Professional Documents
Culture Documents
Uberaba, novembro/2009
OBJETIVO
Preparo de meios de cultura e materiais para elaboração de práticas no laboratório
de Microbiologia.
INTRODUÇÃO
Em um laboratório de microbiologia, é importante que existam equipamentos e
normas para proporcionar segurança e exatidão nos resultados. Para isso, segundo a
ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária), são precisos equipamentos mínimos
para seu funcionamento adequando, como: estufa bacteriológica, forno de Pasteur,
autoclave, microscópio binocular, centrifugador de baixa rotação, homogeneizador, banho-
maria de pequena dimensão, destilador para água, balança para tarar tubos, balança
comum com uma ou duas casas decimais, bico de Bunsen, geladeira e capela de fluxo
laminar.
Com estes equipamentos, pode-se então dar início à prática de microbiologia, sem
riscos de contaminação e com segurança.
MATERIAIS E MÉTODOS
Foram utilizados os seguintes equipamentos:
Autoclave
Papel pardo
Barbante
Pipetas
Balão de fundo chato
Balança de precisão
Espátula de madeira
Meio de cultura sólido
Água destilada
Placa de Petri
Tubo de ensaio
Bico de Bunsen
Fita crepe termossensível
Ponteiras descartáveis
Processo de autoclavagem
Foi utilizado invólucro de papel pardo, para envolver pipetas, ponteiras, tubos de
ensaio e o gargalo do balão de fundo chato. Identificou-se o material com fita crepe
termossensível, o nome dos meios de cultura e os volumes das pipetas. Estes foram
lacrados com barbante. Em seguida adicionou-se água destilada para cobrir a resistência
da autoclave e, posteriormente, inseriu os materiais na autoclave. Esta foi fechada e
ligada durante 30 minutos a 121ºC. Após esse tempo, aguardar a saída do vapor e
diminuição da pressão, abrindo a autoclave e retirando os materiais com cuidado.
http://www2.phoenix.ind.br/?id=474
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Após a solidificação dos meios, estes são armazenados, podendo ser utilizados
para culturas e em prova bioquímicas para análise de microrganismos.
Os equipamentos autoclavados estarão prontos para serem utilizados, com uma
capacidade de armazenamento de até 15 dias.
Segundo o manual da ANVISA “Segurança e Controle de Qualidade no Laboratório
de Microbiologia Clínica”, todos os materiais e resíduos do laboratório deverão ser
descontaminados antes de serem utilizados e descartados através de um método de
descontaminação aprovado, como a esterilização por calor úmido (autoclave). Outras
medidas para diminuir os riscos no laboratório referem-se, principalmente, a:
Pipetagem: É contra-indicada a pipetagem, com a boca, de material clínico
(sangue, liquor, urina, etc.) ou de suspensões bacterianas. Deve-se utilizar, sempre que
possível, pipetas automáticas ou bulbos de borracha;
Flambagem de Alça Bacteriológica: Deve ser feita através de chama, que deve
estar entre o manipulador e a alça, sempre que for feito a manipulação de material
biológico ou durante transferência de massa bacteriana;
Disseminação de Esporos de Fungos: Ao se trabalhar com fungos, particularmente
os filamentosos, recomenda-se o uso de cabines biológicas.
BIBLIOGRAFIA
1. TRABULSI, Luiz Rachid; ALTERTHUM, Flavio. Microbiologia. 4. ed. São Paulo:
Atheneu, 2005.
Uberaba, novembro/2009
OBJETIVO
Coletar amostras de fossas nasais, orofaringe e urina, para semeadura e
identificação pelo método de Gram.
INTRODUÇÃO
Quando se suspeita de uma doença infecciosa, devem ser solicitados cultivos
apropriados ou técnicas dirigidas à detecção sorológica de antígenos e anticorpos. Em
muitas instituições e comunidades, pode-se contar com patologistas, microbiologistas e
técnicos para auxiliar os médicos na seleção das amostras adequadas para cultivo, e
solicitar as provas apropriadas para alcançar o máximo isolamento ou detecção do
microrganismo. É possível que a colheita apropriada de uma amostra para cultivo seja a
etapa mais importante na confirmação final de que um microrganismo é responsável pelo
processo de enfermidade infecciosa. Uma amostra mal colhida pode resultar em fracasso
no isolamento de microrganismos importantes.
As infecções urinárias estão entre as enfermidades mais freqüentes na prática
médica, sendo que o sexo feminino é o mais afetado devido à proximidade do ânus com a
abertura urinária e ao fato da uretra feminina ser mais curta do que a masculina entre
outros fatores, o que proporciona a predominância de enterobactérias neste sítio
anatômico, sobretudo Escherichia coli.
É altamente recomendável que os microbiologistas efetuem exames microscópicos
diretos das amostras enviadas para cultivo. Não só pode ser possível proporcionar ao
médico um rápido diagnóstico presuntivo, mas também a detecção de microrganismos
específicos pode servir como guia para selecionar os meios de cultura apropriados e
fornecer uma valiosa comparação de controle de qualidade com os isolados recuperados.
A coloração de Gram, descoberta há pouco menos de 100 anos, é utilizada com muita
freqüência para o exame microscópico direto de amostras e subcultivos.
MATERIAIS E MÉTODOS
Foram utilizados os seguintes materiais:
Swab
Espátula de madeira
Bico de bunsen
Ágar sangue
Ágar MacConkey
Ágar manitol
Amostras biológicas
Alça de platina
Tubos de ensaio
Lâmina
Cristal violeta
Lugol
Álcool etílico 95%
Fucsina de Gram
Óleo de imersão
Microscópio ótico
Pipeta automática
Ponteiras descartáveis
Soro fisiológico
Coleta e semeadura de material
Foram coletas amostras clínicas dos próprios estudantes, utilizando-se um swab
para material das fossas nasais e um para a orofaringe.
Nas fossas nasais, esfrega-se o swab, umedecido com soro fisiológico, com
movimentos circulares delicados, pressionando-o contra a parede lateral do nariz,
conforme desenho abaixo:
http://www.saude.rs.gov.br/dados/12424086612881241803265859Normas%20laboratoriais%20coleta%20Inf
luenza%20AH1N1.pdf
http://www.saude.rs.gov.br/dados/12424086612881241803265859Normas%20laboratoriais%20coleta%20Inf
luenza%20AH1N1.pdf
Coloração de Gram
Após o crescimento nos meios de cultura, foi feito um esfregaço do material em
duas lâminas, conforme o esquema abaixo. Na primeira, foram utilizadas três colônias
diferentes do meio ágar sangue. Na segunda, foram utilizadas uma colônia do ágar
manitol (A) e uma colônia do ágar MacConkey (B). Deixar secar ao ar.
Após isso, deve-se fixar o material na lâmina, passando-a três a quatro vezes
através da chama do bico de bunsen, de modo que o material não seja removido durante
o procedimento durante o procedimento de coloração.
Coloca-se a lâmina sobre um suporte para coloração e cobrir a superfície com
solução de cristal violeta. Após um minuto, lavar bem com água destilada. Cobrir o
esfregaço com solução de lugol durante dois minutos. Lavar novamente com água
destilada. Sustenta-se a lâmina entre os dedos polegar e indicador e cobrir a superfície do
esfregaço com álcool durante alguns poucos segundos. Lavar com água corrente e
colocar novamente a preparação sobre suporte para coloração. Adiciona-se fucsina de
Gram durante um minuto e lavar com água corrente. Coloca-se a lâmina em posição
vertical deixando que o excesso de água escorra e o esfregaço seque. Examinar o
esfregaço com óleo de imersão na objetiva de 100x no microscópio óptico.
RESULTADOS
Na cultura de ágar sangue, cresceram três tipos de colônias diferentes, todas
apresentando aspecto brilhante:
1. Acinzentada com alfa-hemólise;
2. Amarelada com gama-hemólise;
3. Transparente com gama-hemólise.
Na cultura de ágar manitol (A), cresceu apenas um tipo de colônia, sendo esta rosa
e brilhante.
Na cultura de ágar MacConkey (B), cresceu apenas um tipo de colônia, sendo esta
transparente, permanecendo inalterado a cor do meio.
DISCUSSÃO
Segundo o módulo IV da apostila da ANVISA. O meio Ágar sangue, oferece ótimas
condições de crescimento a maioria dos microrganismos. A conservação dos eritrócitos
íntegros favorecem a formação de halos de hemólise nítidos, úteis para a diferenciação
de Streptococcus sp e Staphylococcus sp. A interpretação da cor original do meio é
vermelho. Na beta hemólise, apresenta halo transparente ao redor das colônias
semeadas (lise total dos eritrócitos). Na alfa hemólise, apresenta halo esverdeado ao
redor das colônias semeadas (lise parcial dos eritrócitos). Na gama hemólise (sem
hemólise) há ausência de halo ao redor das colônias (eritrócitos permanecem íntegros).
Analisando os resultados obtidos da coloração de Gram de colônias retiradas do ágar
sangue, pode-se fazer as seguintes inferências:
• Região 1 – A hemólise presente no ágar sangue é justificada pela presença de cocos
Gram-positivos, sendo estes do gênero Streptococcus produtores de hemolisinas. A
presença de cocos Gram-negativos pode ser justificado por uma mistura de colônias,
uma contaminação ou uma possível lavagem excessiva durante a coloração de Gram.
• Regiões 2 e 3 – A falta de hemólise no ágar sangue pode ser justificada pela presença
de cocos Gram-negativos, não produtores de hemolisinas.
Uberaba, novembro/2009
OBJETIVO
Isolar e identificar, através de provas bioquímicas, as espécies de cocos Gram-
positivos mais comuns isolados de seres humanos.
INTRODUÇÃO
Com exceção dos membros da família Enterobacteriaceae, as bactérias Gram-
positivas, principalmente os cocos, são os microrganismos isolados com mais freqüência
a partir de amostras biológicas humanas em laboratórios de microbiologia. Essas
bactérias estão amplamente distribuídas na natureza, e podem ser isoladas de ambientes
ou como habitantes comensais da pele, mucosas e outros sítios. Os cocos Gram-positivos
produzem uma variedade de doenças, incluindo foliculite, furúnculo, carbúnculo, erisipela
e celulite (estreptococos), além de pneumonia e bacteremia (pneumococos). Portanto, o
isolamento e identificação desses microrganismos, a partir de amostras clínicas, sempre
deve ser correlacionado com o quadro clínico do paciente.
MATERIAIS E MÉTODOS
Foram utilizados os seguintes materiais:
Swab
Bico de bunsen
Meios de cultura ágar sangue, Mueller Hinton, ágar DNAse, ágar manitol
Amostras biológicas
Alça de platina
Agulha de platina
Pinça
Lâmina
Cristal violeta
Lugol
Álcool etílico 95%
Fucsina Gram
Óleo de imersão
Microscópio ótico
Peróxido de hidrogênio
Tubos de ensaio contendo plasma de coelho
Solução salina
Discos de antibióticos (novobiocina, bacitracina e optoquina)
Tubos contendo ágar bile esculina, caldo NaCl a 6,5%
Coloração de Gram
Foi feito um esfregaço do material em duas lâminas. Na primeira, foram utilizadas
três colônias diferentes do meio ágar sangue. Na segunda, foram utilizadas uma colônia
do ágar manitol e uma colônia do ágar MacConkey. Deixar secar ao ar.
Após isso, deve-se fixar o material na lâmina, passando-a três a quatro vezes através da
chama do bico de bunsen, de modo que o material não seja removido durante o
procedimento durante o procedimento de coloração.
Coloca-se a lâmina sobre um suporte para coloração e cobrir a superfície com solução de
cristal violeta. Após um minuto, lavar bem com água destilada. Cobrir o esfregaço com
solução de lugol durante dois minutos. Lavar novamente com água destilada. Sustenta-se
a lâmina entre os dedos polegar e indicador e cobrir a superfície do esfregaço com álcool
durante alguns poucos segundos. Lavar com água corrente e colocar novamente a
preparação sobre suporte para coloração. Adiciona-se fucsina de Gram durante um
minuto e lavar com água corrente. Coloca-se a lâmina em posição vertical deixando que o
excesso de água escorra e o esfregaço seque. Examinar o esfregaço com óleo de
imersão na objetiva de 100x no microscópio óptico.
Provas Bioquímicas
Produção de catalase: Colocar 2mL de água oxigenada (H2O2) em um tubo de
ensaio. Utilizando um swab estéril, tocar na colônia de cocos Gram-positivos e mergulhar
no tubo contendo H2O2. Se houver formação de bolhas a reação é positiva; se não formar,
a reação é negativa.
Produção de coagulase: Tocar em 2-3 colônias com a alça de platina flambada e fria e
introduzir em tubo de ensaio contendo 1mL de plasma de coelho. Homogeneizar bem e
incubar em estufa microbiológica à 37ºC. Fazer a primeira leitura com uma hora de
incubação e de hora em hora, até quatro horas. Se negativo, fazer nova leitura com 24
horas. Se houver formação de coágulo, o teste é positivo; se não, o teste é negativo.
Prova de CAMP: Em placa de ágar sangue, fazer uma estria central com bactérias da
espécie S. aureus hemolítica usando a alça de platina flambada e, em seguida, fazer
estrias perpendiculares à estria central com bactérias do gênero Streptococcus a ser
identificada. A prova é considerada positiva quando são formadas regiões de hemólise em
formato de seta próximo ao crescimento das duas espécies.
RESULTADOS
Analisando-se a lâmina, observou-se cocos Gram-positivos. Iniciou-se a bateria de
testes bioquímicos para duas bactérias diferentes.
Primeiro Teste
Teste da catalase: Houve formação de bolhas, caracterizando um teste positivo. Com isso
confirma-se o diagnóstico de Estafilococos e passa a ser feita identificação do gênero.
Prova da coagulase: Houve formação de coágulo, sendo um teste positivo, indicando
Staphylococcus aureus.
Teste em ágar manitol salgado: Houve crescimento neste meio, indicando teste positivo.
Presença de DNAse: Houve produção de DNAse, indicando teste positivo.
O diagnóstico é provavelmente de Staphylococcus aureus.
Segundo Teste
Teste da catalase: Não houve formação de bolhas, caracterizando um teste negativo.
Com isso confirma-se o diagnóstico para Estreptococos ou Enterococos.
Teste do NaCl: Houve turvação e mudança de cor do meio, sendo um teste positivo
Teste da bile-esculina: Não houve enegrecimento do meio, sendo um teste negativo.
Sensibilidade à Optoquina e Bacitracina: Não houve formação de halo ao redor dos discos
de antibióticos, caracterizando resistência.
Teste de CAMP: Não houver formação de áreas com hemólise, caracterizando um teste
negativo.
O diagnóstico é provávelmente de Streptococcus agalactiae.
DISCUSSÃO
S. aureus é, sem dúvida, o patógeno humano mais importante entre os
estafilococos. É encontrado no ambiente externo e em narinas anteriores de 20% a 40%
dos adultos. Outros sítios de colonização incluem pregas cutâneas, períneo, axilas e
vagina. Embora esse microrganismo possa fazer parte da microbiota humana normal,
pode produzir infecções oportunistas importantes em condições apropriadas.
De acordo com o observado na lâmina, a positividade do teste da catalase foi
suficiente para classificar o gênero como sendo Staphylococcus. Após o teste da
coagulase identificar o microrganismo como S. aureus, os testes em ágar manitol salgado
e DNAse foram apenas confirmatórios, devendo o teste de Novobiocina ser ignorado para
esta espécie.
BACTERIOSCOPIA
Uberaba, novembro/2009
OBJETIVO
Analisar lâminas contendo microrganismos corados por Gram.
INTRODUÇÃO
A morfologia dos microrganismos só pode ser observada ao microscópio. Mas,
devido ao seu reduzido tamanho e ao seu índice de refração muito próximo do índice de
refração da água, não é fácil sua observação microscópica. Sendo também, em geral, não
pigmentados, a observação microscópica só se torna possível aumentando o contraste
entre o meio envolvente e o conteúdo celular.
Para o preparo de um bom esfregaço para exame bacterioscópico, deve-se seguir
normas padronizadas para que os esfregaços sejam bem feitos. O Setor de Microbiologia,
depois de corar as lâminas, tem de observar uma grande extensão destas para conclusão
do diagnóstico. Para permitir o estudo das propriedades das bactérias e classificá-las em
grupos para efeitos de diagnóstico, várias colorações biológicas e procedimentos
específicos foram desenvolvidos. Das colorações há duas que são de interesse
fundamental em Bacteriologia Médica, a coloração de Gram e a coloração de Ziehl-
Neelsen.
MATERIAIS E MÉTODOS
Microscópio Óptico
Óleo de imersão
Lâminas preparadas pela coloração de Gram
RESULTADOS
Foram observadas dez lâminas:
ANTIBIOGRAMA
Uberaba, novembro/2009
OBJETIVO
Determinar o perfil de sensibilidade a antimicrobianos de amostras de cocos Gram-
positivos (Staphylococcus e Enterococcus), pelo teste de disco difusão;
Determinar o valor da concentração inibitória mínima (CIM) para a vancomicina, pelo teste
de diluição em caldo;
INTRODUÇÃO
O antibiograma é um teste que oferece como resultado padrões de resistência ou
susceptibilidade de uma bactéria específica a vários antimicrobianos (antibióticos ou
quimioterápicos). Seu objetivo é tanto a análise do espectro de sensibilidade/resistência a
drogas de uma bactéria quanto a determinação da concentração mínima inibitória, esta é
definida como a concentração mais baixa de um agente antimicrobiano que impede
crescimento visível de um microorganismo no teste de sensibilidade por diluição em ágar
ou caldo.
A técnica de disco-difusão (Kirby-Bauer) e de diluição em caldo são exemplos de
testes de sensibilidade e resistência a antimicrobianos.
Para esses testes deve ter padronização do meio de cultura, inóculo (escala 0,5 Mc
Farland – 108 bactérias/mL) e antimicrobianos. Estes últimos são de acordo com a
bactéria isolada e é fornecido pelo Manual do Clinical and Laboratory Sandards Institute
(CLSI)/NCCLS. Nele pode-se identificar os grupos de drogas sugeridas para os
antibiogramas.
Os antimicrobianos são divididos em classes: beta-lactâmicos, aminoglicosídeos,
glicopepitídeos e macrolídeos. Para obter um teste de qualidade, deve-se observar a
espessura do ágar na placa, o caldo na microdiluição e macrodiluição, pH, estocagem
apropriada das placas, discos, drogas e soluções estoques dos antimicrobianos e
temperatura de incubação.
A técnica de disco-difusão é a mais utilizada, padronizada pelo CLSI, é realizada no
ágar Müeller-Hinton ou sangue. Esta técnica ainda possibilita a flexibilidade na escolha
dos discos, é de baixo custo, fácil execução e interpretação e tem ainda boa
reprodutibilidade. É um teste qualitativo, dando como resultado se o microorganismo é
sensível, intermediário ou resistente. È necessário ainda para realizar a técnica: o inóculo,
os discos impregnados com antimicrobiano e a difusão da droga. A ausência do halo de
inibição indica que o microorganismo é resiste a tal antimicrobiano. A presença do halo de
inibição indica que o microorganismo pode ser sensível, intermediário ou resistente,
dependendo do tamanho deste halo.
A técnica de diluição em caldo é a considerada “padrão ouro”, no Brasil é pouco
utilizado, é de baixo custo, difícil execução e também é padronizada pelo CLSI. Para
realizá-la deve-se determinar a CIM (Concentração inibitória mínima), dada em µg/mL.
Este método é quantitativo (breakpoints), dando como resultado que o microorganismo
pode ser sensível, intermediário ou resistente ao antimicrobiano.
MATERIAIS E MÉTODOS
Foram utilizados os seguintes materiais:
Cultura axênica dos microrganismos em meio sólido
Tubos de ensaio contendo soro fisiológico estéril
Tubo nº0,5 da escala de Mc Farland
Swab
Bico de bunsen
Placas de Petri com ágar Mueller Hinton
Alça de platina
Pinças estéreis
Discos de antibióticos
Tubos de ensaio contendo caldo Mueller Hinton estéril
Solução estoque aquosa de vancomicina
Pipetas automáticas
Ponteiras estéreis
Estufa microbiológica
Tabelas de sensibilidade/resistência a antimicrobianos (CLSI)
http://www.juntadeandalucia.es/averroes/~29701428/salud/practi/antibio1.jpg
A placa é incubada a 35-37ºC por 16-18 horas em estufa microbiológica. Após esse
tempo, mede-se o halo formado e é feita a classificação dos microrganismos.
RESULTADOS
O antibiograma foi utilizado para uma espécie de Enterococcus.
O teste de disco difusão foi feito utilizando os seguintes antimicrobianos:
Oxaciclina, Penicilina, Azitromicina, Clindamicina, Vancomicina, Claritromicina,
Eritromicina e Sulfazotrim (Sulfametoxazol e Trimetoprim). Foram encontrados os
seguintes resultados:
Bactéria
Antimicrobiano, Tamanho do halo Resultado
Concentração e Sigla (mm)
Oxaciclina – OXA – 1mcg 23 S
Penicilina – PEN – 10mcg 15 R
Azitromicina – AZI – 15mcg 22 S
Clindamicina – CL – 2mcg 30 S
Vancomicina – VC – 30mcg 19 S
Claritromicina – CLA – 15mcg 27 S
Eritromicina – ERI – 15mcg 27 S
Sulfazotrim – SFT – 25mcg 28 S
DISCUSSÃO
Uberaba, novembro/2009
OBJETIVO
Isolar e identificar e espécies os Bacilos Gram-negativos mais comuns isolados em
seres-humanos, a partir de processos bioquímicos empregados em testes de identificação
de bacilos Gram-negativos.
INTRODUÇÃO
Os bacilos Gram-negativos pertencentes às Enterobacteriaceae são as bactérias
isoladas com mais freqüência de amostras biológicas. Distribuídos amplamente na
natureza, esses microrganismos são encontrados no solo, água, plantas e no trato
intestinal de seres humanos e animais. Portanto, os membros dessa família podem ser
suspeitos em virtualmente qualquer tipo de doença infecciosa e isolados de qualquer
amostra recebida no laboratório.
As Enterobactérias são bacilos anaeróbios facultativos e não produtores de
esporos, são fermentadores de glicose e produtores de endotoxinas e exotoxinas, além
de serem citocromo oxidase negativa. Devido ao grande número de espécies, uma bateria
de provas bioquímicas deve ser feita, afim de caracterizar definitivamente um membro.
MATERIAIS E MÉTODOS
Bico de Bunsen
Alça de platina
Agulha de Platina
Pinça
Placas contendo meio ágar MacConkey
Tubos contendo meio de identificação bioquímica O/F
TSI ( Tríplice açúcar e ferro)
SIM (sulfeto-indol-motilidade)
Uréia de Christensen
Citrato de Simmons
Fenilalanina
Caldo Descarboxilase de Moeller (lisina, ornitina, arginina)
Voges-Proskauer (VP)
Vermelho de Metila (VM)
Óleo Mineral estéril
Estufa microbiológica
Tabelas de Identificação
Provas Bioquímicas:
Prova H2S - Em meio SIM o BGN é inoculado com uma agulha de platina até o fim do
tubo sem encostar na parede do tubo. Observa-se a produção de H2S quando altera a
coloração do tubo de inalterado para preto.
Prova Indol – Em meio sim semeia-se a colônia de BGN, e após o crescimento adiciona-
se o reagente de Kovac´s (cor amarela) ao longo das paredes do tubo de modo q não se
misture com o meio de cultura. Este reagente reage com o indol produzindo um composto
rosado. As culturas que produzem um anel avermelhado na superfície do meio após
adição de do reagente, são indol positivas.
Prova da Motilidade – No Meio ágar SIM inocula-se em linha reta o BGN, com uma agulha
de platina ate ¾ do tubo. A prova indica motilidade quando os microrganismos crescem
deslocando-se na linha de inoculação, turvando o meio. Enquanto que motilidade
negativa o crescimento só será na zona da picada.
Prova do citrato
Prova da urease
Prova da Fenilalanina – Este meio é sólido e inclinado em tubo. Tem cor originalmente
bege. A desaminação de fenilalanina forma ácido fenilpirúvico. Dentre os membros da
família Enterobacteriaceae, apenas as espécies de Proteus, Morganella e Providencia
possuem a enzima necessária para a desaminação de fenilalanina. O teste consiste na
detecção de ácido fenilpirúvico, após crescimento do microrganismo em meio contendo
aminoácido. O aparecimento de uma coloração verde escura após a adição de uma
solução de cloreto férrico a 10% (três a cinco gotas) indica resultado positivo.
Procedimento: Inocular a bactéria em ágar fenilalanina e, após incubação a 35ºC por 18-
24horas, adicionar 4 a 5 gotas de reagente de cloreto férrico. O desenvolvimento de uma
intensa cor verde, indica uma prova positiva.
Prova da fenilalanina
Caldo base de Moeller (Prova da utilização dos aminoácidos) - A prova consiste em três
tubos contendo como base o caldo descarboxilase de Moeller e fechado com óleo
mineral. Em cada um dos tubos é adicionado um aminoácido diferente (lisina, arginina e
ornitina), para detecção de enzimas específicas para estes substratos. A enzimas
descarboxilases hidrolisam o grupo carboxil (COOH) de aminoácidos, formando aminas
alcalinas e dióxido de carbono. A reação é específica, cada aminoácido é descarboxilado
por uma enzima particular. Lisina e ornitina são os aminoácidos testados rotineiramente
na identificação de Enterobacteriaceae. A lisina é descarboxilada em cadaverina e a
ornitina em putrescina. A reação se dá em anaerobiose. O meio contém o indicador de pH
púrpura de bromocresol, que em pH ácido é amarelo e em pH alcalino é púrpura. Quando
a bactéria é adicionada, ela quebra a dextrose presente e acidifica o meio, mudando a cor
de roxo para amarelo-esverdeado. Este meio ácido estimula a atividade das
descarboxilase (caso a bactéria o tenha) que quebram os aminoácidos, produzindo
substâncias diferentes. Tudo isso eleva o pH do meio, mudando a cor novamente para
roxo. Logo, o teste é considerado positivo se, após o período de incubação, apresentar
cor roxa (púrpura). Se a bactéria não produz as descarboxilase, o meio fica amarelo. Por
isso a necessidade de um tubo branco para poder fazer a comparação das cores sendo
este da cor original do meio. Procedimento: Inocular a bactéria no caldo base de Moeller
em quatro tubos (um para controle, um para arginina, um para ornitina e outro para lisina)
e adicionar 1mL de óleo mineral. Após a incubação, se for positiva, o tubo controle
encontra-se amarelo e os tubos contendo aminoácidos encontram-se púrpuras.
RESULTADOS
O bacilo Gram-negativo isolado apresentou as seguintes características em relação
às provas bioquímicas:
Prova da Fenilalanina – Após a adição do cloreto férrico no tubo, não houve alteração na
coloração, sendo indicativo de reação negativa.
Prova da Lisina – O tubo apresenta coloração púrpura, sendo uma reação positiva.
Prova da Ornitina – O tubo apresenta coloração levemente púrpura, sendo uma reação
positiva.
Prova do Vermelho de Metila (VM) – Não houve alteração da cor do meio, sendo uma
reação negativa
Prova de Voges-Prouskauer (VP) – Não houve alteração da cor do meio, sendo uma
reação negativa.
DISCUSSÃO
K. pneumoniae é isolada com mais freqüência de amostras clínicas e pode causar
uma forma clássica de pneumonia primária. Não é comum encontrar essa bactéria na
orofaringe de pessoas normais, mas pode haver uma prevalência de 20% em pacientes
hospitalizados. Essa colonização pode ser a fonte das infecções pulmonares que
geralmente ocorrem em pacientes em condições debilitantes, como alcoolismo, diabetes
melito e doença pulmonar obstrutiva crônica. A pneumonia tende a ser destrutiva, com
necrose extensa e hemorragia, resultando na produção de escarro. Esta bactéria também
pode causar uma variedade de infecções extrapulmonares, incluindo enterite e meningite,
infecções urinárias e septicemia.
Apesar da maior parte dos testes serem compatíveis com K. pneumoniae, há
algumas considerações a serem feitas:
•A positividade da prova da ornitina não é característica. Isso pode ter ocorrido por tempo
insuficiente para a viragem do pH;
•Os testes VM e VP foram negativos não apenas para a bactéria em questão, mas sim
para todas as outras bactérias dos outros grupos. Isso pode ser resultado de alguma
alteração do teste ou de seus reagentes.
BIBLIOGRAFIA
1. TRABULSI, Luiz Rachid; ALTERTHUM, Flavio. Microbiologia. 4. ed. São Paulo:
Atheneu, 2005.
Uberaba, novembro/2009
OBJETIVO
INTRODUÇÃO
Micélio Vegetativo
Constituído por um aglomerado de hifas, pode ser dividido de acordo com sua morfologia
em três tipos:
1. Unicelular: caracteriza as leveduras que são constituídas por células arredondadas,
ovóides ou ligeiramente alongadas e que podem se reproduzir por brotamento,
cissiparidade
ou por outros processos.
2. Filamentoso: caracteriza os bolores, podendo apresentar-se septado ou cenocítico. As
hifas podem se diferenciar em estruturas e funções variáveis recebendo, então,
denominações
diversas: rizóides, apressórios, anastomoses, hifas artrosporadas, etc.
3. Pseudomicélio: caracteriza um gênero de levedura (Candida). É formada de
brotamentos sucessivos de células em determinadas condições de cultivo.
MATERIAIS E MÉTODOS
-Macrocultivo
Semear um pequeno fragmento da cultura do fungo filamentoso no centro da placa de
Agar Sabouraud, utilizando a alça de platina em gancho. Identificar a placa e incubar por
uma semana à temperatura ambiente.
-Microcultivo
Colocar sobre a lâmina, dentro da placa de Petri, um cubo de Agar batata, com auxílio de
pinça ou da própria alça, semear fragmentos do fungo filamentoso nos 4 cantos do Agar
batata, cobrir a preparação com lamínula estéril, comprimindo-a suavemente sobre o cubo
de Agar batata; umedecer o algodão hidrófilo com água destilada estéril, criando assim
uma câmara úmida; identificar as placas e incubar à temperatura ambiente.
-Leitura: retirar a lamínula, cuidadosamente, e colocá-la sobre uma lâmina contendo 1
gota de lactofenol-azul de algodão e examinar ao microscópio com objetiva de 10 e 40x.
-Microcultivo de leveduras:
Coloca-se sobre a lâmina de microscopia o meio Agar Fubá-Tween80, previamente
fundido (~50°C), cobrindo toda a superfície da lâmina. Deixar o meio solidificar. Com
auxílio de alça de platina esterilizada, tocar levemente a colônia da levedura (cultura de
24-48 horas). Semear a levedura na superfície do meio de cultura fazendo de três a
quatro estrias paralelas, eqüidistantes 3 a 4 mm umas das outras (ver esquemas abaixo).
Cobre-se as estrias com lamínula esterilizada. Pressionar delicadamente a lamínula com
uma pinça para retirar o ar retido entre a lamínula e a superfície do Agar. Identificar a
placa e incubá-la à 35°C, por 48-96 horas, dentro de uma placa de Petri esterilizada;
umedecer o algodão hidrófilo esterilizado com água destilada estéril e deixar no interior da
placa, criando assim uma câmara úmida. Examinar as lâminas ao microscópio óptico com
objetivas de 10 e 40x e observar as estruturas formadas ( hifas, pseudo-
hifas,blastoconídios, clamidioconídios e artroconidios).
-Teste da uréia:
Inocular as leveduras a serem identificadas em Agar uréia com o auxilio da agulha de
platina e incubar à 37°C, por 24 h. Este teste irá avaliar a produção da enzima uréase
pela levedura, a partir da hidrólise da uréia.
RESULTADOS
DISCUSSÃO