The Difference between amount of bacterial colony and

biofilm formation in Staphylococcus epidermidis on titanium

Ti-6Al-4V and stainless steel 316L



IN VITRO STUDY
oleh:
dr Satiyo

Pembimbing

dr.ISTAN IRMANSYAH,SpOT
dr.DEWI SANTOSANINGSIH, SpMK

Introduction

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major problem in modern
medicines

BAI still occur today in 0,2% - 17,3% of cases of prosthetic
orthopedic surgery.

Caused by Staphylococcus epidermidis.

Navarro M, Michiardi A, Castao O, Planell J. Biomaterials in orthopaedics. J R Soc Interface 2008;5:1137-58; PMID:18667387;
http://dx.doi.org/10.1098/rsif.2008.0151
Introduction

Biomaterial associated infection (BAI) terjadi 1-10 % per kasus
total artroplasti pinggul ( THA ) atau total artroplasti lutut ( TKA ) terjadi
dengan kejadian 1,5-2,5 % untuk THA atau TKA primer ,

Sedangkan revisi THA atau TKA membawa risiko infeksi masing-masing
sebesar 3,2 % atau 5,6 %

Sedangkan 5% dari semua fiksasi internal terinfeksi , fraktur tertutup
0,5 %-2% dan 30% untuk fraktur tertutup





Hanssen AD, Rand JA. Evaluation and treatment of infection at the site of a total hip or knee arthroplasty. Instr
Course Lect 1999; 48:111-22; PMID:10098033
Obremskey WT, Bhandari M, Dirschl DR, et al. Internal fixation versus arthroplasty of comminuted fractures of the distal
humerus. J Orthop Trauma 2003; 17:463465.

Perren SM. Evolution of the internal fixation of long bone fractures: the scientific basis of biological internal fixation: choosing
a new balance between stability and biology. J Bone Joint Surg Br 2002; 84:10931110.



Research question
Are there any differences in the amount of
colonies and the formation of S.epidermidis
bacterial biofilms on the surface of titanium Ti-
6Al-4V and 316L stainless steel?
The aim of this study
to know the process of colonization and
bacterial biofilm formation on the surface of
the implant by S.epidermidis.



Biomaterial-associated
infection (BAI)
CONCEPTUAL FRAMEWORK
Bacterial colonization +
biofilm formation

Factor including in adhesion :
Bacterial characterization
Colonization and biofilm formation
Titanium (Ti-6Al-4V)

Stainless
steel 316L

S.epidermidis
biofilm-formed
bacteria
Colonization and biofilm formation
Bacterial adhesion on
implant surface

Characteristic of implant
surface; surface roughness
and hidrophobic

Infection infection

Materials and Methods

TITANIUM+S.E
PIDERMIDIS
STAINLESS
STEEL+S.EPIDE
RMIDIS

TITANIUM+E.
COLI
IMPLAN
KOLONI
BAKTERI+BIOFILM
KOLONI
BAKTERI
KOLONI
BAKTERI+BIOFILM

STAINLESS
STEEL+E.C
OLI
KOLONI
BAKTERI
This experimental laboratoris study using The t-test
independent
Result
Deskripsi
Hasil Jumlah koloni ( 10
4
CFU/ml)
Logam Titanium Logam Stainless steel
S.epidermid
is
E.coli S.epidermidi
s
E.coli
Rata-rata
4,290 7,214 9,124 12,616
Standar
Deviasi
0,441 1,871 0,847 5,817
N
5 5 5 5
Result
Rata-rata
0
2
4
6
8
10
12
14
S.epidermidis
Titanium
S.epidermidis
Stainless steel E.coli Titanium
E.coli Stainless
steel
Rata-rata
Rata-rata
4,834
6,402
selisih
Result
1.SEM. S. Epidermidis on the surface of titanium with white
biofilm formation around it (7,500 x).
2. E. coli does not form biofilms on the
surface of Titanium (7,500 x)

A. S .Epidermidis does form biofilm on the surface of stainlesss steel (5.000 x ) B. E.Coli does not form biofilm on the surface of stainless steel
(5.000 x )
DISCUSSION
There was significantly different between the
amount of bacterial colony Staphylococcus
epidermidis on the surface of titanium Ti-6Al-4V
than stainless steel 31L.
The value of statistical significance was set at
P<0.05.

Factors influencing bacterial adhesion
1. Environment
2. Bacterial characteristics
Surface hydrophobicity of bacteria
3. Material surface characteristics
hydrophobicity, surface roughness


CONCLUSIONS
The amount of bacterial colony on
surface Titanium Ti-6Al-4V lower
than Stainless Steel 316L.


Thanks You
Bakteri s. Epidermidis (10
6

CFU/ml
Kelompok 1:
Titanium 416L
diimplan dalam
kultur
S.Epidermidis
Kelompok 2:
Stainless steel
316L diimplan
dalam kultur
S.Epidermidis

Kelompok 3 :
kontrol
Titanium 416L
diimplan dalam
kultur E.Coli*

Terbentuk koloni bakteri
dan pembentukan biofilm

Pemeriksaan pembentukan biofilm
dengan Scanning Electron Microscoy
(SEM)
Uji statistik dengan
T-test

Kelompok 4 :
Kontrol
Stainless steel 316L
diimplan dalam
kultur E.Coli*

Penghitungan jumlah koloni bakteri
yang adhesi di permukaan implan pada
medium nutrien agar
Melihat gambaran biofilm
secara deskriptif/kualitatif

Adhesi bakteri

*tidak membentuk biofilm


Alur penelitian
INTERAKSI BIOMATERIAL-BAKTERI

BACTERIA

BIOMATERIAL
HOST
Trampuz A, Widmer AF. Infections associated with orthopedic implants. Curr Opin Infect Dis
2006; 19:349-356.
Kriteria sampel

1. Inclusion Criteria
Titanium implant Ti-6Al-4V, 316L stainless steel which is cut 1 mm
with a length of 0.5 cm that has been sterilized.
2. Exclusion Criteria
Implants that failed to form biofilms
Contaminated implants
Metode Penelitian
Desain Penelitian

Experimental studies in laboratory in vitro by comparing the
growth of colonies of bacteria and biofilm formation on
titanium Ti-6Al-4V, 316L stainless steel
Materials and Methods
This experimental laboratoris in vitro study using The
t-test independent
Inclusion Criteria
Titanium implant Ti-6Al-4V, 316L stainless steel which is
cut 1 mm with a length of 0.5 cm that has been sterilized.
Exclusion Criteria
Implants that failed to form biofilms
Contaminated implants


Classification of prosthetic joint
infections
These include van der Waalss forces,
acid-base, electrostatic and hydrophobic interactions,
protein bindings, etc.14, 53, 54, 78 The surface characteristics
of the biomaterial also seem to be of importance, including
hydrophilicity, roughness, and surface charge.
The more hydrophilic and rougher, the better for bacterial
adhesion.10, 73 There are at least two phases of bacterial
attachment to distinguish: reversible (non-specific)
and irreversible (specific). The reversible adhesion relies
on the non specific physical and chemical characteristics
of the bacteria, as well as on the biomaterial and
surrounding joint fluid. The irreversible attachment is
mediated through more specific structures, for example
adhesin receptors expressed on the bacteria surfaces
(Fig. 4).
Judul : Perbedaan tingkat adhesi bakteri Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis)
pembentuk biofilm pada Titanium 416L dan Stainless Steel 316L
Uji 1: Uji pembentukan biofilm bakteri S. epidermidisIsolat bakteri S. epidermidis
diinokulasi pada medium Congo Red agar dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24-
48 jam. Koloni yang khas (berwarna hitam) menunjukkan bakteri membentuk biofilm
dan digunakan untuk tahap selanjutnya.(saya usul bila ada S.epidermidis yang tidak
membentuk biofilm, maka bakteri tersebut dapat digunakan sebagai kontrol negatif
menggantikan rencana semula menggunakan E.coli).
Uji 2: Evaluasi adhesi (perlekatan) bakteri pada permukaan implant (surface
colonization) (Antoci Jr. V, 2008)
a. S. epidermidis pembentuk biofilm dan bakteri kontrol (bukan pembentuk biofilm:
S.epidermidis atau E.coli pilih salah satu) diinokulasi pada medium Trypticase Soy
Broth (TSB) dan diinkubasi 18-24 jam pada suhu 37oC.
b. Setelah inkubasi 18-24 jam, suspensi bakteri dalam medium TSB diencerkan
dengan tingkat kekeruhan 107-108 CFU/ml (Mc Farland 0,5).
c. Potongan implant Titanium 416L dan Stainless Steel 316L dimasukkan ke dalam 0,5
ml suspensi bakteri yang telah diencerkan dan diinkubasi pada suhu 37oC selama18-24
jam.
d. Setelah inkubasi 18-24 jam, implant dicuci dengan phosphate-buffered saline (PBS)
sebanyak 7 kali untuk menghilangkan bakteri yang tidak melekat pada implant.
e. Dilakukan sonikasi terhadap implant dalam 1 ml medium TSB selama 10 menit
dilanjutkan dengan vortex selama 2 menit untuk melepaskan bakteri yang melekat
pada implant (terjadi adhesii).
Satu ose (10 l) medium TSB yang mengandung bakteri yang lepas dari perlekatannya
diimplant diinokulasi pada medium TSB agar dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu
37oC.g. Jumlah koloni dihitung dan dinyatakan dalam CFU/ml


@ mbak uci dan dr.Tio: apakah di lab FMIPA Univ Negeri Malang bisa melakukan
sonikasi ?
Uji 3: Evaluasi semikuantitatif pembentukan biofilm menggunakan metode mikrotiter
plate@ mbak uci: metode yang biasa digunakan mahasiswa TA

Uji 4: SEM @ dr.Tio : disesuaikan protocol di Lab FMIPA Univ Negeri Malang
Satu ose (10 l) medium TSB yang mengandung bakteri yang lepas
dari perlekatannya diimplant diinokulasi pada medium TSB agar
dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC.g. Jumlah koloni
dihitung dan dinyatakan dalam CFU/ml@ mbak uci dan dr.Tio:
apakah di lab FMIPA Univ Negeri Malang bisa melakukan sonikasi
?Uji 3: Evaluasi semikuantitatif pembentukan biofilm menggunakan
metode mikrotiter plate@ mbak uci: metode yang biasa digunakan
mahasiswa TA
Biomaterial Science
the acetabulum and the proximal
femur have been replaced. The
femoral side is completely metal.
The acetabular side is composed
of the polyethylene bearing
surface
Overview of femoral
replacement
Comparison: Modului of
Elasticity
Modulus of elasticity of different implant materials and bone (in GPa)

Patofisiologi pembentukan biofilm


Bakteri berkolonisasi pada
permukaan implan

Pembentukan biofilm
pada permukaan implan

Jaringan tereliminasi karena adanya
pembentukan biofilm

bakteri pembentuk biofilm
resistensi terhadap antibiotik

Gagal implantasi
Bakteri menuju permukaan
implan.

Adhesi bakteri
pada implan
Extra cellular matrix:
Sebagai pembungkus bahan-
bahan yang mengandung
fibronectin, fibrinogen,
albumin, vitronectin, and
collagen.
mempengaruhi adhesi,
differensiasi, dan proliferasi
sel.
menyebabkan perlengketan
Bukan hanya sebagai substrat
sel host, tapi juga kolonisasi
bakteri.
Bakteri berkoloni

Klasifikasi infeksi yang berkaitan
dengan implan
Trampuz A, Zimmerli W. Prosthetic joint infections: update in diagnosis and treatment. Swiss
Med Wkly 2005; 135:243-51; PMID:15965826