Teknologi DNA Rekombinan

Teknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan, atau dengan istilah yang
lebih populer rekayasa genetika, ini melibatkan upaya perbanyakan gen tertentu di dalam suatu
sel yang bukan sel alaminya. DNA rekombinan adalah pembentukan kombinasi materi genetik
yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga
memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme
lain yang berperan sebagai sel inang.
Teknologi DNA rekombinan memiliki dua keuntungan. Pertama, dengan mengisolasi dan
mempelajari masing-masing gen akan diperoleh pengetahuan tentang fungsi dan mekanisme
kontrolnya. Kedua, teknologi ini memungkinkan diperolehnya produk gen tertentu dalam waktu
lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksisecara konvensional.
Pada dasarnya upaya untuk mendapatkan suatu produk yang diinginkan melalui teknologi
DNA rekombinan melibatkan beberapa tahapan tertentu. Tahapan-tahapan tersebut adalah isolasi
DNA genomik/kromosom, pemotongan molekul DNA menjadi sejumlah fragmen dengan
berbagai ukuran, isolasi DNA vektor, penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untuk
menghasilkan molekul DNA rekombinan, transformasi sel inang menggunakan molekul DNA
rekombinan, reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang, dan analisis DNA rekombinan.
Gambar 2 menunjukan proses DNA rekombinan.

Gambar 2. Proses DNA rekombinan

www.wikipedia.com

Unsur-unsur yang diperlukan dalam pembentukan DNA rekombinan adalah plasmid, enzim
restriksi, DNA ligase, dan tranformasi. Tranformasi merupakan pemindahan potongan segmen
DNA dari suatu organisme ke mikroorganisme yang lain. Berikut ini merupakan perangkat yang
diperlukan :
1. Plasmid: Plasmid merupakan molekul DNA sirkular berukuran kecil umumnya berasal
dari bakteri, sering dianggap sebagai ektrakromosom
Terdapat pada bakteri
DNA selain kromosom
Berbentuk sirkuler
Umumnya berukuran kecil( lebihkecildari
ukuran kromosombakteri )
Jenis, jumlah, dan ukurannya bervariasi antar sel dan antar jenis bakteri

Fungsi plasmid pada pembentukan DNA rekombinan:
a. Digunakan sebagai vector untuk klon gen atau klon fragmen DNA atau mengubah sifat
bakteri.
b. Untuk memperbanyak gen (copy gene) yang telah disisipkan dengan bantuan sel bakteri

2. Enzim restriksi
Enzim restriksi digunakan untuk memotong DNA. Enzim restriksi mengenal dan
memotong DNA pada sekuens spesifik yang panjangnya empat sampai enam pasang
basa. enzym restriksi dapat menghasilkan potongan DNA dengan bentuk sticky ends
(ujung lancip) sehingga mampu berpasangan dengan basa yang cocok/sesuai. Contoh dari
enzim restristik adalah : Enzim EcoRI telah diisolasi pertama kali olehHerbert Boyer
tahun1969 dari E.coli. Enzim EcoRI memotong pada bagian antara basa G danA pada
sekuens GAATTC. Perhatikan pada gambar 3.

Gambar 3. Enzim EcoR1

Sumber : academic.brooklyn.cuny.edu

Enzim restriksi secara tradisional dibagi menjadi 3 tipe berdasarkan komposisi, posisi
pemotongan, spesifisitas sekuens dan kofaktor yang diperlukan , yaitu enzim restriksi tipe
I, tipe II dan tipe III.
Enzim restristik tipe I
Memotong DNA secara acak dan jauh dari sekuen pengenalannya. Enzim ini
tidak dapat menghasilkan potongan fragmen DNA yang diinginkan sehingga tidak
diproduksi.

Enzim restristik tipe II
Memiliki ciri sebagai berikut :
Mengenali urutan tertentu sepanjang empat hinggan tujuh basa di dalam molekul
dna
Memotong ke dua untai molekul DNA ditempat tertentu
Menghasilkan fragmen-fragmen DNA
Tipe ini yang umum digunakan adalah EcoRI

Enzim restristik tipe III
Enzim yang tidak digunakan dalam laboratorium, hal ini dikarenakan
enzim ini memotong diluar situs pengenalan dan membutuhkan dua sekuen
dengan orientasi berlawanan pada DNA yang sama untuk menyelesaikan
pemotongan sehingga enzim ini jarang menghasilkan potongan sempurna

3. Dna ligase
DNA ligase merupakan enzim yang dapat mengkatalisis pembentukan ikatan
fosfodiester antara ujung 5-fosfat dan 3-hidroksil yang digunakan saat proses ligasi
pada DNA yang mengalami pemotongan dengan enzim restriksi sebelumnya. DNA ligase
diperlukan untuk menggabungkan fragmen saat proses replikasi, menyambung potongan-
potongan DNA yang baru disintesis, serta berperan dalam proses reparasi DNA.
DNA ligase dapat digolongkan menjadi 2 jenis berdasarkan kofaktor yang
diperlukan, yaitu NAD
+
atau ATP.DNA ligase NAD
+
-dependent ditemukan hanya di
bakteri, Sementara DNA ligase ATP-dependent ditemukan di bakteriofage, eubacteria,
archae dan virus. DNA ligase ATP-dependent yang umum adalah T4 DNA ligase dan T7
DNA ligase.














Isolasi DNA
Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang
dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh
maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah
lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam
medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan
dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS).
Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel
mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel
dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasimenggunakan fenol atau pelarut
organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis
dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur
dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA.
Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium
asetat dan alcohol.