
esenciales y otros lpidos, aminocidos, sales
minerales, oligoelementos.

*Cada lnea celular tiene unos requerimientos que hacen que crezca mejor en
un determinado tipo de medio
Medios de Cultivo: Aditivos
Antibiticos: estreptomicina (Gram +/-),
penicilina (Gram +), amfotericina (levaduras y
hongos)
Tampn pH: Hepes, bicarbonato, etc.
Indicador pH.
Suero fetal: Bovino, ovino, humano. 10% (2-
50%).
Aditivos especficos: Suplemento de
piruvato, suplemento de glucosa, etc.

Tamponadores de pH
Hepes
Buffer tamponador que acta de manera muy
eficiente en el rango 7,2-7,6


*Importancia de la ppCO
2
en el mantenimiento
del pH

H
2
O + CO
2
H
2
CO
3
H
+
+ HCO
3
-

*
Rojo Fenol (Phenol Red-Na) (Indicador de pH)


Propiedades fsico-qumicos del Medio
CO
2
: Normalmente 5% (2-8% depende de tipo celular y [HCO
3
-
]
pH.............................................................(7.0-7.7)
Osmolaridad.............................................(290-320) mOsm/Kg
Viscosidad................................................ Suero
Temperatura............................................. 37C (mamfero)
(aves: 38,5C; epitelio de ratn: 33C; insectos: 28C)


Test de medio completo con suero
Previamente a la realizacin de
experimentos los medios deben ser
probados a diferentes niveles.

1. Posible Contaminacin
2. Niveles de Proliferacin Celular (eficiencia)
Subcultivos Celulares
Protocolo Subcultivo
Depende de las caractersticas de la lnea
celular con la que se esta trabajando.

1. Clulas en suspensin

2. Clulas adheridas al substrato
Cultivo primario en monocapa
ELISA
Los mtodos de ELISA dependiendo de la
actividad enzimtica se dividen en dos tipos:
Competitivos
No competitivos
ELISA
ELISA COMPETITIVO:
En este mtodo, el anticuerpo de la muestra va a
competir con el conjugado por un nmero limitado de
sitios de unin del antgeno. Habr ausencia de color
en una muestra positiva debido a que el sustrato no
encontrar a la enzima porque el conjugado ha sido
desplazado por el anticuerpo presente en la muestra.


ELISA
ELISA NO COMPETITIVO:
Consiste en enfrentar la muestra con el antgeno
o anticuerpo que est en la fase slida. Si una
muestra es positiva se formar el complejo
antgeno-anticuerpo y al agregar el conjugado
reaccionar con el respectivo sustrato
desarrollando color
ELISA
Dentro de los no competitivos tenemos:
Los directos que detectan antgenos
Los indirectos que detectan anticuerpos.
ELISA
Pasos generales de un ELISA
1. Tapizado del pocillo con el antgeno o anticuerpo
2. Adicin de la muestra problema con la mezcla de antgenos o anticuerpos
3. Unin del antgeno o anticuerpo especfico al anticuerpo o antgeno tapizado
en el posillo.
4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de anticuerpo o antgeno no unido
5. Adicin del anticuerpo secundario marcado con la enzima
6. Unin del anticuerpo secundario al antgeno o anticuerpo
7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida
8. Adicin del sustrato
9. Unin del sustrato a la enzima
10. Desarrollo del color








ELISA Competitiva (1)
ELISA Competitiva (2)
ELISA Competitiva (3)
ELISA Competitiva (4)
ELISA Competitiva (5)
ELISA Competitiva (6)
ELISA Competitiva (7)
ELISA Competitiva (1)
ELISA Competitiva (9)
ELISA Competitiva (10)